CN113940993A

CN113940993A - 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN113940993A
Application number: CN202111558589.3A
Authority: CN
Inventors: 焦铁军; 孟强; 马瑞; 王文博
Original assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN113940993B

Abstract

本发明构建了基于碳纳米管的G2‑2M重组蛋白亚单位疫苗，浸浴免疫后，鱼群的保护率达到94%左右，高于G2蛋白片段，基于M蛋白片段的引入，提高了重组蛋白的免疫原性和保护效力，其相比在先研究，不需要在进行甘露糖化修饰，生产工艺极大地简化，且生产成本也大幅降低，对渔业可持续发展和水产品食品安全生产具有重要意义。

Description

一种鲈鱼弹状病毒G2-2M亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲈鱼弹状病毒G2-2M亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈、黑鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、肉质鲜美、价格高和容易捕捞等众多优点而深受渔民的喜爱。因为大口黑鲈的养殖在国内具有较好的经济效益，在近十几年内已迅速发展成为我国主要的经济养殖鱼种，并被认定为名优品种之一，具有重要的经济价值。鲈鱼易患多种疾病，如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病等。其中，由鲈鱼弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）引起的鲈鱼弹状病毒病（Micropterus salmoides rhabdovirus disease）危害最为严重。其流行地域广，发病时间长，发病死亡率可达85%以上，给鲈鱼养殖带来了巨大经济损失。鲈鱼弹状病毒病在我国主养殖区域内（江苏、江西、湖南、湖北、浙江和广东等）均有报道。该病从每年4月开始，持续至11月，主要流行季节为每年4～5月。当水体温度达到25～28℃、溶氧和透明度降低、水质恶化时，鲈鱼鱼种最易感染和爆发鲈鱼弹状病毒病，进而造成鲈鱼大批死亡。病鱼主要症状是烂身、烂鳍、停止摄食，濒死鱼在水面漫游，严重者体色发黑。解剖病鱼可见肝脏严重肿大、充血；脾脏肿大、充血；肾脏肿大等。

MSRV基因组主要编码5个结构蛋白，分别为核蛋白（nucleoprotein N）、磷蛋白（phosphoprotein P）、基质（matrix M）蛋白、糖蛋白（glycoprotein G）以及RNA聚合酶（RNApolymerise L）。G蛋白即糖蛋白，主要负责与宿主细胞受体的结合，是病毒的主要抗原蛋白。根据推导的氨基酸序列推测，G蛋白与其他弹状病毒相似，呈典型的跨膜蛋白，在氨基端有一段疏水性的信号肽，切除信号肽后组成成熟的糖蛋白。亲水性分析，G蛋白含有两个疏水性区域，分别构成信号肽和跨膜区域。G蛋白在病毒表面形成三聚体状的囊膜粒子，与细胞上的受体结合，介导病毒的内吞作用。G蛋白作为病毒最主要的抗原，诱导机体产生中和抗体并刺激细胞免疫，决定了病毒的血清学特征。在研究较为成熟的弹状病毒的研究中发现，M蛋白分子分布于囊膜和核衣壳之间的空隙里，在维持病毒内外两部分连接的稳定结构方面起关键作用，M蛋白与G蛋白的相互作用能够决定弹状外形的组装及病毒的出芽成熟；在基因调控、致病性中也发挥重要作用，且M蛋白中也存在抗原表位，与机体的免疫应答有关。

目前，MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式。如上所述疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上已有报道，但尚无MSRV亚单位疫苗面市。基于G蛋白的亚单位疫苗的专利申请（ZL202111066165.5），而进一步研发出安全高效的针对MSRV的亚单位疫苗，才能解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展。

发明内容

为解决以上技术问题，在前期G蛋白重组疫苗研究的基础上，进一步研究鲈鱼弹状亚单位疫苗的其他可能性，以丰富鲈鱼弹状亚单位疫苗，探索更为有效的免疫方案。本发明旨在提供一种包含M蛋白和G蛋白主要抗原表位的G2-2M重组蛋白为抗原的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗具有良好的免疫原性，具有相对较长的免疫保护期和较高的免疫保护力。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗由G2-2M重组蛋白和氧化单壁碳纳米管制备而成，所述G2-2M重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：4。

所述疫苗中G2-2M重组蛋白浓度为5mg/mL。

所述的鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，重组G2-2M蛋白的制备和纯化；

步骤二，碳纳米管载体亚单位疫苗的制备：将G2-2M重组蛋白与氧化单壁碳纳米管混合反应，离心后取沉淀溶解，重新溶解沉淀制备得到蛋白混悬液，加入甲醛灭活；

步骤三，乳化：将蛋白混悬液和丙三醇按比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成疫苗；

步骤四，分装：定量分装，轧盖，贴标。

所述步骤二中碳纳米管载体亚单位疫苗的制备包括如下步骤：取酸化的单壁碳纳米管样品0.5g加入到400mL 0.1M，pH=5.6的2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中并40KHz，500W条件下超声处理2h得混合物，然后向混合物中加入4g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和3.5g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并40KHz，500W条件下超声处理2h，然后于6000rpm条件下离心8min，去上清，沉淀加入到300mL pH=7.4的PBS缓冲液中进行超声混合，均匀后向PBS缓冲液中再加入1g G2-2M蛋白，先超声处理2h，再室温搅拌48h；搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析48h，透析完的产物于3000rpm离心20min，沉淀即为单壁碳纳米管载G2-2M抗原蛋白复合物SWCNT-G2-2M，于30-45℃下真空干燥后4℃，即得碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，低温保存；按50mg固体沉淀加入1ml PBS的比例混合，制成蛋白混悬液置于-15℃以下保存；向蛋白混悬液中加入甲醛至终浓度0.07%，2～8℃灭活72小时。

所述乳化为：按蛋白混悬液与丙三醇按照体积比2∶3的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/mL的疫苗。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

首先，本发明先期研究的基础上，在有效的免疫蛋白G2蛋白的基础上，通过柔性接头GGGGS将弹状病毒G蛋白的G2蛋白片段与M蛋白的部分蛋白片段进行连接，且具体采用G2-GGGGSGGGGS-M-GGGGS-M的结构形式，即G2蛋白片段与M蛋白片段的摩尔比为1:2，其与弹状病毒囊膜表面M蛋白丰度相对较高的情形相似，能够更好的贴近病毒感染的过程，提高免疫保护性能。

其次，基于动物试验表明，G2-2M重组蛋白相比G2重组蛋白浸浴免疫能够产生更高滴度的中和抗体水平，在免疫后第7天，G2-2M重组蛋白免疫组能产生1:80的中和抗体滴度，相比而言是G2重组蛋白免疫组的两倍，且在第21天， G2-2M重组蛋白免疫组免疫所产生的中和抗体滴度高达1:160，而G2重组蛋白免疫组仅为1:120。基于以上试验结果表明，本发明选取G蛋白的G2蛋白片段及M蛋白的部分蛋白片段连接后，相对于仅选用G2蛋白片段具有更好的免疫原性，能够刺激机体产生更高的中和抗体水平，对于MSRV的预防具有积极的意义。

在构建的碳纳米管载疫苗系统的基础上，本发明构建了基于碳纳米管的G2-2M重组蛋白亚单位疫苗，其相比浸浴免疫后，鱼群的保护率达到94%左右，高于G2蛋白片段，接近于我公司原有G2亚单位疫苗，且基于M蛋白片段的引入，提高了重组蛋白的免疫原性和保护效力，其相比在先研究，不需要在进行甘露糖化修饰，生产工艺极大地简化，且生产成本也大幅降低，对渔业可持续发展和水产品食品安全生产具有重要意义。

附图说明

图1：重组质粒pET32a-G2-2M的鉴定。图1中，标记M表示Maker DL 5000；标记1表示目的基因G2-2M的PCR产物；标记2表示重组质粒pET32a-G2-2M的双酶切鉴定。

图2：MSRV-G2-2M重组蛋白的表达SDS-PAGE鉴定。图2中，标记M：Maker；标记1表示未诱导的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物；标记2表示诱导后的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物。

图3：MSRV-G2-2M重组蛋白的WB鉴定。图3中，标记M表示Maker；标记1表示未诱导的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物；标记2表示诱导后的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物。

图4：浸浴免疫后的中和抗体滴度测定结果。

图5：G2和G2-2M重组蛋白亚单位疫苗的免疫后的抗体水平检测结果。

图6：G2和G2-2M重组蛋白亚单位疫苗的免疫后的存活率。

具体实施方式

实施例1

本实施例阐述重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的构建和鉴定。

基因片段和M基因片段的扩增

在前期研究和生物信息学分析的基础上，结合其他弹状病毒的研究，选取了核苷酸序列为SEQ ID No：1的G2基因片段以及核苷酸序列为SEQ ID No：2的M基因片段，设计引物，分别扩增得到相应的基因片段，纯化后分别与pMD19-T载体连接，将重组产物命名为pMD19-T-G2和pMD19-T-M。将重组质粒分别转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定。

重组质粒pET32a-G2-2M的构建、转化与筛选

将重组质粒pMD19-T-G2和pMD19-T-M交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并基于over-lap PCR技术合成序列为SEQ ID No：3的重组核苷酸序列（G2-2M），该重组核苷酸序列的结构为5’-G2-linker1（GGGGSGGGGS）-M-linker2（GGGGS）-M-3’，将该序列克隆到pET-32a表达载体上相应的酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-G2-2M，其表达得到氨基酸序列为SEQ ID No：4的G2-2M重组蛋白。

将重组质粒pET32a-G2-2M转化至E. coli BL21（DE3）中，涂布含有氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行针对G2的菌落PCR检测鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图1所示，与预期的片段大小相符的菌落为重组菌E. coli BL21/ pET 32a-G2-2M。

重组质粒pET32a-G2-2M的鉴定

将菌落PCR阳性的菌落接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、以180r/min培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μL质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μL限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，经过酶切得到约900bp的目标基因G2-2M。

实施例2

本实施例阐述MSRV-G2-2M重组蛋白的表达与纯化。

重组菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M的诱导表达

将生产用菌种E. coli BL21/pET32a-G2-2M用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养16-18小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养12～16小时作为一级种子。将一级种子以1%（V/V）接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养14～16小时作为二级种子。将二级种子按1%（V/V）接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL。37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD₆₀₀值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。

菌液处理与超声破碎

发酵产物经管式离心机8000r/min室温离心，收集菌体，用PBS（0.015mol/L，pH7.2）洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液（0.015mol/L，pH7.2）按照质量体积比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀。

蛋白的纯化

按每克蛋白沉淀用10mL平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30分钟，收集上清。用所述平衡缓冲液充分平衡金属（镍Ni^2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20 mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化好的200ml蛋白置于SnakeSkin™透析袋（10K MWCO），直接完全浸入到10L的复性液中（150mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1M L-半胱氨酸，3mM还原型和1mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9）中，4℃透析12h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。

内毒素去除

向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述方法重复处理三次。

重组蛋白的检测

SDS-PAGE检测：向破菌后上清及重悬沉淀后溶液加入等体积的2×凝胶上样缓冲液，另取不经超声波破碎，直接加入等体积的2×凝胶上样缓冲液。煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为15%。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止。同时设立不加IPTG诱导的E. coli BL21/pET32a-G2-2M培养物作为对照。结果如图2所示。

鉴定：先将重组蛋白作SDS-PAGE电泳，方法同上。电泳结束后，取一片胶片置于转膜仪上，200mA条件下转膜1小时。将载有蛋白的PVDF膜置于塑料洗盒中，加入25mL的5%脱脂乳在室温下封闭2小时，倒掉脱脂乳，用TBST洗3次后，加入30mL一抗鼠源组氨酸单克隆抗体（抗体稀释液稀释，比例1∶1000），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉一抗，用TBST洗5次后，加入30mL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（抗体稀释液稀释，比例1∶2000稀释），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉二抗，用TBST洗5次后，将膜放入平皿中，置于暗室。先加入1mL去离子水，再加入DAB显色液（A液和B液各1滴），用移液器反复冲洗膜表面1分钟，至显色完全后，用去离子水冲洗、晾干、成像，显色后在约30KDa有特异性条带，表明样品中存在表达正确的G2-2M蛋白。结果如图3所示。

实施例3

本实施例阐述重组蛋白的免疫效力评价。

重组蛋白浸浴免疫试验

取3～5g健康鲈鱼300尾，分为免疫1组、免疫2组和对照组，每组100尾。免疫1组和免疫2组分别采用G2重组蛋白溶液（20mg/L，基于ZL202111066165.5制备得到）和G2-2M重组蛋白组溶液（20mg/L）进行浸浴处理，对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体。

血清中和抗体效价的测定

分别在免疫后的第3、7、14、21、28d随机从各组中随机选取3条鲈鱼，抽血并分离血清，混合后于-80℃保存，用于抗体中和效价的测定。

血清中和抗体效价的测定方法

（1）采用无血清的M199培养基对血清进行从1:5倍比稀释至1:640，得到试验用血清。

（2）用无血清的M199培养液将FJ985株病毒液稀释为100TCID₅₀/0.1mL，与等量鲈鱼弹状病毒特异性阳性血清混合，置37℃作用1小时，接种于已长成良好单层的CO细胞的96孔板，200μL/孔，分别接种4个孔，同时设阴性血清对照、正常细胞对照和未中和病毒对照，置25℃、含5% CO₂培养箱中培养3日，观察是否出现CPE，以不产生CPE的最高血清稀释度数为该血清的中和抗体滴度。

中和抗体效价的测定结果

在免疫后的3、7、14、21、28d分别对各组鲈鱼进行血清中和抗体效价测定，结果如图4所示，鲈鱼在浸浴免疫后，免疫1组和免疫2组均产生特异性抗体，而对照组未能产生特异性抗体。相比而言，免疫2组（G2-2M）相比免疫1组（G2）能够产生更高滴度的中和抗体水平，在免疫第3天，两组的中和抗体水平接近，而在免疫后第7天，G2-2M免疫组能产生1:80的中和抗体滴度，相比而言是G2蛋白组的两倍，且在第21天，两组均达到最高的平均中和抗体滴度，G2-2M蛋白免疫所产生的中和抗体滴度高达1:160，而G2蛋白组仅为1:120。基于以上试验结果表明，本发明选取G蛋白的G2蛋白片段及M蛋白的部分蛋白片段连接后，相对于仅选用G2蛋白片段具有更好的免疫原性，能够刺激机体产生更高的中和抗体水平，对于MSRV的预防具有积极的意义。

攻毒试验

从以上对照组、免疫1组和免疫2组的鲈鱼中，随机选取50尾，分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μL（病毒含量为100TCID₅₀/mL）/尾。攻毒后连续观察14日，计算各组攻毒后的存活率，其中对照组的存活率为2/50，免疫1组的存活率为32/50，免疫2组的存活率为40/50，可见，本发明所制备得到的G2-2M重组蛋白浸浴免疫处理，相比G2重组蛋白具有更好的保护效力。

实施例4

本实施例阐述亚单位疫苗的制备。

单壁碳纳米管功能化修饰

采用混酸氧化法对单壁碳纳米管进行结构修饰，步骤如下：

（1）将2g单壁碳纳米管样品放入150mL浓H₂SO₄和50mL浓HNO₃中，常温条件下置于磁力搅拌器100rpm搅拌48h；

（2）将上一步获得的碳纳米管混酸混合物用循环水式真空泵进行抽滤，用纯水洗至液体的pH=7.4，然后置于60℃条件下烘干，在研钵中研磨成粉末状，过300目的筛子，所得产物即为功能化单壁碳纳米管（o-SWCNTs）。

碳纳米管载体亚单位疫苗的制备

取酸化的单壁碳纳米管样品（0.5g）加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中（0.1M，pH=5.6，400mL）并超声（40KHz，500W）处理2h得混合物，然后向混合物中加入4g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和3.5g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并超声（40KHz，500W）处理2h，然后于6000rpm条件下离心8min，去上清，沉淀加入到PBS缓冲液中（pH=7.4，300mL）进行超声（40KHz，500W）混合，均匀后向PBS缓冲液中再加入1g G2-2M蛋白，先超声（40KHz，500W）处理2h，再室温搅拌48h。搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析48h，透析完的产物于3000rpm离心20min，沉淀即为单壁碳纳米管载G2-2M抗原蛋白复合物（SWCNT-G2-2M），于30-45℃下真空干燥后4℃，即得碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，低温保存。

将碳纳米管载体亚单位疫苗干粉配成1mg/mL的溶液，通过BCA蛋白检测试剂盒新型蛋白含量测定，计算疫苗系统中抗原蛋白的含量。

半成品的配制

按50mg干燥的固体沉淀加入1mL PBS的比例混合，制成蛋白混悬液置于-15℃以下保存。

蛋白灭活：向蛋白混悬液中加入甲醛至终浓度0.07%，2～8℃灭活72小时。

半成品检验

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

内毒素检测按现行《中国兽药典》一部附录进行检验，每毫升半成品内毒素含量应≤5000EU。

疫苗制备

乳化：按蛋白混悬液∶丙三醇=2∶3（V/V）的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/mL的疫苗。

分装：定量分装，轧盖，贴标。

实施例5

本实施例阐述亚单位疫苗的安全检验和免疫效力评价

浸浴用亚单位疫苗的配制：采用生理盐水溶解碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，使得其中抗原蛋白的浓度为5mg/mL，即得到亚单位疫苗工作液。

安全检验：取0.5～1g（60日龄以上）健康鲈鱼200尾，分为免疫组和对照组，每组100尾。免疫组采用亚单位疫苗工作液的稀释液进行免疫，免疫剂量为2ml/L，对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体，连续观察14日，结果表明，免疫组合对照组的鲈鱼全部健活，且试验期间摄食、游动、精神状态均正常，无临床不良反应。

效力检验-血清学评价

采用实施例4的方法制备得到基于G2重组蛋白片段的碳纳米管载体亚单位疫苗工作液（抗原蛋白G2的浓度为5mg/mL）作为对照。采用如下免疫效力评价试验：取健康鲈鱼300尾，随机分为3组，包括对照组（生理盐水）、G2-2M重组蛋白亚单位疫苗组，G2重组蛋白亚单位疫苗组，免疫组采用亚单位疫苗工作液的稀释液进行免疫，免疫剂量为1ml/L，对照组用生理盐水代替疫苗，所有鲈鱼均通过浴液接种相应的疫苗，浸泡6小时。随后，接种疫苗的鲈鱼被转移到不同的水箱中，并每天进行监测。在每一组中，每周一次随机选择三条鱼进行取样测试和制备血浆，持续到第四周，使用前血浆储存在−20°C，以含3%脱脂牛奶的PBS稀释的血清作为一级抗体，37℃孵育约1.5小时。然后，以纯化的G蛋白（含his-tag）作为抗原检测其中抗G蛋白的抗体浓度，随后，用1:1500稀释的抗His标记抗体和山羊-小鼠IgG抗体，以TMB为比色底物，测定OD₄₅₀，分析血清中的平均抗体水平。具体结果如图5所示。基于图5的结果可知，采用亚单位疫苗进行浸浴，G2亚单位疫苗在早期产生的抗G蛋白的抗体浓度相比G2-2M更高，其是基于G2亚单位疫苗相比G2-2M具有更高的G蛋白浓度，然而，在接种后第21天，G2-2M重组蛋白亚单位疫苗的抗体浓度与G2重组蛋白亚单位疫苗的抗体浓度均达到最高值，且抗体水平接近。

效力检验-免疫攻毒保护：

在以上“效力检验-血清学评价”进行到第21天时，随机从各组中选取健活的鱼苗50尾，分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μL（病毒含量为100TCID₅₀/mL）/尾。攻毒后连续观察14日，定时检查、记录发病和死亡情况，计算得到攻毒后的存活率，经计算，结果如图6所示，其中G2疫苗组的存活率为84%，G2-2M亚单位苗组存活率最高，达到94%，与我公司先期研发的G2蛋白鱼苗的存活率（94-96%，ZL202111066165.5）接近，而相比ZL202111066165.5，本发明的G2-2M蛋白无需经糖基化处理，其制备工艺更为简单，生产成本也降低。

由此可见，本发明在G2蛋白片段的基础上连接了MRSV的M蛋白中的主要抗原表位片段，其更好地模拟了病毒粒子的蛋白结构，能够刺激机体产生除G2蛋白之外的抗体，对于病毒具有更好的预防效果，能够减少病毒感染早期动物的死亡率，进一步提高鲈鱼攻毒的存活率，相比本公司研发的G2蛋白亚单位疫苗，取得了本领域技术人员所不可预期的保护效果。

以上记载的仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依据本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 深圳万可森生物科技有限公司

<120> 一种鲈鱼弹状病毒G2-2M亚单位疫苗及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 1

atgaactgtg gatggaataa cgtgttgact gagtcccaag aattcaccac tttgacttca 60

caccctgtta aattggatgc ctactctttc atattaattg acagcatgtt tgagggagga 120

cggtgtcaat caaaagagtg tcctgtggtg ttccatcaag ggatgtggat tgctgatcaa 180

gaagctttcg gattttgcaa agacttggac aaacacaggg gactactttt caaaactgga 240

ttgaggaatt cactgggaga aattgtcaga caagagtgga atctgaattc ggtattccag 300

ccagagatag gaagggaaaa acatttcaag ggtgcctgta aaatgtcgta ctgcgggaat 360

tcaggggtta gattttctga tagagagtgg tttcaattgg gtacgccgtc agacaattga 420

<210> 2

<211> 432

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 2

atgaaaaaaa ctttaacaga tatcatagaa tatccacgaa agatgcctct gtttaagaag 60

agcaacaaga agtcggctat tacgccatat caagcacctc cgccatactc ggcaaccgca 120

ctcactccga gtgctccgat ggccctgcct gacagtgact acggaatcaa aacaatgatg 180

gtggagttgg acttcaagat catatccagc atcgagatga aaaaaacttt aacagatatc 240

atagaatatc cacgaaagat gcctctgttt aagaagagca acaagaagtc ggctattacg 300

ccatatcaag cacctccgcc atactcggca accgcactca ctccgagtgc tccgatggcc 360

ctgcctgaca gtgactacgg aatcaaaaca atgatggtgg agttggactt caagatcata 420

tccagcatcg ag 432

<210> 3

<211> 903

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 3

ccatggactg tggatggaat aacgtgttga ctgagtccca agaattcacc actttgactt 60

cacaccctgt taaattggat gcctactctt tcatattaat tgacagcatg tttgagggag 120

gacggtgtca atcaaaagag tgtcctgtgg tgttccatca agggatgtgg attgctgatc 180

aagaagcttt cggattttgc aaagacttgg acaaacacag gggactactt ttcaaaactg 240

gattgaggaa ttcactggga gaaattgtca gacaagagtg gaatctgaat tcggtattcc 300

agccagagat aggaagggaa aaacatttca agggtgcctg taaaatgtcg tactgcggga 360

attcaggggt tagattttct gatagagagt ggtttcaatt gggtacgccg tcagacaatg 420

gaggtggagg atcaggaggt ggaggatcaa tgaaaaaaac tttaacagat atcatagaat 480

atccacgaaa gatgcctctg tttaagaaga gcaacaagaa gtcggctatt acgccatatc 540

aagcacctcc gccatactcg gcaaccgcac tcactccgag tgctccgatg gccctgcctg 600

acagtgacta cggaatcaaa acaatgatgg tggagttgga cttcaagatc atatccagca 660

tcgagggagg tggaggatca atgaaaaaaa ctttaacaga tatcatagaa tatccacgaa 720

agatgcctct gtttaagaag agcaacaaga agtcggctat tacgccatat caagcacctc 780

cgccatactc ggcaaccgca ctcactccga gtgctccgat ggccctgcct gacagtgact 840

acggaatcaa aacaatgatg gtggagttgg acttcaagat catatccagc atcgagggag 900

ctc 903

<210> 4

<211> 300

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 4

Met Asp Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu

20 25 30

Ile Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro

35 40 45

Val Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly

50 55 60

Phe Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly

65 70 75 80

Leu Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn

85 90 95

Ser Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala

100 105 110

Cys Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg

115 120 125

Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Lys Thr Leu Thr Asp Ile Ile Glu Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Lys Met Pro Leu Phe Lys Lys Ser Asn Lys Lys Ser Ala Ile

165 170 175

Thr Pro Tyr Gln Ala Pro Pro Pro Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Thr Pro

180 185 190

Ser Ala Pro Met Ala Leu Pro Asp Ser Asp Tyr Gly Ile Lys Thr Met

195 200 205

Met Val Glu Leu Asp Phe Lys Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Met Lys Lys Thr Leu Thr Asp Ile Ile Glu Tyr Pro Arg Lys

225 230 235 240

Met Pro Leu Phe Lys Lys Ser Asn Lys Lys Ser Ala Ile Thr Pro Tyr

245 250 255

Gln Ala Pro Pro Pro Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Thr Pro Ser Ala Pro

260 265 270

Met Ala Leu Pro Asp Ser Asp Tyr Gly Ile Lys Thr Met Met Val Glu

275 280 285

Leu Asp Phe Lys Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gly Ala

290 295 300

Claims

1.一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗由G2-2M重组蛋白和氧化单壁碳纳米管制备而成，所述G2-2M重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：4。

2.根据权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中G2-2M重组蛋白浓度为5mg/mL。

3.一种制备权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，重组G2-2M蛋白的制备和纯化；

步骤四，分装：定量分装，轧盖，贴标。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤二中碳纳米管载体亚单位疫苗的制备包括如下步骤：取酸化的单壁碳纳米管样品0.5g加入到400mL 0.1M，pH=5.6的2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中并40KHz，500W条件下超声处理2h得混合物，然后向混合物中加入4g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和3.5g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并40KHz，500W条件下超声处理2h，然后于6000rpm条件下离心8min，去上清，沉淀加入到300mL pH=7.4的PBS缓冲液中进行超声混合，均匀后向PBS缓冲液中再加入1g G2-2M蛋白，先超声处理2h，再室温搅拌48h；搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析48h，透析完的产物于3000rpm离心20min，沉淀即为单壁碳纳米管载G2-2M抗原蛋白复合物SWCNT-G2-2M，于30-45℃下真空干燥后4℃，即得碳纳米管载体亚单位疫苗干粉，低温保存；按50mg固体沉淀加入1mL PBS的比例混合，制成蛋白混悬液置于-15℃以下保存；向蛋白混悬液中加入甲醛至终浓度0.07%，2～8℃灭活72小时。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳化的方法为：蛋白混悬液与丙三醇按照体积比2∶3的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/mL的疫苗。