CN111733177A - 一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法，为了构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗，我们根据已发表的该菌的外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR技术，扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因，并插入到真核表达载体pcDNA3上，构建成DNA疫苗，命名为pcDNA3‑POMP；以纯化的原核表达蛋白GST‑POMP免疫SD大鼠制备抗血清，用ELISA测定了抗体效价达到1：100000以上；用pcDNA3‑POMP质粒转染293细胞，转染48小时后收集细胞，提取细胞的RNA进行RT‑PCR，检测到外源基因的表达。至此，初步完成了嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建，为进一步的疫苗免疫和效价检测奠定了基础。

Description

一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物抗体的领域，具体涉及一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是重要的人畜、水生生物共患病的致病菌，是引起欧洲鳗鲡暴发性败血症的主要病原菌之一；目前已经报道的嗜水气单胞菌疫苗包括：全菌灭活苗，菌体成分亚单位苗，减毒活疫苗；嗜水气单胞菌血清型很多，全菌灭活疫苗只对相同血清型的菌株攻击具免疫力；而且嗜水气单胞菌抗原结构复杂，全菌苗经灭活后抗原性常发生变异；全菌苗颗粒大，它被吸收的可能性也小于亚单位苗[1]；
DNA疫苗是将含有编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的；DNA疫苗具有许多优点，例如设计操作简便，生产成本低，便于运输和保存，安全性高，可以不加佐剂，使用方便等等，使得DNA疫苗受到越来越多的重视，被称为第3代疫苗[2]；
第一个鱼类DNA疫苗是1996年，Anderson等[3]报告了带有(infectioushematopoietic necrosis virus)IHNV糖蛋白基因的质粒能够在rainbow trout虹鳟肌肉组织中表达，并且该DNA疫苗能够保护免疫鱼抵抗IHNV病毒的感染[4]；此后的一些实验证明，在多种鱼体内，外源基因不仅能够高效、持久地表达，而且能够引起宿主鱼类对外源蛋白的免疫应答:例如虹鳟鱼DNA疫苗的攻毒实验中，Lorenzen等[5]构建了带有VHSV(Viralhemorrhagic septicemia virus)病毒G蛋白基因的DNA疫苗，可以达到78％的保护率；Pasnik[6]等构建了海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)分泌性fibronectin结合蛋白的DNA疫苗，在银花鲈鱼(Stiped bass)中50g的注射量可以达到90％的保护率；2004年Mikalsen等[7]用IPNV(infectious pancreatic necrosis virus)的VP2基因DNA疫苗25g免疫大西洋鲑鱼(Salmo salar)可以获得84％的保护率；
外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构；气单胞属细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发宿主产生体液免疫，也能诱导细胞介导的免疫；而且，由外膜蛋白诱导产生的免疫力对其它血清型的嗜水气单胞菌具有交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原；
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法；选择嗜水气单胞菌的外膜蛋白基因momp为研究对象，构建其DNA疫苗质粒，在293细胞上进行真核转染并检测了外源基因的表达，为进一步研究该疫苗在鱼体上的免疫反应机制，考察疫苗的保护效果奠定基础；
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，包括以下制备方法：
(1)PCR扩增：根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因，辅用分子生物学引物设计软件DNAMAN V6设计了一对PCR引物；上游引物为POMP–F(HindIII)：5‘-CCCAAGCTTATGATGAAAATGGCTCCTT；下游引物为POMP-R(XhoI)：5’-CCGCTCGAGTTACTTCTGAACTTCTTGTAC；
(2)目的片段的克隆：应用PCR回收试剂盒回收1kb左右的目的片段和pcDNA3.0连接，KCM法转化法转化大肠杆菌DH5α，在含AMP的LB平板上涂布进行初步筛选，挑取单菌落提取重组质粒，用PCR和HindIII/XhoI双酶切进行鉴定，阳性重组质粒命名为pcDNA3-POMP；
(3)momp基因的原核表达和纯化：用pGEX-4T-1-POMP质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导4h后用冰PBS洗涤2次，400W超声，12000r·min离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳；
将得到的沉淀用10mLPBS重悬，12000r·min离心20min，弃上清；在沉淀中加10mLSTE，100μL浓度为0.1mM的PMSF，50μL 1M DTT，1.5mL 10％Sarkosyl，超声12sec×25次400W，每次暂停40s，离心保留上清；上清中加入Triton至3％，4℃在旋转仪混合3h；用Glutathione Sepharose 4B进行纯化。
进一步的，所述步骤(1)的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的序列号AF146597；
进一步的，所述步骤(1)的所述反应体系为：反应总体积25μL：ddH2O 15.5μL、10×PCR buffer 2.5μL，上、下游引物浓度为10μmol·L-1各1μL、dNTP浓度为2mmol·L-1的2.5μL、Taq酶的浓度为5U的0.5μL，模板DNA 1μL；反应条件：预变性94℃7min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃补平10min；1％琼脂糖上恒压60V电泳约1h，紫外灯下观察结果，自动凝胶成像扫描仪拍照及处理；
进一步的，所述步骤(1)中PCR buffer内含1.0mmol·L-1MgCl2。
进一步的，所述步骤(3)中IPTG的浓度为0.5mM。
进一步的，步骤(3)中超声工作10sec/间隔，15sec/30个循环。
进一步的，所述步骤(3)中PBS缓冲溶液为138mmol·L-1NaCl，2.7mmol·L-1
KCl，10mmol·L-1Na2HPO4，1.8mmol·L-1KH2PO4。
本发明还包括一种上述方法制备的卵黄抗体。
附图说明
图1为本发明为嗜水气单胞菌外膜蛋白基因(1035bp)；2为嗜水气单胞菌粘附素基因(1074bp)；M为DL2000DNA marker；
图2为本发明重组质粒的酶切鉴定；
图3为融合蛋白的原核表达；
图4为293细胞转染48小时后荧光蛋白表达结果；
图5为RT-PCR检测293细胞中外源基因momp的表达
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定；
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；若未特别指明，
实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料若无特殊标明均为分析纯；
实施案例一
1.1菌株和载体
嗜水气单胞菌L316由本实验室于2001年3月16日从从福建省长乐患病欧鳗肝脏分、离鉴定，E.coli DH5α、BL21(本室保存)，pGEX-4T-1载体(Amersham，GE)、pcDNA3.0(Invitrogen)。
1.2主要试剂
dNTP，Taq酶、限制性内切酶，PCR产物回收试剂盒，IPTG(上海生工生物有限公司)，LB培养基(Sigma)，PCR引物由TAKARA公司合成，Glutathione Sepharose 4B(AmershamPharmacia Biotech)，HRP-标记山羊抗大鼠抗体、显影液、定影液购自碧云天生物技术有限公司，ECL荧光底物(GE)。
1.3 PCR扩增
根据GenBank中发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因(序列号AF146597)，辅用分子生物学引物设计软件DNAMAN V6设计了一对PCR引物。上游引物POMP–F(HindIII)：5‘-CCCAAGCTTATGATGAAAATGGCTCCTT；下游引物POMP-R(XhoI)：5’-CCGCTCGAGTTACTTCTGAACTTCTTGTAC。
反应体系：反应总体积25μL：ddH2O 15.5μL，10×PCRbuffer(内含1.0mmol·L- 1MgCl2)2.5μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各1μL，，dNTP(2mmol·L-1)2.5μL，Taq酶(5U)0.5μL，模板DNA 1μL。反应条件：预变性94℃7min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃补平10min。1％琼脂糖上恒压60V电泳约1h，紫外灯下观察结果，自动凝胶成像扫描仪FR-980A(复日科技)拍照及处理。
1.4目的片段的克隆
应用PCR回收试剂盒回收1kb左右的目的片段和pcDNA3.0连接，KCM法转化法转化大肠杆菌DH5α,在含AMP的LB平板上涂布进行初步筛选，挑取单菌落提取重组质粒，用PCR和HindIII/XhoI双酶切进行鉴定，阳性重组质粒命名为pcDNA3-POMP。将阳性重组质粒送至TAKARA公司测序。
1.5 momp基因的原核表达和纯化
用pGEX-4T-1-POMP质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG(0.5mM)诱导4h后用冰PBS洗涤2次，400W超声(工作10sec/间隔15sec/30个循环)，12000r·min离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。
将得到的沉淀(包涵体蛋白)用10mLPBS(138mmol·L-1NaCl,2.7mmol·L-1KCl,10mmol·L-1Na2HPO4,1.8mmol·L-1KH2PO)(按250ml菌液计算)重悬，12000r·min离心20min，弃上清。在沉淀中加10mLSTE，100μL PMSF(0.1mM)，50μL 1M DTT，1.5mL 10％Sarkosyl，超声12sec×25次400W，每次暂停40s，离心保留上清。上清中加入Triton至3％，4℃在旋转仪混合3h。用Glutathione Sepharose 4B进行纯化。
1.6大鼠抗血清的制备
SPF级SD大鼠3只一组，每只免疫纯化的融合蛋白150μg，加入等体积的完全弗氏佐剂搅拌至油包水状态，采用背部皮下多点注射，并采集免疫前血清作为对照。第二次、第三次免疫相同剂量的纯化蛋白，以不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂，每次免疫间隔2周。最后加强免疫一次，抗原量减半，一周后腹腔动脉采血，用ELISA方法检测血清效价。
1.7真核细胞转染(脂质体法)
转染前一天，用胰蛋白酶进行消化以收获对数期生长的细胞，计数，以0.5×106～1.0×106重新接种于6孔板中培养过夜至细胞达到90％～95％汇合时，进行转染。转染前将培养基换成不含抗生素的培养基。在两个无菌的1.5mL离心管中各加入250μL不含血清和抗生素的DMEM培养液。在其中一个加入1μg质粒DNA，另一个加入3μL LIPOFECTAMINETM 2000(Invitrogen)，单独混匀后室温放置约3min后，将两管溶液混合，室温放置20min。将混合液加入培养板中的一个孔。37℃、5％CO2孵箱中培养24～48h。
实验结果
2.1 PCR扩增和重组质粒的鉴定
以实验室原有质粒为模板用PCR方法扩增出约1.1kb的DNA片段，与预期扩增的目的片段大小相符合(图1)。将回收目的DNA片段插入到pcDNA3.0载体上，构建了重组质粒。重组质粒经酶切鉴定证实含有正确的插入DNA片段，后挑阳性克隆送TAKARA公司测序。酶切验证结果见图2。注：图1中(1为嗜水气单胞菌外膜蛋白基因(1035bp)；2为嗜水气单胞菌粘附素基因(1074bp)；M为DL2000DNAmarker)图2中1-4为重组质粒；M为DNA marker。
2.2融合蛋白的表达
pGEX-4T-1-POMP/BL21经IPTG(0.5mM)诱导后表达的融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，融合蛋白的分子量约为52kDa，如图3所示。注：M为蛋白质marker；1为pET32a-OMPK/BL21诱导上清；2为pET32a-OMPK/BL21诱导沉淀；3为pGEX-4T-1-POMP/BL21诱导上清；4为pGEX-4T-1-POMP/BL21诱导沉淀；5为pET32a-OMPU/BL21诱导上清；6为pET32a-OMPU/BL21诱导沉淀
2.3大鼠抗血清的制备及效价测定
3只SD大鼠共采集到约15mL抗血清，ELISA方法测定抗体效价在1：100000以上。
表1.ELISA测定抗体滴度(λ＝490nm)
Figure BDA0002546147630000061
2.4momp的真核表达及检测
pcDNA3-POMP质粒和表达绿色荧光的pEGFP-N1质粒以10：1的比例混合后共转染293细胞，转染后48小时在倒置荧光显微镜下观察到大量荧光蛋白的表达(90％以上)，说明转染效率比较高(图4)。注：A为484nm激发光下EGFP的表达情况；B为与A图同一视野白光下的细胞形态。
2.5收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR检测，结果可以清晰地看到特异性的扩增片段，而转染pcDNA3空载体的样品未见目的条带(图5)，说明外源基因在转染的293细胞中有表达。293细胞内源性β-actin作为内参。M为DNA marker；1为pcDNA3-POMP质粒(阳性对照)；2为pcDNA3-POMP转染239细胞；3为pcDNA3空载转染293细胞
作为新一代疫苗，DNA疫苗具有许多优点：除了设计操作简便，生产成本较低，分子稳定，便于运输和保存等之外，它比传统疫苗更安全，不存在像减毒疫苗那样毒力回升的危险。而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，容易出现表位丢失。并且，在质粒中可以添加CpG序列作为佐剂，或者是共同表达细胞因子，在使用DNA疫苗时不必额外添加佐剂，既降低成本又方便使用。
细菌的外膜蛋白包括外膜A蛋白(OmpA),微孔蛋白(Porins)，脂蛋白(Lpp)等[10]。本研究组从福建省某鳗场患爆发性败血症病鳗上分离到的菌株嗜水气单胞菌AHL316，其外膜蛋白MOMP是属于ompA蛋白家族。该蛋白起始位点的前24个氨基酸区域构成信号肽，具有跨膜区，体现了典型的外膜蛋白的物理化学性质。并且其表面拥有较多的抗原位点，这些位点与其亲水性位点有较高的相关对应性[11]。
由于细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液免疫而且对细胞免疫亦有刺激作用；而且不同血清型菌株的MOMP具有共同的部分，能够产生强烈的交叉免疫学反应[12]，因此本研究选择了嗜水气单胞菌AHL316的外膜蛋白为候选抗原，试图构建一个适用于多种血清型菌株的DNA疫苗。我们以其基因(序列号AF146597)为模板，应用分子生物学方法将其克隆并连接到真核表达载体pcDNA3上，构建成了嗜水气单胞菌外膜蛋白的DNA疫苗，将质粒命名为pcDNA3-POMP。与此同时，我们在大肠杆菌E.coli中对该基因进行了原核表达，并用纯化蛋白免疫SPF级SD大鼠，制备了抗血清，其效价达到1：100000以上。以pcDNA3-POMP质粒转染293细胞，转染后48小时提取细胞的RNA进行RT-PCR，可以清楚的检测到外源基因的表达，而转染pcDNA3空载体的293细胞样品则未见相应的条带。至此，我们已经成功构建了可用于动物免疫的嗜水气单胞菌外膜蛋白的DNA疫苗质粒，并获得了足够数量的纯化质粒和检测用的抗血清，为下一步的动物实验，研究DNA疫苗的免疫机制以及保护力的检测打下基础。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下制备方法：
（1）PCR扩增：根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因，辅用分子生物学引物设计软件DNAMANV6设计了一对PCR引物；上游引物为POMP–F(HindIII)：5‘-CCCAAGCTTATGATGAAAATGGCTCCTT；下游引物为POMP-R(XhoI)：5’-CCGCTCGAGTTACTTCTGAACTTCTTGTAC；
（2）目的片段的克隆：应用PCR回收试剂盒回收1kb左右的目的片段和pcDNA3.0连接，KCM法转化法转化大肠杆菌DH5α，在含AMP的LB平板上涂布进行初步筛选，挑取单菌落提取重组质粒，用PCR和HindIII/ XhoI双酶切进行鉴定，阳性重组质粒命名为pcDNA3-POMP；
（3）momp基因的原核表达和纯化：用pGEX-4T-1-POMP质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导4 h后用冰PBS洗涤2次，400 W超声，12000 r·min离心10 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳；
将得到的沉淀用10 mLPBS 重悬，12000 r·min离心20 min，弃上清；在沉淀中加10mLSTE，100μL 浓度为0.1mM的PMSF，50 μL 1M DTT，1.5 mL 10% Sarkosyl，超声12 sec×25次 400 W，每次暂停40 s，离心保留上清；上清中加入Triton至3%，4 ℃在旋转仪混合3h；用Glutathione Sepharose 4B进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的序列号AF146597。
3.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的所述反应体系为：反应总体积25 μL：ddH2O 15.5 μL、10×PCR buffer 2.5 μL，上、下游引物浓度为10 μmol·L-1各1 μL、dNTP 浓度为2mmol·L-1的2.5 μL、Taq酶的浓度为5U的0.5 μL，模板DNA 1μL；反应条件：预变性94℃7 min，94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸 2 min，30个循环，最后72℃补平 10 min；1%琼脂糖上恒压60V电泳约1 h，紫外灯下观察结果，自动凝胶成像扫描仪拍照及处理。
4.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR buffer内含1.0 mmol·L-1 MgCl2。
5.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中IPTG的浓度为0.5 mM。
6.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中超声工作10 sec/间隔，15 sec/30个循环。
7.根据权利要求1所述的一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中PBS缓冲溶液为138 mmol·L-1 NaCl ， 2.7 mmol·L-1KCl， 10 mmol·L-1 Na2HPO4， 1.8 mmol·L-1 KH2PO4。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备的卵黄抗体。
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