KR101756968B1 - 인체감염형 노로바이러스의 감염 또는 비감염성 분별용 바이오마커 - Google Patents

인체감염형 노로바이러스의 감염 또는 비감염성 분별용 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노로바이러스(Norovirus) 동물모델을 이용한 노로바이러스 검출 방법, 노로바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법 및 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 유효성분으로 포함하는 장관 바이러스(enteric virus) 감염 중화(neutralization)용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 노로바이러스 검출 방법은 감염형(infectious) 노로바이러스 및 비감염형(non-infectious) 노로바이러스를 구별할 수 있으며, 상기 조성물은 식중독 바이러스를 중화할 수 있다.

Description

인체감염형 노로바이러스의 감염 또는 비감염성 분별용 바이오마커{Biomarkers for Discriminating Human Infectious Norovirus}
본 발명은 분자 바이오 마커 기반 감염형 바이러스 구별 및 식중독 바이러스 중화 기술에 관한 것이다.
현재 노로바이러스를 배양할 수 있는 세포는 없는 상태이며, 노로바이러스 감염모델로는 침팬지를 이용하는 방법이 있다(Karin Bok et al., Chimpanzees as an animal model for Human norovirus infection and vaccine development. PNAS. 108(1): 325-330. 2011). 그러나 침팬지를 이용하기에는 공간 및 비용이 너무 많이 소모된다는 단점이 있다. 제브라피시(Danio rerio)는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, Burgos, J.S et al., Zebrafish as a new model for herpes simplex virus type 1 infection. Zebrafish 5:323-333. 2008), 간염 C형 바이러스(Cun-Bao Ding et al., Zebrafish as a potential model organism for drug test against hepatitis C virus. PLoS one. 8(6): e22921. 2011), 치큰건야 바이러스(Chikungunya Virus, Nuno Palha et al., Real-time whole-body visualization of Chikungunya virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathog. 9:e1003619. 2013) 등 인간 감염형 바이러스에도 높은 감수성을 보이며, 동물윤리면에서 비교적 까다롭지 않게 실험할 수 있으며, 전체게놈분석이 완료된 최적의 동물모델이다.
또한, 단백체 분석(Proteomic analysis) 기술은 단백질체 빅데이터 분석을 통하여 목적 지향적 바이오마커를 확인을 하는데 유용한 기법이다. 제브라피시를 이용하여 노로바이러스를 감염하여 단백질체 변화를 분석하는 시도가 현재까지 보고된 바 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 비감염형 노로바이러스 및 감염형 노로바이러스를 구별할 수 있는 노로바이러스 검출 방법 및 식중독을 유발하는 장관 바이러스인 노로 바이러스(Norovirus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A Virus) 및 로타 바이러스(Rotavirus)를 중화할 수 있는 천연식물유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 제브라피시(Danio rerio)를 이용한 감염성 노로바이러스 검출 방법 및 장관 바이러스 중화용 조성물를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 노로바이러스 검출 방법를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항바이러스제 스크리닝 방법를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 장관 바이러스(enteric virus) 감염 중화(neutralization)용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 노로바이러스(Norovirus) 동물모델을 이용한 노로바이러스 검출 방법을 제공한다:
(a) 제브라피시(Danio rerio, zebrafish)에 노로바이러스를 투여하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 제브라피시로부터 HSP90α(Heat Shock Protein 90α), HSC71(Heat Shock cognate 71) 및 Tfr-1b(Transferrin receptor-1b)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계
본 발명자들은 비감염형 노로바이러스 및 감염형 노로바이러스를 구별할 수 있는 노로바이러스 검출 방법 및 식중독을 유발하는 장관 바이러스인 노로 바이러스, A형 간염 바이러스(Hepatitis A Virus) 및 로타 바이러스(Rotavirus)를 중화할 수 있는 천연식물유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 제브라피시를 이용한 감염성 노로바이러스 검출 방법 및 장관 바이러스 중화용 조성물를 제조하였다.
본 발명의 노로바이러스 검출 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a): 노로바이러스의 투여
먼저, 제브라피시(Danio rerio)에 노로바이러스를 투여한다.
상기 노로바이러스는 칼리시비리대(Caliciviridae) 과(family)-노로바이러스(Norovirus) 속(genus)의 노로바이러스(Norwalk virus) 종(species)을 의미한다.
상기 노로바이러스는 감염성 노로바이러스 또는 비감염성 노로바이러스이다.
본 발명의 노로바이러스 검출 방법은 감염성 노로바이러스 및 비감염성 노로바이러스를 구별할 수 있다. 즉, 감염성 노로바이러스 및 비감염성 노로바이러스가 혼재된 시료로부터 감염성 노로바이러스의 유무를 검출 할 수 있다.
본 발명의 노로바이러스 검출 방법의 주요한 특징 중 하나는 제브라피시를 이용하는 것이다.
상기 노로바이러스는 현재 배양할 수 없는 세포가 없는 실정으로, 본 발명에서 제브라피시를 이용한 노로바이러스 감염 모델을 최초로 제시한다.
본 명세서에서 용어 “투여”는 노로 바이러스의 투여량을 제프라피시에 주입하는 방법을 의미하며, 상기 방법은 예를 들어 비강, 국소적, 전신적, 흡입, 구강, 정맥내, 피하내, 혈관내, 동맥내, 종양내, 복강내, 뇌실내, 육아종내, 비강, 직장, 인두, 눈, 안구내 또는 근육내 주입이다.
단계 (b): 유전자 또는 단백질의 발현정도 검출
다음, 상기 단계 (a)의 제브라피시로부터 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출한다.
본 발명은 상기 노로바이러스의 감염에 의해 과발현되는 제브라피시 단백질, HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b을 통해 감염형 노로바이러스를 검출한다.
상기 노로 바이러스가 감염된 제브라피시의 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현이 상향-조절(up-regulated)된 경우, 감염형 노로바이러스에 감염된 것으로 판정한다. 반대로, 상기 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현이 대조군(노로바이러스 비감염군)과 비교하여 유사한 정도인 경우에 비감염형 노로바이러스에 감염된 것으로 판정한다.
본 명세서에서 유전자 또는 단백질을 언급하면서 사용되는 용어 “상향-조절”은 조사 대상의 시료(예컨대, 균질화된 제브라피시 조직)에서의 상기 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 노로 바이러스를 감염시키지 않은 조직의 유전자 또는 단백질 발현 정도와 비교하여 높은 경우를 의미한다.
본 발명의 노로 바이러스 감염을 판정하는 데 있어서, 상기 상향-조절은 1.1배 이상, 1.3배 이상 또는 1.5배 이상 발현 양이 증가된 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 유전자 또는 단백질의 발현 정도의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 유전자 증폭 또는 항원-항체 반응 방식에 의해 실시된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 항원-항체 반응 방식에 의해 실시된다. 이 경우, 상기 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다. 본 발명에서 용어, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커(HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질) 또는 상기 마커 의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항원-항체 반응 방식은 면역분석 방식과 동일한 의미를 갖는다.
상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 노로 바이러스를 검출하는데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 노로 바이러스를 검출하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
상기 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계는 제브라피시에 노로바이러스를 감염시킨 후 1-5일째에 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계는 노로바이러스 감염 후 2-4일째에 실시한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계는 노로바이러스 감염 후 3일째에 실시한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 노로바이러스 동물모델을 이용한 노로바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 제브라피시에 노로바이러스를 감염시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 제브라피시에 노로바이러스에 대한 항바이러스제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 제브라피시로부터 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하여 항바이러스제 후보 물질의 효능을 결정하는 단계.
본 발명의 항바이러스제 스크리닝 방법은 상기 노로바이러스 검출 방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (a): 노로바이러스의 투여
먼저, 제브라피시에 노로바이러스를 투여한다. 상기 단계 (a)는 상기 언급한 노로바이러스 검출 방법의 단계 (a)와 동일하다.
단계 (b): 항바이러스 후보 물질의 투여
다음, 상기 단계 (a)의 제브라피시에 노로바이러스에 대한 항바이러스제 후보 물질을 투여한다.
상기 항바이러스제 후보 물질로는, 예컨대, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당, 지질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
단계 (c): 항바이러스 후보 물질의 효능 결정
다음, 상기 단계 (b)의 제브라피시로부터 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하여 항바이러스제 후보 물질의 효능을 결정한다.
상기 단계 (a)의 제브라피시에 항바이러스제 후보 물질을 투여하여 상기 HSP90α, HSC71 및 Tfr로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 하향-조절(down-regulated)되는 경우에, 상기 항바이러스제 후보 물질이 노로 바이러스에 대한 항바이러스 효과가 있는 것으로 판정한다.
본 명세서에서 유전자 또는 단백질을 언급하면서 사용되는 용어 “하향-조절”은 조사 대상의 시료(예컨대, 균질화된 제브라피쉬 조직)에서의 상기 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 노로 바이러스를 감염시키지 않은 조직의 유전자 또는 단백질 발현 정도와 비교하여 낮은 경우를 의미한다. 본 발명의 노로 바이러스에 대한 항바이러스 후보 물질을 판정하는 데 있어서, 상기 하향-조절은 1.1배 이상, 1.3배 이상 또는 1.5배 이상 발현 양이 감소된 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 콘카나발린 A(Concanavalin A; Con A)를 유효성분으로 포함하는 장관 바이러스(enteric virus) 감염 중화(neutralization)용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “중화”는 항바이러스 물질(예컨대, 콘카나발린 A)이 바이러스 또는 그의 산물의 생물학적 활성을 갖는 부위에 결합하여 세포의 바이러스 감염을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장관 바이러스는 노로바이러스, A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus; HAV) 또는 로타 바이러스(Rota virus)이다.
상기 콘카나발린 A는 노로 바이러스와 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 노로 바이러스와 3.75×10-7 M의 KD 값을 갖는다.
상기 콘카나발린 A는 노로바이러스와 결합하여 상기 노로바이러스를 중화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 노로 바이러스를 70-100% 중화한다.
본 발명의 콘카나발린 A는 노로바이러스 감염에 대한 제브라피시의 tfr-1b 단백질 발현을 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 제브라피시의 tfr-1b(Transferrin receptor-1b)의 발현을 억제한다.
상기 콘카나발린 A는 A형 간염 바이러스와 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 A형 간염 바이러스의 VP1 도메인(Viral Protein 1 domain)및 VP2 도메인 사이에 결합한다.
상기 콘카나발린 A 및 상기 A형 간염 바이러스의 결합은 1.28×10-6 M의 KD 값을 갖는다.
상기 콘카나발린 A는 A형 간염 바이러스와 결합하여 상기 A형 간염 바이러스를 중화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 A형 간염 바이러스를 80-100% 중화한다.
상기 콘카나발린 A는 로타 바이러스와 결합하여 상기 로타 바이러스를 중화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 콘카나발린 A는 로타 바이러스를 60-90% 중화한다
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 노로바이러스(Norovirus) 동물모델을 이용한 노로바이러스 검출 방법 및 노로바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 노로바이러스 검출 방법은 감염형(infectious) 노로바이러스 및 비감염형(non-infectious) 노로바이러스를 구별할 수 있다.
(c) 본 발명은 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 유효성분으로 포함하는 장관 바이러스(enteric virus) 감염 중화(neutralization)용 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명의 조성물은 식중독 바이러스를 중화할 수 있다.
도 1은 유전자 증폭 반응을 통한 감염성 및 비감염성 노로바이러스의 구별 가능성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2은 단백체 분석을 통해 분석된 단백질을 토대로 IPA(Ingenuity Pathway Analysis) 분석을 이용하여 단백질 변화를 도식하여 나타낸다.
도 3a 및 3b은 감염형 노로바이러스를 감염시킨 제브라피시(Danio rerio)의 HSP90α(Heat Shock Protein 90α) 및 HSC71(Heat Shock Cognate 71)의 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 HSP090α 저해제(17AAG) 및 HSC71 저해제(KNK437)를 처리하여 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b의 바이오마커로서의 가능성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 비감염형 노로바이러스를 감염시킨 제브라피시의 HSP90α 및 HSC71 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 감염성 노로바이러스 및 Con A를 투여한 제브라피시의 HSP90α, HSC71 및 Tfr-1b 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 HAV(Hepatitis A virus)를 고정시킨 ARG2(Amine Reactive 2nd Generation Biosenser) 칩에 Con A를 처리하여 결합친화도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 HAV를 감염시킨 Frhk-4 세포에 대하여 Con A의 HAV 감염 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 Con A 및 HAV의 결합 구조를 나타낸다.
도 10은 Con A 및 노로바이러스가 결합하는지 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 노로바이러스를 고정시킨 ARG2 칩에 Con A를 처리하여 결합친화도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 노로바이러스에 대한 항체 및 Con A의 결합 친화도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 13은 노로바이러스에 대한 항체의 에피토프 및 Con A의 에피토프를 비교한 결과를 나타낸다.
도 14는 Con A 및 로타바이러스의 결합을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 Con A의 로타바이러스 중화 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PCR을 통한 노로바이러스의 확인
인체감염형 노로바이러스(Genotype GⅡ-4)를 50℃-90℃의 온도에서 10분 동안 가열한 후, RNA를 획득하였다. RNA 분리는 TRIzol(Invitrogen)을 이용하였고, 일반적인 RNA 제조 프로토콜에 따라 실시하였다(Chomczynski P, Mackey K. Short technical report. Modification of the TRIzol reagent procedure for isolation of RNA from Polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 19(6): 942-945. 1995). 트라이졸(Trizol) 700 ㎕을 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 가볍게 볼텍싱(voltexing) 한 후, 클로로포름(chloroform) 200 ㎕을 각 분주하여 볼텍싱 한 후 5분 동안 정치하였다. 12,000×g, 15분, 4℃에서 원심분리하여, 상등액을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 담고, 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 각 분주하여 볼텍싱 한 후 10분 동안 정치하였다. 12,000×g에서 10분, 4℃에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 75% 에탄올을 500 ㎕씩 분주하여 가볍게 볼텍싱 하였다. 7,500×g, 5분, 4℃에서 원심분리 한 후, 상등액을 제거하고 10 ㎕의 RNase 제거 초순수물(RNase free water)를 이용하여 RNA를 수득하였다. 수득한 RNA 10 ㎕는 랜덤 프라이머(Random primer) 1 ㎕와 함께 5× M_MLV RTase 반응 완충액 4 ㎕, 5× DTT 2 ㎕, dNTP 2 ㎕, RNase 억제제 0.5 ㎕, M_MLV RTase 1 ㎕를 함께 분주하여 65℃에서 10분, 37℃에서 1시간 72℃ 5분 동안 반응 시켜 준비하였다. PCR 프리믹스(Bioneer)에 16 ㎕의 DNase 제거 초순수물(DNase free water) 및 1 ㎕ 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 각 첨가하여 합성된 2 ㎕의 cDNA를 함께 반응하여 RT-PCR을 실시하였다. PCR 조건은 95℃ 5분, 40 주기 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 45초, 마지막 신장(extension) 72℃ 5분을 실시하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 노로바이러스를 50-90℃ 각 온도별로 가열 처리 한 후 RT-PCR을 실시한 전기영동 결과는 가열 처리된 비감염형 노로바이러스 역시 유전산물이 확인되었다. 따라서 유전자 증폭에 의해서는 감염형과 비감염형 노로바이러스를 구분할 수 없음을 확인하였다.
실시예 2: 감염성 노로바이러스의 바이오마커 후보 선별
지역 수족관에서 구입한 제브라피시(Danio rerio)를 RO(Reverse Osmosis) 시스템 물을 활용한 1 L 수조에 각 5마리씩 적응 기간을 두었다. 물고기 마취에 사용되는 트리카인(Tricaine; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt, sigma) 시약 400 ㎎ 및 2.1 ㎖의 1 M 트리스(Tris)를 함께 97.9 ㎖의 증류수에 용해시키고, pH 7로 적정한 마취용액을 제조하였다. 이 마취용액 4.2 ㎖을 100 ㎖의 RO 시스템 물에 용해시켜 물고기를 마취하였다. 마취된 제브라피시를 미리 준비해둔 멸균 PBS(Phosphate Buffer Saline) 및 멸균 PBS에 희석한 노로바이러스(Genotype GⅡ-4) 20 ㎕씩(titer 1×106 카피수(copy number))을 제브라피시 복강에 투여하였다. 용해 완충액(트리스 10 mM, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 트리톤 X-100 10%, NP40 10%)를 제조하여 프로테이나제(proteinase) 억제제 1:200, 인산염(Phosphate) 억제제 1:100 농도로 첨가한 후 1.5 ㎖ 튜브에 각 분주하고, 제브라피시를 액체질소에서 급속 냉각하여 준비된 1.5 ㎖ 튜브에 넣었다. 멸균된 해부용 가위를 이용하여 제브라피시를 작은 조직으로 절단하였고, 균질기를 이용하여 제브라피시를 균질화 하였다. 이 모든 작업은 얼음에서 시행하였다. 균질화된 제브라피시 조직은 5분에 한번씩 볼텍싱을 실시하였고, 얼음에서 20분 동안 반응하였다. 이 후, 15,000 rpm, 13분, 4℃ 조건에서 원심분리를 실시하여 상등액을 수득하였다. 날짜별로 제브라피시를 샘플링하여 단백질을 추출하고, 단백질 변화를 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 확인하였다. 가장 두드러지게 차이나는 감염 3일차의 제브라피시를 단백체 분석(Proteomics analysis)을 이용하여 단백질 변화를 확인하였다.
분석된 단백질을 토대로 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)분석을 이용하여 단백질 변화를 도식한 도 2에서 확인할 수 있듯이, 단백질 분석을 통하여 많은 단백질 중 중요한 여러 인자를 확인했으며, 이 중, HSP90α(Heat Shock Protein 90α), HSC71(Heat Shock cognate 71), Tfr(Transferrin receptor) 세 종류의 바이오 마커가 감염형 노로바이러스에 의해 과발현됨을 확인하였다.
실시예 3: 감염성 노로바이러스의 바이오마커 후보 확인
인체 감염형 노로바이러스를 감염시킨 제브라피시의 단백질을 획득하여 단백질 변화를 분석한 도 2의 결과에 따라 바이오마커를 특정하였다. 제브라피시 단백질을 각 30 ㎍을 SDS-겔로 로딩한 후, PVDF 막(Immobilon-P, Millipore)에 단백질을 트랜스퍼(Transfer)하였다. 각 막을 5% 탈지우유(skim milk)가 혼합된 TBST(1% Tween20 TBS)로 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. HSC71(항-HSC71 항체, 래빗, Cell Signaling), HSP90α(항-HSP90α 항체, 래빗, Anaspec), Tfr-1b(항-Tfr-1b 항체, 래빗, Anaspec) 각 1차 항체를 5% 탈지우유가 혼합된 TBST에 1:1000의 농도로 분주하여 냉장실에서 밤새 반응하였다. 이 후, 3차례의 TBST로 10분 동안 세척 한 후, 2차 항체(Polyclonal Goat, anti-rabbit immunogloulines HRP, Dako)를 5% 탈지우유가 혼합된 TBST에 1:2000의 농도로 분주하여 실온에서 2시간 동안 반응하였다. 이 후, 5차례의 TBST로 5분 동안 세척을 한 후, 웨스턴 블럿 기질(Luminata Crescendo, Millipore)과 반응하여 단백질 변화를 확인하였다.
도 3a 및 3b은 웨스턴 브럿을 통하여 바이오마커인 HSP90α 및 HSC71의 발현을 날짜별로 확인한 결과이다. 감염 3일차에 Mock(멸균 PBS 접종 그룹)과 노로바이러스 감염 그룹의 단백질 발현이 가장 크게 구분 되었으며 감염 4일차에는 발현양이 Mock 그룹 및 노로바이러스 감염 그룹 모두 크게 감소되어 효과를 확인할 수 없었다. 따라서, 노로바이러스 감염 3일째의 제브라피시 단백질을 이용하여, 바이오마커라고 생각되는 HSP90α 및 HSC71 저해제를 이용하여 마커로써의 가능성을 확인하고자 하였다. 도 4a 및 4b는 HSP90α 저해제(17AAG, Sigma) 및 HSC71의 저해제(KNK437, Sigma)를 통하여 노로바이러스 감염에 의해 증가하는 단백질 발현을 감소시키는 결과이며, 바이오마커로써 기능을 확인하였다. 또한, Tfr-1b(Transferrin receptor 1b 및 Anaspec) 항체를 이용했을 때, 노로바이러스 감염 그룹에서 단백질이 발현되었으며, HSP90α 저해제 및 HSC71 저해제를 함께 처리하였을 때는 단백질 발현이 감소되었으나, 여전히 단백질 발현이 확인되었다(도 4c 및 4d).
실시예 4: 제브라피쉬의 노로바이러스 감염 확인
노로바이러스를 온도별로 10분 동안 가열하여 비감염 상태의 노로바이러스를 제브라피시에 감염하였다. 감염 3일째, 제브라피시에서 단백질을 각 추출하여 웨스턴 블럿을 실시하여 단백질 변화를 확인하였다. 50℃에서 가열 처리한 노로바이러스와 WT(Wild type) 노로바이러스에서는 HSP90α 및 HSC71 모두 발현이 증가하였으나, 70℃ 및 90℃에서 가열 처리한 노로바이러스는 멸균 PBS만 접종시킨 제브라피시와 유사한 수준의 단백질만이 발현되었다. 따라서, HSP90α 및 HSC71은 인체 감염형 및 비감염형 노로바이러스를 구별 할 수 있는 바이오마커라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Tfr-1b의 발현은 50℃ 가열처리 및 WT 노로바이러스를 감염시킨 그룹에서만 단백질이 발현되었기 때문에, HSP90α 및 HSC71보다 더 확실한 바이오마커임을 확인할 수 있었다.
실시예 5: Con A의 노로바이러스 중화
마취 용액을 이용하여 마취된 제브라피시를 미리 준비해둔 멸균 PBS(phosphate buffer saline) 및 멸균 PBS에 희석한 노로바이러스 20 ㎕씩을 제브라피시 복강에 투여하였다. 또한, 100 ㎍/㎖의 Con A(concanavalin A, sigma)를 인체 감염형 노로바이러스와 반응(Genotype GⅡ-4,titer 1×106 카피수, 1시간 동안 실온에서 로터를 이용하여 반응) 시킨 후 제브라피시 복강에 20 ㎕ 씩 투여하였다. 감염 3일 후 제브라피시 단백질을 획득하여 웨스턴 블럿를 실시하였다.
노로바이러스만 감염한 그룹은 여전히 HSP90α 및 HSC71의 발현이 약 2배 가량 증가하여 나타났다(도 6a). 하지만 Con A와 함께 노로바이러스를 감염시킨 제브라피시의 단백질은 멸균 PBS만 감염시킨 그룹과 비슷한 양의 단백질이 발현되었다. 또한, Tfr-1b항체의 경우 Con A와 함께 감염시킨 제브라피시에서는 저해제를 처리했을 때와는 다른 경향을 보였다. 즉, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)가 발현이 되지 않았다(도 6b). 이는 노로바이러스 감염 자체를 억제시키는 영향을 준 것이라 생각된다.
실시예 6: HAV 및 Con A의 결합
간염 A형 바이러스(Hepatitis A virus; HAV)는 FRhk-4 cell(Rhesus monkey kidney, ATCC)에서 감염, 배양되기 때문에 감염기작을 억제할 수 있는 세포주로 활용하였다. FRhk-4 cell은 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, WELGENE)배지에 10% FBS(Fetal bovine serum, WELGENE) 및 1%의 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin; Sigma)을 첨가하여 제조한 배지에서 배양하였다. FRhk-4 세포를 96웰 플레이트에 8×10 세포/웰을 분주하여 24시간 후 약 80-90%의 컨플루언트(confluent)가 되었을 때 바이러스를 접종하였다. HAV는 1×10 unit/웰을 첨가하였고, 동량의 HAV를 Con A 100 ㎍/㎖의 농도와 함께 반응하여 각 웰에 분주하였다. 바이러스 처리한 FRhk-4 세포은 날짜별로 RNA를 획득하여 HAV 카피(copy)를 확인하였다. RNA 분리는 실시예 1의 방법에 따라 실시하였다.
간염 A형 바이러스를 ARG2 칩에 고정시킨 후, Con A 농도별로 결합친화도를 보았으며 Con A의 농도가 증가할수록 노로바이러스가 고정된 칩에 결합하는 것을 확인하였다(도 7). HAV를 감염한 그룹은 감염 5일까지는 큰 변화가 없었으나, 감염 6일 및 감염 7일째 약 2 log 값이 증가하여 3.3×10 unit 까지 복제가 되었다(도 8a 및 8b). 그러나 Con A를 HAV와 함께 감염한 그룹에서는 2.7×10 unit으로 접종한 농도보다 낮은 수준으로 유지되었다. 또한 세포의 이미지를 보면, HAV를 처리한 그룹에서는 세포변성 효과(Cytopathic effect; CPE)가 발견되었으나, Con A와 함께 처리한 그룹에서는 CPE 현상이 나타나지 않았다. 이는 Con A가 HAV의 세포내 침투를 방해하여 복제를 억제하는 역할을 하는 것으로 생각된다.
HAV VP1(구조형성 단백질) 도메인과 VP2 도메인 사이에 Con A가 결합하며, HAV VP2의 도메인 N-말단이 Con A의 두 분자를 결합하여 구조 결합을 안정시켜준다(도 9).
실시예 7: 노로바이러스 및 Con A의 결합
인체감염형 노로바이러스와 Con A가 서로 결합을 하는지 확인하기 RT-PCR과 BLI(Biolayer interferometry) 분석을 통해 확인하였다. 노로바이러스의 농도별로 RT-PCR을 통해 각각의 노로바이러스 농도에 대한 Ct값을 얻었으며, 각각의 농도의 노로바이러스에 100 ㎕의 Con A가 결합된 세파로스 4B 레진(25 ㎎ Con A/㎖; C7275, Sigma)을 혼합하여 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 레진은 원심분리 (2000 g, 3분, 4℃)를 통해 상층액을 제거한 후, 레진은 PBS 용액으로 3회 세척하여 RT-PCR을 수행하였다.
BLI 분석은 BLItz 시스템(ForteBio Inc., CA)을 이용하여 아민 반응성 바이오센서(Amine reactive biosensors; ARG2) 칩과 프로테인 A 칩을 사용하였다. ARG2 칩은 노로바이러스를 ARG2 칩에 고정시킨 후, 0-10 μM의 Con A 농도별로 결합을 확인하였으며, 실험방법은 초기 기준값은 증류수, 30초 활성화: 20 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), 10 mM s-NHS (sulfo-N-hydroxysuccinimide), 240초; 로딩: NaOAc (pH4)에 용해된 노로바이러스, 360초; 블로킹: 1 M ethanolamine (pH 8.5), 240초; 기준값: 10 mM PBS (pH 7.4), 60초; 결합(association): PBS에 용해된 Con A, 180초; 해리(dissociation): 10 mM PBS (pH7.4) 240초로 수행하였다. 센서그램(Sensorgrams)은 데이타 분석 소프트웨어 7.1.0.36을 사용하여 기준값(60초), 결합(180초), 해리(240초) 부분을 도 10 및 11에 제시하였다.
프로테인 A 칩은 노로바이러스에 대한 항체와 Con A의 결합부위가 동일한 부분인지 다른 부분인지 확인하기 위해 경쟁반응 실험을 수행하였으며, 프로테인 A 칩에 항체를 고정시킨 후, Con A, 노로바이러스, 노로바이러스와 Con A (0.1 uM, 5 uM)를 혼합한 시료에 대해서 각각의 센서그램을 확인하였다. 프로테인 A 칩의 실험방법은 초기 기준값: PBS, 30초; 로딩: PBS에 용해된 항체, 120초; 기준값: 10 mM PBS (pH 7.4), 60초; 결합: PBS에 용해된 도 12의 시료, 120초; 해리: 10 mM PBS (pH7.4) 300초로 수행하였다. 센서그램은 데이터 분석 소프트웨어 7.1.0.36을 사용하여 baseline (60초), association (120초), dissociation (300초) 부분을 도 12에 제시하였다.
도 10은 Con A와 노로바이러스가 결합하는지 RT-PCR로 확인한 결과이다. 1×103에서 1×108 카피/㎖의 농도의 노로바이러스에 대해 Con A가 결합된 세파로스 4B 레진으로 회수된 노로바이러스의 Ct값을 비교하였을 때, 노로바이러스 농도 의존적으로 Ct값이 감소하였으며 각각의 노로바이러스 농도의 Ct값과 Con A가 결합된 세파로스 레진으로 회수된 노로바이러스의 Ct값을 비교하였을 때 평균적으로 94.1%의 회수율을 확인하였다.
도 11은 노로바이러스를 ARG2 칩에 고정시킨 후, Con A 농도별로 결합친화도를 보았으며 Con A의 농도가 증가할수록 노로바이러스가 고정된 칩에 결합하는 것을 확인하였다. 항체와 Con A를 각각 ARG2 칩에 고정시킨 후, 노로바이러스가 결합하는지 센서그램을 확인하였다(도 12). 동일한 노로바이러스 농도에 대해서 항체와 Con A의 센서그램을 비교하였을 때 노로바이러스에 대하여 Con A가 항체보다 3배 더 강하게 결합하는 것을 확인하였다.
도 13는 항체와 노로바이러스의 결합 부분이 Con A와 노로바이러스의 결합 부분과 같은 부분에 결합하는지 다른 부분에 결합하는지 경쟁반을을 통해 확인한 결과이다. 프로테인 A 칩에 노로바이러스 항체를 고정시킨 후, Con A, 노로바이러스, 노로바이러스에 Con A를 0.1 μM 및 5 μM로 혼합한 시료를 각각 센서그램으로 비교하였다. 그 결과 양성 대조구인 노로바이러스 시료에서는 노로바이러스가 항체가 붙은 칩에 0.23 ㎚로 결합하는 것을 확인하였으며, 음성 대조구인 Con A 시료에서는 항체가 붙은 칩에 Con A가 결합하지 않았다. 이를 통해 실험에 사용한 노로바이러스 농도에서 항체의 결합하는 센서그램을 얻었으며, Con A와 항체 간에는 결합을 하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 0.1 μM과 5 μM의 Con A와 노로바이러스를 혼합한 각각의 시료에서 항체가 붙은 칩에 0.2 ㎚까지 결합하는 것을 보였으며, 이는 양성 대조구의 결합하는 센서그램과 거의 유사하였다. 또한 Con A가 노로바이러스와 결합하고 있음에도 노로바이러스가 항체가 붙은 칩에 결합한다는 것은 노로바이러스에 대한 Con A와 항체의 결합 부위가 서로 다른 부분일 것으로 보여진다.
실시예 8: 로타 바이러스 및 Con A의 결합
식중독 바이러스 중 로타바이러스가 Con A와 결합하는지 확인하기 위하여 자성체인 자성비드에 연결된 스트렙타비딘(streptavidin)에 바이오티닐화(biotinylation) 처리된 Con A를 연결하여 바이러스 탐침자를 제작한다. Con A를 바이오티닐화 하는 방법은 표지 반응(labeling reaction)을 시작으로 반응 튜브(component C)에 100 ㎕의 Con A (1 ㎎/㎖)를 옮긴다. 1 M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)의 1/10을 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 후 바이오틴-XX SSE를 1 ㎕ 넣고 혼합하여 실온에서 15분 동안 반응하였다. 다음 과정은 바이오티닐화 Con A를 분리하고자 겔 레진(resin)을 상층 챔버(upper chamber)에 채우고, 800 ㎕의 레진을 컬럼에 채우고 16,000 G에서 15초 동안 원심 분리를 실시하였다. 원심분리기를 사용하여 레진을 충진시킨다. 레진을 PBS 용액으로 세척 후 바이오틴과 결합된 Con A 반응물을 레진이 들어있는 스핀 컬럼(spin column)에 넣고 16,000 G에서 1분 동안 원심 하여 반응물을 얻는다. 이렇게 반응된 바이오티닐화된 Con A를 스트렙타비딘이 결합된 자성비드와 연결하여 바이러스 탐침자를 만드는데 그 제조과정은 다음과 같다. 제조한 바이러스 탐침자가 있는 튜브에 로타바이러스를 넣고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 면역학적 반응이 끝난 후 Con A가 결합된 자성 비드에 항원-렉틴 간의 결합이 이루어진 부분은 자석에 붙게 된다. Con A가 결합된 자성 비드 결합체를 200 ㎕ PBS로 3회 씻어내어 비특이적으로 결합한 불순물을 제거한 후, 100 ㎕ PBS로 부유시켜 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 상층액을 제거하였다. 새로운 튜브에 있는 스트렙타비딘에 붙어있는 항원-Con A 결합체를 분리하기 위해 용리액(50 mM 글라이신, pH 2.8)으로 용리하고, 100 mM Tris 용액으로 pH 7.5로 중화시켰다. 그리고 로타바이러스를 순수 분리 확인을 위해 RT-PCR을 실시하여 바이러스를 확인한다.
자성비드를 이용하여 면역침강법으로 로타바이러스를 검출가능 여부를 확인하고자 용리된 산물을 RT-PCR을 실시하여 바이러스를 검출하였다. 바이러스 동정에 사용된 중합연쇄반응(PCR)에 사용된 로타바이러스 프라이머는 RoV_VP4_F(5'-ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC-3')와 RoV_VP4_R(5'-TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A-3')를 사용하였으며, 프라이머를 통해 증폭된 PCR 산물의 크기는 877bp이다.
바이러스 확인을 위한 RoV PCR 조건은 다음과 같다. RoV PCR 조건: 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초에서 35 주기 동안 실시하고 최종 신장은 72℃ 7분 동안 실시하였다. RT-PCR을 실시한 후, PCR 산물은 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
도 14는 Con A가 결합된 자성비드를 사용하여 로타바이러스와 결합하는지 확인을 위해 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 결과이다. 로타바이러스와 반응 후, 회수된 자성비드를 용리액을 이용하여 탈리시킨 후 얻은 용액을 RT-PCR을 수행한 결과는 1열이며, 로타바이러스 원액을 RT-PCR한 결과는 2열이다. 3열은 PCR이 잘 되었는지 확인하기 위한 음성 대조군이다. 그 결과 1열에서 양성 대조군인 2열과 동일한 위치에서 로타바이러스 증폭산물인 877 bp에서 밴드를 확인하였다. 이를 통해 Con A와 로타바이러스가 결합되는 것을 확인하였다.
실시예 9: 로타 바이러스의 중화
로타바이러스(Rotavirus)는 MA-104 세포(Green monkey kidney, ATCC)에서 감염, 배양되기 때문에 감염기작을 억제할 수 있는 세포주로 활용하였다. MA-104 세포는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, WELGENE)배지에 10% FBS(Fetal bovine serum, WELGENE) 및 1%의 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin; Sigma)을 첨가하여 제조한 배지에서 배양하였다. MA-104 세포를 96웰 플레이트에 1×10 세포/웰을 분주하여 24시간 후 약 80-90%의 컨플루언시(confluency)가 되었을 때 바이러스를 접종하였다. 로타바이러스는 1×10 unit/웰을 첨가하였고, 동량의 로타바이러스를 Con A 100 ㎍/㎖의 농도와 함께 한시간동안 실온에서 반응하여 각 웰에 분주하였다. 바이러스 처리한 MA-104 세포은 날짜별로 RNA를 획득하여 로타바이러스 카피(Copy)를 확인하였다. RNA 분리는 실시예 1의 방법에 따라 실시하였다.
로타바이러스를 감염한 그룹은 감염 1일까지는 큰 변화가 없었으나, 감염 3일 및 감염 5일째까지 1.5 log 값이 증가하여 2.7×10 unit 까지 복제가 되었다. 그러나 Con A를 로타바이러스와 함께 감염한 그룹에서는 6.4×10 unit으로 로타바이러스를 감염한 그룹 대비 1 log 값이 감소하였다. 이는 HAV와 Con A의 실험과 비슷한 양상을 보이며, Con A가 로타바이러스를 중화하여 감염을 억제한 결과이다(도 15).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 노로바이러스(Norovirus) 동물모델을 이용한 인체감염형 노로바이러스 검출 방법:
    (a) 제브라피시(Danio rerio)에 노로바이러스를 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 제브라피시로부터 HSP90α(Heat Shock Protein 90α), HSC71(Heat Shock cognate 71) 및 Tfr-1b(Transferrin receptor-1b)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 유전자 증폭 또는 항원-항체 반응 방식에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 단계 (a)의 감염 후 2-6일째에 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 노로바이러스(Norovirus) 동물모델을 이용한 인체감염형 노로바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법:
    (a) 제브라피시(Danio rerio)에 노로바이러스를 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 제브라피시에 노로바이러스에 대한 항바이러스제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 제브라피시로부터 HSP90α(Heat Shock Protein 90α), HSC71(Heat Shock cognate 71) 및 Tfr-1b(Transferrin receptor-1b)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하여 항바이러스제 후보 물질의 효능을 결정하는 단계.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 유전자 증폭 또는 항원-항체 반응 방식에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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