JP5269572B2 - イリドウイルスの抗原性ペプチド及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、免疫学の分野及び疾病の検出に関する。
ハタ類(Grouper:グルーパー,ハタ科の魚)は、アジア太平洋地域の最も重要で経済的な魚類としてよく知られており、台湾の水産養殖産業に多額の経済的価値をもたらした。年間生産価値は2〜5億新台湾ドル(NTD)にまで達する可能性があり、世界的な市場占有率は42%にまで、生産量は12.367メートルトンにまで達すると推定されており、生産価値及び生産占有率は世界一である。しかし、稚魚及び幼魚は屋内で集約的に養殖されていることから、この魚には深刻な感染症が発生している。台湾で養殖ハタ類の感染症を引き起こしているウイルスは、神経壊死症ウイルス及びイリドウイルスであり、これらは稚魚が大量死するという事実をしばしばもたらし、台湾の養殖産業を大いに脅かしている。
本発明は、イリドウイルスの抗原決定領域の1つである新規のアミノ酸配列を特徴とし、前記抗原決定領域に従って産生されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を提供する。前記抗体は更に、従来技術で使用される複雑な細胞培養段階やウイルス単離段階の欠点を克服し、水生動物におけるイリドウイルスの感染を高速且つ経済的な方法で検出することができる、種々の検出法及び高速検出ストリップを含むキットで使用される。
本発明は、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその構造的及び機能的な変異体を提供する。「構造的及び機能的な変異体」という用語は、配列番号13のアミノ酸配列との80%を超える類似性を有し、抗原活性を保持するポリペプチドを指す。この変異体は、配列番号13の突然変異、例えば抗原活性に影響を及ぼさない位置の突然変異に由来してよい。配列番号13には13個のアミノ酸残基しかないため、当業者であれば、抗原活性に関連するアミノ酸位置と関連しない位置とを容易に決定することができ、当該技術分野で既知の技法、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して本発明の変異体を作製することができる。更に、ポリペプチドの抗原活性に影響を及ぼすことなく類似の化学的特性を有するアミノ酸置換基が使用されてもよい。配列番号13の構造的な変異体はいずれも、抗原活性を保持すると予想される。この変異体の活性は、後述の実施例4に記載の方法により決定することができる。
実施例1:試料収集及び分析
ここで使用した試料は、2001年から2006年の間に南台湾の海水魚及び淡水魚の孵化場から収集した。収集した試料は、イリドウイルスの感染を確かめるために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により更に確認した。先ず、腎臓をすりつぶし、QlAamp DNA(登録商標)ミニキット(QIAGN、ドイツ)によりDNAの精製を行った。次に、収集したDNAをPCRにより増幅した。
海水魚からの試料をすりつぶし、10倍ライボビッツL−15培地に浸漬した。0.45μmの膜でろ過した後、0.5mLのろ液を使用してマハタ属の腎臓及び胚細胞株(7GK、自己生成)とE11細胞株(自己生成)とを感染させ、ウイルスを増幅した。細胞をろ液と共に1時間インキュベートし、次いで2%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するライボビッツL−15培地中で25℃にて培養した。細胞変性効果を毎日観察し、感染力価をリード・メンチ法(Reed and Muench Methods)(1938)により決定した。
3度の凍結及び再凍結に引き続き、増幅したウイルスを12000xg、4℃にて20分間遠心分離にかけ、沈殿物及び最初の上清をそれぞれ収集した。沈殿物をTN緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.5)に溶解し、超音波処理器によって破砕した。破砕した細胞を4000xg、4℃にて20分間遠心分離にかけた。その上清と最初の上清とを混合し、混合物を更に10000xg、4℃にて8時間遠心分離にかけた。沈降物を15%〜60%のスクロース勾配にロードし、4℃にて1時間、高速の遠心分離にかけて、ウイルスの沈降線を得た。注射針を使用してこの線上の溶液を吸引し、次いでこの吸引した溶液をTN緩衝液に溶解した。100000xgにて2時間の遠心分離の後、沈殿物をTN緩衝液に溶解し、ウイルス濃度を測定する試験を行った。
フロインド完全アジュバントと混合した、実施例3で得た0.1mg/mL又は0.5mg/mLの精製ウイルスにより、ニュージーランド白ウサギを免疫した。2週間毎に、このウサギを、フロインド不完全アジュバントと混合した同濃度のウイルスで追加免疫した。4回追加免疫を行った後、ウサギの耳静脈から血液を採取し、更にポリクローナル抗体の単離に供した。モノクローナル抗体は、Balb/cマウスにハイブリドーマ細胞を注射し、腹水を収集することによって産生した。
間接免疫蛍光測定法(IFA)
7GK細胞株に107TCID50/mLのウイルス溶液を25℃にて1時間接種し、次いで2%のFBSを含有するL−15培地を添加した。接種から48時間後に、80%のアセトンで15分間細胞を固定し、その後実施例4で単離したモノクローナル抗体(M1、M2及びM3と表記)の1000倍希釈液を、1倍PBSでの3回の洗浄に続いて細胞に添加した。その細胞を1倍PBSにより3回洗浄し、その後二次抗体としてヤギ抗マウスFITC標識抗体の1000倍希釈液を添加した。結果は、倒立蛍光顕微鏡(ツァイス・アキシオベルト135(Zeiss, Axiovert 135))で観察し、図1に示した。
単離したウイルス粒子を4〜12%のSDSゲルで分析し、異なるサイズのウイルスタンパク質ごとに分離した。ウェスタンブロット分析のために、ウイルスタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングした膜を本発明に従う希釈抗体溶液(1:250、1:2000、1:5000)、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)標識IgG(1:1000)、及び3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)基質で順次インキュベートし、X線フィルムをブロットに曝露させた。図2A、図2B、図2Cは、それぞれ1:250、1:2000、1:2500に希釈した抗体の結果を示している。「M」は標準タンパク質分子マーカー(kDa)である。レーン1及びレーン2はイリドウイルス粒子の試料であり、レーン3はマウスからの組織であり、レーン4はマハタ属の試料である。
0.2μmのニトロセルロース膜を再蒸留水で2分間すすぎ、その後Bio−Dotカセット内に配置した。各ウェルに、100μLのラナウイルス遺伝子型60株(実線、―)、メガロシティウイルス(Megalocytivirus)遺伝子型20株(破線、‐‐‐)、マハタ属の陰性試料(C−)、及びマハタ属の陽性試料(C+)をそれぞれロードした。37℃にて1時間2%のウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした後、ブロッキングした膜を、37℃にて1時間本発明の希釈したモノクローナル抗体で順次インキュベートし、1倍PPBT(0.05%(v/v)のTween 20を含有するPBS)で3回洗浄し、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)標識IgG(1:1000)及びDAB基質と反応させて、陽性ブロットを褐色に呈させた。
ラナウイルス及びメガロシティウイルスの主要なカプシドタンパク質の保存ドメインを11個のペプチドに切断し、それらの配列を表3に列挙した。次いで、これらの11個のペプチドを使用して、既述の通りにドットブロットを行った。レーン1〜3はそれぞれ1mg/mL、0.1mg/mL、及び0.01mg/mLのペプチドを指す。「C−」は陰性対照群を指し、「v1」(ラナウイルス株)及び「v2」(メガロシティウイルス株)は陽性ウイルス試料を指す。結果は図4に示した。
本発明の抗体は、広範なラナウイルス及びメガロシティウイルスを検出することができ、且つ、高い感受性を有することから、高速のイリドウイルス検出キットへの応用に適している。
109TCID50/mLのイリドウイルス溶液を103TCID50/mLの濃度に10倍連続希釈し、100μLの希釈溶液を高速検出ストリップ上にロードした。15〜30分後に結果が得られた。1〜6番のストリップには、それぞれl09TCID50/mL、108TCID50/mL、107TCID50/mL、106TCID50/mL、105TCID50/mL、及び104TCID50/mLをロードし、7番のストリップは陰性対照であった。図6Aに示す通り、5番のストリップは陽性の結果を示しており、この高速検出ストリップが達成した下限は105TCID50/mLであることが示された。
この試験では次の4つの試料を使用した。1番はl08TCID50/mLのイリドウイルス、2番はリンホシスティウイルス、3番は陰性対照、4番はノダウイルス。結果は図7に示した。図7に示す通り、イリドウイルスをロードした1番のストリップのみが陽性の結果を示した。従って、本発明の高速検出ストリップは、イリドウイルスに対して高い特異性を有することが証明された。
2 連結パッド
3 プラスチック支持ベース
4 吸収パッド
5 ニトロセルロース膜
6 検査線
7 対照線
Claims (19)
- イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号13のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む組成物。
- 飼料添加物又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項2に記載の組成物。
- 請求項2に記載の組成物をヒト以外において使用してイリドウイルスに対する抗体を産生する方法。
- 請求項4に記載の方法により調製される、イリドウイルスに対する単離された抗体。
- モノクローナル抗体である請求項5に記載の抗体。
- ポリクローナル抗体である請求項5に記載の抗体。
- ラナウイルスに結合することができる請求項5に記載の抗体。
- メガロシティウイルスに結合することができる請求項5に記載の抗体。
- ラナウイルス及びメガロシティウイルスを同時に検出することができる請求項5に記載の抗体。
- 請求項5に記載の抗体を使用してイリドウイルスの感染を検出する方法。
- 固相免疫クロマトグラフィー法、間接免疫蛍光染色法、及び酵素結合免疫吸着測定法である請求項11に記載の方法。
- イリドウイルスの感染を検出するためのキットであって、
(1)固体支持体と、
(2)前記固体支持体に付着された請求項5に記載の抗体と、
(3)イリドウイルス又はそのタンパク質断片と前記抗体とを、信号を発生するように作用的に結合させることができる信号発生手段と、
(4)関連する試薬及び界面活性剤と、
を含むキット。 - 直接又は間接免疫測定法により実施される請求項13に記載のキット。
- 前記固体支持体は、反応プレート、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーション用の膜、又はテストストリップである請求項13に記載のキット。
- 前記信号発生手段は、ハイパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン又は蛍光標識である請求項13に記載のキット。
- 請求項5に記載の抗体を含む組成物。
- 飼料添加物、イリドウイルス治療薬又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項17に記載の組成物。
- 請求項5に記載の抗体を含む飼料添加物。
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