DE69110402T2 - Neue zirkuläre Plasmide aus der Gattung Rhodococcus. - Google Patents
Neue zirkuläre Plasmide aus der Gattung Rhodococcus.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Plasmide, insbesondere Plasmide, die von Bakterien der Gattung Rhodococcus stammen.
- Es ist bekannt, daß Bakterien der Gattung Rhodococcus Nitrile zu Amiden oder Säuren hydratisieren. Außerdem ist bekannt, daß bestimmte Stämme von Rhodococcus rhodochrous eine Aktivität zur Hydratisierung von Nitrilen besitzen.
- Bisher sind jedoch noch keine Vektoren entwickelt worden, die für Rhodococcus-Wirte geeignet sind, wobei man zur Zeit nur wenige Vektoren aus sehr wenigen Quellen kennt, wie z.B. Rhodococcus sp. H13-A (J. Bacteriol. 170 (1988), 638-645). Wenn man die nützlichen Eigenschaften der Bakterien einsetzen möchte, braucht man dafür Vektoren, die für Rhodococcus-Wirte und für die spätere industrielle Nutzung geeignet sind.
- Die Erfinder haben Bakterien der Gattung Rhodococcus daraufhin untersucht, ob sie Vektoren enthalten, die für Wirte und für eine industriellen Nutzung geeignet sind, dabei haben sie zirkuläre Plasmide gefunden, die als Vektoren eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes zirkuläres Plasmid von etwa 2,6kb bereit, das aus einem Bakterium der Gattung Rhodococcus stammt, dessen Restriktionsstellen zwei SacI-Stellen, eine BamHI-Stelle, eine PvuI- Stelle, eine ScaI-Stelle, eine SphI-Stelle und eine XhoI- Stelle umfassen. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes zirkuläres Plasmid von etwa 7,0kb aus einem Bakterium einer Rhodococcus-Art bereit, dessen Restriktionsstellen eine SphI-Stelle, zwei KpnI-Stellen, eine BglII-Stelle und drei SacI-Stellen umfassen.
- Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte der Plasmide pRC001, pRC002 und pRC003.
- Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte von Plasmid pRC010.
- Die neuen Plasmide pRC001, pRC002 und pRC003 stammen von Rhodococcus rhodochrous ATCC 4276, ATCC 14349 bzw. ATCC 14348. Die plasmide sind alle etwa 2,6kb groß. Tabelle 1 zeigt die Anzahl der Restriktionsstellen und die Größe der Restriktionsfragmente. Tabelle 1 Restriktionsenzym Anzahl der Restriktionsstellen Größe (kb)
- Das neue zirkuläre Plasmid pRC010 stammt von Rhodococcus rhodochrous ATCC 4001. Das Plasmid ist etwa 7,0kb groß. Tabelle 2 zeigt die Anzahl der Restriktionsstellen und die Größe der Restriktionsfragmente. Tabelle 2 Restriktionsenzym Anzahl der Restriktionsstellen Größe (kb)
- In den folgenden Beispielen wird die Erfindung ausführlicher beschrieben.
- Rhodococcus rhodochrous ATCC 4276, ATCC 14349 oder ATCC 14348 wurde jeweils in 400ml MY-Medium (0,5% Polypepton, 0,3% Bacto-Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 1% Glucose) gezüchtet. Sobald ein OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert von 0,15 bis 0,2 erreicht war, wurde die Kultur mit 0,5E/ml Penicillin G versetzt. Die Kultur wurde bis zu einem 0D&sub6;&sub6;&sub0;-Wert von 1,0 weiterinkubiert. Nach der Inkubation wurden die Bakterienzellen abzentrifugiert, mit 40ml TES-Puffer (10mM Tris-HCl, pH8, 10mM NaCl, 1 mM EDTA) gewaschen und anschließend in 11 ml einer Lösung suspendiert, die 50 mM Tris-HCl, pH 8, 12,5% Saccharose, 100mM NaCl und 1 mg/ml Lysozym enthielt. Die Suspension wurde unter Schütteln drei Stunden bei 37ºC inkubiert. Sodann wurde das bakterielle Zellysat mit 0,6ml 0,5 M EDTA, 2,4ml 5 M NaCl und 4,4ml 4% SDS/O,7 M NaCl in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Das Gemisch wurde vorsichtig aufgewirbelt und 18 Stunden auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurde das Gemisch eine Stunde bei 65000 x g und 4ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und mit 4,6ml 50% Polyethylenglykol 6000 versetzt. Das Gemisch wurde drei Stunden auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurde das Gemisch fünf Minuten bei 1000 x g zentrifugiert. Der Uberstand wurde verworfen und das Sediment in 5ml TES-Puffer gelöst, diese Lösung wurde anschließend mit 2ml TES-Puffer, enthaltend 7,5g Cäsiumchlorid, und 1,5mg/ml Ethidiumbromid versetzt. Das Gemisch wurde 42 Stunden bei 130000 x g ultrazentrifugiert. Nach der Ultrazentrifugation wurde die Fraktion, die die Plasmide enthielt, unter UV-Licht entnommen. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde die Plasmidfraktion mit n-Butanol extrahiert. Nach der Extraktion wurde die Plasmidfraktion gegen TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) dialysiert und anschließend mit Ethanol gefällt. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide wurden einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht untersucht. Die Bande, die die Plasmide enthielt, wurde auf dem Gel nachgewiesen.
- Die Plasmide wurden zusammen mit pUC18 (2,69kb), pUC 118 (3,16kb) und pBR322 (4,36kb) als Marker einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterworfen. Die Plasmide waren alle etwa 2,6kb groß. Die Plasmide wurden mit pRC001 (ATCC 4276), pRC002 (ATCC 14349) und pRC003 (ATCC 14348) bezeichnet. In den Klammern ist die ATCC-Nummer der Rhodococcus rhodochrous -Quelle angegeben.
- Die Plasmide pRC001, pRC002 und pRC003 wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und die Restriktionsfragmente zusammen mit Markern, wie z.B. HindIII- und PstI-gespaltener Lambda-Phagen-DNA, einer Elektrophorese auf 0,7% Agarosegel und 5% Acrylamidgel unterworfen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Restriktionsenzym Anzahl der Restriktionsstellen Größe (kb)
- Rhodococcus rhodochrous ATCC 4001 wurde in 400ml MY-Medium (0,5% Polypepton, 0,3% Bacto-Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 1% Glucose) gezüchtet. Sobald ein 0D&sub6;&sub6;&sub0;-Wert von 0,15 bis 0,2 erreicht war, wurde die Kultur mit 0,5 E/ml Penicillin G versetzt. Die Kultur wurde bis zu einem 0D&sub6;&sub6;&sub0;-Wert von 1,0 weiterinkubiert. Nach der Inkubation wurden die Bakterienzellen abzentrifugiert, mit 40ml TES-Puffer (10mM Tris-HCl, pH 8, 10mM NaCl, 1mM EDTA) gewaschen und anschließend in 11ml einer Lösung suspendiert, die 50mM Tris-HCl, pH 8, 12,5% Saccharose, 100mM Nacl und 1mg/ml Lysozym enthielt. Die Suspension wurde unter Schütteln drei Stunden bei 37ºC inkubiert. Sodann wurde das bakterielle Zellysat mit 0,6ml 0,5 M EDTA, 2,4ml 5 M NaCl und 4,4ml 4% SDS/0,7 M NaCl in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Das Gemisch wurde vorsichtig aufgewirbelt und 18 Stunden auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurde das Gemisch eine Stunde bei 65000 x g und 4ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und mit 4,6ml 50% Polyethylenglykol 6000 versetzt. Das Gemisch wurde drei Stunden auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurde das Gemisch fünf Minuten bei 1000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment in 5ml TES-Puffer gelöst, diese Lösung wurde anschließend mit 2ml TES-Puffer, enthaltend 7,5g Cäsiumchlorid, und 1,5mg/ml Ethidiumbromid versetzt. Das Gemisch wurde 42 Stunden bei 130000 x g ultrazentrifugiert. Nach der Ultrazentrifugation wurde die Fraktion, die die Plasmide enthielt, unter UV-Licht entnommen. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde die Plasmidfraktion mit n- Butanol extrahiert. Nach der Extraktion wurde die Plasmidfraktion gegen TE (10mM Tris-HCl, pH 8, 1mM EDTA) dialysiert und anschließend mit Ethanol gefällt. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide wurden einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht untersucht. Die Bande, die die Plasmide enthielt, wurde auf dem Gel nachgewiesen.
- Die Plasmide wurden zusammen mit pUC18 (2,69kb), pUC18 (3,16kb) und pBR322 (4,36kb) als Marker einer Elektrophorese auf einem 0,7%igem Agarosegel unterworfen Die Plasmide waren alle etwa 7,0kb groß. Das Plasmid wurde mit pRC010 (ATCC 4001) bezeichnet. In den Klammern ist die ATCC-Nummer der Rhodococcus rhodochrous-Quelle angegeben.
- Das Plasmid pRC010 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und die Restriktionsfragmente zusammen mit Markern, wie z.B. HindIII- und PstI-gespaltener Lambda-Phagen- DNA, einer Elektrophorese auf 0,7% Agarosegel und 5% Acrylamidgel unterworfen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Restriktionsenzym Anzahl der Restriktionsstellen Größe (kb)
Claims (4)
1. Isoliertes zirkuläres Plasmid mit etwa 2,6kb, das von
einem Bakterium der Gattung Rhodococcus stammt und
dessen Restriktionsstellen zwei SacI-Stellen, eine BainHI-
Stelle, eine PvuII-Stelle, eine ScaI-Stelle, eine SphI-
Stelle und eine XhoI-Stelle umfassen.
2. Isoliertes zirkuläres Plasmid nach Anspruch 1, das ein
von Rhodococcus rhodochrous ATCC 4276, ATCC 14349 bzw.
ATCC 14348 stammendes Plasmid umfaßt.
3. Isoliertes zirkuläres Plasmid von etwa 7,0kb, das von
einem Bakterium der Gattung Rhodococcus stammt und
dessen Restriktionsstellen eine SphI-Stelle, zwei KpnI-
Stellen, zwei BglII-Stellen und drei SacI-Stellen
umfassen.
4. Isoliertes zirkuläres Plasmid nach Anspruch 3, das ein
von Rhodococcus rhodochrous ATCC 4001 stammendes Plasmid
umfaßt.
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| EP0149430A1 (de) | Verfahren zur Herstellung chimärer DNS |
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