DE3686579T2

DE3686579T2 - Prokaryotisches expressionssystem.

Info

Publication number: DE3686579T2
Application number: DE8686301306T
Authority: DE
Inventors: Algis Anilionis; John L Palmer
Original assignee: Repligen Corp
Current assignee: Repligen Corp
Priority date: 1984-12-26
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2006-02-25
Also published as: EP0235410B1; EP0235410A1; JPS62207297A; JPH0669376B2; US4691009A; US4888280A; DE3686579D1

Description

Das Expressionsniveau ist einer der wichtigsten Gesichtspunkte bei der Nutzbarmachung klonierter Genprodukte. Erhöhte Niveaus der Proteinexpression betreffen als wichtige Alternativen sowohl das Verhältnis der Proteinausbeute zum Fermentierungsvolumen als auch den Schwierigkeitsgrad bei der Reinigung. Die meisten Versuche, die Expression von klonierten Genprodukten zu erhöhen, haben sich bisher auf die Verwendung starker Promotoren in Verbindung mit einer effizienten ribosomalen Bindungsstelle konzentriert. Zur Erhöhung der Expression sind eine Vielfalt von Promotoren verwendet worden, wobei die am häufigsten verwendeten der PL-Promotor aus dem Phagen Lambda und die E. coli lacUV5- und trp-Promotoren sind.
Der Lambda-PL-Promotor ist erfolgreich in Verbindung mit einem CI857 temperaturempfindlichen Lambda-Repressor eingesetzt worden. Dies erlaubt eine Expression des klonierten Produkts auf niedrigem Niveau während des E. coli- Wachstums bei 30ºC. Sobald eine wesentliche Zelldichte aufgebaut ist, kann das klonierte Gen durch Wachstum bei 42ºC dereprimiert werden. Dieses Verfahren ist bei der Expression von Genprodukten, die lethal für die Wirtszellen sind, verwendet worden. Verschiedene Forscher haben bei Verwendung des PL-Promotors unter Kontrolle eines thermolabilen Repressors über Expressionsniveaus von 4% berichtet (Waldman, A.S., Kaensslein, E., und Milman, G. [1983] J. Bio. Chem. 258:11571-11575); 7% (Yoakum, G.H., Yeung, A.T., Mattes, W.B., und Grossman, L. [1982] PNAS 79:1766-1770; Derom, C., Gheysen, D., und Fiers, W., [1982] Gene, 17:45-54); und 13% (Oehrnichen, R., Klock, G., Altschmid, L., und Hillen, W. [1984] EMBO J. 3:539-543).
Seit kurzem ist zunehmend ein chimärer Promotor verwendet worden, der aus Sequenzen der E. coli lacUV5- und trp-Promotoren besteht. Dieser Hybridpromotor ist als tac-Promotor bekannt; er enthält den -10-Bereich des lac-Promotors und den -35-Bereich von trp. Dieser Hybridpromotor wird durch das E. coli lacIp Genprodukt reprimiert und durch 5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Dieses System ist von mehreren Forschern mit unterschiedlichen Ergebnissen verwendet worden. Die Expression verschiedener Proteine hat das 7%- Niveau (Bagdasarian, M. M., Amann, E., Lurz, R., Ruckert, B., und Bogdasarian, M. [1983] Gene 26:273-282); das 10%-Niveau (Bikel, I., Roberts, T.M., Bladon, M.T., Green, R., Amann, E. and Livingston, D.M. [1983] PNAS 80:906-910) und das 30%-Niveau (Amann, E., Brosius, J., und Ptashne, M. [1983] Gene 25:167-178) erreicht.
Die Niveaus der Proteinexpression sind vom genetischen Hintergrund der Wirtszelle abhängig. Es ist gezeigt worden, daß die Verwendung von Wirtszellen, die spezifische Mutationen enthalten, das Niveau eines klonierten Proteins erhöht. Zwei Gene, die lon- und pnp-Mutationen, haben in dieser Beziehung in großem Umfang Beachtung gefunden.
Die lon-Mutation ist dem capR-Bereich des E. coli-Genoms zugeordnet worden und es ist gezeigt worden, daß sie für eine ATP-abhängige Protease kodiert (Bukhari, A.I. und Zipser, D., [1973] J. Bact. 116:1469-1471; Shineberg, B. und Zipser, D., [1973] J. Bact. 116:1469-1471). Diese ATP-abhängige Protease ist eine der acht Proteasen, die in E. coli gefunden wurden (Chung, C.H. und Goldberg, A.L. [1981] PNAS 78:4931-4935; Sreedhara Swamy, K.H. und Goldberg, A.L. [1981] Nature 292:652-654). Es ist gezeigt worden, daß sie die Hauptprotease ist, die beim Abbau von Proteinen, die aus "Missense"- und "Nonsense"-Mutationen gebildet werden, beteiligt ist (Mount, D.W. [1980] Ann Rev. Genet. 14:297-319). Die pnp-Mutation ist dem Polyribonukleotid-Phosphorylase-Gen zugeordnet worden. Es ist gezeigt worden, daß Polyribonukleotid-Phosphorylase bei der Phosphorolyse von Ribonukleinsäure beteiligt ist und deshalb am Abbau von mRNA teilnimmt. Nachfolgende Untersuchungen haben eine 20- bis 100-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität von klonierter Katabolit-Dehydrogenase aus Pilzen gezeigt, wenn sie in pnp-Mutantenstämme kloniert wurde (Hautala, J.A., Bassett, C.L., Giles, N.H. und Kushner S.R. [1979] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5774-5778).
Diese Untersuchungen zeigten auch eine 4- bis 7-fache Erhöhung der Plasmidkopienzahl in diesen Mutantenstämmen. So könnte die Erhöhung der Enzymspezifischen Aktivität auf erhöhte mRNA-Synthese, verlängerte mRNA-Lebensdauer oder eine Kombination beider Phänomene zurückzuführen sein.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß das rop (Primer-Repressor)-Gen die Plasmidkopienzahl kontrolliert. 1980 wurde gezeigt, daß die Deletion eines nichtessentiellen Bereichs von von E. coli ColE1 abgeleiteten Plasmiden die Plasmidkopienzahl erhöht. Die Deletion dieses Bereichs erhöhte die Plasmid-DNA von 4% der chromosomalen DNA auf 20%. Diese Deletion war transrezessiv, da die Koinfektion des Wirts mit einem Wildtyp-Plasmid die Kopienzahl des Mutantenplasmids verringerte (Twigg, A.J. und Sherratt, D. [1980] Nature 283:216-218).
Jüngerer Stand der Technik berichtet über E. coli Expressionssysteme, worin Proteine, die für den E. coli-Wirt fremd sind, hergestellt werden, und offenbart Expressionsniveaus von etwa 25 bis 30% des gesamten Zellproteins. Simons et al. berichteten, daß Human-Gamma-Interferon auf Niveaus bis zu 25% des gesamten Zellproteins exprimiert wurde. Diese Arbeiter verwendeten den PL-Promotor des Phagen Lambda, welcher vom translationalen Initiationsbereich, der entweder von der Phage-MS2-Replikase oder dem E. coli Tryptophan-Attenuator-Bereich abgeleitet war, gefolgt wurde (Simons, G., Remaut, E., Allet, B., Devos, R. und Fiers,W. [1984] Gene 28:55-64). Amann et al. haben den Lambda-Repressor als 30% des gesamten Zellproteins unter Verwendung des tac-Promotorsystems exprimiert (Amman, E., Brosius, J. und Ptashne, M. [1983] Gene 25:167-178). Wie oben erwähnt, enthält dieser Promotor den -10-Bereich des lacUV5-Promotors und den -35-Bereich des trp-Promotors (DeBoer, H.A., Comstock, L.J., Yansura, D.G. und Heynecker, H.L. in "Promoters, Structure and Function", Praeger, New York [1982] 462-481 (R.L. Rodriquez and M.J.Chamberlin, Hrsg.).
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hybridproteine, die mit einem neuen biologischen System hergestellt werden. Das neue biologische System umfaßt einen prokaryotischen Wirt, der mit neuen Hybridplasmiden transformiert wurde, welche β-Glucuronidase-Gen-DNA (BG) und die gewünschte Protein-Gen-DNA enthalten. Hier wird spezifisch die Konstruktion von neuen Hybridplasmiden erläutert, die als Plasmid pBG9, Plasmid pBG5, Plasmid pBG3-2 und Plasmid pBG3-2 ΔN bezeichnet werden. Diese Plasmide umfassen β-Glucuronidase-Gen-DNA und Protein-A-DNA. Bei Verwendung zur Transformation eines geeigneten prokaryotischen Wirts wird die Produktion von Protein A-ähnlichen Verbindungen verwirklicht, d. h. Verbindungen, die vom nativen Protein A in der biologischen Schlüsselfunktion der Bindung von IgG an die Fc-Region des Moleküls nicht unterscheidbar sind. Vorteilhafterweise ist die Expression dieser Hybridproteine durch den transformierten Wirt beträchtlich höher als mit irgendeinem bekannten prokaryotischen Expressionssystem verwirklicht wurde. Beispielsweise werden die hier erläuterten Fusions(Hybrid)-Proteine auf Niveaus von mehr als 45% des gesamten E. coli Zellproteins in Wirtszellen, die entweder die lon- oder pnp-Mutation enthalten, erzeugt. Ebenso wird vorteilhafterweise nach dem Aufbrechen der Wirtszelle 100% des exprimierten Hybridproteins in der löslichen Cytosol-Fraktion gefunden. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zur Erfahrung vieler Fachleute, die fanden, daß relativ hohe Expression (etwa 7%) fremder Proteine in E. coli in der Produktion eines unlöslichen und inaktiven Proteins resultierte.
Das Plasmid pBG3-2 ΔN ist ein Beispiel für das Maximum des ultrahohen prokaryotischen Expressionssystems. Wirte, die mit diesem Plasmid transformiert wurden, exprimieren > 60% des gewünschten Fusionsproteins. Dieses ultrahohe Expressionsniveau wird durch teilweise oder vollständige Deletion oder anderweitige Inaktivierung des rop-Gens erreicht, indem eine ΔNde-Deletion im Plasmid pBG3-2 konstruiert wird. Dieses Verfahren kann für jedes Plasmid, das von dem E. coli ColE1-Plasmid abgeleitet und in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, verwendet werden, da alle diese Plasmide den rop-Bereich enthalten. Beispiele solcher Plasmide sind pBR322, pBR325 und pHC79.
Das Plasmid pBG3-2 ΔN kann dazu verwendet werden, ein BG/Protein A Fusionsprotein herzustellen, das 18 Aminosäuren von BG-abgeleiteten Sequenzen enthält und Protein A-Aktivität aufweist, d. h. IgG an die Fc-Region des Moleküls bindet.
Es ist überraschend, daß der mit den neuen Hybridplasmiden der vorliegenden Erfindung transformierte E. coli-Wirt das BG/Protein A Fusionsprodukt in ultrahohen Mengen exprimiert, angesichts der bekannten Tatsache, daß BG in sehr geringen Mengen von seinem nativen E. coli-Wirt exprimiert wird. Es wird angenommen, daß diese BG-Expression auf niedrigem Niveau durch natives E. coli Fachleute davon abgehalten hat, BG-Promotor-DNA in prokaryotischen Expressionssystemen zu verwenden. Stattdessen sind die lac- und trp-Promotoren in prokaryotischen Expressionssystemen in großem Umfang verwendet worden.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem, wie durch die Fusion mit dem Protein A-Gen oder Fragmenten davon beispielhaft gezeigt, kann vorteilhaft verwendet werden, wenn es mit anderen Genen, die für andere nützliche Proteine, z. B. Interferone, Interleukine, Insuline, Wachstumshormone und industrielle Enzyme, z. B. Amylasen, Proteasen und Zuckerisomerasen, kodieren, fusioniert wird, indem den hier beschriebenen Verfahren und begleitenden, im Stand der Technik bekannten Verfahren, gefolgt wird.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SCHAUBILDER

Fig. 1: Diese Zeichnung zeigt die Konstruktion eines intermediären Plasmids aus dem Plasmid pAc37. Das Plasmid pAc37 umfaßt das Protein A-Gen und die gesamte DNA von pBR322.
Fig. 2: Gezeigt sind die Restriktionskarten mit Gen-DNA-Insertionen für die Plasmide pBG101-41 und pBG9. Die BamH1-Stellen, die während der Klonierung nicht wiederhergestellt werden, sind markiert (BamH1).
Fig. 3: Gezeigt ist die Konstruktion des Plasmids pBG5 aus dem Plasmid pBG9.
Fig. 4: Gezeigt ist die Konstruktion des Plasmids pBG3-2 aus pBG5 und dem Plasmid pBR325.
Fig. 5: Gezeigt ist die Konstruktion des Plasmids pBG3-2 ΔN aus dem Plasmid pBG3-2.
Schaubild A: Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz des Protein A von Staphylococcus aureus kodiert.
Schaubild B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz des Hybridplasmids pBG9 und die Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins.
Schaubild C: Gezeigt ist die DNA-Sequenz des Hybridplasmids pBG5 und die Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins.
Schaubild D: Gezeigt ist die DNA-Sequenz des Hybridplasmids pBG3-2 und die Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Vor der detaillierten Beschreibung der Konstruktion und Identität der neuen Plasmide, Proteine und des Expressionssystems der vorliegenden Erfindung werden die eingesetzten Materialien und Verfahren beschrieben.

(1) Plasmid-DNA-Herstellung

Das Verfahren, das zur Herstellung von Plasmid-DNA in großem Maßstab verwendet wurde, war im wesentlichen wie folgt: Eine 250 ml Kultur wurde bis zur logarithmischen Phase gezüchtet, bei 0,6 bis 0,7 OD mit Chloramphenicol amplifiziert (oder alternativ ohne Chloramphenicol-Zugabe) und über Nacht gezüchtet. Die Zellen wurden bei 6K, 20 Minuten, in einem JA14-Rotor pelletiert und in 6 ml Glukosepuffer (50 mM Glukose, 25 mM Tris, 10 mM EDTA) suspendiert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1 ml 20 mg/ml frisch hergestelltem Lysozym inkubiert; mit Zugabe von 13,8 ml 1% SDS in 0,2 N NaOH 5 Minuten lang auf Eis gestellt und weitere 15 Minuten mit 7 ml 5 M KAc (pH 5,0-5,5) auf Eis gehalten. Die Zelltrümmer wurden 10 Minuten lang bei 10K pelletiert und der Überstand einmal mit einem gleichen Volumen Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1, gesättigtes TE, 0,1% 8-Hydroxychinolin) extrahiert. Nach der Fällung mit 0,6 Volumina Isopropanol wurde die DNA über CsCl-Gradienten gereinigt.

(2) Verdauung mit Restriktionsenzymen und Isolierung der gewünschten Fragmente

Die Verdauungen wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Trennung der Fragmente wurde durch Agarosegelelektrophorese (unten beschrieben) erreicht. Die elektrophoresierte DNA wurde durch Leiten über "Elu-tip"-Säulen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) nach Angaben des Herstellers, gefolgt von der Fällung in 2,5 Volumina EtOH mit Zugabe von Träger-tRNA, gereinigt und konzentriert.

(3) Minilysat-Plasmidanalyse

Mit transformierten Zelle wurden 1 ml L-Broth, die entweder mit 10 ug/ml Tetracyclin oder 50 ug/ml Ampicillin ergänzt war, angeimpft und 3-5 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch 15 minütige Zentrifugation bei 10000 x g gesammelt und dann in 50 ul STET-Puffer (8% Sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) resuspendiert. 50 ul Lysozym-Lösung (2 mg/ml in STET-Puffer) wurden zugegeben und die Röhrchen 4 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann 3 Minuten lang auf 100ºC erwärmt. Die Röhrchen wurden dann auf Eis auf 0ºC abgekühlt. Nach 5 Minuten bei 0ºC wurde das unlösliche Material durch 15 minütige Zentrifugation bei 10000 x g entfernt. Ein gleiches Volumen an eiskaltem Isopropanol wurde zum Überstand zugegeben und die Röhrchen 5 Minuten lang bei -70ºC gehalten. Der DNA-Niederschlag wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei 10000 x g gesammelt und in 10-25 ul TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert. Der Restriktionsverdau der DNA wurde wie oben beschrieben durchgeführt, unter Verwendung von 5 ul Plasmidlösung in einem Endvolumen von 15 ul, das 6,7 ug/ml RNase A enthielt.

(4) DNA-Ligierungen

T4-Ligase wurde sowohl bei Ligierungen mit kohäsiven als auch mit glatten Enden eingesetzt und war in jedem Fall im Überschuß vorhanden (200 Einheiten/ug DNA). Für kohäsive Enden betrug die Inkubationszeit 2-4 Stunden bei 16ºC, und für glatte Enden wurde die Zeit auf 16 Stunden erhöht. Bei Standard-Vektor-Insert- Ligierungen war das Insert in einem 5-fachen molaren Überschuß bei 0,02 pmol Vektor und 0,1 pmol Insert in einem 20 ul Reaktionsvolumen vorhanden. Für die Erzeugung von Deletionsmutanten durch eine unimolekulare Rezirkulationsreaktion wurde das Plasmid nach dem Restriktionsendonukleaseverdau auf 1 ug/ml verdünnt und ligiert. Die glattendige Linker-Ligierung wurde mit einem 100-fachen molaren Überschuß an Linker durchgeführt, bei einer Konzentration des Vektors von 0,02 pmol/20 ul Reaktion.

(5) Transformation

Frische Übernacht-Kulturen wurden in L-Broth verdünnt und bei 37ºC unter Rühren wachsen gelassen, bis eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3 erhalten wurde. Die Zellen wurden auf Eis abgekühlt und dann durch Zentrifugation (10 Minuten bei 4100 x g) gesammelt. Die Zellen wurden in der Hälfte des ursprünglichen Volumens an eiskaltem 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert und 20 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden wieder wie oben durch Zentrifugation gesammelt und in eiskaltem 50 mM CaCl&sub2; (1/25 des ursprünglichen Volumens) resuspendiert. 0,1 ml der Zellsuspension wurden mit 1-10 ul (50-100 ng) der DNA-Plasmidlösung gemischt und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Die Zellen wurden dann 2 Minuten lang auf 37ºC erwärmt und auf L-Broth-Platten ausplattiert, die 1,5% Agar und entweder 10 ug/ml Tetracyclin oder 50 ug/ml Chloramphenicol, wenn pBR325-Derivate transformiert werden, enthielten. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Es wurden routinemäßig Transformationseffizienzen von 1·10&sup6; Kolonien pro ug Plasmid-DNA beobachtet.

(6) Agarose-Elektrophorese

DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese in 0,8% Agarose in 2 x Tris- Borat-Puffer (178 mM Tris, 178 mM Borsäure, 5 mM Na&sub2; EDTA, pH 8,4) isoliert. Analytische und präparative Gele wurden in einem horizontalen Gelbehälter bei 60 Volt in Elektrophoresepuffer (1 x Tris-Borat) eingetaucht gefahren. DNA-Banden wurden unter UV-Licht durch Einschluß von 5,0 ug/ml Ethidiumbromid (EtBr) im Gel sichtbar gemacht. Eine Scheibe, die die gewünschte DNA-Bande enthielt, wurde aus dem Gel geschnitten und die DNA durch Elektrophorese in 1 x Tris-Borat-Puffer in einem Dialyseschlauch (1,27 cm (1/2 Inch) Durchmesser), der 0,5-1,0 ml Puffer enthielt, wiedergewonnen. Die Elektrophorese wurde 30 Minuten lang bei 10 Volt durchgeführt oder bis das gefärbte Material an der Seite des Dialyseschlauches lokalisiert war. Die Gelscheibe wurde aus dem Dialysebeutel entfernt und die DNA wiedergewonnen, indem der Beutel wiederholt mit Tris-Borat-Puffer gespült wurde. Zur DNA-Lösung wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben und das Ethidiumbromid und Agarosegel-Verunreinigungen durch zwei Extraktionen mit Phenol, das mit Tris-Borat-Puffer gesättigt war, entfernt. Das Phenol wurde durch zwei Extraktionen mit Ether entfernt und die gereinigte DNA durch Fällung mit 1/50 Volumen 5 M NaCl und 2,5 Volumina kaltem Ethanol wiedergewonnen. Die Fällungsreaktion wurde bei -70ºC 15-20 Minuten lang durchgeführt. Die gefällte DNA wurde durch 15 minütige Zentrifugation bei 10000 x g wiedergewonnen. Die Ausbeute des wiedergewonnenen Fragments wurde durch direkten Vergleich der Ethidiumbromid-Fluoreszenz mit reinen DNA-Standards überprüft. Typischerweise wurden 50%-Ausbeuten erhalten, wobei die Ausbeute mit wachsender Fragmentgröße abnahm.

(7) Protein A Radioassay

Die Protein A-Aktivität wurde bestimmt durch Beschichten von Dynatech Immunolon (Dynatech Diagnostics, Inc., South Windham, ME) 1 Mikrotiter-Vertiefungen mit 50 ul einer 1:10000 Verdünnung von normalem Kaninchenserum (NRS) und 4-stündige Inkubation bei Raumtemperatur. Das NRS wurde von den Vertiefungen geschüttelt, die dann mit 1% Ovalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (OVA/PBS) durch einstündige Inkubation bei 4ºC blockiert wurden. Die Vertiefungen wurden geleert und dann 25 ul Proben, die zwischen 0,1 und 1000 ng Protein A enthielten, zu jeder Vertiefung zugegeben. In jedem Assay wurde eine Standardkurve unter Verwendung von handelsüblichem Protein A gefahren. Alle Verdünnungen waren in OVA/PBS. 25 ul ¹²&sup5;I-Protein A (6000 cpm) in OVA/PBS wurden zur jeder Vertiefung zugegeben und die Platten 16 Stunden lang bei 37ºC in einem versiegelten Kunststoffbehälter, der ein kleines Becherglas Wasser enthielt, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen abgesaugt und dreimal mit PBS und einmal mit Wasser gewaschen. Die Vertiefungen wurden getrocknet und 2 Minuten lang in 2 ml Aquasol (New England Nuclear Corp., Boston, MA) in einem Beckman-Beta-Zähler, Modell LS7000 (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) gezählt.

(8) Protein A "Rocket"-Immunelektrophorese

Die Konzentration und Aktivität von Protein A wurde durch "Rocket"- Immunelektrophorese in einem 1% Agarosegel bestimmt, das 31 ug/ml Human-IgG in Tris-Glycin-Puffer (3,75 g/l Tris-Base, 7,5 g/l Glycin), pH 8,6, enthielt. Protein A-Standards zwischen 0,25 und 1,0 ug liefen auf jedem Gel mit. Die Elektrophorese wurde 3 Stunden lang bei 400 Volt fortschreiten gelassen, unter Verwendung von Tris-Glycin als Elektrophoresepuffer. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet, dann kurz mit Coomassie-Blau gefärbt und mit 5% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt.

(9) Zell-Homogenisierung

Transformierte Zellen wurden durch 5 minütige Zentrifugation bei 12000 x g und 4ºC gesammelt und in 0,5 Volumina HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure)/KCl/DTT (Dithiothreit)-Puffer (6 g HEPES pH 8,0, 7,5 g KCl, 0,15 g DTT pro Liter) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit Lysozym bei einer Endkonzentration von 300 ug/ml 30 Minuten lang bei 37ºC verdaut. Die Suspension wurde mit zwei 5 Minuten langen Impulsen bei 300 Watt auf Eis ultrabeschallt. Das lösliche Protein wurde durch 30 minütige Zentrifugation bei 25000 x g und 4ºC isoliert. Der Überstand wurde entfernt und der Niederschlag in einem gleichen Volumen von HEPES/KCl/DTT-Puffer suspendiert. Bei Experimenten, bei denen man Gesamtzellprotein auf SDS-Gelen laufen ließ, wurden die Zellen durch Erhitzen auf 100ºC 5 Minuten lang in 5 Volumina SDS-Homogenisierungspuffer (50% V/V Glycerin, 5% V/V 2-Mercaptoethanol, 5% G/V Natriumdodecylsulfat, und 0,005 mg/ml Pyronin Y) solubilisiert.

(10) Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Analyse

Alle SDS-Gele wurden nach dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, U.K. [1970] Nature [London] 227:680-685) gefahren. Diese Gele enthielten eine Gesamtacrylamidkonzentration von 12%. Plattengele waren 1,5 mm dick und wurden in einer Elektrophoresevorrichtung von Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, CA) gefahren. Röhrengele wurden in Glasröhren mit 6 mm Innendurchmesser · 10 cm ohne "Stacking"-Gel gefahren. Die Western-Blots wurden mit Nitrocellulosefiltern durchgeführt. Protein wurde auf die Filter bei 200 mA 12 Stunden lang übertragen. Die Filter wurden 4 Stunden lang mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur blockiert und entweder mit 10 uCi [1¹²&sup5;I]-IgG (NEN) oder 100 ul Kaninchen-IgG, das mit Peroxidase konjugiert war, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren hybridisiert. Die Blots wurden dann viermal mit PBS gewaschen und einem Kodak XAR-5 Röntgenfilm ausgesetzt oder mit 25 mg Diaminobenzidin in 100 ml PBS mit 25 ul H&sub2;O&sub2; entwickelt.

(11) Messung des Protein A-Gehalts in klonierten Zellen

Nach der Fermentierung wurden die Zellen in 20 mM Tris-HCL, pH 8,3, mit 0,5% Triton X-100 durch mechanisches Verwirbeln ("Vortexen") mit Glaskügelchen oder in einer DyanoMill-Kugelmühle, Modell KDL-Pilot (von Impandex, Maywood, N.J.), die bei Maximalgeschwindigkeit betrieben wurde und mit Glaskügelchen von 0,2 mm Durchmesser beladen war, homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch Zentrifugation bei 16000 x g 30 Minuten lang geklärt und die Proteinkonzentration des Überstands durch den Lowery-Protein-Test oder mit Biuret gemessen. Protein A- Konzentration wurde durch "Rocket"-Immunelektrophorese gegen Human-IgG gemessen.

(12) HPLC-Reinigung von Proteinen

Protein A und Protease K wurden gereinigt oder getestet durch HPLC, unter Verwendung einer Beckman Modell 360 Gradientenvorrichtung (Beckman Instruments, Inc.), die mit einer Waters uBondapak C18 Säule (Waters Associates, Milford, MA) versehen war. Protein A wurde durch einen linearen Gradienten zwischen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2 (Puffer A) und 60% v/v Isopropanol, 10 mM Phosphat (Puffer B) gereinigt. Die Säule wurde bei einer Flußrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100% Puffer B über 80 Minuten eluiert. Auf ähnliche Weise wurde Protease K gereinigt und Protein A getestet, mit der Ausnahme, daß der Puffer A 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt und der Puffer B 0,08% TFA in Acetonitril enthielt. Die Säule wurde bei einer Flußrate von 2 ml/min mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 60% Puffer B 60 Minuten lang eluiert.

(13) Fermentierung

Die Fermentierung wurde in einem 20 l Chemapec-Fermenter (Chemapec, Inc., Woodbury, NY), der mit do&sub2;- und pH-Kontrolle ausgerüstet war, durchgeführt. Die rekombinanten Zellen wurden bei einer do&sub2; von 50% (Luft = 100%) und dem angegebenem pH-Wert gezüchtet. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 5M NH&sub4; OH oder 5 M H&sub2;SO&sub4; nach Bedarf eingestellt. Der Schaum wurde durch Zugabe von Antischaum B (E.I. Du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) geregelt. Die Fermentierungstemperatur betrug 37ºC; alle Fermentierungen wurden mit einem Endvolumen von 9,5 l durchgeführt.

(14) Bakterienstämme und Medien

Quelle und Genotyp aller verwendeten Bakterienstämme sind unten angegeben. Alle Stämme wurden unter Verwendung von YT-Medium (8 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Natriumchlorid) aufrechterhalten und gezüchtet.

(15) Chemikalien

Nitrocellulose wurde von Schleicher und Schuell (Keene, NH) erhalten. Wachstumsmedien wurden von Difco (Detroit, MI) erhalten. Acrylamid wurde von Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY) erhalten. Protein A- Standard wurde von Pharmacia (Piscataway, NJ) erhalten. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. (16) Kulturen (A) Bakterien - Alle hier offenbarten E. coli-Stämme sind E. coli K-12 Derivate. Stämme Relevanter Genotyp Hinterlegungsnummer hinterlegt am 18. August 1982 hinterlegt am 12. Dezember 1984 aus den im folgenden aufgeführten hinterlegten Kulturen nach Standardverfahren erhältlich Plasmid-enthaltender Bakterienwirt Wirt Hinterlegungsnummer hinterlegt am 18. August 1982 hinterlegt am 1. November 1984 hinterlegt am 20. November 1984 hinterlegt am 20. November 1984 hinterlegt am 20. November 1984 hinterlegt am 20. November 1984

(C) Plasmide

Das Plasmid pBR322 ist ein bekanntes und verfügbares Plasmid. Es wird in dem E. coli-Wirt ATCC 37017 aufbewahrt. Gereinigte pBR322-DNA kann wie in Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J. Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. and Falkow, s. (1977) Gene 2:95-113; und Sutcliffe, J.G. (1978) Nucleic Acids Res. 5:2721-2728, beschrieben erhalten werden. Plasmid pBR325 ist ebenfalls ein wohlbekanntes Plasmid. Es kann von BRL Inc., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877 erhalten werden.
NRRL B-15907, NRRL B-15908, NRRL B-15909, NRRL B-15910 und NRRL B-15918 etc. befinden sich in der permanenten Sammlung des Northern Regional Research Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA.
Es gibt andere bekannte E. coli-Wirte, die statt E. coli PR13 verwendet werden können, beispielsweise E. coli MS371, HB101, und E. coli GMS407 (Novel, M. und Novel, G. [1973] Mol. Gen. Genet. 120:319).
Darüber hinaus sind andere verwendbare prokaryotische Wirte Mikroorganismen der Gattungen Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, Strentomyces und dgl.

(17) Isolierung von rekombinanter Plasmid-DNA aus einem transformierten Wirt

Rekombinante Plasmid-DNA kann durch wohlbekannte Verfahren aus ihrem prokaryotischen Wirt isoliert werden, z. B. unter Verwendung von Klarlysatisopyknischen Dichtegradientenverfahren und dgl.

(19) DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzbestimmung wurde ausgeführt wie von Maxam und Gilbert (Maxam, A. und Gilbert, W. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) und Heidecker et al. (Heidecker, G., Messing, J., und Gronenborn, B. [1980] Gene 10:69) beschrieben.

Konstruktion von Hybridprotein-Genen

Die Konstruktion der Hybridprotein-Gene, die hier als repräsentativ für die Erfindung beschrieben werden, wurde mit der Verwendung des Plasmids pBG101-41 begonnen. Dieses Plasmid enthält etwa 6 kb E. coli β-Glucuronidase Gen-DNA, die in der BamH1-Stelle des Plasmids pBR322 eingebaut ist. Das Plasmid pBG101-41 wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH1 geschnitten und durch kurze Behandlung mit Bal-31 Exonuklease glattendig gemacht. Diese Exonuklease- Behandlung entfernte 12 Basen und hinterließ ein glattes Ende.
Die DNA zur Insertion in das geschnittene und glattendige pBG101-41 wurde aus dem Plasmid pAc37 erhalten, welches das Stanhylococcus aureus Protein A-Gen in pBR322 enthält. Siehe Fig. 1 der Zeichnung.
Das geschnittene und glattendige Plasmid pBG101-41 wurde mit dem glattendigen/Cla1-Protein A Fragment ligiert, um das Hybridplasmid pBG9 zu ergeben. Das Plasmid pBG9 enthält 501 Nukleotide, die für die N-terminalen 167 Aminosäuren des β-Glucuronidaseproteins, fusioniert an das Protein A-Gen, kodieren. Siehe Fig. 2 der Zeichnung.
Das Hybridplasmid pBG5 wurde aus dem Hybridplasmid pBG101-41 und dem Hybridplasmid pBG9 konstruiert. Siehe Fig. 3 der Zeichnung. Das Plasmid pBG101-41 wurde mit BamH1 geschnitten und dann mit Bal-31 Exonuklease (IBI-fast Bal-31) verdaut. Die resultierende DNA wurde mit Cla1 verdaut und Insert-DNA, die wie im folgenden beschrieben hergestellt wurde, ligiert.
Die Insert-DNA für die obige Ligierung, die die kodierenden Sequenzen für das reife Protein A enthält, wurde aus dem Hybridplasmid pBG9 hergestellt, indem dieses Plasmid mit den Restriktionsenzymen Cla1 und Fnu4H1 geschnitten wurde.
Die Insert- und Vektor-DNA wurden ligiert und in den E. coli-Stamm PR13 transformiert und aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt. Ein Klon mit der Bezeichnung pBG5 enthielt das vorhergesagte Restriktionsprofil. Die Sequenzanalyse dieses Klons durch das Standard-M13-Verfahren zeigte, daß 18 Aminosäuren der BG-kodierenden Sequenz verblieben.
Das Hybridplasmid pBG3-2 wurde dem Plasmid pBG5 und dem Plasmid pBR325 konstruiert. Siehe Fig. 4 der Zeichnung. Das Plasmid pBG3-2 enthält dieselbe DNA wie das Plasmid pBG5, mit der Ausnahme, daß pBG5 pBR322-DNA enthält und pBG3-2 pBR32S DNA enthält; pBG3-2 enthält auch einen Stopcodon-Linker an der ClaI- Stelle am Ende der Protein A Gen-DNA. Das konstruierte Linkersegment der DNA enthielt Stopcodons in allen drei Leserahmen. Es wurde in die ClaI-Stelle in der pBG3-2 Konstruktion eingeführt, um sicherzustellen, daß das Hybridprotein- Endprodukt keine von pBR325 abgeleiteten Aminosäuren enthielt.
Erhöhte Expression des Hybridproteins, das von dem fusionierten Gen im Plasmid pBG3-2 kodiert wurde, wurde durch Konstruktion einer ΔNde-Deletion erhalten, d. h., durch Entfernung der DNA zwischen der Nde-Stelle in pBR325 und der Nde-Stelle auf der BG-Sequenz. Diese Deletion entfernte den Hauptteil des rop-Gens in pBR325 ebenso wie die ersten 230 Basen des BG-Promoterbereichs. Diese Konstruktion ist als Plasmid pBG3-2 ΔN identifiziert. Wenn ein E. coli-Wirt mit pBG3-2 ΔN transformiert wird, exprimiert der Wirt Protein A auf Niveaus > 60% des gesamten E. coli-Proteins. Im Vergleich dazu wird Protein A in E. coli zu 50% des gesamten Zellproteins in Wirtszellen, die das Plasmid pBG3-2 enthalten, exprimiert.

Verwendbarkeit von Protein A

Protein A wird in großem Umfang als Immunoabsorbens in einer Vielfalt von Testsystemen für Diagnose und Grundlagenforschung verwendet. Siehe US-Patent Nr. 4,322,274. Das kürzliche Interesse für Anwendungen des Proteins A konzentrierte sich auf seine mögliche klinische Verwendung bei der Krebsbehandlung. Sensitivierte periphere Blutlymphozyten, die normalerweise für die Zytotoxizität von Tumorzellen verantwortlich sind, werden Hypothesen zufolge in dieser Funktion durch Serum-Blockierungsfaktoren inhibiert, von denen man annimmt, daß sie aus spezifischen Antigenen, Antikörpern, Antiglobulinen und Immunkomplexen bestehen. Siehe Barnes, B.C. (1981) Cancer Bull. 33:278. Diese "Blockierungs-"Faktoren können aus Seren von Tumorträgern durch Absorption an S. aureus, Cowan I Zellen, die Protein A enthalten, entfernt werden, um auf diese Weise zuzulassen, daß die zellvermittelte Tumorzelltoxiziät in in vitro Testsystemen fortschreitet. Siehe Steele, G., Ankerst, J., und Sjogren, H. (1974) Int. J. Cancer 14:85. Protein A aktiviert auch polyklonale Antikörpersynthese unabhängig von seiner IgG- Bindungsaktivität. Siehe Sjodahl, J. und Moller, G. (1979) Scand. J. Immunol. 10:593.
Ausführliches Testen von Protein A als Krebsbekämpfungsmittel ist durch die hohen Kosten des Materials und durch die Anwesenheit von Verunreinigungen in einigen Protein A-Präparationen behindert worden. Sollten die Kosten von Protein A-Präparationen wesentlich verringert und die Reinheit verbessert werden, würden weitere klinische Tests von Protein A für Krebsbekämpfungszwecke schneller fortschreiten.
Mit den hier offenbarten Daten können Fachleute leicht die Identität anderer äquivalenter Nukleotidsequenzen feststellen, die für Moleküle mit im wesentlichen derselben Protein A-ähnlichen biologischen Aktivität kodieren. So schließt der Umfang dieser Erfindung nicht nur die spezifische oben gezeigte Nukleotidsequenz ein, sondern auch alle äquivalenten Nukleotidsequenzen, die für Moleküle mit im wesentlichen derselben identifizierbaren Protein A-ähnlichen biologischen Aktivität kodieren. Der Terminus "äquivalent" wird hier verwendet wie bei Patenten üblich, als Bezeichnung einer Nukleotidsequenz, die sich im wesentlichen wie die hier identifizierte Nukleotidsequenz verhält, um Moleküle mit im wesentlichen derselben identifizierbaren Protein A-ähnlichen biologischen Aktivität in im wesentlichen derselben Art von Wirten zu erzeugen. Eingeschlossen in diese Definition sind Subfragmente des Protein A-ähnlichen Materials, die die Eigenschaft der Bindung von IgG an die Fc-Region aufweisen, oder Subfragmente, die polyklonale B-Zellen-aktivierende Aktivität aufweisen. Das Plasmid pAc37, das in Beispiel 1 beschrieben ist, enthält die gesamte Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz des Staphylococcus aureus Protein A kodiert. Diese Sequenz, die im Schaubild A gezeigt ist, ermöglicht es Fachleuten, klonierte Nukleotidsequenzen zu erhalten, die für identifizierbares Protein A-ähnliches Material und identifizierbare Subfragmente von Protein-ähnlichem Material, wie es oben definiert ist, kodieren. Das identifizierbare Protein A-ähnliche Material der vorliegenden Verbindung und die identifizierbaren Protein A-ähnlichen Subfragmente davon können auf dieselbe Weise wie das oben offenbarte Protein A verwendet werden.
Es folgen Beispiele, die Verfahren zur Durchführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sollen nicht als beschränkend verstanden werden. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittelverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, soweit nicht anders angegeben.

Beispiel 1--Konstruktion des Hybridplasmids pBG9 aus dem Plasmid pBG101-41 und dem Plasmid pAc37 und Expression des Protein A-Fusionsprodukts

Das Plasmid pBG9, das den β-Glucuronidase-Promotor und das β-Glucuronidase- Protein A-Hybridgen enthält, wurde aus dem Plasmid pBG101-41 und dem hier beschriebenen glattendigen/CalI Protein A-Fragment konstruiert. Das Plasmid pBG101-41 wurde an der nur einmal vorkommenden BamHI-Stelle (179 Aminosäuren nach dem Start-Methionin lokalisiert) geöffnet und durch kurze Behandlung mit Bal31 Exonuklease glattendig gemacht (wie vom Hersteller beschrieben) Diese Exonuklease-Behandlung entfernte 36 Basen (12 Aminosäuren) und hinterließ ein glattes Ende. Das Plasmid wurde weiter mit ClaI an der nur einmal vorkommenden Stelle im Plasmid pBR322 geschnitten.
Das Plasmid pAc37 enthält das Protein A-Gen in pBR322. Das Plasmid pAc37 wurde mit Rsa verdaut, welches das Protein A-Gen an Position 65 und 1264 nach dem TTG-Startcodon (T=1) spaltet. Das 1199 Basenpaar Rsa-Fragment wurde durch Agarose-Elektrophorese isoliert. ClaI-Linker (New England Biolabs, Beverly, MA, Sequenz CATCGATG) wurde mit dem isolierten Rsa-Fragment fusioniert. Diese Konstruktion wurde mit ClaI geschnitten und in die ClaI-Stelle von pBR322 eingebaut, um ein intermediäres Plasmid mit der Bezeichnung pA1 zu bilden. Das Plasmid pA1 wurde partiell mit ClaI verdaut und das ClaI-kohäsive Ende in einer Reaktion aufgefüllt, die 2 mM an jedem der 4 Desoxynukleotidtriphosphate und 5 Einheiten des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase I in 25 ul 50 mM Tris- Cl, pH 7,2, 10 mM Mg&sub2;SO&sub4;, 0,1 mM DTT, 50 ug/ml BSA und 1 ug des Restriktionsfragments enthielt. Die Auffüllreaktion wurde 20 Minuten bei 22ºC inkubiert und durch Wärmeinaktivierung bei 70ºC 10 Minuten lang gestoppt. Das Plasmid wurde dann mit SalI verdaut und das 1826 Basenpaar-Fragment durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde weiter mit ClaI geschnitten und in das geschnittene oben beschriebene Plasmid eingebaut (siehe Fig. 1 der Zeichnung).
Die DNA-Sequenz des Plasmids pBG9 und die Aminosäuresequenz des von E. coli PR13(pBG9) exprimierten Fusionsproteins sind im Schaubild B gezeigt.

Plasmid pBG9 und Plasmid pBG101-41 und Expression des Protein A-Fusionsprodukts

Das Plasmid pBG101-41 besteht aus pBR322, das an der BamHI-Stelle geöffnet worden ist, unter Insertion der SauI Partialsequenzen, die den BG-Promotor und die für BG kodierenden Domänen enthalten. Das Plasmid pBG101-41 wurde mit BamHI geschnitten, welches dieses Plasmid an einer Stelle 179 Aminosäuren nach dem Methionin-Startcodon spaltet, dann mit Bal-31 Exonuklease (IBI-fast Bal-31) bei einer Enzymkonzentration von 20 U/ml und einer DNA-Konzentration von 100 ug/ml verdaut. Die Reaktion wurde bei 30ºC fortschreiten gelassen. Nach 10 Minuten, 15 Minuten und 20 Minuten wurde ein Drittel des Verdaus entfernt und die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis 20 mM, gefolgt von Einfrieren bei -80ºC, gestoppt. Die Zeitpunkte wurden einzeln mit Phenol-Ether extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde mit ClaI, welches in der nur einmal vorkommenden Stelle in pBR322 schneidet, verdaut und dann die Insert-DNA ligiert.
Insert-DNA, welche die kodierenden Sequenzen für das reife Protein A enthielt, wurde aus dem Plasmid pBG9 hergestellt. Dieses Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und Fnu4HI geschnitten. Die Restriktionsendonuklease Fnu4HI schneidet das Protein A-Gen eine Base zum 5'-Ende des Signalpeptid- Spaltungspunkts hin und ClaI schneidet das Gen in den C-terminalen wiederholten Domänen. Diese ClaI-Stelle wurde durch Ligierung eines ClaI-Linkers an die Rsa- Stelle, die 284 Basenpaare vom 3'-Ende des Protein A-Gens lokalisiert ist, konstruiert.
Insert- und Vektor-DNA wurden in einem 4:1 Verhältnis von Insert zu Vektor in einer Reaktion mit 20 ug/ml Vektor-DNA zusammen ligiert. Der T4-Ligasekatalysierten Reaktion wurde erlaubt, über Nacht bei 15ºC fortzuschreiten; dann wurde die Ligase durch 15 minütiges Erwärmen auf 70ºC inaktiviert. Die Reaktionsmischung wurde mit Xho (das an einer nur einmal vorkommenden Stelle im BG- Protein schneidet) verdaut, um die Transformation jeglicher Plasmide, die eine BG-Deletion enthalten, zu verhindern. Die Reaktionsmischung wurde in den E. coli- Stamm PR13 transformiert und aus den Transformanten Plasmid-DNA hergestellt. Ein Klon mit der Bezeichnung pBG5 enthielt das vorhergesagte Restriktionsprofil. Die Sequenzanalyse dieses Klons durch das M13-Verfahren zeigte, daß 18 Aminosäuren der BG-kodierenden Sequenz verblieben (siehe Fig. 3 der Zeichnung).
Die DNA-Sequenz des Plasmids pBG5 und die Aminosäuresequenz des durch E. coli PR13(pBG5) exprimierten Fusionsproteins sind im Schaubild C gezeigt.

Beispiel 3--Konstruktion des Hybridplasmids pBG3-2 aus dem Plasmid pBG5 und dem Plasmid pBR325 und Expression des Protein A-Fusionsprodukts

Das Plasmid pBR325 wurde mit ClaI und SalI verdaut und das 5368 Basenpaar- Fragment, welches die Hauptmenge der kodierenden Plasmidsequenzen enthielt, wurde durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Das Plasmid pBG5 wurde ebenfalls mit ClaI und SalI verdaut und das 2000 Basenpaar-Fragment, welches den BG-Promotor und die kodierenden Sequenzen für Protein A enthielt, durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Diese beiden DNA-Fragmente wurden in einem gleichen molaren Verhältnis bei 30 ug/ml pro Fragment gemischt und mit T4 Ligase ligiert. Das resultierende Produkt wurde mit ClaI verdaut und das resultierende lineare Molekül von 7,4 kb durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Ein Linker-DNA-Fragment, das die Stopcodons enthielt, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde in einem großen molaren Überschuß zugegeben und die Reaktion über Nacht bei 15ºC mit T4 Ligase ligiert. Das geschlossene zirkuläre Plasmid wurde mit ClaI und SmaI verdaut, um Plasmide, die mehrfache oder keine Stop-Linker enthielten, zu linearisieren und dann in E. coli PR13 transformiert (siehe Fig. 4 der Zeichnung).
Die DNA-Sequenz des Plasmids pBG3-2 und die Aminosäuresequenz des durch E. coli PR13(pBG3-2) exprimierten Fusionsproteins sind im Schaubild D gezeigt.

Beispiel 4--Konstruktion eines Stop-Linkers

Ein DNA-Linkersegment, das Stop-Codons in allen drei Leserahmen enthält, wurde in die ClaI-Stelle in der pBG3-2-Konstruktion eingebaut, um sicherzustellen, daß das Endprodukt keine von pBR abgeleiteten Aminosäuren enthielt. Ein synthetisches DNA-Segment mit der Sequenz CGGGCGCGCTAGCTAGCGCGCC wurde unter Verwendung einer "Applied Biosystems" DNA-Synthesemaschine, Modell 380A (Foster City, CA) durch das vom Hersteller vorgeschlagene Verfahren synthetisiert. Diese Sequenz ist selbstverschmelzend und ergibt das doppelsträngige DNA-Fragment:
C G G G C G C G C T A G C T A G C T A G C G C G C C
C C G C G C G A T C G A T C G A T C G C G C G G G C
welche die Stopsequenzen CTAGCTAGCTAG und die BssHI-Stelle: CCGCGC an beiden Enden des dreiphasigen Stops enthält.

Beispiel 5--Konstruktion des Plasmids pBG3-2/ΔN aus dem Plasmid pB&3-2

Das Plasmid pBG3-2 wurde mit der Restriktions-Endonuklease Nde verdaut und das geschnittene Plasmid mit Phenol-Ether extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Plasmid wurde bei einer verdünnten DNA-Konzentration (12 ug/ml), um intermolekulare Rezirkularisation ohne den Einbau des Nde-Fragments zu begünstigen, religiert, um das Plasmid pBG3-2/ΔN zu ergeben. Mit der Reaktionsmischung wurde E. coli PR13 transformiert und die Kolonien durch Minilysat-Analyse überprüft. Siehe Fig. 5 der Zeichnungen.

Beispiel 6--Transformation der Plasmide pBG3-2, pBG3-2ΔN, pBG9 und pBG5 in E. coli PR13 oder E. coli SG20251

E. coli PR13 oder E. coli SG20251 wurden aus frischen Über-Nacht-Kulturen geerntet, wie in (5) Transformation beschrieben.
Die Zellen wurden zur Transformation durch Behandlung mit Calciumchlorid kompetent gemacht, wie beschrieben.
Plasmid-DNA wurde aus Zellen, welche das Plasmid beherbergten, nach den (1) Plasmid-DNA-Herstellung beschriebenen Verfahren hergestellt.
0,1 ml der kompetenten Zellen wurden mit 50-100 ng Plasmid-DNA 30 Minuten lang bei 0ºC gemischt. Die Zellen wurden 2 Minuten lang auf 37ºC erwärmt und dann auf L-Broth-Platten, die 1,5% Agar und entweder 10 ug/ml Tetracyclin oder 50 ug/ml Chloramphenicol, wenn pBR325-Derivate transformiert werden, enthielten, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Es wurde routinemäßig Transformationseffizienzen von 1·10&sup6; Kolonien pro ug Plasmid-DNA beobachtet.

Beispiel 7--Fermentierung von E. coli PR13(pBG3-2)

E. coli PR13(pBG3-2) kann mit irgendeinem aus einer Anzahl von Verfahren gezüchtet werden, die Fachleuten bekannt sind. Dieser Organismus wird auf jedem komplexen Medium wachsen, das imstande ist, das Wachstum von E. coli zu unterstützen, und auf jedem definierten Medium, wenn ein solches definiertes Medium ausreichend Wachstumsfaktoren und Metaboliten enthält, die nötig sind, um das Zellwachstum zu unterstützen. Im allgemeinen umfassen diese definierten Medien solche, die das Wachstum von E. coli unterstützen können, wenn sie die Aminosäuren Threonin und Leucin enthalten. Die Produktion von rekombinantem Protein durch diesen Organismus ist einer Katabolit-Repression unterworfen. So muß, wenn eine Proteinproduktion erwünscht ist, darauf geachtet werden, daß das Wachstumsmedium keine Glukose oder irgendeine Substanz enthält, die Katabolit-Repression verursachen kann. Katabolit-Repression wird bei E. coli durch interzellulären Abfall der cAMP-Spiegel vermittelt. So kann dieser Organismus in Gegenwart von Wachstumsmedien, die Glukose enthalten, gezüchtet werden, wenn solche Medien einen hohen cAMP-Spiegel, typischerweise 4 mM, enthalten oder wenn solche Medien hohe Spiegel eines Lipid-löslichen cAMP-Derivats enthalten, beispielsweise Dibuteryl-cyclisches AMP bei einer Konzentration von etwa 10 uM.
Im allgemeinen können hohe Niveaus an Protein A erzeugt werden, indem eine Impfprobe aus einem gefrorenen Vorrat von E. coli PR13 (pBG3-2) hergestellt wird, die auf YT/Cm Medium ausgestrichen und über Nacht gezüchtet wurde. YT enthält 8 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Trypton und 5 g/l NaCl. YT/Cm enthält 50 mg/l Chloramphenicol. Es wurde eine Kolonie von dieser Platte gepickt und damit 10 ml YT/Cm angeimpft, die bei 37ºC 6-12 Stunden gezüchtet wurden und dann direkt in den Fermenter überimpft.
E. coli PR13(pBG3-2) wurde in einem 20 l Chemapec-Fermenter (Chemapec, Woodbury, NY) gezüchtet, der mit 9,8 l von 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Trypton beschickt worden war. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde bei etwa 50% gehalten (Luft = 100%) und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 5 M NaOH oder 5 M H&sub2;SO&sub4; bei etwa pH 6,8 gehalten. Das normale Impfprobenvolumen beträgt etwa 10 ml. Mit dieser Impfprobe kann der Fermenter nach 9 Stunden Wachstum abgeerntet werden. Wenn Zellen auf diese Weise gezüchtet werden, ist 46% des gesamten von E. coli abgeleiteten Proteins, das im Fermenter produziert wird, Protein A.
Belege zeigen, daß das klonierte Protein A in einer aktiven Form exprimiert wird. Ein Western-Blot, der mit [¹²&sup5;I]-markiertem Kaninchen IgG getestet wird, zeigt, daß das Hybridprotein sogar nach einer Behandlung mit heißer SDS-Lösung und Elektrophorese in SDS-Polyacrylamidgelen IgG-Bindungsaktivität aufweist.
Die spezifische Aktivität von löslichem Protein A, das aus dem pnp- Wirtsstamm extrahiert wurde, wurde durch Radioassay (siehe (6) Protein A Radioassay) bestimmt. Dieser Assay zeigte, daß das Zellcytosol eine Protein A- Aktivität aufwies, die 35% der spezifischen Aktivität von reinem Handelsmaterial betrug. Die Protein A Konzentration in dieser cytosolischen Präparation wurde durch SDS-Gelelektrophorese zu 35% bestimmt, was anzeigte, daß das klonierte Material eine mit dem natürlich vorkommenden Protein im wesentlichen identische spezifische Aktivität aufweist.

Beispiel 8--Fermentierung von E. coli PR13(pBG3-2ΔN)

Wenn der rekombinante Organismus in einem Fermenter wie in (13) Fermentierung beschrieben, gezüchtet wird, so wie das Plasmid PBG3-2, ist das Plasmid pBG3-2ΔN einer Katabolit-Repression unterworfen. Die Medien und Bedingungen, die für E. coli PR13(pBG3-2) beschrieben sind, können ebenso zur Züchtung dieses Organismus verwendet werden. Überraschenderweise erzeugt E. coli, das das Plasmid pBG3-2ΔN enthält, ein außerordentlich hohes Niveau des rekombinanten Produkts. Die folgende Tabelle zeigt die Protein A-Expressionsniveaus von pBG9, pBG3-2 und pBG3-2/ΔN: Protein A-Expressionsniveaus Zahl der BG-Aminosäuren Expressionsniveau* *Protein A als Prozent des löslichen Zellproteins. Der Proteil A-Gehalt wurde durch "Rocket"-Immunelektrophorese bestimmt und das Gesamtprotein durch Biuret.

Beispiel 9--Isolierung eines mit einem Plasmid transformierten Wirts

Der Wirtsmikroorganismus, z. B. E. coli PR13, kann ohne das Plasmid, z. B. pBG9, mit dem es transformiert worden war, durch Standardverfahren zurückgewonnen werden. Beispielsweise kann der transformierte Wirt in YT-Medium, das 0,01% w/v SDS enthält, gezüchtet werden, um das Plasmid aus dem Wirt zu entfernen. Wirtszellen ohne Plasmid können aufgrund des Verlusts der Resistenz gegenüber Chloramphenicol und/oder Ampicillin gescreent werden.
Wie im Stand der Technik wohlbekannt, ist die Aminosäuresequenz eines Proteins, z. B. Protein A, durch die Nukleotidsequenz der DNA bestimmt. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, d. h. daß mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplett (Codon) für die meisten Aminosäuren verwendet werden kann, um Proteine zu bilden, können verschiedene Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäure kodieren. So kann der genetische Code wie folgt dargestellt werden:
Phenylalanin
Leucin
Isoleucin
Methionin
Valin
Serin
Prolin
Threonin
Alanin
Tyrosin
Terminationssignal
Histidin
Glutamin
Asparagin
Lysin
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Cystein
Tryptophan
Arginin
Glycin
Schlüssel: Jedes 3-buchstabige Desoxynukleotidtriplett entspricht einem Trinukleotid von mRNA mit einem 5'-Ende an der linken und einem 3'-Ende auf der rechten Seite. Alle hier angegebenen DNA-Sequenzen sind diejenigen des Stranges, dessen Sequenz der mRNA-Sequenz entspricht, wobei Thymin Uracil ersetzt. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Desoxynukleotid- Sequenz bilden.
A = Adenin
& = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin
X = T oder C, wenn Y A oder G
X = C, wenn Y = C oder T
Y = A, G, C oder T, wenn X = C
Y = A oder G, wenn X = T
W = C oder A, wenn Z = A oder G
W = C, wenn Z = C oder T
Z = A, G, C oder T, wenn W = C
Z = A oder G, wenn W = A
QR = TC, wenn S = A, G, C oder T
J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G
M = A, C oder T
Das Vorstehende zeigt, daß die neue Aminosäuresequenz des Protein A- Fusionsprodukts und anderer nützlicher Proteine durch äquivalente Nukleotidsequenzen hergestellt werden kann, die für dieselbe Aminosäuresequenz der Proteine kodieren. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung solche äquivalenten Nukleotidsequenzen ein. Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß Proteine einer identifizierten Struktur und Funktion konstruiert werden können, indem die Aminosäuresequenz geändert wird, wenn solche Änderungen die Proteinsekundärstruktur nicht ändern (Kaiser, E.T. und K zdy, F.J. [1984] Science 223:249-255).

Claims

1. Hybridprotein mit der im Schaubild B gezeigten Aminosäuresequenz.

2. Hybridprotein mit der im Schaubild C gezeigten Aminosäuresequenz.

3. Hybridprotein mit der im Schaubild D gezeigten Aminosäuresequenz (***Leu Ala Arg Pro ausnehmend).

4. Rekombinanter DNA-Übertragungsvektor, umfassend DNA mit der im Schaubild B gezeigten Nukleotidsequenz (außer dem letzten Triplett TGA) oder einer äquivalenten Nukleotidsequenz, die Basen enthält, deren translatierter Bereich für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert.

5. Rekombinanter DNA-Übertragungsvektor, umfassend DNA mit der im Schaubild C gezeigten Nukleotidsequenz oder einer äquivalenten Nukleotidsequenz, die Basen enthält, deren translatierter Bereich für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert.

6. Rekombinanter DNA-Übertragungsvektor, umfassend DNA mit der im Schaubild D gezeigten Nukleotidsequenz oder einer äquivalenten Nukleotidsequenz, die Basen enthält, deren translatierter Bereich für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert.

7. Prokaryotischer Mikroorganismus, in den ein Übertragungsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6 übertragen und repliziert wurde.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der ein E. coli K-12- Derivat ist.

9. Plasmid pBG9, Plasmid pBG5, Plasmid pBG3-2 oder Plasmid pBG3-2ΔN, wie erhältlich in den entsprechenden NRRL- Hinterlegungen B-15907, B-15908, B-15909 und B-15910.

10. Mikroorganismus, der durch einen Übertragungsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert wurde.

11. E. coli PR13(pBG9), E. coli PR13 (pBG5), E. coli PR13 (pBG3-2) oder E. coli (pBG3-2ΔN), wie erhältlich in den entsprechenden NRRL-Hinterlegungen B-15907, B-15908, B-15909 und B-15910.

12. Verfahren zur Herstellung des Plasmids pBG9 nach Anspruch 9, welches umfaßt:

(a) das Schneiden des Plasmids pBG101-41, NRRL B-15905, mit der Endonuklease BamHI und das Versehen mit glatten Enden durch die Behandlung mit Bal-31 Exonuklease;

(b) das weitere Schneiden von pBG101-41 mit ClaI an der nur einmal vorkommenden Stelle in der pBR322-DNA;

(c) das Erhalten eines glattendigen/ClaI-Protein A Fragments aus dem Plasmid pAc37, und

(d) das Koppeln des Konstrukts aus (c) mit (b).

13. Verfahren zur Herstellung des Plasmids pBG3-2 nach Anspruch 9, welches umfaßt:

(a) das Verdauen des Plasmids pBR325 mit ClaI und SalI und Isolieren des 5368 bp-Fragments;

(b) das Verdauen von pBG5 nach Anspruch 9 mit ClaI und SalI und Isolieren des 2000 bp-Fragments;

(c) das Ligieren der in (a) und (b) erhaltenen Fragmente;

(d) das Verdauen des ligierten Produkts von (c) mit ClaI und Isolieren eines linearen Moleküls von 7,4 kb; und

(e) das Ligieren des 7,4 kb-Moleküls mit einem Linker- DNA-Fragment, das Stop-Codons enthält.

14. Verfahren zur Herstellung des Plasmids pBG3-2ΔN nach Anspruch 9, welches umfaßt:

(a) das Verdauen des Plasmids pBG3-2 nach Anspruch 9 mit der Restriktionsendonuklease Nde;

(b) das Extrahieren des verdauten Plasmids mit Phenol-Ether und das Fällen mit Ethanol; und

(c) das Religieren der in (b) erhaltenen Produkt-DNA bei verdünnter DNA-Konzentration.

15. Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins nach Anspruch 1, welches das Kultivieren von E. coli umfaßt, das eine lon oder pnp-Mutation aufweist und einen rekombinanten DNA-Übertragungsvektor nach Anspruch 4 beherbergt.

16. Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins nach Anspruch 2, welches das Kultivieren von E. coli umfaßt, das eine lon- oder pnp-Mutation aufweist und einen rekombinanten DNA-Übertragungsvektor nach Anspruch 5 beherbergt.

17. Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins nach Anspruch 3, welches das Kultivieren von E. coli umfaßt, das eine lon- oder pnp-Mutation aufweist und einen rekombinanten DNA-Übertragungsvektor beherbergt, der DNA mit der in Anspruch 6 definierten Nukleotidsequenz minus der letzten fünf Tripletts oder eine äquivalente Nukleotidsequenz, welche Basen enthält, deren translatierter Bereich für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.

18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, worin der Vektor das Plasmid pBG3-2 oder das Plasmid pBG3-2ΔN nach Anspruch 9 ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines anderen Proteins als β-Glucuronidase, welches das Kultivieren von E. coli umfaßt, das eine lon- oder pnp-Mutation aufweist und einen rekombinanten DNA-Übertragungsvektor beherbergt, der von dem E. coli co1E1-Plasmid abgeleitet ist und das Gen für das genannte Protein in funktioneller Verknüpfung mit DNA von β-Glucuronidase-Gen, wie von einem E. coli K-12-Derivat erhalten, umfaßt, bei dem das rop-Gen des Vektors teilweise oder vollständig deletiert oder auf andere Weise desaktiviert ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das E. coli K-12-Derivat E. coli MS371 ist.

21. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20, worin das E. coli, das eine lon- oder pnp-Mutation aufweist, ein E. coli K-12-Derivat ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin das E. coli K-12-Derivat E. coli SG20251, NRRL B-15918, oder E. coli PR13 ist.