JPH0669376B2 - 超高度原核発現系 - Google Patents
超高度原核発現系Info
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- JPH0669376B2 JPH0669376B2 JP61048770A JP4877086A JPH0669376B2 JP H0669376 B2 JPH0669376 B2 JP H0669376B2 JP 61048770 A JP61048770 A JP 61048770A JP 4877086 A JP4877086 A JP 4877086A JP H0669376 B2 JPH0669376 B2 JP H0669376B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は超高度原核発原系用組替えDNAトランスファー
ベクター又はプラスミド又はそれらの製法に関する。
ベクター又はプラスミド又はそれらの製法に関する。
発現水準ということはクローン化遺伝子製品を利用する
うえで最も重要な考慮すべき点である。評価された蛋白
質発現の水準は、醗酵容量当りの蛋白質収率、及び精製
の困難性の程度、という二つの重要な結果を有する。ク
ローン化された遺伝子製品の増加する発現に対する殆ど
の努力は今日まで効率のよいリボソーム結合位置に関連
した強いプロモーターの使用に焦点があてられてきた。
発現を増加させるために種々のプロモーターが使用され
てきており、最も一般的に使用されているのはファージ
ラムダからのPLプロモーター及び大腸菌lacUV5及びtrp
プロモーターである。 ラムダPLプロモーターはCl857温度感受性ラムダリプレ
ッサーに関連してうまく使用されてきた。これは30℃に
於ける大腸菌の生育中にクローン化された製品の低い水
準の発現を可能にする。実質的な細胞密度が一旦確立さ
れたらクローン化された遺伝子は42℃に於ける生育によ
ってデリプレッション（抑制解除）される。この方法は
宿主細胞に対し致死的な遺伝子製品の発現において使用
されてきた。幾人かの研究者等は熱に不安定なリプレッ
サー制御のもとでPLプロモーターを使用して発現水準４
％（ワルデマン エー．エス．、ハエンスレイン イ
ー．及びミルマン ジー．［1983］ J.Bio.Chem.285:1
1571-11575）、７％（ヨアクム ジー．エッチ．、イエ
ング エー．ティー．、マッテス ダブリュ．ビー．及
びグロスマン エル．［1982］PNAS 79:1766-1770,デロ
ム シー．、ゲイセン、ディー．及びフィールスダブリ
ュ．［1982］Gene 17:45-54）及び13％（オエヘルニッ
ヘン アール．、クロック ジー．、アルツシュミット
エル．及びヒレン ダブリュ．［1984］EMBO J.3:53
9-543）を報告している。 最近では大腸菌lacUV5及びtrpプロモーターからの配列
からなるキメリックなプロモーターの使用が増加してき
ている。このハイブリッドプロモーターはtacプロモー
ターとして知られている。これはlacプロモーターから
‐10領域及びtrpの‐35領域を含んでいる。このハイブ
リッドプロモーターは大腸菌lac lq遺伝子製品によって
抑制され、5mMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（lPTG）によって誘導される。この系は幾人か
の研究者によって使用されて異なる結果を得ている。種
々の蛋白質の発現は、 ７％水準（バグダサリアン エム．エム．、アマン イ
ー．、ルルツ アール．、ルッカート ビー．及びボグ
ダサリアン エム．［1983］Gene 26:273-282）、 10％水準（バイケル アイ．、ロバーツ ティー．エ
ム．、ブラボン エム．ティー．、グリーン アー
ル．、アマン イー．及びリビングストン ディー．エ
ム［1983］PNAS80:906-910）及び 30％水準（アマン イー．、ブロシウム ジェー．、及
びプタッシン エム．［1983］Gene25:167-178）に達し
ている。 蛋白質発現水準は宿主細胞の遺伝子背景に依存する。特
定の突然変異を含有する宿主細胞の利用はクローン化蛋
白質の水準を増加させることが示された。この点に関し
二つの遺伝子が広く注目を受けている。即ちlon及びpnp
突然変異である。 lon突然変異は大腸菌ゲノムcapR領域にマップされてお
り、ATP依存蛋白分解酵素に対しコードを有しているこ
とが示されている（ブクハリ エー．アイ．、及びジッ
プセル ディー．［1973］J.Bact.116:1460-1471シーン
‐ベルグ ビー．及び ジップセル ディー．［1973］
J.Bact.116:1460-1471）。このATP依存蛋白分解酵素は
大腸菌中で見出されている８つの蛋白分解酵素のひとつ
である（チュング シー．エッチ．、及びゴルドベルグ
エイ．エル．［1981］PNAS78:4931-4935スリードハ
ラ、スワミー ケイ．エッチ．及びゴルドベルグ エ
イ．エル．［1981］Nature:292:652-654）。これはミス
センス突然変異及びナンセンス突然変異から造られた蛋
白質の分解に関与する主要な蛋白分解酵素であることが
実証されている（モント ディー．ダブリュー．［198
0］Ann Rev.Genet.14:297-319）。pnp突然変異はポリリ
ボヌクレオチドホスホリラーゼ遺伝子に対してマップさ
れている。ポリリボヌクレオチドホスホリラーゼはリボ
核酸のホスホリシスに関与していることが示されてお
り、従ってmRNA分解に関与することが意味される。その
後の研究はpnp突然変異株中にクローン化されたときに
クローン化されたカビの分解産物デヒドロゲナーゼの特
異活性に於て20〜100倍の増加を示した（ハウタラ ジ
ェー・エイ・、バセット シー．エル．、ギレス エ
ヌ．エッチ．及びクッシュナー エス．アール．［197
9］Proc.Natur.Acad.Sci.米国76:5774-5778）。これら
の研究は又はこれらの突然変異株に於けるプラスミドコ
ピー数の４〜７倍の増加をも実証した。従って酵素特異
活性における増加は増加したmRNA合成、増加したmRNA寿
命及びこれらの現象の組合わせによるものであり得る。 rop（プライマーのリプレッサー＝repressor of prime
r）遺伝子はプラスミドコンピー数を制御することが知
られてからかなりになる。1980年に大腸菌colEl誘導プ
ラスミドの非必須領域の欠失がプラスミドコピー数を増
加させることが実証された。この領域の欠失はクロモソ
ームDNAの４％から20％へプラスミドDNAを増加させた。
この欠失は野性形のプラスミドの宿主を共感染させると
突然変異体プラスミドのコピー数を減少させたのでトラ
ンスレセッシブ（trans recessive）であった（ツィグ
エー．ジェー．及びセラット ディー．［1980］Natu
re 283:216-218）。 最近の技術の先行技術は大腸菌発現系について報告して
おり、ここで大腸菌宿主に対して外来の蛋白質が製造さ
れ、全細胞蛋白質の約25〜30の発現水準が開示されてい
る。シモンズ等は人のインターフェロンγが全細胞蛋白
質の25％迄の水準で発現されたことを報告している。こ
れらの研究者たちはファージラムダのPLのプロモーター
を使用し、続いてファージMS2レプリカーゼ又は大腸菌
トリプトファン減衰域の何れかに由来する翻訳開始領域
を使用した（シモンズ ジー．、レマウト イー．アレ
ット ビー．、デボス アール．及びファイヤース ダ
ブリュー．［1984］Gene 28:55-64）。アマン等はtacプ
ロモーター系を使用して全細胞蛋白の30％としてラムダ
リプレッサーを発現した（アマン イー．、ブロシウス
ジェー．及びプタッシン エム．［1983］Gene 25:16
7-178）。上に述べた様にこのプロモーターはlacUV5プ
ロモーターの‐10領域及びtrpプロモーターの‐35領域
を含有している（デボアー エッチ．エー．、コムスト
ック エル．ジェイ．、ヤンスラ ディー．ジー．及び
ハイネッカー エッチ．エル．プロモーターズストラク
チャーアンドファンクション（Promoters Structuer an
d Function）、プラーガー、ニユーヨーク［1982］462-
481（アール．エル．ロドリクェツ及びエム．ジェー．
チャンベルリン編））。
うえで最も重要な考慮すべき点である。評価された蛋白
質発現の水準は、醗酵容量当りの蛋白質収率、及び精製
の困難性の程度、という二つの重要な結果を有する。ク
ローン化された遺伝子製品の増加する発現に対する殆ど
の努力は今日まで効率のよいリボソーム結合位置に関連
した強いプロモーターの使用に焦点があてられてきた。
発現を増加させるために種々のプロモーターが使用され
てきており、最も一般的に使用されているのはファージ
ラムダからのPLプロモーター及び大腸菌lacUV5及びtrp
プロモーターである。 ラムダPLプロモーターはCl857温度感受性ラムダリプレ
ッサーに関連してうまく使用されてきた。これは30℃に
於ける大腸菌の生育中にクローン化された製品の低い水
準の発現を可能にする。実質的な細胞密度が一旦確立さ
れたらクローン化された遺伝子は42℃に於ける生育によ
ってデリプレッション（抑制解除）される。この方法は
宿主細胞に対し致死的な遺伝子製品の発現において使用
されてきた。幾人かの研究者等は熱に不安定なリプレッ
サー制御のもとでPLプロモーターを使用して発現水準４
％（ワルデマン エー．エス．、ハエンスレイン イ
ー．及びミルマン ジー．［1983］ J.Bio.Chem.285:1
1571-11575）、７％（ヨアクム ジー．エッチ．、イエ
ング エー．ティー．、マッテス ダブリュ．ビー．及
びグロスマン エル．［1982］PNAS 79:1766-1770,デロ
ム シー．、ゲイセン、ディー．及びフィールスダブリ
ュ．［1982］Gene 17:45-54）及び13％（オエヘルニッ
ヘン アール．、クロック ジー．、アルツシュミット
エル．及びヒレン ダブリュ．［1984］EMBO J.3:53
9-543）を報告している。 最近では大腸菌lacUV5及びtrpプロモーターからの配列
からなるキメリックなプロモーターの使用が増加してき
ている。このハイブリッドプロモーターはtacプロモー
ターとして知られている。これはlacプロモーターから
‐10領域及びtrpの‐35領域を含んでいる。このハイブ
リッドプロモーターは大腸菌lac lq遺伝子製品によって
抑制され、5mMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（lPTG）によって誘導される。この系は幾人か
の研究者によって使用されて異なる結果を得ている。種
々の蛋白質の発現は、 ７％水準（バグダサリアン エム．エム．、アマン イ
ー．、ルルツ アール．、ルッカート ビー．及びボグ
ダサリアン エム．［1983］Gene 26:273-282）、 10％水準（バイケル アイ．、ロバーツ ティー．エ
ム．、ブラボン エム．ティー．、グリーン アー
ル．、アマン イー．及びリビングストン ディー．エ
ム［1983］PNAS80:906-910）及び 30％水準（アマン イー．、ブロシウム ジェー．、及
びプタッシン エム．［1983］Gene25:167-178）に達し
ている。 蛋白質発現水準は宿主細胞の遺伝子背景に依存する。特
定の突然変異を含有する宿主細胞の利用はクローン化蛋
白質の水準を増加させることが示された。この点に関し
二つの遺伝子が広く注目を受けている。即ちlon及びpnp
突然変異である。 lon突然変異は大腸菌ゲノムcapR領域にマップされてお
り、ATP依存蛋白分解酵素に対しコードを有しているこ
とが示されている（ブクハリ エー．アイ．、及びジッ
プセル ディー．［1973］J.Bact.116:1460-1471シーン
‐ベルグ ビー．及び ジップセル ディー．［1973］
J.Bact.116:1460-1471）。このATP依存蛋白分解酵素は
大腸菌中で見出されている８つの蛋白分解酵素のひとつ
である（チュング シー．エッチ．、及びゴルドベルグ
エイ．エル．［1981］PNAS78:4931-4935スリードハ
ラ、スワミー ケイ．エッチ．及びゴルドベルグ エ
イ．エル．［1981］Nature:292:652-654）。これはミス
センス突然変異及びナンセンス突然変異から造られた蛋
白質の分解に関与する主要な蛋白分解酵素であることが
実証されている（モント ディー．ダブリュー．［198
0］Ann Rev.Genet.14:297-319）。pnp突然変異はポリリ
ボヌクレオチドホスホリラーゼ遺伝子に対してマップさ
れている。ポリリボヌクレオチドホスホリラーゼはリボ
核酸のホスホリシスに関与していることが示されてお
り、従ってmRNA分解に関与することが意味される。その
後の研究はpnp突然変異株中にクローン化されたときに
クローン化されたカビの分解産物デヒドロゲナーゼの特
異活性に於て20〜100倍の増加を示した（ハウタラ ジ
ェー・エイ・、バセット シー．エル．、ギレス エ
ヌ．エッチ．及びクッシュナー エス．アール．［197
9］Proc.Natur.Acad.Sci.米国76:5774-5778）。これら
の研究は又はこれらの突然変異株に於けるプラスミドコ
ピー数の４〜７倍の増加をも実証した。従って酵素特異
活性における増加は増加したmRNA合成、増加したmRNA寿
命及びこれらの現象の組合わせによるものであり得る。 rop（プライマーのリプレッサー＝repressor of prime
r）遺伝子はプラスミドコンピー数を制御することが知
られてからかなりになる。1980年に大腸菌colEl誘導プ
ラスミドの非必須領域の欠失がプラスミドコピー数を増
加させることが実証された。この領域の欠失はクロモソ
ームDNAの４％から20％へプラスミドDNAを増加させた。
この欠失は野性形のプラスミドの宿主を共感染させると
突然変異体プラスミドのコピー数を減少させたのでトラ
ンスレセッシブ（trans recessive）であった（ツィグ
エー．ジェー．及びセラット ディー．［1980］Natu
re 283:216-218）。 最近の技術の先行技術は大腸菌発現系について報告して
おり、ここで大腸菌宿主に対して外来の蛋白質が製造さ
れ、全細胞蛋白質の約25〜30の発現水準が開示されてい
る。シモンズ等は人のインターフェロンγが全細胞蛋白
質の25％迄の水準で発現されたことを報告している。こ
れらの研究者たちはファージラムダのPLのプロモーター
を使用し、続いてファージMS2レプリカーゼ又は大腸菌
トリプトファン減衰域の何れかに由来する翻訳開始領域
を使用した（シモンズ ジー．、レマウト イー．アレ
ット ビー．、デボス アール．及びファイヤース ダ
ブリュー．［1984］Gene 28:55-64）。アマン等はtacプ
ロモーター系を使用して全細胞蛋白の30％としてラムダ
リプレッサーを発現した（アマン イー．、ブロシウス
ジェー．及びプタッシン エム．［1983］Gene 25:16
7-178）。上に述べた様にこのプロモーターはlacUV5プ
ロモーターの‐10領域及びtrpプロモーターの‐35領域
を含有している（デボアー エッチ．エー．、コムスト
ック エル．ジェイ．、ヤンスラ ディー．ジー．及び
ハイネッカー エッチ．エル．プロモーターズストラク
チャーアンドファンクション（Promoters Structuer an
d Function）、プラーガー、ニユーヨーク［1982］462-
481（アール．エル．ロドリクェツ及びエム．ジェー．
チャンベルリン編））。
本発明は新規な生物学的系で製造される新規なハイブリ
ッド蛋白質に関するものである。新規な生物系はβ‐グ
ルクロニダーゼ遺伝子DNA（BG）及び所望の蛋白遺伝子D
NAからなる新規なハウブリッドプラスミドで形質転換し
た原核宿主からなる。本明細書で特定的に例示したのは
プラスミドpBG9、プラスミドpBG8、プラスミドpBG3-2及
びプラスミドpBG3-2ΔＮと命名される新規なハイブリッ
ドプラスミドの構築である。これらのプラスミドはβ‐
グルクロニダーゼ遺伝子DNA及びプロテインA DNAからな
る。適当な原核宿主を形質転換するのに使用される時プ
ロテインＡ様の化合物の製造が実現される。即ち本来の
蛋白Ａとは分子のFc領域におけるlgGを結合する鍵とな
る生物学的機能において元来のプロテインＡとは区別で
きない化合物である。有利なことにこれらのハイブリッ
ド蛋白質を形質転換した宿主によって発現することは知
られた任意の原核発現系で実現されるよりもかなり高
い。例えば本明細書で例示される融合（ハイブリッド）
蛋白質は、全大腸菌宿主細胞中のlon又はpnp突然変異の
何れかを含有している宿主細胞中で大腸菌の全細胞蛋白
質の45％よりも高い水準で製造される。又有利なことに
は発現されたハイブリッド蛋白質の100％が宿主細胞を
破裂させることによって可溶な細胞質ゾルフラクション
中に見出されることである。この結果は大腸菌の外来蛋
白質の比較的高い発現約７％）が不溶、不活性の蛋白質
を製造したことを見出した多くの当業者によって経験さ
れていることとは逆である。 プラスミドpBG3-2ΔＮは超高度な原核発現系の究極を例
示する。このプラスミドで形質転換された宿主は所望の
融合蛋白質の60％より多くを発現する。この超高水準発
現はプラスミドpBG3-2中に於けるΔNde欠失を構築する
ことによってrop遺伝子を部分的又は全体的に欠失させ
るか、又はそれ以外の方法で不活性化させることによっ
て達成される。この手順は大腸菌colE1プラスミドに由
来する全てのプラスミドがrop領域を含有しているので
これらの任意のものに本発明に於て使用できる。そのよ
うなプラスミドの例はpBR322、pBR328及びpHC79であ
る。 プラスミドpBG3-2ΔＮはBGに配列の18 のアミノ酸を含有しており、プロテインＡ活性を示す、
即ち分子のFc領域に於けるlgG結合活性を有する、BG-プ
ロテインＡ融合蛋白を製造するのに使用できる。 本発明の新規なハイブリッドプラスミドで形質転換した
大腸菌宿主がBGが本来の大腸菌宿主によって僅かな量し
か発現されないという事実に鑑みて、超高量でBG-プロ
テインＡ融合製品を発現するということは驚くべきこと
である。この低い本来の大腸菌によるBG発現水準は当業
者が原核表原形においてBGプロモーターDNAを使用する
ことをやめてしまうことに導いたと信じられる。BGプロ
モーターを使用するのでなくて、原核発現系においてla
c及びtrpプロモーターが広範に使用されてきたのであ
る。 本発明の発現系はプロテインＡ遺伝子又はその断片に対
する融合によって例示されているが、有利には他の有用
な蛋白質例えばインターフェロン、インターロイキン
類、インシュリン、成長ホルモン及び産業酵素、例えア
ミラーゼ、蛋白分解酵素、及び糖イソメラーゼ、等に対
しコードを有している他の遺伝子に融合された時にも、
ここに開示された手順に従い、そしてこの技術で知られ
ている付随する手順に従って有利に使用できる。 第１図はプラスミドpAc37からの中間プラスミドの構築
を例示する。プラスミドpAcはプロテインＡ遺伝子及び
全pBR322 DNAからなる。 第２図はプラスミドpBG101-41及びpBG9に対する遺伝子D
NA挿入物についての制限マップを示す。クローニング中
に再生されないBamH Iの位置は（BamH I）として印す。 第３図はプラスミドpBG9からのpBG5の構築を示す。 第４図はpBG5及びプラスミドpBR325からのプラスミドpB
G3-2の構築を示す。 第５図は、プラスミドpBG3-2からの、プラスミドpBG3-2
ΔＮの構築を示す。 式Ａはスタフィロコッカスオウレウス（Staphylo-coccu
s aureus）プロテインＡのアミノ酸配列に対しコードを
するヌクレオチド配列を示す。 式ＢはハイブリッドプラスミドpBG9のDNA配列の一部と
発現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。 式ＣはハイブリッドプラスミドpBG5のDNA配列の一部及
び発現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。 式ＤはハイブリッドpBG3-2のDNA配列の一部（β‐グル
クロニダーゼDNA中のSau3A位置からプロテインＡコーテ
ィング領域末端に位置するストップリンカーまでの部
分）と、発現された融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。 新規なプラスミド蛋白質及び本発明の発現系の構成及び
同定を詳細に記す前に使用された物質及び方法を此に開
示する。 （１）プラスミドDNA調製 プラスミドDNAの大規模製造に対して使用する手順は本
質的に以下の通りである。250mlの培養基を対数期へ成
長させ、クロラムフェニコールで光学密度0.6〜0.7（又
は別の方法としてクロラムフェニルコール添加なしで）
で増殖し、一夜生育させた。細胞を6Kで20分間JA14ロー
ターでペレット化し、6mlグルコース緩衝液（50mMグル
コース、25mMトリス、10mM EDTA）中で再懸濁した。細
胞を室温で1mlの20mg／mlの新たに造ったリゾチームの
存在下でデ10分間培養し13.8mlの0.2N NaOH中１％SDSを
添加しながら、５分間氷上に置き、氷上で更に15分間7m
lの5M KAC（pH5.0-5.5）と共に保った。デブリを10Kで1
0分間ペレット化し、等容量のフェノ‐クロロホルム‐
イソアミルアルコール（25:24:1、TE飽和、0.1％8-ヒド
ロキシキノリン）で１度上澄みを抽出した。0.6容量イ
ソプロピルアルコールで沈殿させることに続いて、DNA
をCsCl勾配物上で精製した。 （２）制限酵素消化及び所望断片の単離 消化を供給者の指示に従って実施した。断片の分離はア
ガロースゲル電気泳動で達成した（下に記載）。電気泳
動したDNAを、供給者の指示に従ってエル‐チップ（Elu
-tip）カラム（シュライヒャー及びシュネル、キイー
ネ、NH）上を通過させ、続いて2.5容量のEtOH中でキャ
リヤーのtRNAを添加して沈殿させることによって精製し
濃縮した。 （３）ミニ溶菌物プラスミド分析 形質転換した細胞を10μｇ／mlテトラサイクリン又は50
μｇ／mlのアンピシリンの何れかを補充した1mlのL-ブ
ロス中に接種し、３〜５時間、37℃で生育させた。細胞
を10,000×ｇで15分間遠心することによって集め、次に
50μｌのSTET緩衝液（８％庶糖、 ５％トライントンX-100、50mlのEDTA、50mMのトリスHC
l,pH8.0）中に再懸濁させた。 50μｌのリゾチーム 溶液（2mg／mlのSTET緩衝液中）を加え、試験管を４分
間室温で培養し、次に100℃で３分間加熱した。試験管
を次に氷上で０℃で冷却させた。０℃で５分後不溶の物
質を10,000xgの遠心で15分間で除いた。 等容量の氷冷イソプロピルアルコールを上澄み液に加
え、試験管を70℃で５分間おいた。DNA沈殿を10,000xg
で10分間の遠心によって集め、10〜25μｌのTE緩衝液
（10mMトリス‐Cl、0.1mM EDTA pH8.0）中に再懸濁し
た。DNAの制限消化物を上に記載したように6.7μｇ／ml
のRNase A（リボヌクレアーゼＡ）を含有する15μｌ最
終容量中の５μｌのプラスミド溶液を使用して上記のよ
うに実施した。 （４）DNA連結 付着性末端連結及びプラント末端連結の両方にT4リガー
ゼを用い、これは各場合に過剰で存在した（200u／μｇ
のDNA）。付着性末端については培養時間は16℃で２〜
４時間、そしてプラント末端に対しては時間を16時間に
増加させた。標準のベクター／挿入物連結に対し挿入物
は５倍のモル過剰で存在し、20μｌの反応容量中で0.02
pモルのベクター及び0.1pモルの挿入物であった。単一
分子レサーキュラリゼーション反応による欠失突然変異
の発生についてはプラスミドを１μｇ／mlに希釈し、続
いて制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結を行った。リ
ンカーのプラント末端連結はリンカーの100倍モル過剰
で行い、20μｌ反応当り0.02pモルでのベクターの濃度
であった。 （５）形質転換 新たな一夜培養基をL-ブロス中で希釈し、37℃で撹拌し
ながらA6000.3が得られるまで生育させた。細胞の氷の
上で冷却し、次に遠心分離により集めた（10分4100x
g）。細胞を氷冷50mM CaCl2の最初の容量の１／２中の
再懸濁し、氷上で20分間培養した。細胞を再度上記のよ
うに遠心分離で集め、氷冷50mM CaCl2（最初の容量の１
／25）中に再懸濁した。0.1mlの細胞懸濁液を１〜10μ
ｌ（50-100ng）のDNAプラスミド溶液と混合し、０℃で3
0分間静置させた。細胞を次に37℃で２分間加熱し、1.5
％の寒天及び10μｇ／mlのテトラサイクリン又は50μｇ
／mlのクロラムフェニコールの何れかを含有しているL-
ブロスプレート上で平板培養しこのときpBR325誘導物が
形質転換された。プレートを一夜37℃で培養した。１×
106コロニー／μｇプロスミドDNAの形質転換効率が常に
観測された。 （６）アガロース電気泳動 DNA断片を2X トリスボレート緩衝液（178mMトリス、17
8mMホウ酸、5mM Na2EDTA pH8.4）中の0.8％アガロース
中でのゲル電気泳動によって単離した。分析及び分離用
ゲルを水平ゲル箱中で電気泳動緩衝液（1X トリスボレ
ート）中に浸漬して、60ボルトにおいて走らせた。DNA
バンドがゲル中に5.0μｇ／mlのエチジウムブロマイド
（EtBr）を含ませることによって、紫外線下で見ること
が出来るようにされた。所望のDNAバンドを含有してい
る切片をゲルから切り取り、透析管（１／２の径）中の
0.5〜1.0mlの緩衝液を含有している1X トリスボレート
緩衝液中の電気泳動によってDNAを回収した。電気泳動
を30分間10ボルト又は染色された物質が透析管の側面に
対して位置するまで実施した。ゲルの切片を透析バッグ
から除去し、バッグを何回もトリスボレート緩衝液でフ
ラッシュすることによってDANを回収した。NaClを最終
濃度１モル迄DNA溶液に加え、エチジウムブロマイド及
びアガロースゲル不純物をトリスボレート緩衝液を飽和
させたフェノールで二度抽出することによって除いた。
フェノールをエーテルで２回抽出することによって除
き、精製したDNAを１／50容量の5M NaCl及び及び2.5容
量の冷たいエタノールで沈殿させることによって回収し
た。沈殿反応は‐70℃で15〜20分間実施した。沈殿した
DNAを10,000Xgで15分間遠心分離させることによって回
収した。回収した断片の収率は純粋なDNA標準とのエチ
ジウムブロマイド蛍光の直接比較によって検定した。典
型的には50％の回収が得られ、断片の寸法が増加するに
従い収率は減少した。 （７）プロテインＡラジオアッセイ プロテインＡ活性を50μｌの1:10000希釈正常兎血清（N
RS）を有するダイナテック イミュノロン（Dyna-tech
Immunolon）［ダイナテックダイアグノスティックスイ
ンコーポレーテッド、サウスウインドハムME］１ミクロ
力価ウエルを被覆して、室温で４時間培養することによ
って決定した。NRSをウェルから振動させ、これを次に
１時間４℃で培養することによって燐酸緩衝塩水中の１
％オバルブミン（OVA／PBS）でブロックした。ウェルを
空にし、次に25μｌの1.0及び1000ngプロテインＡの間
の量を含有している25μｌ試料を各ウェルに加えた。市
販プロテインＡを用いた標準曲線を各検定中で走らせ
た。全ての希釈はOVA／PBS中のものであった。25μｌの
125I-プロテインＡ（6000cpm）OVA／PBS中のものを各ウ
ェルに加え、プレートを16時間37℃で小さな水のビーカ
ーを含有している密封プラスチック容器中で培養した。
培養に続いてウェルを吸引し、PBS 3X及び水で１度洗浄
した。ウェルを乾燥し、2mlのアクアソル（Aquasol）
［ニュウイングランドニュークレアーコーポレーショ
ン、マサチュウセッツ州ボストン］中でベックマンモデ
ルLS7000ベータカウンター中で２分間計数した（ベック
マンインストラメンツインコーポレーテッド、カリフォ
ルニア州フラートン）。 （８）プロテインＡロケット免疫電気泳動（roket immu
noelectrophoresisi） プロテインＡの濃度及び活性を31μｇ／mlの人IgGをト
リス‐グリシンpH8.6緩衝液（3.75g／ｌトリス塩基、7.
5g／ｌグリシン）中に含有している１％アガロースゲル
中のロケット免疫電気泳動によって測定した。0.25及び
1.0μｇの間のプロテインＡを標準を各ゲル上で走らせ
た。電気泳動を３時間400ボルトで電気泳動緩衝液とし
てトリス‐グリシンを用いながら行った。電気泳動に続
いてゲルを乾燥させ、続いてコマッシーブルーで短時間
染色させ、そして５％メタノール、10％酢酸で脱染し
た。 （９）細胞均質化 形質転換した細胞を12,000xgで５分間４℃で遠心するこ
とによって集め、0.5容量のHEPES［4-（2-ヒドロキシエ
チル）‐1-ピペラジン‐エタンスルホン酸］‐KCl-DTT
（ジチオスレイトール）緩衝液（6g HEPES pH8.0、7.5g
KCl、0.15g DTT／ｌ）中に再懸濁させた。細胞を懸濁液
をリゾチームで最終濃度300μｇ／mlにおいて30分37℃
で消化させた。懸濁液を５分間で２回氷上で300ワット
のパルスで高周波による分解（sonicate）にかけた。可
溶蛋白を25,000xgで30分４℃で遠心することによって単
離した。上澄み液を除去し、沈殿を等容量のHEPES／KCl
／DTT緩衝液中に懸濁した。全細胞蛋白質がSDSゲル上で
走らせる実験については100℃で５分間、５容量のSDS-
均質化緩衝液（50％容量／容量グリセロール、５％容量
／容量2-メルカプトエタノール、５％重量／容量ドデシ
ル硫酸ナトリウム及び0.005g／mlピロニンＹ）中で加熱
することによって細胞を可溶化した。 （10）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタン
アナリシス 全てのSDSゲルはラエムリの方法によって走らせた（ラ
エムリU.K.［1970］ネイチャー［ロンドン］227:680-68
5）。これらのゲルは12％の全アクリルアミド濃度を含
有していた。スラブゲルは1.5mmの巾でホエファーサイ
エンティックインストラメンツ（カリフォルニア州サン
フランシスコ）から得た電気泳動装置中で走らせた。チ
ューブのゲルをスタッキングゲルなして6mm内径×10cm
ガラス管中で走らせた。ウェスタンボルツはニトロセル
ロースフィルター上で実施した。蛋白質を200mAで12時
間フィルターに移した。フィルターを４時間0.1％牛血
清アルブミン（BSA）で燐酸緩衝食塩（PBS）中で室温に
おいてブロックし、10uCiの［I125］‐IgG（NEN）又は1
00μｌのパーオキシダーゼとコンジュゲートさせた兎Ig
Gの何れかで室温で一夜撹拌させながらハイブリッド化
させた。このボルツを次に４回PBSで洗い、コダックXAR
-5X腺フィルムに露出するか又は25μl H2O2を有する100
ml PBS中25mgのジアミノベンジジンで展開した。 （11）クローン化細胞中のプロテインＡ含有量の測定 醗酵に続いて細胞を0.5％のトライトンX-100を有する20
mMのトリスHCl pH8.3中でガラスビーズで渦巻きさせる
か又はダイアノミル（DyamoMill）モデルKDL-パイロッ
トビードミル中で均質化させた（ニュージャージ州メイ
ウッドのインパンデックスから得られる）。これは最高
速度で運転し、0.2mm径のグラスビーズを仕込んであ
る。均質化物を16,000xgで30分間遠心することによって
透明にし、上澄み蛋白濃度はローレー（Lowery）蛋白質
検定又はビウレットによって測定した。プロテインＡ濃
度の人のIgGに対するロケット免疫電気泳動（roket imm
unoelectrophoresisis）で測定した。 （12）蛋白質のHPLC精製 プロテインＡ及びプロテアーゼＫをウォータース（Wate
rs）μボンダパック（Bondapak）C18カラム（ウォータ
ースアッソシエイツ、マサチューセッツミフォード）を
備えたベックマンモデル360勾配機械（ベックマンイン
ストラメンツインコーポレーテッド）を用いてHPLCによ
って精製又は検定した。プロテインＡを10mM燐酸ナトリ
ウムpH7.2（緩衝液Ａ）及び60％容量／容量イソプロパ
ノール10mMホスフェート（緩衝液Ｂ）の間で、線形勾配
によって精製した。カラムを1mM／分の流速において０
及び100％緩衝液Ｂの間で80分にわたって線形勾配で溶
出させた。プロテアーゼＫを精製し、プロテインＡを同
様の方法で検定したが、但し、緩衝液Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸（TFA）及び緩衝液Ｂは0.08％のアセトニト
リル中のTFAであった。カラムを流速2ml／分で０及び60
％緩衝液Ｂの間の60分に亘る線形勾配によって溶出させ
た。 （13）醗酵 醗酵はdo2及びpH制御を備えた201ケマペックファーメン
ター（ニューヨーク州ウッドバリーケマペックインコー
ポレーテッド）中で実施した。組替えセルを50％のdo2
（空気＝100％）に於て、示されたpHに於て生育させ
た。pHを5M NH4OH又は5M H2SO4のを必要ならば添加して
調製した。泡を消泡剤Ｂ（antifoam B）イー．アイ．デ
ュポンデネモアースアンドカンパニーインコーポレーテ
ッド、デラウエア州ウィルミントン）の添加によって抑
制した。醗酵温度は37℃で全ての醗酵は最終容量9.51で
実施した。 （14）細菌菌株及び培地 全ての使用した細菌株の起源及び遺伝子型は以下に挙げ
られている。全ての菌株はYT培地を用いて保持及び生育
された（8g／ｌトリプトン、5g／ｌ酵母抽出物、及び5g
／ｌ塩化ナトリウム） （15）化学物 ニトロセルロースはシュライヒャー及びシュネル（キー
ネ,NH）から得た。生育培地はディフコ（ミシガン州デ
トロイト）から得た。アクリルアミドはアキュレートケ
ミカルアンドサイエンティフィックコーポレーション
（ニューヨーク州ウェストリバー）から得た。プロテイ
ンＡ標準はファーマシア（ニュージャージー州フィスカ
タウェイ）から得た。全ての他の化学物質はシグマケミ
カルカンパニー（ミズリー州セントルイス）から得た。 （16）培養基 （Ａ）細菌 此に開示されている全ての大腸菌株は大腸菌K-12誘導菌
である。 （Ｂ）プラスミドを含有する微生物宿主 （Ｃ）プラスミド プラスミドpBR322は良く知られていて入手可能なプラス
ミドであり大腸菌宿主ATCC 37017中で保持されている。
精製されたpBR322DNAはボリバーエフ．、ロドロクェツ
アール．エル．、グリーネ ピー．ジェー．、ベスラ
ッチ エム．シー．、ハイネッカー エッチ．エル．、
ボイヤー エッチ．ダブリュー．、クロサ ジェイ．エ
ッチ．、及びファルコウ エス．（1977）、Gene2:95-1
13及びサトクリフ ジェイ．ジー．（1978）Nucleic Ac
ids Res.5:2721-2728中に記載されるように得ることが
出来る。プラスミドpBR325も良く知られているプラスミ
ドである。これは20877ミッドランド州ガイサーバーグ
ピーオーボックス6009ビーアールエルインコーポレー
テッドから得ることが出来る。 NRRL B-15907、NRRL B-15908、NRRL B-15909、NRRL B-1
5910及びNRRL B-15918はこれらの寄託番号を開示してい
る特許の付与によって一般に入手可能である。これらの
寄託菌が入手できるからといって行政行為によって本発
明に付与された特許権を損なってまで本発明を実施する
権利を構成するものではないことを理解すべきである。
培養寄託物はアメリカ合衆国イリノイ州ペオリア米国農
務省ノーザンリージョナルリサーチラボラトリー（NRR
L）の永久寄託中に寄託されている。 大腸菌PR13の代りに使用できる良く知られた他の大腸菌
宿主、例えば大腸菌MS371、HB101及び大腸菌GMS407（ノ
ベル エム．及びノベル ジー．［1973］Mol.Gen.Gen
t.120:319）がある。 更に使用できる他の原核宿主は、サルモネラ（Salmonel
la）、シュードモナス（Pseudomonas）、バシルス（Bac
illus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属から
の微生物である。 （17）形質転換宿主からの組替えプラスミドDNAの単離 組替えプラスミドDNAはその原核宿主から良く知られた
手順、例えば透明にした溶菌物‐密度勾配平衡手順など
を用いて単離することが出来る。 （18）DNA配列決定 DNA配列決定はマックサム及びギルバート（マクサム
エー．、ギルバート ダブリュ．［1977］Proc.Natl.Ac
ad.Sci.米国74:560）及びハイデッカー等（ハイデッカ
ー ジー．、メッシング ジェー．及びグロネンボルン
ビー．［1980］Gene 10:69）に記載されるように実施
される。 ハイブリッド蛋白遺伝子の構築 本明細書の代表として例示されるハイブリッド蛋白質遺
伝子の構築はプラスミドpBG101-41の使用で開始され
た。このプラスミドはプラスミドpBR322のBamHIに挿入
されているおよそ6kbの大腸菌β‐グルクロニダーゼ遺
伝子DNAを含有する。プラスミドpBG101-41はBamH I制限
エンドヌクレアーゼで切断され、Bal-31エクソヌクレア
ーゼでの短い処理によってブラント末端化される。この
エクソヌクレアーゼ処理は12の塩基を除去し、ブラント
末端を残す。 切断されブラント末端にされたpBG101-41への挿入のた
めのDNAは、pBR322中のスタフィロコッカスオウレウス
（Staphylococcus aureus）プロテインＡ遺伝子を含有
しているプラスミドpAc37から得られた。図面の第１図
を参照。 切断しブラント末端にしたプラスミドpBG101-41をブラ
ント末端のClaIプロテインＡ断片に連結させ、そしてハ
イブリッドプラスミドpBG9を与える。プラスミドpBG9は
プロテインＡ遺伝子に融合されたβ‐グルクロニダーゼ
蛋白質のN-末端167アミノ酸に対してコードを有してい
る501のヌクレオチドを含有している。図面の第２図を
参照。 ハイブリッドプラスミドpBG5はハイブリッドプラスミド
pBG101-41及びハイブリッドプラスミドpBG9から構築し
た。図面第３図参照。プラスミドpBG101-41はBamH Iで
切断し、次にBal-31エクソヌクレアーゼ（IBI-fast-Bal
-31）で消化した。生じるDNAをCla Iで消化し、上記の
ようにして調製した挿入DNAを連結させた。 完成したプロテインＡに対するコード配列を含有してい
る上記の連結の為の挿入DNAをハイブリッドプラスミドp
BG9からこのプラスミドを制限酵素Cla I及びFnu4H1で切
断することにより調製した。 挿入及びベクターDNAを連結させ大腸菌株PR13中に形質
転換し、プラスミドDNAを形質転換物から製造した。pBG
5としてラベルされる一つのクローンは予想された制限
プロフィールを含有していた。標準のM13方法によるこ
のクローンの配列分析はBGコード配列の18のアミノ酸が
残っていることを明らかにした。 ハイブリッドプラスミドpBG3-2はプラスミド pBG5及び
プラスミドpBR325から構築した。図面の第４図を参照。
プラスミドpBG3-2はプラスミド pBG5と同じDNAを含有
するが、但しpBG5はpBR322 DNAを含有し、pBG3-2はpBR3
25DNAを含有する点が違うだけである。またpBG3-2はプ
ロテインＡ遺伝子DNAの末端におけるCla I位置において
ストップコドンリンカーを含有している。DNAの構築さ
れたリンカーセグメントは全ての三つの読み枠（リーデ
ィングフレーム）に於てストップコドンを含有してい
た。最終的なハイブリッド蛋白質製品がどんなpBR325に
由来するアミノ酸も含有しないことを確実にするため
に、これをpBG3-2構築におけるCla I位置へ挿入した。 プラスミドpBG3-2中の融合遺伝子によってコードされる
ハイブリッド蛋白質の増加された発現がΔNde欠失を構
築することによって、即ちpBR325のNde位置とBG配列のN
de位置の間のDNAを除去することによって得られた。こ
の欠失はpBR325中のrop遺伝子の大部分を除去し、並び
にBGプロモーター領域の最初の230塩基を除去する、こ
の構築はプラスミドpBG3-2ΔＮとして同定される。大腸
菌宿主がpBG3-2ΔＮで形質転換されるとき、宿主は全大
腸菌蛋白質の60％を越える水準でプロテインＡを発現す
る。これと対照してプロテインＡはプラスミドpBG3-2を
含有する宿主細胞中で全細胞蛋白質の50％で大腸菌中で
発現される。 プロテインＡの有用性 プロテインＡは種々の診断及び基本的な研究試験系に於
てイミュノアブソーベント（免疫吸収材）として広く使
用されている。米国特許4,322,274を参照。プロテイン
Ａの応用における最近の興味はその抗癌処理に於ける可
能性のある臨床使用に中心がおかれてきた。感作された
末梢の血液のリンパ球は、通常は腫よう細胞の細胞毒性
の原因となっているが特定の抗原、抗体、抗グロブリン
及び免疫複合体からなると推定される血清封鎖因子によ
ってその機能が阻害されると仮説がたてられている。バ
ーナーズ ビー．シー．（1981）Caneer Bull.33:278参
照。これらのブロッキング因子はプロテインＡを含有す
るスタフィロコッカスオウレウスのコーワン（Cowan）
Ｉ細胞に吸収されることによって腫ようを有する血清か
ら除去さ得、従ってインビトロ試験系において細胞によ
って媒介される腫よう細胞毒性が進行できるようにす
る。スティール ジー．アンケルスト ジェー．及びス
ジョグルン エッチ．［1974］Int.J.Cancer 14:83参
照。プロテインＡ又はIgG結合活性と独立したポリクロ
ナール抗体合成も活性化させる。スジョダール ジェ
ー．及びモラー ジー．［1979］Scand.J.Immunol.10:5
93参照。 プロテインＡの抗癌剤としての広範な試験は材料の高い
コスト及びプロテインＡ調製に於ける不純物の存在によ
って邪魔されてきた。プロテインＡの調製のコストが非
常に減少され、純度が改良されればプロテインＡの抗癌
用途に対する臨床試験が更により迅速に進行するであろ
う。 本明細書に開示したデータを有すれば当業者は容易に実
質的に同じプロテインＡ様の生物活性を有する分子に対
しコードを有する他の同等のヌクレオチド配列の同定す
ることを容易に認識するであろう。従って本発明の範囲
は上記の特定のヌクレオチド配列のみならず、実質的に
同じ同定しうるプロテインＡ様生物活性を有する分子に
対しコードを有する均等なヌクレオチド配列全てを包含
するものである。均等のという用語はその通常の特許用
語としての使用であって、本質的に同じ宿主中で実質的
に同じ同定しうるプロテインＡ様生物活性を有する分子
を製造するのに本明細書で同定したヌクレオチド配列の
様に実質的に作用するヌクレオチド配列を意味する。こ
の定義内でFc領域にIgG結合性を有するプロテインＡ様
物質のサブ断片又はポリクロナールＢ細胞活性化活性を
有するサブ断片が含まれる。実施例１で開示されるプラ
スミドpAc37はスタフィロコッカスオウレウスプロテイ
ンＡのアミノ酸配列に対し、コードを有する全ヌクレオ
チド配列を含有している。この配列は式Ａに示される
が、上に定義した同定しうるプロテインＡの様な物質及
び上に定義したプロテインＡ様の物質の同定しうるサブ
断片に対しコードを有しているクローン化ヌクレオチド
配列を得ることを当業者が出来るようにする。本発明の
同定しうるプロテインＡ様の物質及びそのプロテインＡ
様の同定しうるサブ断片は上に開示したプロテインＡと
同じ方法で使用できる、
ッド蛋白質に関するものである。新規な生物系はβ‐グ
ルクロニダーゼ遺伝子DNA（BG）及び所望の蛋白遺伝子D
NAからなる新規なハウブリッドプラスミドで形質転換し
た原核宿主からなる。本明細書で特定的に例示したのは
プラスミドpBG9、プラスミドpBG8、プラスミドpBG3-2及
びプラスミドpBG3-2ΔＮと命名される新規なハイブリッ
ドプラスミドの構築である。これらのプラスミドはβ‐
グルクロニダーゼ遺伝子DNA及びプロテインA DNAからな
る。適当な原核宿主を形質転換するのに使用される時プ
ロテインＡ様の化合物の製造が実現される。即ち本来の
蛋白Ａとは分子のFc領域におけるlgGを結合する鍵とな
る生物学的機能において元来のプロテインＡとは区別で
きない化合物である。有利なことにこれらのハイブリッ
ド蛋白質を形質転換した宿主によって発現することは知
られた任意の原核発現系で実現されるよりもかなり高
い。例えば本明細書で例示される融合（ハイブリッド）
蛋白質は、全大腸菌宿主細胞中のlon又はpnp突然変異の
何れかを含有している宿主細胞中で大腸菌の全細胞蛋白
質の45％よりも高い水準で製造される。又有利なことに
は発現されたハイブリッド蛋白質の100％が宿主細胞を
破裂させることによって可溶な細胞質ゾルフラクション
中に見出されることである。この結果は大腸菌の外来蛋
白質の比較的高い発現約７％）が不溶、不活性の蛋白質
を製造したことを見出した多くの当業者によって経験さ
れていることとは逆である。 プラスミドpBG3-2ΔＮは超高度な原核発現系の究極を例
示する。このプラスミドで形質転換された宿主は所望の
融合蛋白質の60％より多くを発現する。この超高水準発
現はプラスミドpBG3-2中に於けるΔNde欠失を構築する
ことによってrop遺伝子を部分的又は全体的に欠失させ
るか、又はそれ以外の方法で不活性化させることによっ
て達成される。この手順は大腸菌colE1プラスミドに由
来する全てのプラスミドがrop領域を含有しているので
これらの任意のものに本発明に於て使用できる。そのよ
うなプラスミドの例はpBR322、pBR328及びpHC79であ
る。 プラスミドpBG3-2ΔＮはBGに配列の18 のアミノ酸を含有しており、プロテインＡ活性を示す、
即ち分子のFc領域に於けるlgG結合活性を有する、BG-プ
ロテインＡ融合蛋白を製造するのに使用できる。 本発明の新規なハイブリッドプラスミドで形質転換した
大腸菌宿主がBGが本来の大腸菌宿主によって僅かな量し
か発現されないという事実に鑑みて、超高量でBG-プロ
テインＡ融合製品を発現するということは驚くべきこと
である。この低い本来の大腸菌によるBG発現水準は当業
者が原核表原形においてBGプロモーターDNAを使用する
ことをやめてしまうことに導いたと信じられる。BGプロ
モーターを使用するのでなくて、原核発現系においてla
c及びtrpプロモーターが広範に使用されてきたのであ
る。 本発明の発現系はプロテインＡ遺伝子又はその断片に対
する融合によって例示されているが、有利には他の有用
な蛋白質例えばインターフェロン、インターロイキン
類、インシュリン、成長ホルモン及び産業酵素、例えア
ミラーゼ、蛋白分解酵素、及び糖イソメラーゼ、等に対
しコードを有している他の遺伝子に融合された時にも、
ここに開示された手順に従い、そしてこの技術で知られ
ている付随する手順に従って有利に使用できる。 第１図はプラスミドpAc37からの中間プラスミドの構築
を例示する。プラスミドpAcはプロテインＡ遺伝子及び
全pBR322 DNAからなる。 第２図はプラスミドpBG101-41及びpBG9に対する遺伝子D
NA挿入物についての制限マップを示す。クローニング中
に再生されないBamH Iの位置は（BamH I）として印す。 第３図はプラスミドpBG9からのpBG5の構築を示す。 第４図はpBG5及びプラスミドpBR325からのプラスミドpB
G3-2の構築を示す。 第５図は、プラスミドpBG3-2からの、プラスミドpBG3-2
ΔＮの構築を示す。 式Ａはスタフィロコッカスオウレウス（Staphylo-coccu
s aureus）プロテインＡのアミノ酸配列に対しコードを
するヌクレオチド配列を示す。 式ＢはハイブリッドプラスミドpBG9のDNA配列の一部と
発現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。 式ＣはハイブリッドプラスミドpBG5のDNA配列の一部及
び発現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。 式ＤはハイブリッドpBG3-2のDNA配列の一部（β‐グル
クロニダーゼDNA中のSau3A位置からプロテインＡコーテ
ィング領域末端に位置するストップリンカーまでの部
分）と、発現された融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。 新規なプラスミド蛋白質及び本発明の発現系の構成及び
同定を詳細に記す前に使用された物質及び方法を此に開
示する。 （１）プラスミドDNA調製 プラスミドDNAの大規模製造に対して使用する手順は本
質的に以下の通りである。250mlの培養基を対数期へ成
長させ、クロラムフェニコールで光学密度0.6〜0.7（又
は別の方法としてクロラムフェニルコール添加なしで）
で増殖し、一夜生育させた。細胞を6Kで20分間JA14ロー
ターでペレット化し、6mlグルコース緩衝液（50mMグル
コース、25mMトリス、10mM EDTA）中で再懸濁した。細
胞を室温で1mlの20mg／mlの新たに造ったリゾチームの
存在下でデ10分間培養し13.8mlの0.2N NaOH中１％SDSを
添加しながら、５分間氷上に置き、氷上で更に15分間7m
lの5M KAC（pH5.0-5.5）と共に保った。デブリを10Kで1
0分間ペレット化し、等容量のフェノ‐クロロホルム‐
イソアミルアルコール（25:24:1、TE飽和、0.1％8-ヒド
ロキシキノリン）で１度上澄みを抽出した。0.6容量イ
ソプロピルアルコールで沈殿させることに続いて、DNA
をCsCl勾配物上で精製した。 （２）制限酵素消化及び所望断片の単離 消化を供給者の指示に従って実施した。断片の分離はア
ガロースゲル電気泳動で達成した（下に記載）。電気泳
動したDNAを、供給者の指示に従ってエル‐チップ（Elu
-tip）カラム（シュライヒャー及びシュネル、キイー
ネ、NH）上を通過させ、続いて2.5容量のEtOH中でキャ
リヤーのtRNAを添加して沈殿させることによって精製し
濃縮した。 （３）ミニ溶菌物プラスミド分析 形質転換した細胞を10μｇ／mlテトラサイクリン又は50
μｇ／mlのアンピシリンの何れかを補充した1mlのL-ブ
ロス中に接種し、３〜５時間、37℃で生育させた。細胞
を10,000×ｇで15分間遠心することによって集め、次に
50μｌのSTET緩衝液（８％庶糖、 ５％トライントンX-100、50mlのEDTA、50mMのトリスHC
l,pH8.0）中に再懸濁させた。 50μｌのリゾチーム 溶液（2mg／mlのSTET緩衝液中）を加え、試験管を４分
間室温で培養し、次に100℃で３分間加熱した。試験管
を次に氷上で０℃で冷却させた。０℃で５分後不溶の物
質を10,000xgの遠心で15分間で除いた。 等容量の氷冷イソプロピルアルコールを上澄み液に加
え、試験管を70℃で５分間おいた。DNA沈殿を10,000xg
で10分間の遠心によって集め、10〜25μｌのTE緩衝液
（10mMトリス‐Cl、0.1mM EDTA pH8.0）中に再懸濁し
た。DNAの制限消化物を上に記載したように6.7μｇ／ml
のRNase A（リボヌクレアーゼＡ）を含有する15μｌ最
終容量中の５μｌのプラスミド溶液を使用して上記のよ
うに実施した。 （４）DNA連結 付着性末端連結及びプラント末端連結の両方にT4リガー
ゼを用い、これは各場合に過剰で存在した（200u／μｇ
のDNA）。付着性末端については培養時間は16℃で２〜
４時間、そしてプラント末端に対しては時間を16時間に
増加させた。標準のベクター／挿入物連結に対し挿入物
は５倍のモル過剰で存在し、20μｌの反応容量中で0.02
pモルのベクター及び0.1pモルの挿入物であった。単一
分子レサーキュラリゼーション反応による欠失突然変異
の発生についてはプラスミドを１μｇ／mlに希釈し、続
いて制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結を行った。リ
ンカーのプラント末端連結はリンカーの100倍モル過剰
で行い、20μｌ反応当り0.02pモルでのベクターの濃度
であった。 （５）形質転換 新たな一夜培養基をL-ブロス中で希釈し、37℃で撹拌し
ながらA6000.3が得られるまで生育させた。細胞の氷の
上で冷却し、次に遠心分離により集めた（10分4100x
g）。細胞を氷冷50mM CaCl2の最初の容量の１／２中の
再懸濁し、氷上で20分間培養した。細胞を再度上記のよ
うに遠心分離で集め、氷冷50mM CaCl2（最初の容量の１
／25）中に再懸濁した。0.1mlの細胞懸濁液を１〜10μ
ｌ（50-100ng）のDNAプラスミド溶液と混合し、０℃で3
0分間静置させた。細胞を次に37℃で２分間加熱し、1.5
％の寒天及び10μｇ／mlのテトラサイクリン又は50μｇ
／mlのクロラムフェニコールの何れかを含有しているL-
ブロスプレート上で平板培養しこのときpBR325誘導物が
形質転換された。プレートを一夜37℃で培養した。１×
106コロニー／μｇプロスミドDNAの形質転換効率が常に
観測された。 （６）アガロース電気泳動 DNA断片を2X トリスボレート緩衝液（178mMトリス、17
8mMホウ酸、5mM Na2EDTA pH8.4）中の0.8％アガロース
中でのゲル電気泳動によって単離した。分析及び分離用
ゲルを水平ゲル箱中で電気泳動緩衝液（1X トリスボレ
ート）中に浸漬して、60ボルトにおいて走らせた。DNA
バンドがゲル中に5.0μｇ／mlのエチジウムブロマイド
（EtBr）を含ませることによって、紫外線下で見ること
が出来るようにされた。所望のDNAバンドを含有してい
る切片をゲルから切り取り、透析管（１／２の径）中の
0.5〜1.0mlの緩衝液を含有している1X トリスボレート
緩衝液中の電気泳動によってDNAを回収した。電気泳動
を30分間10ボルト又は染色された物質が透析管の側面に
対して位置するまで実施した。ゲルの切片を透析バッグ
から除去し、バッグを何回もトリスボレート緩衝液でフ
ラッシュすることによってDANを回収した。NaClを最終
濃度１モル迄DNA溶液に加え、エチジウムブロマイド及
びアガロースゲル不純物をトリスボレート緩衝液を飽和
させたフェノールで二度抽出することによって除いた。
フェノールをエーテルで２回抽出することによって除
き、精製したDNAを１／50容量の5M NaCl及び及び2.5容
量の冷たいエタノールで沈殿させることによって回収し
た。沈殿反応は‐70℃で15〜20分間実施した。沈殿した
DNAを10,000Xgで15分間遠心分離させることによって回
収した。回収した断片の収率は純粋なDNA標準とのエチ
ジウムブロマイド蛍光の直接比較によって検定した。典
型的には50％の回収が得られ、断片の寸法が増加するに
従い収率は減少した。 （７）プロテインＡラジオアッセイ プロテインＡ活性を50μｌの1:10000希釈正常兎血清（N
RS）を有するダイナテック イミュノロン（Dyna-tech
Immunolon）［ダイナテックダイアグノスティックスイ
ンコーポレーテッド、サウスウインドハムME］１ミクロ
力価ウエルを被覆して、室温で４時間培養することによ
って決定した。NRSをウェルから振動させ、これを次に
１時間４℃で培養することによって燐酸緩衝塩水中の１
％オバルブミン（OVA／PBS）でブロックした。ウェルを
空にし、次に25μｌの1.0及び1000ngプロテインＡの間
の量を含有している25μｌ試料を各ウェルに加えた。市
販プロテインＡを用いた標準曲線を各検定中で走らせ
た。全ての希釈はOVA／PBS中のものであった。25μｌの
125I-プロテインＡ（6000cpm）OVA／PBS中のものを各ウ
ェルに加え、プレートを16時間37℃で小さな水のビーカ
ーを含有している密封プラスチック容器中で培養した。
培養に続いてウェルを吸引し、PBS 3X及び水で１度洗浄
した。ウェルを乾燥し、2mlのアクアソル（Aquasol）
［ニュウイングランドニュークレアーコーポレーショ
ン、マサチュウセッツ州ボストン］中でベックマンモデ
ルLS7000ベータカウンター中で２分間計数した（ベック
マンインストラメンツインコーポレーテッド、カリフォ
ルニア州フラートン）。 （８）プロテインＡロケット免疫電気泳動（roket immu
noelectrophoresisi） プロテインＡの濃度及び活性を31μｇ／mlの人IgGをト
リス‐グリシンpH8.6緩衝液（3.75g／ｌトリス塩基、7.
5g／ｌグリシン）中に含有している１％アガロースゲル
中のロケット免疫電気泳動によって測定した。0.25及び
1.0μｇの間のプロテインＡを標準を各ゲル上で走らせ
た。電気泳動を３時間400ボルトで電気泳動緩衝液とし
てトリス‐グリシンを用いながら行った。電気泳動に続
いてゲルを乾燥させ、続いてコマッシーブルーで短時間
染色させ、そして５％メタノール、10％酢酸で脱染し
た。 （９）細胞均質化 形質転換した細胞を12,000xgで５分間４℃で遠心するこ
とによって集め、0.5容量のHEPES［4-（2-ヒドロキシエ
チル）‐1-ピペラジン‐エタンスルホン酸］‐KCl-DTT
（ジチオスレイトール）緩衝液（6g HEPES pH8.0、7.5g
KCl、0.15g DTT／ｌ）中に再懸濁させた。細胞を懸濁液
をリゾチームで最終濃度300μｇ／mlにおいて30分37℃
で消化させた。懸濁液を５分間で２回氷上で300ワット
のパルスで高周波による分解（sonicate）にかけた。可
溶蛋白を25,000xgで30分４℃で遠心することによって単
離した。上澄み液を除去し、沈殿を等容量のHEPES／KCl
／DTT緩衝液中に懸濁した。全細胞蛋白質がSDSゲル上で
走らせる実験については100℃で５分間、５容量のSDS-
均質化緩衝液（50％容量／容量グリセロール、５％容量
／容量2-メルカプトエタノール、５％重量／容量ドデシ
ル硫酸ナトリウム及び0.005g／mlピロニンＹ）中で加熱
することによって細胞を可溶化した。 （10）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタン
アナリシス 全てのSDSゲルはラエムリの方法によって走らせた（ラ
エムリU.K.［1970］ネイチャー［ロンドン］227:680-68
5）。これらのゲルは12％の全アクリルアミド濃度を含
有していた。スラブゲルは1.5mmの巾でホエファーサイ
エンティックインストラメンツ（カリフォルニア州サン
フランシスコ）から得た電気泳動装置中で走らせた。チ
ューブのゲルをスタッキングゲルなして6mm内径×10cm
ガラス管中で走らせた。ウェスタンボルツはニトロセル
ロースフィルター上で実施した。蛋白質を200mAで12時
間フィルターに移した。フィルターを４時間0.1％牛血
清アルブミン（BSA）で燐酸緩衝食塩（PBS）中で室温に
おいてブロックし、10uCiの［I125］‐IgG（NEN）又は1
00μｌのパーオキシダーゼとコンジュゲートさせた兎Ig
Gの何れかで室温で一夜撹拌させながらハイブリッド化
させた。このボルツを次に４回PBSで洗い、コダックXAR
-5X腺フィルムに露出するか又は25μl H2O2を有する100
ml PBS中25mgのジアミノベンジジンで展開した。 （11）クローン化細胞中のプロテインＡ含有量の測定 醗酵に続いて細胞を0.5％のトライトンX-100を有する20
mMのトリスHCl pH8.3中でガラスビーズで渦巻きさせる
か又はダイアノミル（DyamoMill）モデルKDL-パイロッ
トビードミル中で均質化させた（ニュージャージ州メイ
ウッドのインパンデックスから得られる）。これは最高
速度で運転し、0.2mm径のグラスビーズを仕込んであ
る。均質化物を16,000xgで30分間遠心することによって
透明にし、上澄み蛋白濃度はローレー（Lowery）蛋白質
検定又はビウレットによって測定した。プロテインＡ濃
度の人のIgGに対するロケット免疫電気泳動（roket imm
unoelectrophoresisis）で測定した。 （12）蛋白質のHPLC精製 プロテインＡ及びプロテアーゼＫをウォータース（Wate
rs）μボンダパック（Bondapak）C18カラム（ウォータ
ースアッソシエイツ、マサチューセッツミフォード）を
備えたベックマンモデル360勾配機械（ベックマンイン
ストラメンツインコーポレーテッド）を用いてHPLCによ
って精製又は検定した。プロテインＡを10mM燐酸ナトリ
ウムpH7.2（緩衝液Ａ）及び60％容量／容量イソプロパ
ノール10mMホスフェート（緩衝液Ｂ）の間で、線形勾配
によって精製した。カラムを1mM／分の流速において０
及び100％緩衝液Ｂの間で80分にわたって線形勾配で溶
出させた。プロテアーゼＫを精製し、プロテインＡを同
様の方法で検定したが、但し、緩衝液Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸（TFA）及び緩衝液Ｂは0.08％のアセトニト
リル中のTFAであった。カラムを流速2ml／分で０及び60
％緩衝液Ｂの間の60分に亘る線形勾配によって溶出させ
た。 （13）醗酵 醗酵はdo2及びpH制御を備えた201ケマペックファーメン
ター（ニューヨーク州ウッドバリーケマペックインコー
ポレーテッド）中で実施した。組替えセルを50％のdo2
（空気＝100％）に於て、示されたpHに於て生育させ
た。pHを5M NH4OH又は5M H2SO4のを必要ならば添加して
調製した。泡を消泡剤Ｂ（antifoam B）イー．アイ．デ
ュポンデネモアースアンドカンパニーインコーポレーテ
ッド、デラウエア州ウィルミントン）の添加によって抑
制した。醗酵温度は37℃で全ての醗酵は最終容量9.51で
実施した。 （14）細菌菌株及び培地 全ての使用した細菌株の起源及び遺伝子型は以下に挙げ
られている。全ての菌株はYT培地を用いて保持及び生育
された（8g／ｌトリプトン、5g／ｌ酵母抽出物、及び5g
／ｌ塩化ナトリウム） （15）化学物 ニトロセルロースはシュライヒャー及びシュネル（キー
ネ,NH）から得た。生育培地はディフコ（ミシガン州デ
トロイト）から得た。アクリルアミドはアキュレートケ
ミカルアンドサイエンティフィックコーポレーション
（ニューヨーク州ウェストリバー）から得た。プロテイ
ンＡ標準はファーマシア（ニュージャージー州フィスカ
タウェイ）から得た。全ての他の化学物質はシグマケミ
カルカンパニー（ミズリー州セントルイス）から得た。 （16）培養基 （Ａ）細菌 此に開示されている全ての大腸菌株は大腸菌K-12誘導菌
である。 （Ｂ）プラスミドを含有する微生物宿主 （Ｃ）プラスミド プラスミドpBR322は良く知られていて入手可能なプラス
ミドであり大腸菌宿主ATCC 37017中で保持されている。
精製されたpBR322DNAはボリバーエフ．、ロドロクェツ
アール．エル．、グリーネ ピー．ジェー．、ベスラ
ッチ エム．シー．、ハイネッカー エッチ．エル．、
ボイヤー エッチ．ダブリュー．、クロサ ジェイ．エ
ッチ．、及びファルコウ エス．（1977）、Gene2:95-1
13及びサトクリフ ジェイ．ジー．（1978）Nucleic Ac
ids Res.5:2721-2728中に記載されるように得ることが
出来る。プラスミドpBR325も良く知られているプラスミ
ドである。これは20877ミッドランド州ガイサーバーグ
ピーオーボックス6009ビーアールエルインコーポレー
テッドから得ることが出来る。 NRRL B-15907、NRRL B-15908、NRRL B-15909、NRRL B-1
5910及びNRRL B-15918はこれらの寄託番号を開示してい
る特許の付与によって一般に入手可能である。これらの
寄託菌が入手できるからといって行政行為によって本発
明に付与された特許権を損なってまで本発明を実施する
権利を構成するものではないことを理解すべきである。
培養寄託物はアメリカ合衆国イリノイ州ペオリア米国農
務省ノーザンリージョナルリサーチラボラトリー（NRR
L）の永久寄託中に寄託されている。 大腸菌PR13の代りに使用できる良く知られた他の大腸菌
宿主、例えば大腸菌MS371、HB101及び大腸菌GMS407（ノ
ベル エム．及びノベル ジー．［1973］Mol.Gen.Gen
t.120:319）がある。 更に使用できる他の原核宿主は、サルモネラ（Salmonel
la）、シュードモナス（Pseudomonas）、バシルス（Bac
illus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属から
の微生物である。 （17）形質転換宿主からの組替えプラスミドDNAの単離 組替えプラスミドDNAはその原核宿主から良く知られた
手順、例えば透明にした溶菌物‐密度勾配平衡手順など
を用いて単離することが出来る。 （18）DNA配列決定 DNA配列決定はマックサム及びギルバート（マクサム
エー．、ギルバート ダブリュ．［1977］Proc.Natl.Ac
ad.Sci.米国74:560）及びハイデッカー等（ハイデッカ
ー ジー．、メッシング ジェー．及びグロネンボルン
ビー．［1980］Gene 10:69）に記載されるように実施
される。 ハイブリッド蛋白遺伝子の構築 本明細書の代表として例示されるハイブリッド蛋白質遺
伝子の構築はプラスミドpBG101-41の使用で開始され
た。このプラスミドはプラスミドpBR322のBamHIに挿入
されているおよそ6kbの大腸菌β‐グルクロニダーゼ遺
伝子DNAを含有する。プラスミドpBG101-41はBamH I制限
エンドヌクレアーゼで切断され、Bal-31エクソヌクレア
ーゼでの短い処理によってブラント末端化される。この
エクソヌクレアーゼ処理は12の塩基を除去し、ブラント
末端を残す。 切断されブラント末端にされたpBG101-41への挿入のた
めのDNAは、pBR322中のスタフィロコッカスオウレウス
（Staphylococcus aureus）プロテインＡ遺伝子を含有
しているプラスミドpAc37から得られた。図面の第１図
を参照。 切断しブラント末端にしたプラスミドpBG101-41をブラ
ント末端のClaIプロテインＡ断片に連結させ、そしてハ
イブリッドプラスミドpBG9を与える。プラスミドpBG9は
プロテインＡ遺伝子に融合されたβ‐グルクロニダーゼ
蛋白質のN-末端167アミノ酸に対してコードを有してい
る501のヌクレオチドを含有している。図面の第２図を
参照。 ハイブリッドプラスミドpBG5はハイブリッドプラスミド
pBG101-41及びハイブリッドプラスミドpBG9から構築し
た。図面第３図参照。プラスミドpBG101-41はBamH Iで
切断し、次にBal-31エクソヌクレアーゼ（IBI-fast-Bal
-31）で消化した。生じるDNAをCla Iで消化し、上記の
ようにして調製した挿入DNAを連結させた。 完成したプロテインＡに対するコード配列を含有してい
る上記の連結の為の挿入DNAをハイブリッドプラスミドp
BG9からこのプラスミドを制限酵素Cla I及びFnu4H1で切
断することにより調製した。 挿入及びベクターDNAを連結させ大腸菌株PR13中に形質
転換し、プラスミドDNAを形質転換物から製造した。pBG
5としてラベルされる一つのクローンは予想された制限
プロフィールを含有していた。標準のM13方法によるこ
のクローンの配列分析はBGコード配列の18のアミノ酸が
残っていることを明らかにした。 ハイブリッドプラスミドpBG3-2はプラスミド pBG5及び
プラスミドpBR325から構築した。図面の第４図を参照。
プラスミドpBG3-2はプラスミド pBG5と同じDNAを含有
するが、但しpBG5はpBR322 DNAを含有し、pBG3-2はpBR3
25DNAを含有する点が違うだけである。またpBG3-2はプ
ロテインＡ遺伝子DNAの末端におけるCla I位置において
ストップコドンリンカーを含有している。DNAの構築さ
れたリンカーセグメントは全ての三つの読み枠（リーデ
ィングフレーム）に於てストップコドンを含有してい
た。最終的なハイブリッド蛋白質製品がどんなpBR325に
由来するアミノ酸も含有しないことを確実にするため
に、これをpBG3-2構築におけるCla I位置へ挿入した。 プラスミドpBG3-2中の融合遺伝子によってコードされる
ハイブリッド蛋白質の増加された発現がΔNde欠失を構
築することによって、即ちpBR325のNde位置とBG配列のN
de位置の間のDNAを除去することによって得られた。こ
の欠失はpBR325中のrop遺伝子の大部分を除去し、並び
にBGプロモーター領域の最初の230塩基を除去する、こ
の構築はプラスミドpBG3-2ΔＮとして同定される。大腸
菌宿主がpBG3-2ΔＮで形質転換されるとき、宿主は全大
腸菌蛋白質の60％を越える水準でプロテインＡを発現す
る。これと対照してプロテインＡはプラスミドpBG3-2を
含有する宿主細胞中で全細胞蛋白質の50％で大腸菌中で
発現される。 プロテインＡの有用性 プロテインＡは種々の診断及び基本的な研究試験系に於
てイミュノアブソーベント（免疫吸収材）として広く使
用されている。米国特許4,322,274を参照。プロテイン
Ａの応用における最近の興味はその抗癌処理に於ける可
能性のある臨床使用に中心がおかれてきた。感作された
末梢の血液のリンパ球は、通常は腫よう細胞の細胞毒性
の原因となっているが特定の抗原、抗体、抗グロブリン
及び免疫複合体からなると推定される血清封鎖因子によ
ってその機能が阻害されると仮説がたてられている。バ
ーナーズ ビー．シー．（1981）Caneer Bull.33:278参
照。これらのブロッキング因子はプロテインＡを含有す
るスタフィロコッカスオウレウスのコーワン（Cowan）
Ｉ細胞に吸収されることによって腫ようを有する血清か
ら除去さ得、従ってインビトロ試験系において細胞によ
って媒介される腫よう細胞毒性が進行できるようにす
る。スティール ジー．アンケルスト ジェー．及びス
ジョグルン エッチ．［1974］Int.J.Cancer 14:83参
照。プロテインＡ又はIgG結合活性と独立したポリクロ
ナール抗体合成も活性化させる。スジョダール ジェ
ー．及びモラー ジー．［1979］Scand.J.Immunol.10:5
93参照。 プロテインＡの抗癌剤としての広範な試験は材料の高い
コスト及びプロテインＡ調製に於ける不純物の存在によ
って邪魔されてきた。プロテインＡの調製のコストが非
常に減少され、純度が改良されればプロテインＡの抗癌
用途に対する臨床試験が更により迅速に進行するであろ
う。 本明細書に開示したデータを有すれば当業者は容易に実
質的に同じプロテインＡ様の生物活性を有する分子に対
しコードを有する他の同等のヌクレオチド配列の同定す
ることを容易に認識するであろう。従って本発明の範囲
は上記の特定のヌクレオチド配列のみならず、実質的に
同じ同定しうるプロテインＡ様生物活性を有する分子に
対しコードを有する均等なヌクレオチド配列全てを包含
するものである。均等のという用語はその通常の特許用
語としての使用であって、本質的に同じ宿主中で実質的
に同じ同定しうるプロテインＡ様生物活性を有する分子
を製造するのに本明細書で同定したヌクレオチド配列の
様に実質的に作用するヌクレオチド配列を意味する。こ
の定義内でFc領域にIgG結合性を有するプロテインＡ様
物質のサブ断片又はポリクロナールＢ細胞活性化活性を
有するサブ断片が含まれる。実施例１で開示されるプラ
スミドpAc37はスタフィロコッカスオウレウスプロテイ
ンＡのアミノ酸配列に対し、コードを有する全ヌクレオ
チド配列を含有している。この配列は式Ａに示される
が、上に定義した同定しうるプロテインＡの様な物質及
び上に定義したプロテインＡ様の物質の同定しうるサブ
断片に対しコードを有しているクローン化ヌクレオチド
配列を得ることを当業者が出来るようにする。本発明の
同定しうるプロテインＡ様の物質及びそのプロテインＡ
様の同定しうるサブ断片は上に開示したプロテインＡと
同じ方法で使用できる、
以下のものは本発明を実施するのに最良の方法を含めた
手順を例示する。これらの実施例は制限するものと解釈
されない。特に示さなければ全ての％は重量により、全
ての溶媒混合物は容量による。 実施例１ プラスミドpBG101-41及びプラスミドpAc37からのハイブ
リッドプラスミドpBG9の構築及び融合プロテインＡ製品
の発現 β‐グルクロニダーゼプロモーター及びβ‐グルクロニ
ダーゼプロテインＡハイブリッド遺伝子を含有するプラ
スミドpBG9は、プラスミドpBG101-41及びブラント末端
のCla Iでの上記プロテインＡの断片から構築した。プ
ラスミドpBG101-41は独特のBamH I場所（最初のメチオ
ニンから後の179アミノ酸位置）において開き、Bal-31
エクソヌクレアーゼ（製造業者によって記載される通
り）での短い処理によってプラント末端にした。このエ
クソヌクレアーゼ処理は36の塩基（12のアミノ酸）を除
去し、ブラント末端を残した。プラスミドを更にプラス
ミドpBR322の独特の位置においてCla Iで切断した。プ
ラスミドpAc37はpBR322中にプロテインＡ遺伝子を含有
する。プラスミドpAc37はTTG出発コンド（Ｔ＝１）の
後、65及び1265位置においてプロテインＡ遺伝子を開裂
させるRsaで消化した。1199塩基対のRsa断片をアガロー
ス電気泳動で単離した。Cla Iリンカー（ニューイング
ランドバイオラブ、マサチュウセッツ州バーレー、配列
はCATCGATG）を単離したRsa断片に融合した。この構築
物をCla Iで切断し、pBR322のCla I位置に挿入し、pA1
と命名される中間プラスミドを形成した。プラスミドpA
1を部分的にCla Iで消化し、Cla Iのスティッキー末端
（付着性末端・粘性末端）を、25μｌの50mMトリス‐Cl
pH7.2、10mM Mg2SO4、0.1mM DTT、50μｇ／ml BSA、及
び１μｇの制限断片中に、各2mMの4-デオキシヌクレオ
チド三燐酸及び５単位の大腸菌DNAポリメラーゼ１のク
レノウ（Klenow）断片含有する反応中で充填させた。充
填反応は20分間22℃で培養し、70℃で10分間熱不活性化
することによって止めた。プラスミドを次にSal Iで消
化して1826塩基対断片をアガロース電気泳動で単離し
た。この断片を更にCla Iで切断し、上に述べた切断プ
ラスミド中に挿入した（図面の第１図参照）。 プラスミドpBG9のDNA配列及び大腸菌PR13（pBG9）によ
って発現された融合蛋白質のアミノ酸配列を式Ｂに示
す。 プラスミドpBG9及びpBG101-41及び融合プロテインＡ製
品の発現 プラスミドpBG101-41はBamH Iによって開かれたpBR322
であって、BGプロモーター及びBGコーティング領域を含
有しているSau I部分配列の挿入を有するものからな
る。プラスミドpBG101-41はBamH Iで切断し、これはメ
チオニン出発コドンの後、179アミノ酸の位置でこのプ
ラスミドを開裂させ、次にBal-31エクソヌクレアーゼ
（IBI-fast Bal-31）で酵素濃度20U／ml及びDNA濃度100
μｇ／mlに於て消化される。反応を30℃で進行させる。
10分、15分及び20分に於て消化物の１／３が除かれ、反
応をEDTAを20mM添加し、続いて‐80℃に冷凍することに
よって停止させる。特定時点のものを独立にフェノール
‐エーテルで抽出し、エタノールで沈殿させる。DNAをC
la Iで消化させ、これがpBR322の独特の位置で切断さ
れ、次に挿入物DNAを連結させる。 挿入物DNAは完全なプロテインＡコード化配列を含有し
ており、プラスミドpBG9から調製した。このプラスミド
を制限酵素Cla I及びFnu4H1で切断した。制限エンドヌ
クレアーゼFnu4H1はプロテインＡ遺伝子をシグナルペプ
チド開裂位置の５′末端に対し一つの塩基の所で切断
し、そしてCla Iはこの遺伝子をC-末端繰り返し領域に
おいて切断する。このCla I位置はプロテインＡ遺伝子
の３′‐末端から284塩基対離れた位置のRsa位置に於て
Cla Iリンカーを連結させることによって構築される。 挿入物及びベクターDNAを4:1の挿入物：ベクター比で20
μｇ／mlベクターをDNAを含有する反応中で連結させ
る。T4リガーゼ触媒反応を15℃で一夜進行させ、次にリ
ガーゼ70℃で15分間加熱することによって不活性化させ
た。反応混合物をXho（これはBG蛋白質中の独特の位置
において切断する）で消化させ、BG欠失を含有している
任意のプラスミドの形質転換を防止する。反応混合物を
大腸菌株PR13中に形質転換させ、プラスミドDNAを形質
転換物から調製する。一つのクローンである標準された
pBG5は予想された制限プロフィールを含有していた。こ
のクローンのM13方法による配列分析はBGコード配列の1
8のアミノ酸が残っていることを明らかにした（図面の
第３図を参照）。 プラスミドpBG5のDNA配列と大腸菌PR13（pBG5）で発現
された融合蛋白のアミノ酸を式Ｃに示す。 実施例３ プラスミドpBG5及びプラスミドpBR325からのハイブリッ
ドプラスミドpBG3-2の構築及び融合プロテインＡ製品の
発現 プラスミドpBR325をCla I及びSal Iで消化させ、プラス
ミドコード化配列のほとんどを含有している5368塩基対
断片をアガロース電気泳動によって単離する。プラスミ
ドpBG5もCla I及びSal Iで消化させ、BGプロモーター及
びフロテインＡコーティング配列を含有している2000塩
基対断片をアガロースゲル電気泳動で単離する。これら
の二つのDNA断片を等モル比で、断片当り30μｇ／mlに
於て混合し、T4リガーゼで連結させる。生じる生成物を
Cla Iで消化させ、生じる7.4kbの線状分子をアガロース
電気泳動で単離する。実施例４に記載のように調製した
ストップコドンを含有するリンカーDNA断片を大モル過
剰で加え、反応をT4リガーゼで一晩15℃で連結させる。
閉環状のプラスミドをCla Sma Iで消化させ、複数のス
トップリンカーを有するか又はストップリンカーを有し
ないプラスミドに線状化させ、次に大腸菌PR13に形質転
換する（図面の第４図を参照）。 プラスミドpBG3-2のDNA配列及び大腸菌PR13（pBG3-2）
によって発現される融合蛋白のアミノ酸配列を式Ｄに示
す。 実施例４ −−ストップリンカーの構築 ストップコドンを全ての三つの読み枠（リーディングフ
レーム）中に含有しているDNAのリンカーセグメントをp
BG3-2構築物中のCla I位置に挿入し、最終生成物がどん
なpBRに由来するアミノ酸も含有しないことを確実にす
る。合成DNAセグメントで配列CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGC
GCCを有するものを製造業者の指示する手順にしたがっ
てアプライドバイオシステムDAN合成機械、モデル380A
（フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて合
成する。この配列は自己アニーリングのものであって二
重鎖DNA断片を生成する。 CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGCGCC CCGCGCGATCGATCGATCGCGCGGGC を生成し、これは停止配列CTAGCTAGCTAG及びBssH Iの位
置GCGCGCをトリフェージック（三重）ストップの両端に
含有している。 実施例５ −−プラスミドpBG3-2からのプラスミドpBG3
-2ΔＮの構築 プラスミドpBG3-2を制限エンドヌクレアーゼNdeで消化
し、切断したプラスミドをフェノール‐エーテルで抽出
し、エタノールで沈殿させた。プラスミドを希釈DNA濃
度（12μｇ／ml）に於て連結させてNde断片の取込なし
に分子間リサーキュラリゼーションがしやすいようにし
てプラスミドpBG3-2ΔＮをあたえる。反応混合物を大腸
菌PR13に形質転換し、コロニーをミニリゼート分析で検
定する。図面の第５図を参照。 実施例６ −−大腸菌PR13又は大腸菌SG20251へのプラ
スミドpBG3-2、pBG3-2ΔＮ、pBG9及びpBG5の形質転換 大腸菌PR13又は大腸菌SG20251を（５）の形質転換で記
載したように生育させ新たな一夜培養基から収穫した。 細胞を上記の様にCaCl2で処理することにより形質転換
能力があるようにした。 プラスミドDNAを（１）プラスミドDNA調製において記載
した方法によってプラスミドを宿している細胞から調製
した。 能力のある（コンペテント）細胞0.1mlを50〜100ngのプ
ラスミドDNAと30分間０℃で混合した。細胞を37℃で２
時間加熱し、次に1.5％寒天及び10μｇ／mlのテトラサ
イクリン又は50μｇ／mlのクロラムフェニコールの何れ
かを含有しているL-ブロス平板培養基上で平板培養し、
ここでpBR325誘導物が形質転換された。平板培養基を一
夜37℃で培養した。プラスミドDNAμｇ当り１×106コロ
ニーの形質転換効率が常に観測された。 実施例７ −−大腸菌PR13（pBG3-2）の醗酵 大腸菌PR13（pBG3-2）はこの技術の当業者に良く知られ
た幾つもの方法の任意のものによって生育できる。この
微生物は大腸菌の生育を指示することのできる任意の複
合培地上で、そして定義された培地が十分な生育因子及
び細胞成長を支持するのに必要な代謝物を含有するなら
ば任意の定義された培地上で生育するのであろう。一般
にこれらの定義培地は、アミノ酸スレオニン及びロイシ
ンをもし含有するならば大腸菌を生育することのできる
ものをなす。この微生物による組替え蛋白質の製造は分
解産物抑制に従う。従って蛋白質の製造が望まれる時は
グルコース又は分解産物抑制（カタボライトプレッショ
ン）を生じることのできるどんな基質も生育培地が含有
しないように注意すべきである。大腸菌の分解産物抑制
はcAMPの水準の細胞間の減少によって仲介される。従っ
てこの生物はこのような培地が高水準のcAMP、典型的に
は4mMを含有するならば、又はこれらの培地が高水準の
脂質可溶cAMP誘導体、例えばジブテリルcAMPを約10μＭ
の濃度で含有するならばグルコースを含有している生育
培地の存在下で生育させられ得る。 一般にプロテインＡの高水準は大腸菌PR13（pBG3-2）の
凍結原料からの接種物を調製することによって製造する
ことが出来る。これはYT／Cm上に斜面培養され、一夜生
育されたものである。YTは8g／ｌの酵母抽出物、5g／ｌ
のトリプトン及び5g／ｌのNaClを含有する。YT／Cmは50
mg／ｌのクロラムフェニコールを含有している。コロニ
ーを平板培養基からとりあげ、10mlのYT／Cm中に接種
し、これをで37℃で６〜12時間生育させて次に直接醗酵
器中に接種する。 大腸菌PR13（pBG3-2）を9.8lの5g／ｌ酵母抽出物及び5g
／ｌのトリプトンを仕込んだ201ケェマペックファーメ
ンター（ニューヨーク州ウッドリバー）中で生育させ
る。溶解させた酵素濃度を約50％（空気＝100％）に保
ち、5M NaOH又は5M H2SO4を自動的に添加することによ
ってpHを約6.8に保った。正常な接種物容量は約10mlで
ある。この接種物で醗酵器は９時間の生育の後に収穫で
きる。細胞がこの方法で生育される時、醗酵器中で製造
される全大腸菌に由来する蛋白質の46％がプロテインＡ
である。 クローン化されたプロテインＡが活性形で発現されてい
ることが証拠により実証される。［125I］標識された兎
IgGをブロブ（探り）にしたウエスタンブロットは、熱
いSDS溶液での処理、及びSDSポリアクリルアミドゲル中
での電気泳動の後においてさえハイブリッド蛋白質がIg
G結合活性を有することを示している。 pnp-宿主株から抽出された可溶性プロテイＡの特異的活
性はラジオアッセイによって測定した（（６）プロテイ
ンＡラジオアッセイを参照）。この検定は細胞原形質ゾ
ル（cytosol）が純粋な市販物質の特異活性の35％であ
るプロテインＡ活性を有したことを実証した。この原形
質ゾル（cytosolic）調製中のプロテインＡ濃度はSDSゲ
ル電気泳動によって35％と測定され、クローン化された
物質が天然の蛋白質と本質的に同等の特異的活性を有し
ていることを示している。 実施例８ −−大腸菌PR13（pBG3-2ΔＮ）の醗酵 組替え生物を（13）醗酵のところで記載したように醗酵
器中で生育させ、pBG3-2の様にプラスミドpBG3-2ΔＮを
分解産物抑制にかけた。大腸菌PR13（pBG3-2）に対して
記載した培地及び条件をこの微生物を生育させるにも使
用できる。驚くべきことにプラスミドpBG3-2ΔＮを含有
している大腸菌は組替え産物の驚くほど高い水準を生じ
た。 次の表はpBG9、pBG3-2及びpBG3-2NΔのプロテインＡ発
現水準を示す。 プロテインＡ発現水準 BGアミノ酸数 発現水準＊ pBG9 168 46％ pBG3-2 18 50％ pBG3-2ΔＮ 18 73％ ＊ 可溶性細胞蛋白質に対する％としてのプロテインＡ プロテインＡの含有量はロケット免疫電気泳動により、
そして全蛋白質をビウレットによって測定した。 実施例９ −−プラスミドで形質転換した宿主の単離 宿主微生物、例えば大腸菌PR13は、プラスミド、例えば
pBG9抜きで回収できる。これを用いて標準手順によって
これを形質転換された。例えば形質転換された宿主は0.
01％重量／容量SDSを含有しているYT培地中で生育出
来、宿主からプラスミドをエジェクトする。プラスミド
のない宿主細胞はクロラムフェニコール及び／又はアン
ピシリンに対する抵抗性がないことの為にスクリーンす
ることが出来る。 この技術で良く知られているように蛋白質、例えばプロ
テインＡのアミノ酸配列はDNAのヌクレオチド配列によ
って決定できる。遺伝子コードの冗長性、即ち蛋白質を
製造するのに使われるアミノ酸の多くに対し、一個より
多くのコード化ヌクレオチドトリブレット（コドン）が
使用され得るので特定のアミノ酸に対して異なるヌクレ
オチド配列がコード出来る。従って遺伝子コードは以下
のように描かれる。 フェニルアラニン（Phe） TTK ヒスチジン（His） CAK ロイシン（Leu） XTY ルタミン（Gln） CAJ イソロイシン（Ile） ATH アスパラギン（Asn）AAK メチオニン（Met） ATG リジン（Lys） AAJ バリン（Val） GTL アスパラギン酸(Asp)GAK セリン（Ser） QRS グルタミン酸（Glu）GAJ プロリン（Pro） CCL システイン（Cys） TGK スレオニン（Thr） ACL トリプトファン(Try)TGG アラニン（Ala） GCL アルギニン（Arg） WGZ チロシン（Tyr） TAK グリシン（Gly） GGL 末端信号 TAJ 末端信号 TGA キー：各３文字のデオキシヌクレオチドトリプレットは
左側に５′‐末端、及び右側に３′‐末端を有するmRNA
のトリヌクレオチドに対応する。本明細書に与えられる
全てのDNA配列はその配列がmRNA配列に対応する配列の
鎖のものであって、ウラシルの代りにチミンで置き換え
られている。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成し
ているプリン又はピリミジン塩基を表している。 Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミ
ン Ｘ＝ＹがＡ又はＧの時にＴ又はＣ Ｘ＝ＹがＴ又はＣの時にＣ Ｙ＝ＸがＣの時にＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｙ＝ＸがＴの時にＡ又はＧ Ｗ＝ＺがＡ又はＧの時にＣ又はＡ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの時にＣ Ｚ＝ＷがＣの時Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｚ＝ＷがＡの時Ａ又はＧ QR＝ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの時TC Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 上記は融合されたプロテインＡ製品の新規なアミノ酸配
列及び他の有用な蛋白質が蛋白質の同じアミノ酸配列に
対しコードしている均等なヌクレオチド配列によって製
造できることを示す。従って本発明はそのような均等の
ヌクレオチド配列を含むものである。更に、変化が蛋白
質の二次構造を変化させないならば、アミノ酸配列を変
化させることによって、同定された構造及び機能の蛋白
質を構成することが出来ることを示している（カイザー
イー．ティー．及びゲズディー エフ．ジェー．［19
84］Science 223:249-255）。 ここに記載された研究は全てNIHガイドラインに特定さ
れた物理的及び生物学的封じ込め要求にのっとってなさ
れた。
手順を例示する。これらの実施例は制限するものと解釈
されない。特に示さなければ全ての％は重量により、全
ての溶媒混合物は容量による。 実施例１ プラスミドpBG101-41及びプラスミドpAc37からのハイブ
リッドプラスミドpBG9の構築及び融合プロテインＡ製品
の発現 β‐グルクロニダーゼプロモーター及びβ‐グルクロニ
ダーゼプロテインＡハイブリッド遺伝子を含有するプラ
スミドpBG9は、プラスミドpBG101-41及びブラント末端
のCla Iでの上記プロテインＡの断片から構築した。プ
ラスミドpBG101-41は独特のBamH I場所（最初のメチオ
ニンから後の179アミノ酸位置）において開き、Bal-31
エクソヌクレアーゼ（製造業者によって記載される通
り）での短い処理によってプラント末端にした。このエ
クソヌクレアーゼ処理は36の塩基（12のアミノ酸）を除
去し、ブラント末端を残した。プラスミドを更にプラス
ミドpBR322の独特の位置においてCla Iで切断した。プ
ラスミドpAc37はpBR322中にプロテインＡ遺伝子を含有
する。プラスミドpAc37はTTG出発コンド（Ｔ＝１）の
後、65及び1265位置においてプロテインＡ遺伝子を開裂
させるRsaで消化した。1199塩基対のRsa断片をアガロー
ス電気泳動で単離した。Cla Iリンカー（ニューイング
ランドバイオラブ、マサチュウセッツ州バーレー、配列
はCATCGATG）を単離したRsa断片に融合した。この構築
物をCla Iで切断し、pBR322のCla I位置に挿入し、pA1
と命名される中間プラスミドを形成した。プラスミドpA
1を部分的にCla Iで消化し、Cla Iのスティッキー末端
（付着性末端・粘性末端）を、25μｌの50mMトリス‐Cl
pH7.2、10mM Mg2SO4、0.1mM DTT、50μｇ／ml BSA、及
び１μｇの制限断片中に、各2mMの4-デオキシヌクレオ
チド三燐酸及び５単位の大腸菌DNAポリメラーゼ１のク
レノウ（Klenow）断片含有する反応中で充填させた。充
填反応は20分間22℃で培養し、70℃で10分間熱不活性化
することによって止めた。プラスミドを次にSal Iで消
化して1826塩基対断片をアガロース電気泳動で単離し
た。この断片を更にCla Iで切断し、上に述べた切断プ
ラスミド中に挿入した（図面の第１図参照）。 プラスミドpBG9のDNA配列及び大腸菌PR13（pBG9）によ
って発現された融合蛋白質のアミノ酸配列を式Ｂに示
す。 プラスミドpBG9及びpBG101-41及び融合プロテインＡ製
品の発現 プラスミドpBG101-41はBamH Iによって開かれたpBR322
であって、BGプロモーター及びBGコーティング領域を含
有しているSau I部分配列の挿入を有するものからな
る。プラスミドpBG101-41はBamH Iで切断し、これはメ
チオニン出発コドンの後、179アミノ酸の位置でこのプ
ラスミドを開裂させ、次にBal-31エクソヌクレアーゼ
（IBI-fast Bal-31）で酵素濃度20U／ml及びDNA濃度100
μｇ／mlに於て消化される。反応を30℃で進行させる。
10分、15分及び20分に於て消化物の１／３が除かれ、反
応をEDTAを20mM添加し、続いて‐80℃に冷凍することに
よって停止させる。特定時点のものを独立にフェノール
‐エーテルで抽出し、エタノールで沈殿させる。DNAをC
la Iで消化させ、これがpBR322の独特の位置で切断さ
れ、次に挿入物DNAを連結させる。 挿入物DNAは完全なプロテインＡコード化配列を含有し
ており、プラスミドpBG9から調製した。このプラスミド
を制限酵素Cla I及びFnu4H1で切断した。制限エンドヌ
クレアーゼFnu4H1はプロテインＡ遺伝子をシグナルペプ
チド開裂位置の５′末端に対し一つの塩基の所で切断
し、そしてCla Iはこの遺伝子をC-末端繰り返し領域に
おいて切断する。このCla I位置はプロテインＡ遺伝子
の３′‐末端から284塩基対離れた位置のRsa位置に於て
Cla Iリンカーを連結させることによって構築される。 挿入物及びベクターDNAを4:1の挿入物：ベクター比で20
μｇ／mlベクターをDNAを含有する反応中で連結させ
る。T4リガーゼ触媒反応を15℃で一夜進行させ、次にリ
ガーゼ70℃で15分間加熱することによって不活性化させ
た。反応混合物をXho（これはBG蛋白質中の独特の位置
において切断する）で消化させ、BG欠失を含有している
任意のプラスミドの形質転換を防止する。反応混合物を
大腸菌株PR13中に形質転換させ、プラスミドDNAを形質
転換物から調製する。一つのクローンである標準された
pBG5は予想された制限プロフィールを含有していた。こ
のクローンのM13方法による配列分析はBGコード配列の1
8のアミノ酸が残っていることを明らかにした（図面の
第３図を参照）。 プラスミドpBG5のDNA配列と大腸菌PR13（pBG5）で発現
された融合蛋白のアミノ酸を式Ｃに示す。 実施例３ プラスミドpBG5及びプラスミドpBR325からのハイブリッ
ドプラスミドpBG3-2の構築及び融合プロテインＡ製品の
発現 プラスミドpBR325をCla I及びSal Iで消化させ、プラス
ミドコード化配列のほとんどを含有している5368塩基対
断片をアガロース電気泳動によって単離する。プラスミ
ドpBG5もCla I及びSal Iで消化させ、BGプロモーター及
びフロテインＡコーティング配列を含有している2000塩
基対断片をアガロースゲル電気泳動で単離する。これら
の二つのDNA断片を等モル比で、断片当り30μｇ／mlに
於て混合し、T4リガーゼで連結させる。生じる生成物を
Cla Iで消化させ、生じる7.4kbの線状分子をアガロース
電気泳動で単離する。実施例４に記載のように調製した
ストップコドンを含有するリンカーDNA断片を大モル過
剰で加え、反応をT4リガーゼで一晩15℃で連結させる。
閉環状のプラスミドをCla Sma Iで消化させ、複数のス
トップリンカーを有するか又はストップリンカーを有し
ないプラスミドに線状化させ、次に大腸菌PR13に形質転
換する（図面の第４図を参照）。 プラスミドpBG3-2のDNA配列及び大腸菌PR13（pBG3-2）
によって発現される融合蛋白のアミノ酸配列を式Ｄに示
す。 実施例４ −−ストップリンカーの構築 ストップコドンを全ての三つの読み枠（リーディングフ
レーム）中に含有しているDNAのリンカーセグメントをp
BG3-2構築物中のCla I位置に挿入し、最終生成物がどん
なpBRに由来するアミノ酸も含有しないことを確実にす
る。合成DNAセグメントで配列CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGC
GCCを有するものを製造業者の指示する手順にしたがっ
てアプライドバイオシステムDAN合成機械、モデル380A
（フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて合
成する。この配列は自己アニーリングのものであって二
重鎖DNA断片を生成する。 CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGCGCC CCGCGCGATCGATCGATCGCGCGGGC を生成し、これは停止配列CTAGCTAGCTAG及びBssH Iの位
置GCGCGCをトリフェージック（三重）ストップの両端に
含有している。 実施例５ −−プラスミドpBG3-2からのプラスミドpBG3
-2ΔＮの構築 プラスミドpBG3-2を制限エンドヌクレアーゼNdeで消化
し、切断したプラスミドをフェノール‐エーテルで抽出
し、エタノールで沈殿させた。プラスミドを希釈DNA濃
度（12μｇ／ml）に於て連結させてNde断片の取込なし
に分子間リサーキュラリゼーションがしやすいようにし
てプラスミドpBG3-2ΔＮをあたえる。反応混合物を大腸
菌PR13に形質転換し、コロニーをミニリゼート分析で検
定する。図面の第５図を参照。 実施例６ −−大腸菌PR13又は大腸菌SG20251へのプラ
スミドpBG3-2、pBG3-2ΔＮ、pBG9及びpBG5の形質転換 大腸菌PR13又は大腸菌SG20251を（５）の形質転換で記
載したように生育させ新たな一夜培養基から収穫した。 細胞を上記の様にCaCl2で処理することにより形質転換
能力があるようにした。 プラスミドDNAを（１）プラスミドDNA調製において記載
した方法によってプラスミドを宿している細胞から調製
した。 能力のある（コンペテント）細胞0.1mlを50〜100ngのプ
ラスミドDNAと30分間０℃で混合した。細胞を37℃で２
時間加熱し、次に1.5％寒天及び10μｇ／mlのテトラサ
イクリン又は50μｇ／mlのクロラムフェニコールの何れ
かを含有しているL-ブロス平板培養基上で平板培養し、
ここでpBR325誘導物が形質転換された。平板培養基を一
夜37℃で培養した。プラスミドDNAμｇ当り１×106コロ
ニーの形質転換効率が常に観測された。 実施例７ −−大腸菌PR13（pBG3-2）の醗酵 大腸菌PR13（pBG3-2）はこの技術の当業者に良く知られ
た幾つもの方法の任意のものによって生育できる。この
微生物は大腸菌の生育を指示することのできる任意の複
合培地上で、そして定義された培地が十分な生育因子及
び細胞成長を支持するのに必要な代謝物を含有するなら
ば任意の定義された培地上で生育するのであろう。一般
にこれらの定義培地は、アミノ酸スレオニン及びロイシ
ンをもし含有するならば大腸菌を生育することのできる
ものをなす。この微生物による組替え蛋白質の製造は分
解産物抑制に従う。従って蛋白質の製造が望まれる時は
グルコース又は分解産物抑制（カタボライトプレッショ
ン）を生じることのできるどんな基質も生育培地が含有
しないように注意すべきである。大腸菌の分解産物抑制
はcAMPの水準の細胞間の減少によって仲介される。従っ
てこの生物はこのような培地が高水準のcAMP、典型的に
は4mMを含有するならば、又はこれらの培地が高水準の
脂質可溶cAMP誘導体、例えばジブテリルcAMPを約10μＭ
の濃度で含有するならばグルコースを含有している生育
培地の存在下で生育させられ得る。 一般にプロテインＡの高水準は大腸菌PR13（pBG3-2）の
凍結原料からの接種物を調製することによって製造する
ことが出来る。これはYT／Cm上に斜面培養され、一夜生
育されたものである。YTは8g／ｌの酵母抽出物、5g／ｌ
のトリプトン及び5g／ｌのNaClを含有する。YT／Cmは50
mg／ｌのクロラムフェニコールを含有している。コロニ
ーを平板培養基からとりあげ、10mlのYT／Cm中に接種
し、これをで37℃で６〜12時間生育させて次に直接醗酵
器中に接種する。 大腸菌PR13（pBG3-2）を9.8lの5g／ｌ酵母抽出物及び5g
／ｌのトリプトンを仕込んだ201ケェマペックファーメ
ンター（ニューヨーク州ウッドリバー）中で生育させ
る。溶解させた酵素濃度を約50％（空気＝100％）に保
ち、5M NaOH又は5M H2SO4を自動的に添加することによ
ってpHを約6.8に保った。正常な接種物容量は約10mlで
ある。この接種物で醗酵器は９時間の生育の後に収穫で
きる。細胞がこの方法で生育される時、醗酵器中で製造
される全大腸菌に由来する蛋白質の46％がプロテインＡ
である。 クローン化されたプロテインＡが活性形で発現されてい
ることが証拠により実証される。［125I］標識された兎
IgGをブロブ（探り）にしたウエスタンブロットは、熱
いSDS溶液での処理、及びSDSポリアクリルアミドゲル中
での電気泳動の後においてさえハイブリッド蛋白質がIg
G結合活性を有することを示している。 pnp-宿主株から抽出された可溶性プロテイＡの特異的活
性はラジオアッセイによって測定した（（６）プロテイ
ンＡラジオアッセイを参照）。この検定は細胞原形質ゾ
ル（cytosol）が純粋な市販物質の特異活性の35％であ
るプロテインＡ活性を有したことを実証した。この原形
質ゾル（cytosolic）調製中のプロテインＡ濃度はSDSゲ
ル電気泳動によって35％と測定され、クローン化された
物質が天然の蛋白質と本質的に同等の特異的活性を有し
ていることを示している。 実施例８ −−大腸菌PR13（pBG3-2ΔＮ）の醗酵 組替え生物を（13）醗酵のところで記載したように醗酵
器中で生育させ、pBG3-2の様にプラスミドpBG3-2ΔＮを
分解産物抑制にかけた。大腸菌PR13（pBG3-2）に対して
記載した培地及び条件をこの微生物を生育させるにも使
用できる。驚くべきことにプラスミドpBG3-2ΔＮを含有
している大腸菌は組替え産物の驚くほど高い水準を生じ
た。 次の表はpBG9、pBG3-2及びpBG3-2NΔのプロテインＡ発
現水準を示す。 プロテインＡ発現水準 BGアミノ酸数 発現水準＊ pBG9 168 46％ pBG3-2 18 50％ pBG3-2ΔＮ 18 73％ ＊ 可溶性細胞蛋白質に対する％としてのプロテインＡ プロテインＡの含有量はロケット免疫電気泳動により、
そして全蛋白質をビウレットによって測定した。 実施例９ −−プラスミドで形質転換した宿主の単離 宿主微生物、例えば大腸菌PR13は、プラスミド、例えば
pBG9抜きで回収できる。これを用いて標準手順によって
これを形質転換された。例えば形質転換された宿主は0.
01％重量／容量SDSを含有しているYT培地中で生育出
来、宿主からプラスミドをエジェクトする。プラスミド
のない宿主細胞はクロラムフェニコール及び／又はアン
ピシリンに対する抵抗性がないことの為にスクリーンす
ることが出来る。 この技術で良く知られているように蛋白質、例えばプロ
テインＡのアミノ酸配列はDNAのヌクレオチド配列によ
って決定できる。遺伝子コードの冗長性、即ち蛋白質を
製造するのに使われるアミノ酸の多くに対し、一個より
多くのコード化ヌクレオチドトリブレット（コドン）が
使用され得るので特定のアミノ酸に対して異なるヌクレ
オチド配列がコード出来る。従って遺伝子コードは以下
のように描かれる。 フェニルアラニン（Phe） TTK ヒスチジン（His） CAK ロイシン（Leu） XTY ルタミン（Gln） CAJ イソロイシン（Ile） ATH アスパラギン（Asn）AAK メチオニン（Met） ATG リジン（Lys） AAJ バリン（Val） GTL アスパラギン酸(Asp)GAK セリン（Ser） QRS グルタミン酸（Glu）GAJ プロリン（Pro） CCL システイン（Cys） TGK スレオニン（Thr） ACL トリプトファン(Try)TGG アラニン（Ala） GCL アルギニン（Arg） WGZ チロシン（Tyr） TAK グリシン（Gly） GGL 末端信号 TAJ 末端信号 TGA キー：各３文字のデオキシヌクレオチドトリプレットは
左側に５′‐末端、及び右側に３′‐末端を有するmRNA
のトリヌクレオチドに対応する。本明細書に与えられる
全てのDNA配列はその配列がmRNA配列に対応する配列の
鎖のものであって、ウラシルの代りにチミンで置き換え
られている。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成し
ているプリン又はピリミジン塩基を表している。 Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミ
ン Ｘ＝ＹがＡ又はＧの時にＴ又はＣ Ｘ＝ＹがＴ又はＣの時にＣ Ｙ＝ＸがＣの時にＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｙ＝ＸがＴの時にＡ又はＧ Ｗ＝ＺがＡ又はＧの時にＣ又はＡ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの時にＣ Ｚ＝ＷがＣの時Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｚ＝ＷがＡの時Ａ又はＧ QR＝ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの時TC Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 上記は融合されたプロテインＡ製品の新規なアミノ酸配
列及び他の有用な蛋白質が蛋白質の同じアミノ酸配列に
対しコードしている均等なヌクレオチド配列によって製
造できることを示す。従って本発明はそのような均等の
ヌクレオチド配列を含むものである。更に、変化が蛋白
質の二次構造を変化させないならば、アミノ酸配列を変
化させることによって、同定された構造及び機能の蛋白
質を構成することが出来ることを示している（カイザー
イー．ティー．及びゲズディー エフ．ジェー．［19
84］Science 223:249-255）。 ここに記載された研究は全てNIHガイドラインに特定さ
れた物理的及び生物学的封じ込め要求にのっとってなさ
れた。
第１図はプラスミドpAc37からの中間プラスミドの構築
を例示する。プラスミドpAc37はプロテインＡ遺伝子及
び全pBR322 DNAからなる。 第２図はプラスミドpBG101-41及びpBG9に対する遺伝子D
NA挿入物についての制限マップを示す。クローニング中
に再生されないBamH Iの位置は（BamH I）として印す。 第３図はプラスミドpBG9からのpBG5の構築を示す。第４
図はpBG5及びプラスミドpBR325からのプラスミドpBG3-2
の構築を示す。 第５図はプラスミドpBG3-2からのプラスミドpBG3-2ΔＮ
の構築を示す。
を例示する。プラスミドpAc37はプロテインＡ遺伝子及
び全pBR322 DNAからなる。 第２図はプラスミドpBG101-41及びpBG9に対する遺伝子D
NA挿入物についての制限マップを示す。クローニング中
に再生されないBamH Iの位置は（BamH I）として印す。 第３図はプラスミドpBG9からのpBG5の構築を示す。第４
図はpBG5及びプラスミドpBR325からのプラスミドpBG3-2
の構築を示す。 第５図はプラスミドpBG3-2からのプラスミドpBG3-2ΔＮ
の構築を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】D1-D2-GCT-D3-D4、D1-CTT-D3-D4、及びD1-
CTT-D3-D5から選択されるヌクレオチド配列、及び これらのそれぞれのヌクレオチド配列をその配列中に含
んでいる、pBG9、pBG5、及びpBG3-2から選択されるプラ
スミドのヌクレオチド配列、及び pBG3-2のSal制限位置をほぼ中央にはさんでいる二つのN
de制限位置の間が削除された配列を有するpBG3-2ΔＮの
ヌクレオチド配列、及び 翻訳された領域がこれらのものと同じアミノ酸配列に対
するコードを有している塩基を含有しているこれらと均
等のヌクレオチド配列、 からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有するDNA
を含んでいる組替えDNAトランスファーベクター 〔式中 D1は D2は D3は D4は D5は GGG CGC GCT AGC TAG CTA GCG CGC CCG である〕。 - 【請求項２】原核微生物中に移され複製された特許請求
の範囲第１項に記載のDNAトランスファーベクター。 - 【請求項３】原核微生物が大腸菌K-12誘導菌である、特
許請求の範囲第２項に記載のDNAトランスファーベクタ
ー。 - 【請求項４】（ａ）プラスミドpBG101-41をエンドヌク
レアーゼBamH Iで切断し、Bal-31エクソヌクレアーゼで
の処理によってブラント末端化し、 （ｂ）pBG101-41を更にpBR322 DNA中の独特の位置にお
いてCla Iで切断し、 （ｃ）プラスミドpAc37からのブラントCla Iプロテイン
Ａ断片を得て、 （ｄ）（ｃ）の構築物を（ｂ）と結合させてプラスミド
pBG9を得ることからなるプラスミドpBG9の製造方法。 - 【請求項５】（ａ）プラスミドpBR325をCla I及びSal I
で消化して5368 bpの断片を単離し、 （ｂ）pBG5をCla I及びSal Iで消化して2000 bp断片を
単離し、 （ｃ）（ａ）及び（ｂ）で得られた断片を連結させ、 （ｄ）（ｃ）の連結させた生成物をCla Iで消化して7.4
Kbの線状分子を単離し、 （ｅ）上記7.4Kbの分子を停止コドンを含有しているリ
ンカーDNA断片と連結させ、プラスミドpBG3-2を得て生
成物とするか、又はこれに続いて更に （ｆ）プラスミドpBG3-2を制限エンドヌクレアーゼNde
で消化し、 （ｇ）上記消化したプラスミドをフェノール−エーテル
で抽出して、エタノールで沈殿させ、そして （ｈ）（ｇ）で得た上記生成物DNAを希DNA濃度において
再連結させてプラスミドpBG3-2ΔＮを得ることからなる
組替えプラスミドpBG3-2、及びpBG3−２ΔＮを製造する
方法。 - 【請求項６】D1-D2-GCT-D3-D4、D1-CTT-D3-D4、及びD1-
CTT-D3-D5から選択されるヌクレオチド配列をそれぞれ
その配列中に含んでいる、pBG9、pBG5、及びpBG3-2、及
びpBG3-2のSal制限位置をほぼ中央にはさんでいる二つ
のNde制限位置の間が削除された配列を有するpBG3-2Δ
Ｎからなる群から選択されるトランスファーベクターに
よって形質転換された微生物、大腸菌PR13（pBG9）、大
腸菌PR13（pBG5）、大腸菌PR13（pBG3-2）、及び大腸菌
PR13（pBG3-2ΔＮ）からなる群から選ばれる微生物〔式
中 D1は D2は D3は D4は D5は GGG CGC GCT AGC TAG CTA GCG CGC CCG である〕。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/686,342 US4691009A (en) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | Hybrid proteins produced by an ultrahigh prokaryotic expression system |
Related Child Applications (1)
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Publications (2)
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|---|---|
| JPS62207297A JPS62207297A (ja) | 1987-09-11 |
| JPH0669376B2 true JPH0669376B2 (ja) | 1994-09-07 |
Family
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Family Applications (1)
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| JP61048770A Expired - Lifetime JPH0669376B2 (ja) | 1984-12-26 | 1986-03-07 | 超高度原核発現系 |
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| JP (1) | JPH0669376B2 (ja) |
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| SG122738A1 (en) * | 1990-06-15 | 2006-06-29 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| WO1992004455A1 (en) * | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genetics Institute, Inc. | Multidomain hematopoiesis stimulators |
| EP0560807A1 (en) * | 1990-11-26 | 1993-09-22 | The Public Health Laboratory Service Board | Immunoglobulin-binding proteins and recombinant dna molecules coding therefor |
| US5525491A (en) * | 1991-02-27 | 1996-06-11 | Creative Biomolecules, Inc. | Serine-rich peptide linkers |
| US20060281681A1 (en) * | 1997-05-28 | 2006-12-14 | Pilon Aprile L | Methods and compositions for the reduction of neutrophil influx and for the treatment of bronchpulmonary dysplasia, respiratory distress syndrome, chronic lung disease, pulmonary fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease |
| US7122344B2 (en) * | 1997-05-28 | 2006-10-17 | Claragen, Inc. | Methods for the production of purified recombinant human uteroglobin for the treatment of inflammatory and fibrotic conditions |
| US20060025348A1 (en) * | 1997-05-28 | 2006-02-02 | Pilon Aprile L | Methods and compositions for the treatment of fibrotic conditions & impaired lung function & to enhance lymphocyte production |
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| US9168285B2 (en) | 2009-10-15 | 2015-10-27 | Therabron Therapeutics, Inc. | Recombinant human CC10 protein for treatment of influenza and ebola |
| PL2488205T3 (pl) | 2009-10-15 | 2018-01-31 | Clarassance Inc | Rekombinowane białko ludzkie cc10 do leczenia grypy |
| CN103694322B (zh) * | 2013-12-09 | 2016-08-17 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌SpA5突变体及其制备方法和应用 |
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| CN113512099B (zh) * | 2021-04-08 | 2022-08-09 | 赣江中药创新中心 | 一种葡萄球菌蛋白a、纯化制备方法及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US4322274A (en) * | 1980-08-28 | 1982-03-30 | Wilson Gregory B | Method of diagnosing cystic fibrosis patients and asymptomatic carrier of the cystic fibrosis gene |
| US5151350A (en) * | 1982-10-27 | 1992-09-29 | Repligen Corporation | Cloned genes encoding recombinant protein a |
| US4617266A (en) * | 1983-04-28 | 1986-10-14 | Genex Corporation | Production of Protein A |
| US4721671A (en) * | 1984-12-26 | 1988-01-26 | Repligen Corporation | Efficient prokaryotic expression system using portions of the E. coli .beta. |
-
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- 1984-12-26 US US06/686,342 patent/US4691009A/en not_active Expired - Fee Related
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1986
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- 1986-02-24 DE DE8686301306T patent/DE3686579T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-07 JP JP61048770A patent/JPH0669376B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-25 US US06/899,699 patent/US4888280A/en not_active Expired - Fee Related
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