JPS62207297A - 超高度原核発現系 - Google Patents

超高度原核発現系

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JPS62207297A
JPS62207297A JP61048770A JP4877086A JPS62207297A JP S62207297 A JPS62207297 A JP S62207297A JP 61048770 A JP61048770 A JP 61048770A JP 4877086 A JP4877086 A JP 4877086A JP S62207297 A JPS62207297 A JP S62207297A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 表現水準ということはクロン化遺伝子製品を利用するう
えで最も重要な考慮すべき点である。評すされた蛋白質
表現の水準は、８ｍ容量当りの蛋白質収率、及び精製の
困難性の程度、という二〇〇重要な結果を有する。クロ
ーン化された遣云子認品の増加する表現に対する殆どの
努力は今日まで効率のよいリポソーム結合位置に関連し
た強いプロモーターの使用に焦点があてられてきた。表
現を増加させるために種々のプロモーターが使用されて
きており、最も一般的に使用されているの：よファージ
ラムダからのＰＬプロモーター及び大腸ｘｍｕｖｓ及び
−プロモーターである。
ラムダＰＬプロモーターはＣｌ８５７温度感受性ラムダ
リブレッサーに間違してうまく使用されてきた。
これは３０℃に於ける大腸菌の成育中にクローン化され
た製品の低い水準の表現を可能にする。実質的な細胞密
度が一旦確立されたらクローン化された遺伝子は４２°
Ｃに於ける成育によってプリプレッション（抑制解除）
される。この方法は宿主細胞に対し致死的な遺伝子製品
の表現において部用されてきた。最大かの研究者等は熱
に不安定なリプレッサー制御のもとでｐｔプロモーター
を使用して表現水準４χ（ワルデマン　ニー、ニス１、
ハエンスレイン　イー、及びミルマンジー、［１９８３
］　　ｊ、　Ｂｉｏ。
Ｃｈｅｍ、　２８５：１１５７１１１５７５）、７Ｘ（
ヨアクムジー、エッチ９、イニングニー、ティー１、マ
ツテス　ダブリュ、ビー、及びグロスマンエル、Ｃｌ９
Ｂ２］　ＰＮＡＳ　７９：１７６６−１７７０．ブロム
　シー１、ゲイセンディー、及びフィールス　ダプリュ
、［１９８２］　Ｇｅｎｅ　１７：４５−５４）及び１
３ｚ（オエヘルニッヘンアール０、クロックジー０、ア
ルツシュミット　エル、及びヒレンダブリュ、Ｃ１９８
４］　ＥＭＢＯＪ、　３：５３９−５４３）を報告して
いる。
最近では大腸面出ＬＩ　Ｖ　５及びｍプロモーターから
の配列からなるキメリックなプロモーターの使用が増加
してきている。このハイブリットプロモーターは怠プロ
モーターとして知られている。
これはＩａｃプロモーターから・１０領域及びｔｒｐの
一３５領域を含んでいろ。このハイブリッドプロモータ
ーは大腸［１ｗｌ’ｌ遺伝子製遺伝上製て抑制され、５
ｍＭのイソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）によつて誘導されろ。この系は最大かの研究
者によって使用されて異なる結果を得ている。
種々の蛋白質の表現は、 ・７ｚ水準（バグダサリアンエム、エム０、アマン　イ
ー１、ルルツ　アール６、ルッカート　ビー、及びボグ
ダサリアンエム、［１９８３コＧｅｎｅ　２６：２７３
−２８２）、ｌＯｔ水遣（バイケルアイ９、ロバーツ　
ティー、エム１、アラボンエム。ティー１、グリーンア
ール０、アマン　イー、及びリビングストンディー、エ
ム。
［１９８３］　ＰＮＡＳ　８０：　９０６−９１０）及
び３ｏｚ水準（アマン　イー１、プロシラスジニー０、
及びブタッシンエム、［１９８３］　Ｇｅｎｅ　２５：
　１６７１７８）に達している。
蛋白質表現水準は宿主＊＋ｔａの遺伝子背景に依存する
。特定の突然変異を含有する宿主細胞の利用はクローン
化蛋白質の水準を増加させることが示された。この点に
間し二つの遺伝子が広く注目を受けている。即ち出及び
山突然変異である。
山突然変異は大ｌｌｉ菌ゲノムのΩパ領域にマツプされ
ており、ＡＴＰ依存蛋白分解酵素に対しコードを有して
いることが示されている（ブクハリ　ニー、アイ０、及
びジップセルディー、　　［１９７３］　Ｊ。
Ｂａｃｔ、　＋１６：　＋４６０−１４７１シーンーベ
ルグ　ビー、及びジップセルディー（：１９７３］　Ｊ
、　８ａｃｔ、１１６：１４６９−１４７１）。このＡ
ＴＰ依存蛋白分解酵素は大腸菌中で見出されている８つ
の蛋白分解酵素のひとつである（チュングシー、エッチ
９、及びボルドベルブエイ。
エル、［１９８１コＰＮＡＳ　７８：　４９３１−４９
３５スリードハラ、スフミーケイ。エッチ、及びボルド
ベルブエイ。
エル、［１９８１］　Ｎａｔｕｒｅ：　２９２：　６５
２−６５４）、これはミスセンス突然変異及びナンセン
ス突然変異から造られた蛋白質の分解に関与する主要な
蛋白分解酵素であることが実証されている（モント　デ
ィー。
ダブリ：ｚ　−、Ｃｌ９８０コＡｎｎ　Ｒｅｖ、Ｇｅｎ
ｅｔ、１４：　２９７−３１９）。
Ｉ突然変異はポリリボヌクレオチドホスホリラーゼ遺伝
子に対してマツプされている。ポリリボヌクレオチドホ
スホリラーゼはリボ核酸のホスポリシスに関与している
ことが示されており、従ってｍＲＮＡ分解に関与するこ
とが意味される。その後の研究は出突然変異株中にクロ
ーン化されたときにクローン化されたカビの分解産物デ
ヒドロゲナーゼの特異活性に於て２０〜１００倍の増加
を示した（ハウタラジエー、エイ１、バセット　シー、
エル０、ギレス　エヌ、エッチ、及びクッシュナー　ニ
ス、アール、［１９７９］　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｕｒ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国７６：　５７７４−５７７
８）。これらの研究は又これらの突然変異株に於けるプ
ラスミドコピー数の４〜７倍の増加をも実証した。従っ
て酵素特異活性におけろ増加は増加したｍＲＮＡ合成、
増加したｍＲＮＡ寿命及びこれらの現象の組合わせによ
るものであり得る。
Ｉｉｇ（ブライマーのリプレッサー＝　ｒｅｐｒｅｓｓ
ｏｒ　ｏｆｐｒｉｎｔｅｒ）遺伝子はプラスミドコピー
数を制御することが知られてからかなりになる。　１９
８０年に大腸菌ｃｏｌＥ１誘導プラスミドの非必須領域
の欠失がプラスミドコピー数を増加させることが実証さ
れた。
この領域の欠失はクロモソームＤＮＡの４ｅＡから２０
χヘブラスミドＤＮＡを増加させた。この欠失は野性形
のプラスミドで宿主を共感染させると突然変異体プラス
ミドのコピー数を減少させたのでトランスレセラシブ（
ｔｒａｎｓ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）であった（ツイグエ
ー、ジエー、及びセラット　ディー、［１９８０コＮａ
ｔｕｒｅ２８３：　２１６−２１８）。
最近の先行技術は大ＩＩＩ菌表現系について報告してお
り、ここで大腸菌宿主に対して外来の蛋白質が製造され
、全細胞蛋白質の約２５〜３０の表現水準が開示されて
いる。シモンズ等は人のインターフェロンγが全細胞蛋
白質の２５％迄の水準で表現されたことを報告している
。これらの研究者たちはファージラムダのＰＬのプロモ
ーターを使用し、続いてファージＭＳ２レプリカーゼ又
は大腸菌トリプトファン減衰域の何れかに由来する翻訳
開始領域を使用したくシモンズジー０、レマウト　イー
３、アレット　ビー０、デボスアール、及びファイヤー
スダブリ：Ｌ　−、［１９８４］　Ｇｅｎｅ　２８：　
５５−６４）。′アマン等はｍプロモーター系を使用し
て全細胞蛋白の３０′ｇとしてラムダリプレッサーを表
現した（アマン　イー９、プロシラス　ジエー、及びブ
タツシンエム、［１９８３コＧｅｎｅ　２５：　１６７
−１７８）　、上に述べた様にこのプロモーターはｌｘ
　ｕ　ｖ　！５プロモーターの一１０領域及びｍプロモ
ーターの一３５領域を含有している（デボアー　エッチ
、ニー０、コムストック　エル。
ジエイ０、ヤンスラディー、ジー、及びハイネツカー　
エッチ、エル、プロモーターズストラクチャーアンドフ
ァンクション（Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ）、ブラーガー、ニューヨ
ーク　［１９８２］４６２−４８１（アール、エル、ロ
ドリクエツ及びエム。
ジェー、チャンベルリン編））。
本発明は新規な生物学的系で製造される新規なハイブリ
ッド蛋白質に間するものである。新規な生物系はβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子ＤＮＡ（ＢＧ）及び所望の蛋白遺
伝子ＤＮＡからなる新規なハイブリッドプラスミドで形
質転換した原核宿主からなる。
本明細書で特定的に例示したのはプラスミドｐＢＧ９、
プラスミドｐ８Ｇ５、プラスミドｐ８Ｇ３−２及びプラ
スミドｐＢＧ３４ΔＮと命名される新規なハイブリッド
プラスミドの構築である。これらのプラスミドはβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子ＤＮＡ及び蛋白質Ａ　ＤＮＡから
なる。適当な原核宿主を形質転換するのに使用されろ時
蛋白１（Ａ様の化合物の製造が実現されろ。
即ち本来の蛋白Ａとは分子のＦｃ領域におけるＩｇＧを
結合する鍵となる生物学的機能において元来の蛋白質Ａ
とは区別できない化合物である。有利なことにはこれら
のハイブリッド蛋白質を形質転換した宿主によって表現
することは知られた任意の原核表現系で実現されろより
もかなり高い。例えば本明細書で例示される融合（ハイ
ブリッド）蛋白質は、全大腸薗宿主細泡中の−又は江突
然変異の何れかを含有している宿主細胞中で大腸菌の全
細胞蛋白質の４５χよりも高い水準で製造される。
又有利なことには表現されたハイブリッド蛋白質の１０
０１が宿主細胞を破裂させることによって可溶な細胞質
ゾルフラクション中に見出されることである。この結果
は大腸菌の外来蛋白質の比較的高い表現（約７２）が不
溶、不活性の蛋白質を製造したことを見出した多くの当
業者によって経験されていることとは逆である。
プラスミドｐＢＧ３−２ΔＮは超高度な原核表現系の究
極を例示する。このプラスミドで形質転換された宿主は
所望の融合蛋白質の６０％より多くを表現する。この超
高水準表現はプラスミドｐＢＧ３−２中に於けるΔＮｄ
ｅ欠失を構築することによって工遺伝子を部分的又は全
体的に欠失させるか、又はそれ以外の方法で不活性化さ
せることによって達成されろ、この手順は大腸菌ｃａｌ
ε１プラスミドに由来する全てのプラスミドが上領域を
含有しているのでこれらの任意のものに本発明に於て使
用できる。そのようなプラスミドの例はｐＢＲ３２２、
ｐＢＲ３２５及びｐＨｃ７９である。
プラスミドｐ８Ｇ３−２ΔＮはＢＧに由来する配列の１
８のアミノ酸を含有しており、蛋白質入活性を示す、即
ち分子のＦｃ領域に於けるＩｇＧ結合活性を有する、Ｂ
Ｇ−蛋白質入融合蛋白を製造するのに使用できる。
本発明の新規なハイブリッドプラスミドで形質転換した
大腸菌宿主がＢＧが本来の大腸菌宿主によって僅かな量
しか表現されないという事実に鑑みて、垣高量でＢＧ−
蛋白質入融合製品を表現するということは驚くべきこと
である。この低い本来の大ＷａｇによるＢＧ表現水準は
当業者が原核表原形においてＢＧプロモーター［ＩＮＡ
を使用することをやめてしまうことに導いたと信じられ
る。ＢＧプロモーターを使用するのでなくて、原核表現
系において出及び−プロモーターが広範；こ使用されて
きたのである。
本発明の表現系は蛋白質Ａ遺伝子又はその断片に対する
融合によって例示されているが、有利には他の有用な蛋
白質例えばインターフェロン、インターロイキン類、イ
ンシュリン、成長ホルモン及び産業酵素、例えばアミラ
ーゼ、蛋白分ｇ酵素、及び糖イソメラーゼ、等に対しコ
ードを有している他の遺伝子に融合された時にも、ここ
に開示された手順に従い、そしてこの技術で知られてい
る付随する手順に従って有利に使用できる。
第１図はプラスミドｐＡｃ３７からの中間プラスミドの
構築を例示する。プラスミドｐＡｃ３７は蛋白質入遺伝
子及び全ｐ８Ｒ３２２ＯＮ、Ａからなる。
第２図はプラスミドｐ８Ｇ１０１−４１及びｐ　Ｂ　Ｇ
　９に対する遺伝子ＤＮＡ挿入物についての制限マツプ
を示す。
クローニング中に再生されないＢａｍＨＩの位置は（Ｂ
ａｍＨＩ　）として印す。
第３図はプラスミドｐＢＧ９からのｐＢＧ５の構築を示
す。
第４図はｐＢＧ５及びプラスミドｐＢＩ’１３２５から
のプラスミドｐＢＧ３−２の構築を示す。
第５図は、プラスミドｐＢＧ３−２からの、プラスミド
ｐ８Ｇ３−２ΔＮの構築を示す。
式Ａはスタフィロコッ力スオウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）蛋白質入のアミノ酸
配列に対しコードをするヌクレオヂド配列を示す。
式ＢはハイブリッドプラスミドｐＢＧ９のＤＮＡ配列と
表現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。
式Ｃはハイブリッドプラスミドｐ８Ｇ５のＤＮＡ配列及
び表現された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。
弐〇はハイブリッドｐＢＧ３−２のＤＮＡ配列と、表現
された融合蛋白のアミノ酸配列を示す。
新規なプラスミド蛋白質及び本発明の表現系の構成及び
同定を詳細に記す前に使用された物質及び方法を此に開
示する。
（１）プラスミドＤＮＡ調製 プラスミドｔｌＮＡの大規模製造に対して使用する手順
は来貢的に以下の通りである。　２５０ｍ１の培養基を
対数期へ成長さ・せ、クロラムフェニコールで光学密度
０．６〜０．７（又は別の方法としてクロラムフェニコ
ール添加なして）で増殖し、−夜成育させた。細胞を６
にで２０分間開Ａ１４０−ターてベレット化し、６１グ
ルコースｉ衡を夜（５０ｍＭグルコース、２５１トリス
、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ）中で再懸濁した。細胞を室温で
１ｆｆｉ＋の２０ｍｇ／ｍ　Ｉの新たに造ったりゾチー
ムの存在下でて１０分間培養し１３．８１１１の０．２
Ｎ　ＮａＯＨ中１ｘｓｏｓを添加しながら、５分間氷上
に置き、氷上で更に１５分間７１０５ＭＫＡＣ（１））
１５．０−５．５）と共に保った。デブリをｌＯにで１
０分間ベレット化し、等容量のフェノ−クロロホルム−
イソアミルアルコール（２５：２４：１、ＴＥ飽和、０
．１＄　８−ヒドロキシキノリン）で１度上澄みを抽出
した。０．６容量イソプロとルアルコールで沈殿させろ
ことに続いて、ＤＮＡをＣｓＣＩ勾配物上で精製した。
（２）制限酵素消化及び所望断片の単離消化を供給者の
指示に従って実施した。断片の分離はアガロースゲル電
気泳動で達成した（下に記載）、電気泳動したＤＮＡを
、供給者の指示に従フてエル−チップ（Ｅｌｕ−ｔｉｐ
）カラム（シュライヒャー及びシュネル、キイーネ、Ｎ
Ｈ）上を通過させ。
続いて２．５容量のＥ　ｔ　Ｉ）　Ｈ中でキャリヤーの
ｔＲＮＡを添加して沈殿させろことによってＩｌｌ製し
濃縮した。
（３）ミニ溶薗物プラスミド分析 形質転換した細＠をｌＯμ３／ｍｌチトラサイクリン又
は５０μｇ／ｍ　Ｉのアンピシリンの何れかを補充した
１１のＬ−プロス中に接種し、３〜５時間、３７℃で成
育させた。細胞を１０．０００にｇで１５分間遠心する
ことによって集め、次に５０μｍの５ＴＥＴ緩衝液（８
′ｇ庶糖、５％）ライドンｘ−１００，５０ｍ１（ＤＥ
ＤＴＡ、５０ｍＭ（７）　　）　’）　スＨＣＩ　、ｐ
）１８．０）中に再懸濁させた。５０μｍのリゾチーム 溶液（２ｍｇ／ｍｌの５ＴＥＴ緩衝液中）を加え、試験
管を４分間室温で培養し、次に１００℃で３分間加熱し
た。
試験管を次に氷上でＯ′Ｃて冷却させた。０℃で５分後
不溶の物質を１０．０００ｘｇの遠心で１５分間で除い
た。
等容量の水冷イソプロピルアルコールを上ｉ登み液に加
え、試験管を７０℃で５分間おいた。ＤＮＡ沈殿を１０
．０００　ｘ　ｇで１０分間の遠心によって集め、１０
〜２５μｍのＴＥ緩衝液　（１０ｍＭ）リス−Ｃ１，０
，１ｍＭεＤＴＡ　ｐＨ８，０）中に再懸濁した。ＯＮ
、Ｌの制限消化物を上に記載したように６．７Ｍｇ／ｍ
ｌの　ＲＮａｓｅ　Ａ　（リネ”ヌクレ７−セ−Ａ）を
含有する１５μｍ最終容量中の５μｍのプラスミド溶ｉ
ｒｉを使用して上記のように実施した。
（４）　ＯＮへ連結 付着性末端連結及びプラント末端連結の両方にＴ４リガ
ーゼを用い、これは各場合に過剰で存在した（２００ｕ
／μ８のＤ　）ｌ　Ａ　）。付着性末端については培養
時間は１６℃で２〜４時間、そしてプラント末端に対し
ては時間を１６時間に増加させた。標準のベクター／挿
入物連結に対し挿入物は５倍のモル過剰で存在し、２０
Ｍ１０反応容量中で０．０２　ｐモルのベクター及び０
．１１）モルの挿入物であった。単一分子レサーキユラ
リゼーション反応による欠失突然変異の発生については
プラスミドを１Ｍｇ／ｍｌに希釈し、続いて制限エンド
ヌクレアーゼ消化及び連結を行った。リンカ−のプラン
ト末端連結はリンカ−の１００倍モル過剰で行い、２０
μｍ反応当り０．０２ｐモルでのベクターの濃度であっ
た。
（５）形質転換 新たな一夜培養基をし＝ブロス中で希釈し、３７℃で攪
拌しながらＡＢＯ３０，３が得られるまで成育させた。
細胞を氷の上で冷却し、次に遠心分離により集めた（１
０分４１００　ｘｇ）。細胞を氷冷５０ｍＭ　ＣａＣｌ
２の最初の容量の１／２中に再懸濁し、氷上で２０分間
培養した。細胞を再度上記のように遠心分離で集め、氷
冷５０ｍＭ　ＣａＣｌ２（Ｉ！Ｌ初の容量の１／２５）
中に再懸濁した。０．１１の細胞懸濁液を１〜１０ｔｔ
　Ｉ（５０−１００ｎｇ）のＤＮＡプラスミド溶液と混
合し、Ｏ′Ｃで３０分間静置させた。細胞を次に３７℃
で２分間加熱し、１．５％の寒天及び１０μｇ／ｍｌの
テトラサイクリン又は５０Ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コールの何れかを含有しているし一プロスプレート上で
平板培養しこのときｐＢＲ３２５誘導物が形質転換され
た。プレートを一夜３７℃で培養した。１　ｘ　１０’
コロニ一／μｇプラスミドＤＮＡの形質転換効率が常に
観測された。
（６）アガロース電気泳動 ＤＮＡ断片を２Ｘ　）リスボレートｉ衝液（１７８ｍＭ
　）リス、１７８ｍＭホウ酸、５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ
　ｐＨ８，４）中の０．８％アガロース中でのゲル電気
泳動によって単離した。
分析及び分離用ゲルを水平ゲル筒中で電気泳動緩衝ｔｆ
ｆ（Ｈ）リスボレート）中に浸漬して、６０ボルトζこ
おいて走らせた。ＤＮＡバンドがゲル中に５．０Ｍｇ／
ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含ませる二
とによつて、紫外線下で見ることが出来るようにされた
。所望のＤＮＡバンドを含有している切片をゲルから切
り取り、透析管（１／２の径）中の０．５〜１．０ｍｌ
の緩衝液を含有しているＩＸトリスボレート緩衝液中の
電気泳動によってＤＮＡを回収した。電気泳動を３０分
間１０ボルト又は染色された物質が透析管の側面に対し
て位置するまで実施した。ゲルの切片を透析バッグから
除去し、バッグを何回もトリスボレート緩衝液でフラッ
シュすることによつてＤＮＡを回収した。　ＮａＣｌを
最終濃度１モル迄ＤＮＡ溶液に加え、エチジウムブロマ
イド及びアガロースゲル不純物をトリスボレート緩衝液
を飽和させたフェノールで二度抽出することによって除
いた。
フェノールをエーテルで２回抽出することによって除き
、精製したＤＮＡを１７５０容量の５Ｍ　ＮａＣｌ及び
及び２．５容量の冷たいエタノールで沈殿させることに
よつて回収した。沈殿反応は一７０℃で１５〜２０分間
実施した。沈殿したＤＮＡｆｔ１０，０００　Ｘ　ｇｌ
’　１５分間遠心分離させることによって回収した。回
収した断片の収率は純粋なりＮＡ標準とのエチジウムブ
ロマイド蛍光の直接比較によって検定、した。典型的に
は５０％の回収が得られ、断片の寸法が増加するに従い
収率は減少した。
（７）蛋白質入ラジオアッセイ 蛋白質入活性を５０μｍの１：１００００希釈正常児血
清（ＮＲ５）を有するダイナチック　イミュノロン（Ｄ
ｙｎａ・ｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ）［ダイナテツ
クダイアグノステイックスインコーボレーテツド、サウ
スウインドハムＭＥＩ　１ミクロ力価ウェルを被覆して
、室温で４時間培養することによって決定した。ＮＲ５
をウェルから振動させ、これを次に１時間４℃で培養す
ることによって燐１１１ｔ街塩水中のＨオバルブミン（
ＯＶ　、Ａ／ＰＢＳ）でブロックした。ウェルを空にし
、次に２５μｍの１．０及び１０００ｎ３蛋白質Ａの間
の量を含有している２５７．ｃｌ試料を各ウェルに加え
た。市販蛋白質Ａを用いた標準曲線を各検定中で走らせ
た。全ての希釈はＯＶＡ／ＰＢＳ中のも（Ｄ　Ｔ：　ａ
　ｖ　タ、　２５μＩ（７）　＋２５１−蛋白質Ａ　（
６０００ｃｐａ＋）のＯＶＡ／ＰＢＳ中ｔ７）　モ（Ｄ
　＠　各’７　エルに加え、プレートを１６時間３７℃
で小さな水のビーカーを含有している密封プラスチック
容器中で培養した。培養に続いてウェルを吸引し、ＰＢ
Ｓ　３Ｘ及び水で１度洗浄した。ウェルを乾燥し、２１
のアクアツル（Ａｑｕａｓｏｌ）　ｃニュウイングラン
ドニュークレアーコーポレーション、マサチュウセッツ
州ボストン］中でベックマンモデルし５７０００ベータ
カウンター中で２分間計数した（ベツクマンインストラ
メンツインコーボレーテッド、カリフォルニア州フラー
トン）。
（８）蛋白質入ロケット免疫電気泳動（ｒｏｃｋｅｔ　
ｉｍ＋ｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉ）蛋
白質入の濃度及び活性を３１ｇｇ／ｍ　ｌの人１ｇＧを
トリス−グリシンｐＨ８，６緩衝液（３，７５ｇ／Ｌ）
リス塩基、７．５ｇだグリシン）中に含有している１ｚ
アガロースゲル中のロケット免疫電気泳動によって測定
した。０．２５及び１．０ｇｇの間の蛋白質入標準を各
ゲル上で走らせた。電気泳動を３時間４００ボルトで電
気泳動ｌｉＩ衝液としてトリス−グリシンを用いながら
行った。電気泳動に続いてゲルを乾燥させ、続いてコマ
ッシーブルーで短時間染色させ、そして５ｚメタノール
、ＩＯＸｍ￥酸で脱染した。
（９）細胞均質化 形質転換した細胞を１２．ＯＯＯｘｇで５分間４℃で遠
心ｔ　４　コトニヨッ１”集め、０．５容ｆｆｉ　ｃ７
）　ＨＥＰＥＳ［：４−（２−１＝　’ドロキシエチル
）−１−とペラジン−エタンスルホン酸コーにＣ１−Ｄ
ＴＴ（ジチオスレイトール）緩衝液（６ｇＨＥＰＥＳ　
ｐｉ　ａ、ｏ、７．５３　ＫＣＩ、０．１５ｇ　ＤＴＴ
／Ｉ）中に再懸濁させた。細胞を懸濁液をリゾチームで
最終濃度３００μｇ／ｍ　Ｉにおいて３０分３７℃で消
化させた。懸濁液を５分間で２回氷上で３００ワツトの
パルスで高周波による分解（ｓｏｎｉｃａｔｅ）にかけ
た。可溶蛋白を２５　、　ＯＯＯｘｇで３０分４℃で遠
心することによって単離した。上澄み液を除去し、沈殿
を等容量のＨＥＰＥＳ／にＣ１１０ＴＴ緩衡液中に懸濁
した。全４ａ胞蛋白質がＳＯＳゲル上で走らせる実験に
ついては１００℃で５分間、５容量のＳＯ５〜Ｏ５化緩
衝液（５０％容量ｌ容量グリセロール、５ｚ容量／容量
２−メルカプトエタノール、５１重量ｌ容量ドデシル硫
酸ナトリウム及び０．００５ｇ／ｍｌビロニンＹ）中で
加熱することによって細胞を可溶化した。
（１０）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び、ウェス
タンアナリシス 全てのＳＯＳゲルはラエムリの方法によって走らせた（
ラエムリＵ、に、［１９７０コネイチヤー［ロンドンコ
２２７：６８０−６８５）、これらのゲルは１２％の全
アクリルアミド濃度を含有していた。スラブゲルは１．
５ｍｍの巾でホエフ７−サイエンティックインストラメ
ンッ（カリフォルニア州すンフランシスコ）から得た電
気泳動装置中で走゛らせた。チューブのゲルをスタッキ
ングゲルなして６ｎｕｗ内径Ｘ　ｔｏｃｎ＋ガラス管中
で走らせた。ウェスタンボルフはニトロセルロースフィ
ルター上で実施した。蛋白質を２００ｍＡで１２時間フ
ィルターに移した。フィルターを４時間０．１ｚ牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）で燐酸緩衝食塩（ＰＢＳ）中で室
温においてブロックし、　１０　ｕＣｉの［：１１２５
１−１ｇＧ（ＮＥＮ）又は１００μｍのパーオキシダー
ゼとコンジュゲートさせた兎＋ｇｃの何れかで室温で一
夜攪拌させながらハイブリッド化させた。このボルフを
次に４回ＰＢＳで洗い、コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィル
ムに露出するか又は２５μＩ　Ｈ２Ｏ２を有する１００
ａｌ　ＰＢＳ中２５１１１８のジアミノベンジジンで展
開した。
（１１）クローン化細胞中の蛋白質入含有量の測定呂酢
に続いて細胞を０．５ｚのトライトンＸ−１００を有す
る２０ｍＭのトリスＨＣＩ　ｐＨ８，３中でガラスピー
ズで渦巻きさせるか又はダイアノミル（ＤｙａｍｏＭ目
１）モデルにＤＬ−パイロットビードミル中で均質化さ
せたにュージャージー州メイウッドのインバンデックス
から得られる）。これは最高速度で運転し、０．２ｍｍ
径のグラスビーズを仕込んである。均質化物を１６．ｏ
ｏｏｘｇで３０分間遠心することによって透明にし、上
澄み蛋白濃度はローレー（Ｌｏｗｅｒｙ）蛋白質検定又
はビウレットによって測定した。蛋白質入濃度を人の　
ＩｇＧに対するロケット免疫電気泳動（ｒｏｃｋｅｔ　
ｉＩＩｌｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｓ
）で測定した・（１２）蛋白質のＨＰＬＣ精製 蛋白質入及びプロテアーゼＫをウォータース（νａｔｅ
ｒｓ）μボンダバック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　Ｃ１８カ
ラム（ウォータースアツソシエイツ、マサチューセッツ
ミルフォード）を備えたベックマンモデル３６０勾配機
械（ベックマンインストラメンツインコーボレーテッド
）を用いてＨＰＬＣによって精製又は検定した。蛋白Ｈ
Ａを１０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７，２（緩衝液Ａ）及
び６０′＆容量／容量イソプロパツ一ル１０ｍＭホスフ
ェート（緩衝液Ｂ）の間で、線形勾配によって精製した
。カラムを１ｍＭ／分の流速において０及び１００％ｍ
衝液Ｂの間で８０分にわたって線形勾配で溶出させた。
プロテアーゼＫを精製し、蛋白質Ａを同様の方法で検定
したが、但し、緩衝ｔｌ！　Ａは０．１χトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）及び緩衝液Ｂは０．０８％のアセトニト
リル中のＴ　Ｆ　、４であった。カラムを流速２１ノ分
て０及び６ｏｚ緩衝液Ｂの間の６０分に亘る線形勾配に
よって溶出させた。
（１３）醗酵 醗酵はｄｏ２及びｐＨ制御を備えた２１ケマベツクフア
ーメンターにューヨーク州つッドバリーケマペックイン
コーボレーテッド）中で実施した。組替えセルを５０％
のｄｏ２　（空気＝１００Ｅ）に於て、示されたｐＨに
於て成育させた。ｐＨを５Ｍ　Ｎ）１４０８又は５ＭＨ
２ＳＯ４のを必要ならば添加して調製した。泡を消泡剤
Ｂ　（ａｎｔｉｆｏａｍ　Ｂ）（イー、アイ、デュポン
デネモアースアンドカンパニーインコーボレーテッド、
プラウエア州つィルミントン）の添加によって抑制した
。醗酵温度は３７℃で全ての醗酵は最終容量９．５１で
実施した。
（１４）細面菌株及び培地 全ての使用した細菌株の起源及び遺伝子型は以下に挙げ
られている。全ての菌株はＹＴ培地を用いて保持及び成
育された（８ｇ／Ｉ）リブトン、５ｇ／　Ｉ　ｎ母抽出
物、及び５ｇ／ｌ塩化ナトリウム）。
（１５）化学物 ニトロセルロースはシュライヒャー及びシュネル（キー
ネ、ＮＨ）から得た。成育培地はディフコ（ミシガン州
デトロイト）から得た。アクリルアミ・ドはアキュレー
トケミカルアンドサイエンティフィックコーポレーショ
ンにューヨーク州ウェストバリー）から得た。蛋白質入
標準はフ７−マシアにュージャージー州フイスカタウエ
イ）から得た。全ての他の化学物質はシグマケミカルカ
ンパニー（ミズリー州セントルイス）から得た。
（１６）培養基　　（Ａ）、＊薗　　此に開示されてい
る全ての大腸菌株は大腸菌Ｋ−１２誘導菌である。
、ニー　　　　・　−井・　　　　！ＩＬＥ旦大＠Ｍ　
　Ｆ−、、Ｇａ１−、Ｔｈ１−、！ＪＩＡ　ＮＲＲＬ　
Ｂ−１５１２９，１９８２Ｍ５３７１　　山Ｂ、　ｂ、
ｎｌ’＋４　　　　年８月１８日寄託、ＮＲＲＬ寄託所
に請求 し現在一般に入手可 ＳＧ２０２５１　Ｆ−、山０１３９．工、　　ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５９１８，１９８４山−１００，７ｎｌＯ：　
　　年１２月１２日寄託二山Ｅ、出Ａ、血 ＰＲ１３Ｆ−、瓜−１３、ｆｕｌｌ　−１９、標準手順
によって血−１，山８６．　　　以下に挙げられる正−
１，出Ｙｌ、　　　寄託培養基から得Ｌｔｉ−７１ＬＬ
Ｉ　−２＋　　　　ろことが出来ろ。
ｕｉｌＡＩ、出Ａ１３２ （＝！ＪｕＬ１２３） （Ｂ）プラスミドを含有する微生物宿主大ｉ１ＷＭｓ３
７１（ｐＡｃ３７）　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１２７１９
８２年８月１８日寄託、ＮＲＲＬ寄託所に 請求することによって 一般に現在入手可能 ＭＳ３７１（ｐＢＧｌｏｌ−４１）　　　　ＮＲＲＬ　
　８−１５９０５１９８４年１１月１日寄託 ＰＲ１３（ｐＢＧ９）　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１
５９０７１９８４年１１月２０日寄託 ＰＲ１３（ｐＢＧ５）　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１
５９０８１９８４年１１月２０日寄託 ＰＲ１３（ＰＢＧ３−２）　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−
１５９０９１９８４年１１月２０日寄託 ＰＲ１３（ρＢＧ３−２ΔＮ）　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−
１！ｌ’ｌｌ。
１９８４年１１月２０日寄託 （ｃ）プラスミド プラスミド９８Ｒ３２２は良く知られていて人手可能な
プラスミドであり大ＩＩＭ宿主ＡＴＣ（３７０１７中で
深持されている。精製されたｐＢＲ３２２ＤＮＡはポリ
バーエフ８、ロドロクエツアール、エル９、グリーネビ
ー、ジエー１、ヘスラッチエム。シー０、ハイネッカー
エッチ、エル０、ボイヤーエッチ、ダブり二一１、クロ
サジエイ、エッチ３、及びファルコウエス、（１９７７
）、Ｇｅｎｅ　２：　９５−１１３及びサトクリフジエ
イ、ジー、（１９７８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　５：２７２１−２７２８中に記載されるよ
うに得ろことが出来る。
プラスミドｐＢＲ３２５も良く知られているプラスミド
である。これは２０８７７ミツドランド州ガイサーバー
グビーオーボツクス６００９ピーアールエルインコーボ
レーテツドから得ることが出来る。
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９０７、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９
０８、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９０９、ＮＲＲＬ　８−１
５９１０及びＮＲＲＬ　８−１５９１８はこれらの寄託
番号を開示している特許の付与によつて一般に人手可能
である。これらの寄託菌が人手できるからといって行政
行為によって本発明に付与された特許権を損なフてまで
本発明を実施する権利を構成するものではないことを理
解すべきである。培′！＃、寄託物はアメリカ合衆国イ
リノイ州ペオリア米国農務省ノーザンリージョナルリサ
ーチラボラトリー（ＮＲＲＬ）の永久寄託中に寄託され
ている。
大腸菌ＰＲ１３の代りに使用できろ良く知られた他の大
腸菌宿主、例えば大腸菌　ＭＳ３７１．　　）１８１０
１及び大腸菌ＧＭＳ４０７（ノベルエム、及びノベルジ
ー。
［１９７３１Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｔ、　１２０
：　３１９）がある。
更に使用できる他の原核宿主は、サルモネラ（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌ　ｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏａ＋
ｏｎａｓ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、　　スト
レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属からの
微生物である。
（１７）形質転換宿主からの組替えプラスミドＤＮＡ。
単離 組替えプラスミドＤＮＡはその原核宿主から良く知られ
た手順、例えば透明にした溶菌物−密度勾・配平衡手順
などを用いて単離することが出来る。
（１８）ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡｌ１！列決定はマックサム及びギルバート（マ、
クサム　ニー１、ギルバート　ダブリ−１、［１９７７
］　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国７４：５６０）
及びハイデツカ−等（ハイデツカ−ジー１、メッシング
ジエー。
及びグロネンボルン　ビー−１１，１９８０１Ｇｅｎｅ
　１０：　６Ｇ）に記載されろように実施される。
ハ　　　　　Ｉ　　、−”青　；　　　　　　　り本明
細書の代表として例示されるハイブリッド蛋白質遺伝子
の構築はプラスミドｐ８Ｇ１０１−４１の使用で開始さ
れた。このプラスミドはプラスミドｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩに挿入されているおよそ６ｋｂの大＊ｉｉｒβ−
グルクロニダーゼ遺伝子ＤＮＡを含有する。
プラスミドｐＢＧ１０１−４１はＢａｍＨＩ制限エンド
ヌクレアーゼで切断され、ＬＬＬ　−３１エクソヌクレ
アーゼでの短い処理によってプラント末端化される。こ
のエクソヌクレアーゼ処理は１２の塩基を除去し、プラ
ント末端を残す。
切断されプラント末端にされたｐＢＧｌｏｌ−４１への
挿入のためのＤＮＡは、ρＢＲ３２２中のスタフィロコ
ツ力スオウレウス（＋　　観」ム）蛋白質Ａ遺伝子を含
有しているプラスミドｐＡｃ３７から得られた０図面の
第１図を参照。
切断しプラント末端にしたプラスミドｐＢＧ１０１−４
１をプラント末端のＣ１ａ　Ｉ蛋白質入断片に連結させ
、モしてハイブリッドプラスミドｐＢＧ９を与える。
プラスミドｐＢ０９は蛋白質Ａ遺伝子に融合されたβ−
グルクロニダーゼ蛋白質のＮ−末＃　１６７アミノ酸に
対してコードを有している５０１のヌクレオチドを含有
している。図面の第２図を参照。
ハイブリッドプラスミドｐｅａｓはハイブリッドプラス
ミドｐＢＧ１０１−４１及びハイブリッドプラスミドｐ
ＢＧ９から構築した。図面第３図を参照。プラスミドｐ
ＢＧ１０１−４１は９ａｍＨＩで切断し、次にＢａｌ−
３１エクソヌクレアーゼ（ＩＢＩ−ｆａｓｔ−Ｂａｌ３
１）で消化した。
生じろＤＮＡをＣ１ａ　Ｉで消化し、上記のようにして
調製した挿入ＨＡを連結させた。
完成した蛋白ｆ（Ａに対するコード配列を含有している
上記の連結の為の挿入ＤＮＡをハイブリッドプラスミド
’ｐ　８　Ｇ　９からこのプラスミドを制限酵素Ｃｌａ
Ｉ及びＦｎｕ４Ｈ１で切断することにより調製した。
挿入及びベクターＤＮＡを連結させ大Ｉｌ！菌株ＰＲ１
３中に形質転換し、プラスミドＤＮＡを形質転換物から
製造した。ｐＢＧ５としてラベルされる一つのクローン
は予想された制限プロフィールを含有していた。標準の
Ｍ１３方法によるこのクローンの配列分析はＢＧコード
配列の１８のアミノ酸が残っていることを明らかにした
。
ハイブリッドプラスミドｐＢＧ３−２はプラスミドｐＢ
Ｇ５及びプラスミドρＢＲ３２５から構築した０図面の
第４図を参照。プラスミドｐＢＧ３−２はプラスミドｐ
８Ｇ５と同じＤＮＡを含有するが、但しｐｅａｓはｐ［
ｌＲ３２２ＤＮＡを含有し、ｐ８Ｇ３−２はｐＢＲ３２
５ＤＮＡを含有する点が違うだけである。またｐＢＧ３
−２は蛋白質Ａ遺伝子ＤＮＡの末端におけるＣ１ａ　Ｉ
位置においてストップコドンリンカ−を含有している。
ＤＮＡの構築されたリンカ−セグメントは全ての三つの
読み枠（リーディングフレーム）に於てストップコドン
を含有していた。最終的なハイブリッド蛋白質製品がど
んなｐＢＲ３２５に由来するアミノ酸も含有しないこと
を確実にするために、これをρＢＧ３−２構築′におけ
るＣ１ａ　１位置へ挿入した。
プラスミドル８Ｇ３−２中の融合遺伝子によってコード
されるハイブリッド蛋白質の増加された表現がΔＮｄｅ
欠失を構築することによつて、即ちｐＢＲ３２５のＮｄ
ｅ位置とＢＧ配列のＮｄｅ位置の間のＤＮＡを除去する
ことによって得られた。この欠失はｐＢＲ３２５中の工
遺伝子の大部分を除去し、並びにＢＧプロモーター領域
の最初の２３０塩基を除去する。この構築はプラスミド
ｐＢＧ３−２ΔＮとして同定される。大腸菌宿主が９８
Ｇ３−２ΔＮで形質転換されるとき、宿主は全細胞蛋白
質の６０ｘを越える水準で蛋白質入を表現する。これと
対照して蛋白質入はプラスミドｐＢＧ３・２を含有する
宿主細胞中で全細胞蛋白質の５０χで大腸菌中で表現さ
れる。
蛋白質入は種々の診断及び基本的な研究試験系に於てイ
ミュノアブソーベント（免疫吸収材）として広く使用さ
れている。米国特許４，３２２．２７４を参照。蛋白質
Ａの応用における最近の興味はその抗癌処理に於ける可
能性のある臨床使用に中心がおかれてきた。感作された
末梢の血液のリンパ球は、通常は腫よう細胞の細胞毒性
の原因となっているが特定の抗原、抗体、抗グロブリン
及び免疫複合体からなると推定される血清封鎖因子によ
ってその機能が阻害されろと仮説がたてられている。
バーナーズビー、シー、（１９８１）　Ｃａｎｃｅｒ　
Ｂｕｌｌ、　３３：２７８参照。これらのブロツキグ因
子は蛋白質入を含有するスタフィロコツ力スオウレウス
のコーワン（ｃｏｖａｎ）　Ｉ細胞に吸収されることに
よって腫ようを有する血清から除去され得、従ってイン
ビトロ試験系において細胞によって媒介される腫よう細
胞毒性が進行できろようにする。スティールジー９、ア
ンケルスト　ジエー、及びスジョグルンエッチ、［：１
９７４］　Ｉｎｔ、　Ｊ、、Ｃａｎｃｅｒ　１４：８３
参照。蛋白質入は又＋３ｃ結合活性と独立したポリクロ
ナール抗体合成も活性化させる。スジョダールジエー。
及びモラージー、［：１９７９］　５ｃａｎｄ、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１０：５９３参照。
蛋白質Ａの抗癌剤としての広範な試験は材料の高いコス
ト及び、蛋白質Ａｍ製に於ける不純物の存在によって邪
魔されてきた。蛋白質入の調製のコストが非常に減少さ
れ、純度が改良されれば蛋白質入の抗癌用途に対する臨
床試験が更により迅速に進行するであろう。
本明細書に開示したデータを有すれば当業者は容易に実
質的に同じ蛋白質入様の生物活性を有する分子に対しコ
ードを有する他の同等のヌクレオチド配列の同定するこ
とを容易に認識するであろう。従って本発明の範囲は上
記の特定のヌクレオチド配列のみならず、実質的に同じ
同定しろるの蛋白質Ａ様生物活性を有する分子に対しコ
ードを有する均等なヌクレオチド配列全てを包含するも
のである。均等のという用語はその通常の特許用語とし
ての使用であって、本質的に同じ宿主中で実質的に同じ
同定しうる蛋白質Ａ様生物活性を有する分子を製造する
のに本明細書で同定したヌクレオチド配列の様に実質的
に作用するヌクレオチド配列を意味する。この定義内で
Ｆｃ領域にＩｇＧ結合性を有する蛋白質Ａ様物質のサブ
断片又はポリクロナールＢｍ胞活性化活性を有するサブ
断片が含まれる。実施例１で開示されるプラスミドｐＡ
ｃ３７はスタフィロコツ力スオウレウス蛋白質Ａのアミ
ノ酸配列に対し、コードを有する全ヌクレオチド配列を
含有している。この配列は弐Ａに示されるが、上に定義
した同定しうる蛋白質入の様な物質及び上に定義した蛋
白質Ａｔ’Ｍの物質の同定しうろサブ断片に対しコード
を有しているクローン（ヒヌクレオチド配列を得ること
を当業者が出来るようにする。本発明の同定しうる蛋白
質入様の物質及びその蛋白質Ａｍの同定しうるサブ断片
は上に開示した蛋白！Ａと同じ方法で使用できる。
以下のものは本発明を実施するのに最良の方法を含めた
手順を例示する。これらの実施例は制限するものと解釈
されない。特に示さなければ全ての％は重量により、全
ての溶媒混合物は容量による。
実施例１ プラスミドｐＢＧｉｏ１−４１及びプラスミドｐＡｃ３
７からのハイブリッドプラスミドｐＢＧ９の構築及び融
合蛋白質入製品の表現 β−グルクロニダーゼプロモーター及びβ−グルクロニ
ダーゼ蛋白質入ハイブリッド遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＢＧ９は、プラスミドｐＢＧ１０１−４１及びプラ
ント末端のＣ１ａ　Ｉでの上記蛋白質入の断片から構築
した。プラスミド　ｐＢＧｌｏｌ−４１は独特のＢａｍ
ＨＩ場所（最初のメチオニンから後の１７９アミノ酸位
置）において間き、Ｂａｔ−３１エクソヌクレア、−ゼ
（Ｉ！遺業者によって記載される通り）での短い処理に
よってプラント末端にした。このエクソヌクレアーゼ処
理は３６の塩基（１２のアミノ酸）を除去し、プラント
末端を残した。プラスミドを更にプラスミドｐ８Ｒ３２
２の独特の位置においてＣ１ａ　Ｉで切断した。プラス
ミドｐＡｃ３７はｐＢＲ３２２中に蛋白質入遺伝子を含
有する。プラスミドｐＡｃ３７はＴＴＧ出発コドン（Ｔ
＝１）の後、６５及び１２６５位置において蛋白質入遺
伝子を開裂させろＲｓａで消化した。　１１９９塩基対
のＲｓａ断片をアガロース電気泳動で単離した＊　　Ｃ
１ａｌリンカ−にューイングランドバイオラブ、マサチ
ュウセッツ州バーレー、配列はＣＡＴＣＧＡＴＧ）を単
離したＲｓａ断片に融合した。この構築物をＣ１ａ　Ｉ
で切断し、ｐＢＲ３２２のＣ１ａ　Ｉ位置に挿入し、ｐ
ＡＩと命名される中間プラスミドを形成した。
プラスミドｐＡ１を部分的にＣ１ａ　Ｉで消化し、Ｃ１
ａ　Ｉのスティッキー末＃（付着性末端・粘性末ｔｒｙ
＞を、２５μＩ（＋）　５０＋ａＭ　）　’Ｊ　ス−Ｃ
Ｉ　ｐＨ７，２，１０ａＭ　ＭｇｚＳＯ４、ｏ、ｉｍＭ
　ＤＴＴ、　５０μｇ／ｍｌ　８ＳＡ、及び１１１ｇの
制限断片中に、各２０１Ｍの４−デオキシヌクレオチド
三燐酸及び５単位の大腸菌　ＤＮＡポリメラーゼｌのフ
レノウ（にｌｅｎｏｗ）断片含有する反応中で充填させ
た。充填反応は２０分間２２℃で培養し、７０℃でｌＯ
分闇熱不活性化することによって止めた。プラスミドを
次に５ａｌＩで消化して１８２６塩基対断片をアガロー
ス電気泳動で単離した。この断片を更にＣｌａ　Ｉて切
断し、上に述べた切断プラスミド中に挿入した（図面の
第１図参照）。
プラスミドｐ８Ｇ９のＤＮＡ配列及び大ｌｌＩ面ＰＲ１
３（ｐＢＧ９）によって表現された融合蛋白質のアミノ
酸配列を式Ｂに示す。
プラスミドｐ８Ｇ１０１−４１はＢａｍ）Ｉ　Ｉによつ
て間かれたｐＢＲ３２２であって、ＢＧプロモーター及
びＢ６コーデイング領域を含有しているＳａｕ　Ｉ部分
配列の挿入を有するものからなる。プラスミドｐＢＧ１
０１−４１はＢａｍ）Ｉ　Ｉで切断し、これはメチオニ
ン出発コドンの後、１７９アミノ酸の位置でこのプラス
ミドを開裂させ、次にＢａｌ−３１エクソヌクレアーゼ
（１ｅｔ−ｆａｓｔＢａｔ−３１）で酵素濃度２０Ｕ／
ｍｌ及びＤＮＡ１ｌ！１度１００μｇ／ｍｌに於て消化
される。反応を３０℃で進行させる。１０分、１５分及
び２０分に於て消化物の１／３が除かれ、反応をＥＤＴ
Ａを２０ｍＭ添加し、続いて一８０℃に冷凍することに
よって停止させろ。特定時点のものを独立にフェノール
−エーテルで抽出し、エタノールで沈殿させる。ＯＮ　
、ＡをＣｌａ　Ｉて消化させ、これがｐＢＲ３２２の独
特の位置で切断され、次に挿入物［ＩＮＡを連結させろ
。
挿入物ＤＮＡは完全な蛋白質Ａコード化配列を含有して
おりニブラスミドｐＢＧ９から調製した。このプラスミ
ドを制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ及びＦｎｕ４Ｈ１で切断した。
制限エンドヌクレアーゼＦｎｕ４Ｈ１は蛋白質Ａ遺云子
をシグナルペプチド開裂位置の５′末端に対し一つの塩
基の所で切断し、モしてＣｌａＩはこの遺伝子をＣ−末
端繰り返し領域において切断する。二〇Ｃ１ａ　Ｉ位置
は蛋白質入遺伝子の３′−末端から２８４塩基対離れた
位置のＲｓａ位置に於てＣ１ａ　Ｉリンカ−を連結させ
ることによって構築される。
挿入物及びベクターＤＮＡを４＝１の挿入物：ベクター
比で２０μｇ／ｍｌベクターＤＮＡを含有する反応中で
連結させる。Ｔ４リガーゼ触媒反応を１５℃で一夜進行
させ、次にリガーゼを７０℃で１５分間加熱することに
よって不活性化させた０反応混合物をＸｈｏ　（これは
ＢＧ蛋白質中の独特の位置において切断する）で消化さ
せ、８Ｇ欠失を含有している任意のプラスミドの形質転
換を防止する。反応混合物を大腸菌株ＰＲ１３中に形質
転換させ、プラスミドＤＮＡを形質転換物からｉｌｌ製
する。一つのクローンである標識されたｐＢＧ５は予想
された制限プロフィールを含有していた。このクローン
のＭ１３方法による配列分析はＢＧコード配列の１８の
アミノ酸が残っていることを明らかにした（図面の第３
図を参照）。
プラスミドｐＢＧ５のＤＮＡ配列と大腸菌ＰＲ１３（ｐ
ＢＧ５）で表現された融合蛋白のアミノ酸を式Ｃに示す
。
実施例３ プラスミドｐ８６５及びプラスミドｐＢＲ３２５からの
ハイブリッドプラスミドｐＢＧ３−２の構築及び融合蛋
白質Ａｉ１品の表現 プラスミドｐＢＲ３２５をＣｊａｌ及び５ａｌＩで消化
させ、プラスミドコード化配列のほとんどを含有してい
る５３６８塩基対断片をアガロース電気泳動によつて単
離する。プラスミドｐＢＧ５もＣ１ａ　Ｉ及び５ａｌＩ
で消化させ、ＢＧプロモーター及び蛋白質Ａコーディン
グ配列を含有している２０００塩基対断片をアガロース
ゲル電気泳動で単離する。これらの二つのＤＮＡ断片を
等モル比で、断片当り３０μｇ／ｍｌに於て混合し、Ｔ
４リガーゼで連結させる。生じる生成物をＣ１ａ　Ｉで
消化させ、生じる？、４ｋｂの線状分子を７ガロース電
気泳動で単離する。実施例４に記載のように調製したス
トップコドンを含有する号ンカーＤＮＡ断片を大モル過
剰で加え、反応をＴ４リガーゼて−＠１５℃で連結させ
ろ、閉環状のプラスミドをＣ１ａ　ｒ及びＳｍａ　Ｉで
消化させ、複数のストップリンカ−を有するか又はスト
ップリンカ−を有しないプラスミドに線状化させ、次に
大Ｉｌ！菌ＰＲ１３に形質転換する（図面の第４図を参
照）。
フラ７．　ミｌ’　ｐＢＧ３−２ｃＤ　（ＩＮＡ配タリ
及び大Ｉｌｌ菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２）によって表現
される融合蛋白のアミノ酸配列を式りに示す。
実施例４−−ストップリンカ−の構築 ストップコドンを全ての三つの読み枠（リーディングフ
レーム）中に含有しているＤＮＡのリンカ−セグメント
をｐＢＧ３−２構築物中のＣ！ａ　Ｉ位置に挿入し、最
終生成物がどんなｐＢＲに由来するアミノ酸も含有しな
いことを確実にする。合成りＮＡ上セグメント配列ＣＧ
ＧＧＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＧＣＣを
有するものを製造業者の指示する手順にしたがってアプ
ライドバイオシステムＤＮＡ合成機械、モデル３８０゛
Ａ（ブォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて
合成する。この配列は自己アニーリングのものであって
二重鎖ＤＮＡ断片を生成する。
ＣＧＧＧ　ＣＧＣＧＣＴ　Ａ　Ｇ　ＣＴＡ　Ｇ　ＣＴＡ
　ＧＣＧ　ＣＧ　ＣＣＣＣＧＣＧＣＧＡ　Ｔ　ＣＧＡ　
Ｔ　ＣＧＡ　Ｔ　ＣＧＣＧ　ＣＧ　Ｇ　Ｇ　Ｃを生成し
、これは体止配列ＣＩｌ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ａ　Ｇ
及びＢｓ５Ｈ■の位置ＧＣＧＣＧＣをトリフエージツク
（三重）ストップの両端に含有している。
実施例５−−プラスミド９８Ｇ３−２からのプラスミド
ρＢＧ３−２ΔＮの構築 プラスミド　ｐＢＧ３−２を制限エンドヌクレアーゼ出
で消化し、切断したプラスミドをフェノール−エーテル
で抽出し、エタノールで沈殿させた。
プラスミドを希釈ＤＮＡ濃度（１２μｇ／ｍｌ）に於て
連結させてＮｄｅ断片の取込なしに分子間リサーキュラ
リゼーションがしやすいようにしてプラスミドｐＢＧ３
−２ΔＮをあたえる。反応混合物を大ｍ面ＰＲ１３に形
質転換し、コロニーをミニリゼート分析で検定する。図
面の第５図を参照。
実施例６−一大腸菌ＰＲ１３又は大腸菌ＳＧ２０２５　
ｔへのプラスミドｐ８Ｇ３−２、ｐＢＧ３−２ΔＮ−ｐ
ＢＧ９及びｐＢＧ５の形質転換 大腸菌ＰＲ１３又は大腸菌ＳＧ２０２５１を（５）の形
質転換で記載したように成育させた新たな一夜培養基か
ら収穫した。
細胞を上記のようにＣａＣＩ　２で処理することによっ
て形質転換能力があるようにした。
プラスミドＤＮＡを（１）プラスミドＤＮＡＩＩ　Ｉ！
において記載した方法によってプラスミドを宿している
細胞から調製した。
能力のある（コンベテント）細胞０，１１を５０〜１１
００ｎのプラスミドＤＮＡと３０分間０℃で混合した。
細胞を３７℃で２時間加熱し、次に１．５％寒天及び１
０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン又は５０μｇ／ｍ　Ｉ
のクロラムフェニコールの何れかを含有しているし一プ
ロス平板培養基上で次に平板培養し、ここでｐＢＲ３２
５誘導物が形質転換された。平板培養基を一夜３７゛Ｃ
で培養した。プラスミドＤＮＡμｇ当り１　ｘ　１０６
コロニーの形質転換効率が常に観測された。
実’ｋ　例７　−−　大％Ｉ　’Ｉ　ＰＲ１３（ｐＢＧ
３−２）（７）　￥ａ酵大ｌ１％　ｇ　ＰＲ１３ぐｐＢ
Ｇ３−２）はこの技術の当業者に良く知られた幾つもの
方法の任意のものによって成育できる。この微生物は大
腸菌の成育を指示することのできる任意の複合培地上で
、そして定義された培地が十分な成育因子及び細胞成長
を支持するのに必要な代謝物を含有するならば任意の定
義された培地上で成育するであろう。一般にこれらの定
義培地は、アミノ酸スレオニン及びロイシンをもし含有
するならば大ＨＭを成育することのできるものをなす、
この微生物による組替え蛋白質の製造は分解産物抑制に
従う、従って蛋白質の製造が望まれる時はグルコース又
は分解産物抑制（カタボライトレプレッション）を生じ
ることのできるどんな基質も生育培地が含有しないよう
に注意すべきである。大腸菌の分解産物抑制はｃＡＭＰ
の水準の細胞間の減少によって仲介される。従ってこの
生物はこのような培地が高水準のｃＡＭＰ、典型的には
４ｍＭを含有するならば、又はこれらの培地が高水準の
脂質可″ｌｃＡＭＰ誘導体、例えばジブチリルＣＡｌ１
’Ｐを約ｌＯμ門の濃度で含有するならばグルコースを
含有している成育培地の存在下で成育させられ得る。
一般に蛋白質への高水準は大ＩＩ　ｉｒ　ＰＲ１３（ｐ
ＢＧ３−２）の凍結原料からの接種物を調製することに
よって製造することが出来る。これはＹＴ／Ｃｍ上に斜
面培養され、−夜成育されたものである。ＹＴは８ｇ／
　ｌの酵母抽出物、５ｇ／　Ｉのトリプトン及び５ｇ／
　ＩのＮａＣｌを含有する。　ＹＴ／Ｃｍは５０ｎ＋ｇ
／　Ｉのクロラムフェニコールを含有している。コロニ
ーを平板培養基からとりあげ、１０ｍ１のＹＴ／Ｃｎ＋
中に接種し、これをで３７℃で６〜１２時間成育させて
次に直接醗酵話中に接種する。
大１！　Ｍ　ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２）を９．８１の５
ｇ／ｌ酵母抽出物及び５ｇ／ｌのトリプトンを仕込んだ
２０１ケエマペックフ７−メンタ−にューヨーク州ウッ
ドバリー）中で成育させる。溶解させた酸素濃度を約５
０χ（空気＝１００＄）に保ち、５Ｍ　Ｎａ０）ｌ又は
５Ｍ　＋（２５０４を自動的に添加することによってｐ
）Ｉを約６．８に保った。正常な接種物容量は約１０ｍ
１である。この接種物で陀酵器は９時間の成育の後に収
穫できる。細胞がこの方法で成育される時、醗酵雪中で
製造される全天ｌｌＩ面に由来する蛋白質の４６％が蛋
白質入である。
クローン化された蛋白質入が活性形で表現されているこ
とが証拠により実証される。［：Ｉ２Ｊ］標識された兎
１３Ｇをプロブ（探り）にしたウェスタンプロットは、
熱い５ＤＳｉｌ液での処理、及びＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル中での電気泳動の後においてさえハイブリッド
蛋白質がＩｇＧ結合活性を有することを示している。
ｐｎｐ−宿主株から抽出された可溶性蛋白ｊｊＡの特異
的活性はラジオアッセイによって測定した（（６）の蛋
白質Ａラジオアッセイを参照）。この検定は細胞原形質
ゾル（ｃｙｔｏｓｏ　ｌ　）が純粋な市販物質の特異活
性の３５％である蛋白質入活性を有したことを実証した
。この原形質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ　：ｃ＞ＦＡ製中の
蛋白質入濃度は５０Ｓゲル電気泳動によって３５ｚと測
定され、クローン化された物質が天然の蛋白質と本質的
に同等の特異的活性を有していることを示している。
実施例８−一大１！　Ｍ　ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２ΔＮ
）の餡酵組替え生物を（１３）醗酵のところで記載した
ように陀酵器中で成育させ、ｐＢＧ３−２の掻にプラス
ミドｐＢＧ３−２ΔＮを分解産物抑制にかけた。大腸菌
ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２）に対して記載した培地及び条
件をこの微生物を成育させるにも使用できる。驚くべき
ことにプラスミドｐ８Ｇ３−２ΔＮを含有している大腸
菌は組替え産物の驚くほど高い水準を生じた。
次の表はｐＢＧ９、ｐＢＧ３−２及びｐＢＧ３−２ΔＮ
の蛋白質入表現水準を示すものである。
ｐＢＧ９　　　　　１６８　　　　　４６％ｐＢＧ３−
２　　　　１８　　　　　５０％ｐ８Ｇ３−：２ΔＮ　
　　　１８　　　　　７３％本可溶性細胞蛋白質に対す
る％としての蛋白質Ａ蛋白質４への含有量はロケット免
疫電気泳動により、そして全蛋白質をビウレットによっ
て測定した。
実施例９−−プラスミドで形質転換した宿主の単離 宿主微生物、例えば大ｌｌ！菌ＰＲ１３は、プラスミド
、例えばρＢＧ９抜きで回収できる。これを用いて標準
手順によってこれを形質転換された。例えば形質転換さ
れた宿主はｏ、ｏｌｘ重量ｌ容量ＳＤＳを含有している
’／Ｔ培地中で成育出来、宿主からプラスミドをエジェ
クトする。プラスミドのない宿主細胞はクロラムフェニ
コール及び／又はアンピシリンに対する抵抗性がないこ
との為にスクリーンすることが出来る。
この技術で良く知られているように蛋白質、ηりえば蛋
白質入のアミノ酸配列はＤＮＡのヌクレオチド配列によ
って決定できる。遺伝子コードの冗長性、即ち蛋白質を
製造するのに使われるアミノ酸の多くに対し、−個より
多くのコード化ヌクレオチドトリブレット（コドン）が
使用され得るので特定のアミノ酸に対して異なるヌクレ
オチド配列がコード出来る。従って遺伝子コードは以下
のように描かれる。
フェニル７ラニシ（、Ｐｈｅ）　　ＴＴＫ　　　　ヒス
チシ゛ン（Ｈｉｓ）　　　　　　ＣＡにロイシン（Ｌｅ
ｕ）　　　　　　ＸＴＹ　　　　クールタミン（Ｇｌｎ
）　　　　　　ＣＡＪイブロイシン（ｌｌｅ）　　　　
ＡＴＨ７スハ０う４”ン（Ａｓｎ）　　　　ＡＡにメチ
オニン（Ｍｅｔ）　　　　　ＡＴＧ　　　　リシ゛ン（
Ｌｙｓ）　　　　　　　　Ａ、Ａ、Ｊハ゛リシ（Ｖａｌ
）　　　　　　’ＧＴＬ　　　　７スハ０ラキーン酸（
Ａｓｐ）　　ＧＡＫセリン（Ｓｅｒ）　　　　　　　Ｑ
ＲＳ　　　　クールタミン酸（Ｇｌｕ）　　　　ＧＡＪ
フ０ａリシ（Ｐｒｏ）　　　　　ＣＣＬ　　　　システ
ィン（ｃｙｓ）　　　　　　　ＴＧにストオニン（Ｔｈ
ｒ）　　　　　ＡＣＬ　　　　）リフ０トフ７ン（Ｔｒ
ｙ）　　　　ＴにＧ１ラニン（Ａｌａ）　　　　　　Ｇ
ＣＬ　　　　７１Ｗニン（Ａｒｇ）　　　　　　ＷＧＺ
チａシン（Ｔｙｒ）　　　　　　ＴＡＫ　　　　クーリ
シン（Ｇｌｙ）　　　　　　　ＧＧＬ末端信号　　　Ｔ
ＡＪ 末端信号　　　ＴＧＡ キー：各３文字のデオキシヌクレオチドトリブレットは
左側に５゛−末端、及び右偏に３′−末端を有するｍＲ
ＮＡのトリヌクレオチドに対応する。本明細書に与えら
れる全てのＤＮＡ配列はその配列がｍＲＮＡ配列に対応
する配列の鎖のものであって、ウラシルの代りにチミン
で置き換えられている。文字はデオキシヌクレオチド配
列を形成しているプリン又はピリミジン塩基を表してい
る。
Ａ＝アデニン Ｇ＝ニブアニ ン＝シトシン Ｔ＝チミン Ｘ　＝ＹがＡ又はＧの時にＴ又はＣ Ｘ　＝ＶがＴ又はＣの時にＣ Ｙ＝ＸカＣ（７）時ニＡ、Ｇ、Ｃ又ハＴＶ　＝ＸがＴの
時にＡ又はＧ 讐＝ＺがＡ又はＧの時にＣ又はＡ 讐＝ＺｂＩＣ又はＴの時にＣ Ｚ＝讐がＣの時Ａ−Ｇ％Ｃ又はＴ Ｚ＝讐がＡの時Ａ又はＧ ＱＲ＝ＳがＡ−Ｇ−Ｃ又はＴの時ＴＣ Ｊ　＝Ａ又はＧ に：Ｔ又はＣ Ｌ　＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ又はＧ Ｍ　＝Ａ、　Ｃ又はＴ 上記は融合された蛋白質入製品の新規なアミノ酸配列及
び他の有用な蛋白質が蛋白質の同じアミノ酸配列に対し
コードしている均等なヌクレオチド配列によって製造で
きることを示す。従って本発明はそのような均等のヌク
レオチド配列を含むものである。更に、変化が蛋白質の
二次構造を変１ヒさせないならば、アミノ酸配列を変化
させることによって、同定された構造及び機能の蛋白質
を構成することが出来ることを示している（カイザー　
イー、ティー、及びケズディー　エフ、ジエー。
［１９８４］　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　２４Ｌ２５
５）。
ここに記載された研究は全てＮ１）Ｉガイドラインに特
定された物理的及び生物学的封じ込め要求にのっとって
なされた。
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ａＪ　ｕ− ＱＱ　Ｉ−一　Ｑく ０ψ　＜ｏＩ−輔 ＜　＞　　ｕ　Ｌ　　Ｕ　＆− く−Ｑら　Ｑく りφ　←Ｃく論 ＜）＜φ　Ｕ− ＜−＜＜　　リＵ Ｉ−１＜　　　コ　　　　　←　　ｄ くψ　く−　Ｑ− ＩＪ＜　　ｕ（Ｊ　　”Ｊ＜ ←−くコ　くコ ←ｄ　く−　←Ｑ す＞　　ＱＩＪ　　←− ←−←≧　くコ ←ｄ　　Ｃｊ−←０ Ｃｊ　＞　　Ｃ５Ｃｊ　　ｉ−、Ｊ ←　　コ　　　　　ｌ−Ｌ　　　　　Ｃｊ　　　ｄ←＠
Ｊ　　ＩＪ　Ｊ：　　ＩＪ　− ｕ　−＜　Ｉ−ＩＪ　＜ 弐Ｂ−ｐＢＧ９ ｃｏ　ＲＶ Ｓａｕ３Ａ　　　　　　　　　　Ｒｓａ　ｌ　　　　　
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ＡＴＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　Ｔ
ＣＧａｑ　Ｉ ＴＴＣＣＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＣＴＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　
ＣＧＴ　ＴＣＧ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　Ａ
ＴＧＨｉｎｃ　ＩＩ　　　　Ａｈａ　ＩＩＩ　　　　　
　　５ａｕ３ＡＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＴＣＡＡＣＧＣＴ　
ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＣＧ　Ａ
ＴＣＴＡＴ　ＡＴＣａｕ３Ａ ＡＣＧ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　Ｔ
ＴＴ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＧ　ＣＧ
Ｇ　ＴＧＴ・１０Ｎｃｏ　ｌ　　・・・・ ＣＡＧ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＴＴ
Ｔ　ＣＴＣＴＴＣＣＡＴ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＣＴＣＡＣ
Ａ式Ｂ 旧ｎｃｌｌ 旧ｎｃｌｌ　　　　　　　　　　　　　　ＲＢＳ　　　
　　　ＩＡＡＧ　ＧＴＴ　ＧＡＣＣＡＧ　ＴＡＴ　ＴＡ
Ｔ　ＴＡＴ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣ
ＣＴＴ　ＡＴＣ凪 Ｔａｑ　１ ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣＣＣ
Ａ　ＡＣＣＣＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＡ　Ｃ
ＴＣＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ
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　　　　　　　　５４ Ｓ５　　　　　　　　　　　　　　ＳｅＧＡＣＡＡＣＡ
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　ＧＧＣＡＡＣＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴＡｓｐ　Ａｓｎ
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Ａｓｐ　ａｎｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＧＩｙＳ８
　　　　　　　　　　　　　５９ ５１０　　　　　　　　　　　　５ｌｌＰｒｏ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ａｓ
ｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌ
ｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ式Ｄ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　零零ネ　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａ
ｒｇ　　Ｐｒ。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＡｃ３７からの中間プラスミドの
構築を例示する。プラスミドｐＡｃ３７は蛋白質入遺伝
子及び全ｐＢＲ３２２［）ＮＡからなる。 第２図はプラスミドｐＢＧ１０１−４１及びｐＢＧ９に
対する遺伝子［ＩＮＡ挿入物についての制限マツプを示
す。 クローニング中に再生されないＢａｍＨＩの位置は（Ｂ
へｍＨＩ）として印す。 第３図はプラスミドｐＢＧ９からのｐＢＧ５の構築を示
す。 第４図はｐＢＧ５及びプラスミドｐＢＲ３２５からのプ
ラスミドｐＢＧ３−２の構築を示す。 第５図はプラスミドｌ）Ｂ＜；３−２からのプラスミド
ｐＢＧ３−２ΔＮの構築を示す。 出願人　レブリゲン　コーポレーションＦｉｇｕｒｅ　
２ ｌａ 星 巳１ｕｎｉ 口　Ｂ−グｊし’）ｃニタ”ｔ−ＤＮＡ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ′■３ｔｏＯ曲にｅ
「 一口牙３２５Ｃ１０ Ｆｉ９ｕｒｅ　５ 手続補正書（禎） １１件の表示　　　　　　　　　昭和６１年特許願第０
４８７７０号２　発明の名称 超高度原核表現系により製造されたハイブリッド蛋白質
３　補正をする者 事件との関係　　　　　　特許出願人 性　　所　　　アメリカ合衆国　０２１４２　　マサチ
ューセッツ州　カンブリッジ　ビネーストリート　１０
１ 氏名（名称）　レブリゲン　コーポレーション４代理人 住　　所　　ｖＲ京都新宿区新宿２丁目８番１号セブン
ビル３０３号６　補正により増加する発明の数　　　　
　増加せず７　補正の対象　　　　明細′＠（７９−１
０１頁）８　補正の内容　　　　別紙の通り

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質 【アミノ酸配列があります】 ２、次のアミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質 【アミノ酸配列があります】 ３、次のアミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質 【アミノ酸配列があります】 ４、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同じ
    アミノ酸配列に対するコードを有している塩基を含有し
    ている均等のヌクレオチド配列を有するＤＮＡからなる
    組替えＤＮＡトランスファーベクター 【遺伝子配列があります】 ５、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同じ
    アミノ酸配列に対してのコードを有する塩基を含有して
    いる均等のヌクレオチド配列を有するＤＮＡからなる組
    替えＤＮＡトランスファーベクター【遺伝子配列があり
    ます】 ６、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同じ
    アミノ酸配列に対してのコードを有する塩基を含有して
    いる均等のヌクレオチド配列を有するＤＮＡからなる組
    替えＤＮＡトランスファーベクター【遺伝子配列があり
    ます】 ７、原核微生物中に移され複製された特許請求の範囲第
    １項に記載のＤＮＡトランスファーベクター８、原核微
    生物が大腸菌Ｋ−１２誘導薗である特許請求の範囲第７
    項に記載のＤＮＡトランスファーベクター ９、原核微生物中に移され複製された特許請求の範囲第
    ５項に記載のＤＮＡトランスファーベクター１０、原核
    微生物が大腸菌Ｋ−１２誘導薗である特許請求の範囲第
    ９項に記載のＤＮＡトランスファーベクター １１、原核微生物中に移され複製された特許請求の範囲
    第６項に記載のＤＮＡトランスファーベクター１２、原
    核微生物が大腸菌Ｋ−１２誘導菌である特許請求の範囲
    第１１項に記載のＤＮＡトランスファーベクター １３、図面の第２図に示されるプラスミドｐＢＧ９。 １４、図面の第３図に示されるプラスミドｐＢＧ５。 １５、図面の第４図に示されるプラスミドｐＢＧ３−２
    。 １６、図面の第５図に示されるプラスミドｐＢＧ３−２
    ΔＮ１７、特許請求の範囲第４項に記載のトランスファ
    ーベクターによって形質転換された微生物。 １８、特許請求の範囲第５項に記載のトランスファーベ
    クターによって形質転換された微生物。 １９、特許請求の範囲第６項に記載のトランスファーベ
    クターによって形質転換された微生物。 ２０、特許請求の範囲第１７項に記載の微生物、大腸菌
    ＰＲ１３（ｐＢＧ９）。 ２１、特許請求の範囲第１８項に記載の微生物、大腸菌
    ＰＲ１３（ｐＢＧ５）。 ２２、特許請求の範囲第１９項に記載の微生物、大腸菌
    ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２）。 ２３、大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２ΔＮ）。 ２４、（ａ）プラスミドｐＢＧ１０１−４１をエンドヌ
    クレアーゼＢａｍＨＩで切断し、Ｂａｌ−３１エクソヌ
    クレアーゼでの処理によってプラント末端化し、 （ｂ）ｐＢＧ１０１−４１を更にｐＢＲ３２２ＤＮＡ中
    の独特の位置においてＣｌａＩで切断し、 （ｃ）プラスミドｐＡｃ３７からのプラントＣｌａＩ蛋
    白質Ａ断片を得て、 （ｄ）（ｃ）の構築物を（ｂ）と結合させてプラスミド
    ｐＢＧ９を得ることからなる組替えプラスミドｐＢＧ９
    の製造方法。 ２５、（ａ）プラスミドｐＢＲ３２５をＣｌａＩ及びＳ
    ａｌＩで消化して５３６８ｂｐの断片を単離し、 （ｂ）ｐＢＧ５をＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化して２０
    ００ｂｐ断片を単離し、 （ｃ）（ａ）及び（ｂ）で得られた断片を連結させ、（
    ｄ）（ｃ）の連結させた生成物をＣｌａＩで消化して７
    ．４Ｋｂの線状分子を単離し、 （ｅ）上記７．４Ｋｂの分子を停止コドンを含有してい
    るリンカーＤＮＡ断片と連結させ、プラスミドｐＢＧ３
    −２を得て、 （ｆ）プラスミドｐＢＧ３−２を制限エンドヌクレアー
    ゼ￥Ｎｄｅ￥で消化し、 （３）上記消化したプラスミドをフェノール−エーテル
    で抽出して、エタノールで沈殿させ、そして （ｈ）（ｇ）で得た上記生成物ＤＮＡを希ＤＮＡ濃度に
    おいて再連結させてプラスミドｐＢＧ３−２ΔＮを得る
    ことからなる組替えプラスミドｐＢＧ３−２、及びｐＢ
    Ｇ３−２ΔＮを製造する方法。 ２６、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同
    じアミノ酸配列に対してのコードを有する塩基を含有し
    ている均等のヌクレオチド配列 【塩基配列があります】 を有するＤＮＡからなる組替えＤＮＡトランスファーベ
    クターを宿す原核微生物を培養することからなる、次の
    アミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質の製造方法 【アミノ酸配列があります】 ２７、原核微生物がｌｏｎ又はｐｎｐ突然変異を有して
    いる大腸菌Ｋ−１２誘導菌であって、上記組替えＤＮＡ
    トランスファーベクターがプラスミドｐＢＧ９である特
    許請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８、上記大腸菌Ｋ−１２誘導菌が大腸菌ＳＧ２０２５
    １又は大腸菌ＰＲ１３である特許請求の範囲第２７項に
    記載の方法。 ２９、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同
    じアミノ酸配列に対してのコードを有する塩基を含有し
    ている均等のヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡからなる組替えＤＮＡトランスファーベ
    クターを宿す原核微生物を培養することからなる、次の
    アミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質の製造方法 【アミノ酸配列があります】 ３０、原核微生物が￥ｌｏｎ￥又は￥ｐｎｐ￥突然変異
    を有している大腸菌Ｋ−１２誘導菌であって、上記組替
    えＤＮＡトランスファーベクターがプラスミドｐＢＧ５
    である特許請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１、上記大腸菌Ｋ−１２誘導菌が大腸菌ＳＧ２０２５
    １又は大腸菌ＰＲ１３である特許請求の範囲第３０項に
    記載の方法。 ３２、以下のヌクレオチド配列又は翻訳された領域が同
    じアミノ酸配列に対してのコードを有する塩基を含有し
    ている均等のヌクレオチド配列 【塩基配列があります】 を有するＤＮＡからなる組替えＤＮＡトランスファーベ
    クターを宿す原核微生物を培養することからなる次のア
    ミノ酸配列を有するハイブリッド蛋白質の製造方法 【アミノ酸配列があります】 ３３、原核微生物が￥ｌｏｎ￥又は￥ｐｎｐ￥突然変異
    を有している大腸菌Ｋ−１２誘導菌であって、上記組替
    えＤＮＡトランスファーベクターがプラスミドｐＢＧ３
    −２又はプラスミドｐＢＧ３−２ΔＮである特許請求の
    範囲第３２項に記載の方法。 ３４、上記大腸菌Ｋ−１２誘導菌が大腸菌ＳＧ２０２５
    １又は大腸菌ＰＲ１３である特許請求の範囲第３３項に
    記載の方法。 ３５、β−グルクロニダーゼ遺伝子ＤＮＡを含み、￥ｒ
    ｏｐ￥遺伝子を部分的に又は全体的に欠失させているか
    又は他の方法で不活性化させている大腸菌ｃｏｌε１プ
    ラスミドに由来する組替えＤＮＡトランスファーベクタ
    ーを宿す原核微生物を培養することからなる有用蛋白質
    の製造方法。 ３６、上記β−グルクロニダーゼ遺伝子ＤＮＡが大腸菌
    Ｋ−１２誘導菌から得られる特許請求の範囲第３５項に
    記載の方法。 ３７、上記大腸菌Ｋ−１２誘導菌が大腸菌ＭＳ３７１で
    ある特許請求の範囲第３６項に記載の方法。 ３８、原核微生物が￥ｌｏｎ￥又は￥ｐｎｐ￥突然変異
    を有している大腸菌Ｋ−１２誘導菌である特許請求の範
    囲第３５項に記載の方法。 ３９、上記大腸菌Ｋ−１２誘導菌が大腸菌ＳＧ２０２５
    １又は大腸菌ＰＲ１３である特許請求の範囲第３８項に
    記載の方法。
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