CZ284774B6 - Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin - Google Patents
Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ284774B6 CZ284774B6 CS91241A CS24191A CZ284774B6 CZ 284774 B6 CZ284774 B6 CZ 284774B6 CS 91241 A CS91241 A CS 91241A CS 24191 A CS24191 A CS 24191A CZ 284774 B6 CZ284774 B6 CZ 284774B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pro
- protein
- composite protein
- composite
- chain
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 35
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 18
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 title 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 261
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 242
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 119
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 119
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 61
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 120
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 17
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 claims description 5
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 claims description 4
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 claims 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 201
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 61
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 21
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 16
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- -1 methionine amino acid Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 6
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 108010048188 MS2 polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001108452 Neisseria gonorrhoeae MS11 Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 2
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N Ala-Arg-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101000828148 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Transposon Ty3-G Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000790437 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Transposon Ty3-I Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5403—IL-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5409—IL-5
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Enzymatické štěpení složených bílkovin za získání jejich požadovaných částí, tak, že se 1) modifikuje pomocí genetické technologie přechodná oblast, jíž jsou spojeny dvě části složené bílkoviny takovým způsobem, že se do této oblasti uloží alespoň jedno rozpoznávací místo pro IgA-proteázu s řetězcem Y-Pro./.X-Pro, v němž X znamená libovolnou aminokyselinu a Y znamená jednu nebo větší počet libovolných aminokyselin, 2) složená bílkovina, získaná v předchozím stupni se štěpí IgA-proteázou v rozpoznávacím řetězci v místě, které je označeno ./. a 3) po rozštěpení se získá jedna nebo větší počet požadovaných částí složené bílkoviny.ŕ
Description
Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin, složená bílkovina, rekombinantní DNA, vektor a buňka s jejím obsahem
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu specifického štěpení bílkovin, získaných biotechnologickým způsobem při použití IgA-proteáz (které se označují také jako igázy), zejména jde o způsobu výroby rekombinantních bílkovin nebo peptidů v prokaryotických organismech s následným odstraněním N-terminálního řetězce. Vynález se rovněž týká složené bílkoviny, rekombinantní DNA a vektoru a buňky s jejím obsahem.
Dosavadní stav techniky
Biotechnologické získávání bílkovin se s výhodou provádí při použití mikroorganismů, které se snadno pěstují a umožňují získání vyrobených bílkovin jednoduchým způsobem. Vhodným mikroorganismem pro toto použití je například gramnegativní bakterie Escherichia coli, grampozitivní bakterie Streptococcus camosus a také pekařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Exprese autentických cizorodých genů v takových mikroorganismech je však často spojena s nevýhodami. Při použití například E. coli se aminoterminální methioninový zbytek přírodních bílkovin po translaci obvykle odštěpí působením proteáz. U cizorodých bílkovin však toto odštěpení prvního methioninového zbytku často probíhá pouze částečně. Vhodným způsobem pro získání bílkovin s určitým zakončením řetězce aminokyselin je tedy postup, získat tuto bílkovinu nejprve ve formě složené bílkoviny a pak tuto složenou bílkovinu rozštěpit proteázou, která ji štěpí ve specifickém místě.
Kromě autentických bílkovin mohou takové složené bílkoviny mít ještě tu výhodu, že v buňkách mikroorganismu tvoří agregáty a tělíska, vzniklá srážením (inkluzní tělíska), která je možno oddělit od jiných částí buňky poměrně snadno, což ulehčuje izolaci a čištění požadované bílkoviny. Na druhé straně udělují nosné bílkoviny, které byly genetickou technologií vázány na požadovanou bílkovinu, vysokou stálost proti nespecifickému proteolytickému odbourávání. Problém odbourávání polypeptidů, které jsou rozpoznávány jako cizorodé, se týká zejména biotechnologické produkce malých peptidů. Další nosné bílkoviny umožňují uložení požadovaných bílkovin v určité části buňky, z níž je možno ji snadno izolovat a čistit a kde je zvláště stálá a/nebo dostupná pro případné zkoušky. Konečně mohou nosné bílkoviny mít také zvláštní vlastnosti, které dovolují účinné čištění například afinitní chromatografii. Pro většinu účelů jsou výhodné takové složené bílkoviny, které obsahují nosnou bílkovinu na aminoterminálním zakončení a požadovanou bílkovinu na karboxyterminálním zakončení. V někteiých případech je však možný také obrácený postup, nebo spojení požadované bílkoviny se dvěma dalšími bílkovinami. Dále může být požadovaná bílkovina uložena uvnitř složené bílkoviny.
Při výrobě požadovaných bílkovin ve volné formě z těchto složených bílkovin je nutné odštěpení kovalentně vázané nosné bílkoviny. Zásadně je to možno provést chemicky nebo biochemicky (enzymaticky). Omezujícím faktorem je většinou omezená specifičnost postupů, které jsou v současné době k dispozici. Je totiž důležité pro získání požadované bílkoviny, aby ke štěpení došlo mezi nosnou a požadovanou bílkovinou, tj. v přechodné části, avšak v žádném případě v požadované bílkovině samotné. Odštěpení nosné bílkoviny musí tedy být vysoce specifické.
Z dosud užívaných chemických postupů pro specifické štěpení složených bílkovin je možno uvést například štěpení bromkyanem na aminokyselině methioninu uvnitř některé z bílkovin a štěpení mezi aminokyselinami Asp./. Pro v kyselém prostředí při použití kyseliny mravenčí. Tyto postupy jsou vhodné pouze v tom případě, že se specifické místo štěpení v požadované bílkovině kromě přechodu mezi touto bílkovinou a nosnou bílkovinou již nevyskytuje. Obecně jsou k dispozici ještě biochemické štěpící metody, které provádějí štěpení většinou za fyziologických
-1 CZ 284774 B6 podmínek, a chemické postupy, prováděné za mírných reakčních podmínek, které nepoškozují požadovanou bílkovinu.
Biochemické postupy pro rozštěpení složení bílkoviny jsou založeny na použití pokud možno specifických proteáz. Například trypsin štěpí peptidovou vazbu uvnitř bílkoviny za aminokyselinou argininem nebo lysinem. Zvýšení specifičnosti je možno dosáhnout předchozí chemickou modifikací aminokyselin lysinu, takže specifickým místem štěpení zůstává aminokyselina argininu. Další biotechnologicky používanou proteázou je clostripain. Tento enzym štěpí peptidovou vazbu mezi aminokyselinou argininem a libovolnou další následující aminokyselinou. Přehled dosud užívaných chemických enzymatických postupů pro štěpení složených bílkovin je možno nalézt v publikaci F.A.O. Marston, v D.M. Glover E.: DNA cloning III, IRL PRESS Oxfor a Washington DC, (1987). Také enzymatické štěpné postupy jsou omezeny tím, že specifická aminokyselina, vhodná pro štěpení, se může vyskytovat také v požadované bílkovině. Při biochemickém štěpení složených bílkovin by tedy měly být užívány zvláště enzymy, jejichž místem štěpení není pouze jediná aminokyselina, nýbrž řetězec aminokyselin. Pravděpodobnost, že určitý řetězec aminokyselin se bude vyskytovat kromě štěpeného místa mezi oběma částmi bílkoviny ještě také v požadované bílkovině, je tím menší, čím větší je počet aminokyselin, tvořících štěpný řetězec.
Proteázy, které velmi specificky štěpí určitou bílkovinu, jsou známé. Většina těchto selektivních proteáz, které se vyskytují například v komplementu a v systému, zajišťujících srážení krve u člověka, provádí štěpení na přesně definovaném místě substrátu. Při přenesení štěpné oblasti do jiné, například složené, bílkoviny již tyto proteázy zpravidla nejsou schopné bílkovinu rozštěpit. Podklady pro tyto jevy jsou mnohostranné a spočívají například v rozpoznání určité sekundární nebo terciární struktury v substrátu proteázou, nebo v nepřístupnosti místa štěpení ve složené bílkovině.
Seznamy proteáz, specifických pro určité řetězce a až dosud užívaných ke štěpení složených bílkovin, se někdy uvádějí jako faktor Xa. Tato proteáza specificky štěpí řetězec Ile-Glu-GlyArg./.X, kde ./. znamená místo štěpení a X znamená libovolnou aminokyselinu. Ukázalo se však, že ani tento typ proteázy není obecně vhodný ke štěpení složených bílkovin, které mají určitý štěpný řetězec v přechodové části. Často se stává, že takové substráty, tj. složené bílkoviny, které obsahují požadovanou bílkovinu, kovalentně vázanou na nosnou bílkovinu, nejsou vůbec rozštěpeny, nebojsou rozštěpeny jen v malé míře nebo pouze v rozpustné formě.
Zvláště významné je účinné štěpení složených bílkovin při získávání rekombinantních bílkovin v prokaryotických organismech. V tomto případě je nutné zejména klonování řetězce DNA, který obsahuje AUG jako iniciační kodon před počátkem vlastního řetězce DNA. V důsledku této skutečnosti dochází v prokaryotických organismech, například v E. coli, k expresi rekombinantních bílkovin, které obsahují v poloze 1 zbytek methioninu.
í
V mnoha případech je však nutné získat rekombinantní bílkovinu, která je prostá tohoto methioninového zbytku. Získání takové bílkoviny z prokaryotických organismů je možné například při použití peptidázy, specifické pro methionin, která odštěpí N-terminální methioninový zbytek. Tento postup je však velmi náročný, protože toto štěpení je možno doložit jen při analýze řetězce. Mimoto je velmi obtížné oddělit bílkovinu s obsahem tohoto zbytku od bílkoviny bez tohoto zbytku vzhledem ke stejné molekulové hmotnosti obou látek. Dělení proto bývá neúplné.
V PCT-přihlášce WO 84/02351 se popisuje odštěpení N-terminální aminokyseliny ze složené bílkoviny. Tímto způsobem je možno odstranit větší počet aminokyselin bílkoviny od Nterminálního zakončení působením exopeptidázy, s výhodou leucinpeptidázy, a to až k řetězci X-Pro. Řetězec X-Pro je pak možno odstranit buď ve dvou stupních nebo v jediném stupni při použití postprolindipeptidylaminopeptidázy (EC 3.4.14). Tento postup však má tu nevýhodu, že postupným odštěpením aminokyselin od N-terminálního zakončení nevzniká jednotný produkt,
-2CZ 284774 B6 nýbrž vždy směs produktů, protože vzhledem ktypu štěpení se ve směsi vyskytují jak neúplně rozštěpené, tak příliš rozštěpené bílkoviny.
Další postup pro enzymatické štěpení složených bílkovin byl popsán v evropském patentovém spisu 20 290. Při tomto postupu se užívá enzym kolagenáza k odštěpení části složené bílkoviny od určitého řetězce. Pak je možno odstranit další aminokyseliny dalším enzymatickým štěpením. Bylo zjištěno, že kolagenáza a také jiné endopeptidázy jsou jen málo specifické, jak bylo uvedeno v publikaci Biochem. Biophys, Acta 271 (1972), 133-144. Mimoto jsou kolagenázy účinné jen u bílkovin, které mají specifickou prostorovou strukturu.
Také použití již uvedeného faktoru Xa k odštěpení N-terminální části složené bílkoviny je známé. I tento postup však má kromě účinnosti štěpení další nevýhody, zejména může dojít k rozštěpení i uvnitř řetězce bílkoviny. Mimoto je nutno faktor Xa izolovat ze séra skotu, takže je zejména při štěpení bílkovin, určených pro léčebné použití, nutné další obtížné čištění a použít je zapotřebí také analytických postupů ke zjištění případně přítomných patogenních faktorů nebo virů.
Různé patogenní druhy bakterií, například z čeledi Neisseria, jako Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis, nebo z čeledi Haemophilus, jako Heamophilus influenzae a Heamophilus aegypticus, které rostou na sliznicích u lidí, vylučují proteázy, blízce příbuzné svými řetězci, které jsou specifické pro lidský IgAl a označují se proto jako IgA-proteázy nebo igázy. Imunoglobulin IgAl je důležitá složka sekretorické imunologické odpovědi, která chrání proti infekci těmito patogenními organismy, přehled tohoto problému je uveden v publikaci Komfeld a Plaut, Rev. Infect. Dis. 3 (1981), 521-534. Mimoto štěpí IgA-proteáza také svou vlastní bílkovinu, která je jejím prekurzorem, a to autoproteolýzou. Tvorba IgA-proteázy z Neisseria gonorrhoeae MS 11 v autentickém bakteriálním kmenu i v gram-negativních produkčních buňkách již byla popsána v patentovém spisu DE 36 22 221.6.
IgA-proteáza štěpí následující rozpoznávací řetězce, jak bylo popsáno například v publikaci Pohlner a další, Nátuře 325 (1987), 458-462.
1. Pro-Ala-Pro./.Ser-Pro
2. Pro-Pro./.Ser-Pro
3. Pro-Pro./.Ala-Pro
4. Pro-Pro./.Thr-Pro
V těchto řetězcích znamená symbol ./. vždy místo štěpení působením IgA-proteázy. Klonování tohoto enzymu bylo popsáno například ve svrchu uvedené publikaci Pohlner a další, 1987.
Vynález si klade za úkol navrhnout dokonalejší postup pro biochemické (enzymatické) štěpení složených bílkovin tak, aby genetickou technologií získané složené bílkoviny, tvořené libovolnými částmi se specifickým místem štěpení v přechodové části, mohly být substrátem pro získání požadovaných bílkovin, a to reprodukovatelně při pokud možno vysokém výtěžku.
Podstata vynálezu
Způsobem podle vynálezu je tento úkol genetickou technologií vyřešen zavedením rozpoznávacího místa nebo místa štěpení Pro./.X-Pro do přechodové oblasti mezi oběma částmi specifické bílkoviny s následným specifickým rozštěpením tohoto řetězce působením IgA-proteázy v místě, označeném ./., přičemž X s výhodou znamená aminokyseliny ze skupiny Ser, Thr a Ala, zvláště
Ser nebo Thr, může však být užito i jiných aminokyselin.
-3 CZ 284774 B6
Podstata vynálezu tvoří způsob enzymatického štěpení bílkovin a získávání požadovaných částí těchto složených bílkovin. Postup spočívá v tom, že se
1) modifikuje pomocí genetické technologie přechodná oblast, jíž jsou spojeny dvě části složené bílkoviny takovým způsobem, že se do této oblasti uloží alespoň jedno rozpoznávací místo pro IgA-proteázu s řetězcem Y-Pro./.X-Pro, v němž X znamená libovolnou aminokyselinu a Y znamená nosnou část složené bílkoviny, obsahující 1 až 100 aminokyselin a končící řetězcem Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Arg-Pro nebo Pro-Ala-ProArg-Pro,
2) složená bílkovina, získaná v předchozím stupni, se štěpí IgA-proteázou v rozpoznávacím řetězci v místě, které je označeno ./., a
3) po rozštěpení se izoluje jedna nebo větší počet požadovaných částí složené bílkoviny.
Pod pojmem „IgA-proteáza“ se ve smyslu vynálezu rozumí proteázy, které specificky štěpí IgA, tak jak byly popsány například vRev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534. Stejně jsou vhodné také rekombinantní IgA-proteázy, tak jak byly uvedeny například v DE-A 36 22 221, Proč. Nati. Acad. Aci. USA 79 (1982) 7881 - 7885, Proč. Nati. Acad. Aci. USA 80 (1983) 2681-2685, Nátuře 325 (1987) 458-462 a EMBo Jour. 3 (1984) 1595-1601.
Při provádění způsobu podle vynálezu se modifikace přechodové oblasti složených bílkovin s výhodou provádí tak, že se do přechodové oblasti složené bílkoviny zabuduje nukleotidový řetězec, který je kódem pro rozpoznávací místo IgA-proteázy nebo pro jeho část, přičemž tento nukleotidový řetězec může být zabudován před a/nebo za jeden nebo větší počet kódových řetězců pro požadovanou bílkovinu. S výhodou se užívá k tomuto účelu nukleotidových řetězců, syntetizovaných chemicky.
Neočekávaně bylo zjištěno, že tento způsob je vhodný také pro štěpení složených bílkovin, které původně, tj. před modifikací přechodové oblasti, neobsahovaly žádné přírodní místo pro štěpení IgA-proteázou.
Rozpoznávací místo pro působení IgA-proteázy spočívá v řetězci aminokyselin Y-Pro./.X-Pro. V tomto řetězci X znamená libovolnou aminokyselinu a Y znamená jednu nebo větší počet libovolných aminokyselin. S výhodou X znamená serin, threonin nebo alanin, zejména serin nebo threonin. Y s výhodou znamená větší počet aminokyselin, které končí Pro, Pro-Ala, ArgPro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro nebo Pro-Ala-Pro-Arg-Pro.
Způsob podle vynálezu zajišťuje zabudování rozpoznávacího místa pro IgA-proteázu s alespoň následujícím štěpným řetězcem Pro./.-X-Pro do přechodové oblasti, například mezi nosnou bílkovinou a požadovanou bílkovinou. Způsob je možno využít k rozštěpení složené bílkoviny a izolaci požadované bílkoviny. Ve štěpeném řetězci Pro./.-X-Pro znamená X s výhodou aminokyseliny Ser, Ala nebo Thr. K. další optimalizaci štěpení v uvedeném místě je možno zařadit před štěpný řetězec další specifické aminokyseliny, zejména aminokyselinu Pro.
Zvláště vhodné pro následující řetězce aminokyselin:
a) Pro-Ala-Pro./.Ser-Pro,
b) Pro-Pro./.Ser-Pro,
c) Pro-Arg-Pro-Pro./.Ala-Pro,
d) Pro-Pro./.Thr-Pro,
e) Ala—Pro-Arg-Pro-Pro./.Thr-Pro nebo
f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.-Thr-Pro.
-4CZ 284774 B6
Při použití způsobu podle vynálezu ke štěpení složených bílkovin, v nichž je požadovaná bílkovina zařazena za nosnou bílkovinu, vzniká po rozštěpení Iga-proteázou bílkovina, jejíž aminoterminální zakončení končí řetězcem X-Pro. Tento řetězec může být vhodný, nevhodný nebo nemusí mít žádný význam. Výhodný je tento řetězec obecně vtom případě, když požadovaná bílkovina, získaná genetickou technologií, má také ve své přírodní formě uvedené aminokyseliny X-Pro na svém aminoterminálním zakončení. Tento typ bílkovin, důležitých z biotechnologického hlediska, se v přírodě skutečně vyskytuje.
Způsob podle vynálezu má ve srovnání se známými postupy pro štěpení složených bílkovin tu výhodu, že je univerzálně použitelný pro složené bílkoviny, které obsahují ve své přechodové oblasti svrchu uvedený štěpný řetězec, mimoto je způsob možno použít jak pro nerozpustné, tak pro rozpustné bílkoviny a také pro složené bílkoviny, které jsou spojeny s membránami nebo vázány na buňku. Zvláštní výhodou je možnost, že je možno štěpit složené bílkoviny ve formě inkluzních tělísek, tak jak se vyskytují u mikroorganismů, z nichž je možno je snadno získat. Další výhodou postupu je skutečnost, že užitý štěpný enzym je možno bez velkých časových nákladů získat ze živného prostředí nepatogenních bakterií.
Vestavba štěpného řetězce pro igázu do přechodové oblasti složené bílkoviny se provádí genetickou technologií. Je například možno syntetizovat řetězec nukleotidů, který je kódem pro štěpný řetězec nebo jeho část, a pak jej zařadit mezi části řetězce DNA pro nosnou bílkovinu a pro požadovanou bílkovinu známými prostředky v genetické technologii. Odpovídajícím způsobem je možno zařadit také přírodní řetězec nukleotidů pro štěpný řetězec nebo jeho část. Gen, který je kódem pro složenou bílkovinu, se s výhodou vytvoří pod kontrolou vhodných signálů pro expresi, s výhodou podléhajících indukci, takže je umožněna tvorba složené bílkoviny. Jako produkční buňky je možné použít vhodné prokaryotické nebo eukaryotické (rostlinné nebo živočišné) buňky, je však možno užít také bezbuněčné systémy. Nosné bílkoviny mohou obsahovat nejrůznější funkce podle požadovaných vlastností složené bílkoviny, jako je transport, biologická funkce, avšak také možnost pozdějšího čištění nebo stálost a podobně. Vhodné nosné bílkoviny budou uvedeny později.
Způsob podle vynálezu se provádí při použití igázy, vytvořené nepatogenním bakteriálním kmenem a získané čištěním živného prostředí, například podle DE-36 22 221.
Způsob podle vynálezu je možno využít pro preparativní i pro analytické účely. Při preparativním použití slouží postup k získání bílkovin, důležitých z biotechnologického hlediska, například v lékařství, ve výzkumu, při ochraně životního prostředí nebo při provádění průmyslových postupů. Při analytickém použití je možno postup použít ve spojení s vhodným systémem pro expresi k běžnému vyšetřování složených genů.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu pro enzymatické štěpení složených bílkovin a získávání požadovaných částí těchto bílkovin se postupuje tak, že
1) buňka se transformuje rekombinantní DNA nebo rekombinantním vektorem, přičemž tato DNA nebo tento vektor obsahují alespoň jednu kopii genu, který je kódem pro složenou bílkovinu, obsahující ve své přechodové oblasti alespoň jedno rozpoznávací místo pro štěpení IgA-proteázou,
2) transformovaná buňka se pěstuje ve vhodném prostředí,
3) indukuje se exprese genu pro složenou bílkovinu v transformované buňce,
4) získaná složená bílkovina se rozštěpí IgA-proteázou, a
5) izoluje se jeden nebo větší počet požadovaných podílů složené bílkoviny.
-5CZ 284774 B6
Působení IgA proteázy na složenou bílkovinu je možno uskutečnit přímo ve fermentačním prostředí, po rozrušení buněk a/nebo po částečném nebo úplném oddělení buněčných bílkovin.
Pro zpracování složené bílkoviny, zejména ve formě produktu exprese prokaryotických organismů, je dále vhodné imobilizovat IgA-proteázu známým způsobem, například podle EPB 0 141 223 nebo EP-B 0 141 224.
Způsob podle vynálezu je možno s výhodou použít k získávání rekombinantních bílkovin a peptidů bez N-terminálního methioninového zbytku ze složených bílkovin nebo peptidů s řetězcem Met-Y-Pro./.X-Pro-A, kde X znamená libovolnou aminokyselinu, s výhodou Thr, Ala nebo Ser, Y znamená jednu nebo větší počet libovolných aminokyselin, a to řetězec, který v případě, že X znamená Thr nebo Ala, končí aminokyselinou Pro, a v případě, že X znamená Ser, končí skupinou Pro-Ala nebo Pro-Pro, A znamená libovolný řetězec aminokyselin. Při štěpení složené bílkoviny nebo peptidů působením IgA-proteázy se získá štěpný produkt s řetězcem X-Pro-A. Tento postup je například vhodný pro získání rekombinantních bílkovin z prokaryotických buněk bez N-terminálního methioninového zbytku v následujících stupních:
1) prokaryotická buňka se transformuje genem, který je kódem pro bílkovinu nebo peptid s řetězcem aminokyselin Met-Y-Pro./.Y-Pro-A, kde X, Y a A mají svrchu uvedený význam,
2) transformovaná buňka se pěstuje ve vhodném prostředí, přičemž dojde k expresi transformovaného genu,
3) produkt exprese z transformované buňky se štěpí IgA-proteázou v řetězci aminokyselin Met-Y-Pro./.X-Pro-A, a
4) výsledné štěpné produkty s řetězcem aminokyselin X-Pro-A bez N-terminálního methioninového zbytku se izolují.
Způsob podle vynálezu je možno v překvapivě vysokém výtěžku a s dobrou specifičností získat v jediném stupni bílkoviny bez N-terminálního methioninového zbytku. Tyto bílkoviny mají Nterminální řetězec X-Pro, v němž X s výhodou znamená Thr, Ala nebo Ser.
Nosná část Y složené bílkoviny obsahuje alespoň jednu, s výhodou až 100 aminokyselin, zvláště 1 až 50 aminokyselin, bílkovina končí štěpným řetězcem pro IgA-proteázy. V případě, že X znamená serin, končí Y s výhodou řetězcem Pro-Ala nebo Pro. V případě, že X znamená Thr nebo Ala, končí Y s výhodou Pro a zvláště Arg-Pro, Pro-Arg-Pro nebo Ala-Pro-Arg-Pro.
Ve zvláště výhodném provedení znamená Y alespoň pět aminokyselin, které končí řetězcem ProAla-Pro-Arg-Pro. Pro způsob podle vynálezu jsou však vhodné všechny štěpné řetězce pro štěpení IgA-proteázou.
Nosná část Y může obsahovat ještě další libovolné kyseliny, s výhodou až 100 a zvláště až 50 aminokyselin. S výhodou se však v tomto případě užívá takových řetězců aminokyselin, které na úrovni DNA zlepšují expresi bílkoviny Met-Y-Pro./.X-Pro-A a/nebo na úrovni aminokyselin zlepšují izolaci z buňky a čištění.
Expresi bílkoviny Met-Y-Pro./.X-Pro-A na úrovni DNA je možno zlepšit například spojením s fragmenty genu pro β-galaktosidázu, to znamená, že nosná část Y obsahuje část β-galaktosidázy. Další možnosti, jak zvýšit expresi uvedené bílkoviny, jsou v oboru známy. Spojením s dalšími polypeptidy, například s peptidy, které mají řetězce poly(Lys, Arg) nebo peptidy, které se váží na určité látky s vysokou afinitou, například streptavidin, je možno usnadnit čištění a izolaci produktu exprese, jak bylo popsáno například v EP-A 0 089 626, EP-A 0 036 510.
-6CZ 284774 B6
Předmětem vynálezu je rovněž složená bílkovina, která obsahuje větší počet polypeptidových částí a která obsahuje v alespoň jedné přechodové oblasti mezi různými částmi jedno nebo větší počet rozpoznávacích míst pro IgA-proteázu s řetězcem Pro./.X-Pro, v němž X znamená libovolnou aminokyselinu, s výhodou Ser, Thr nebo Ala. Zvláště vhodné jsou jako rozpoznávací místo řetězce aminokyselin
a) Pro-Ala-Pro./.Ser-Pro,
b) Pro-Pro./.Ser-Pro,
c) Pro-Arg-Pro-Pro./.Ala-Pro,
d) Pro-Pro./.Thr-Pro,
e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.Thr-Pro nebo
f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.Zhr-Pro.
Vynález se týká také bílkoviny nebo peptidu s řetězcem aminokyselin Met-Y-Pro./.X-Pro-A, kde X s výhodou znamená Thr, Ala nebo Ser, Y znamená jednu nebo větší počet libovolných aminokyselin a s výhodou v případě, že X znamená Thr nebo Ala, končí Y aminokyselinou Pro, a v případě, že X znamená Ser, končí Y řetězcem Pro-Ala nebo Pro, a A znamená libovolný řetězec aminokyselin. Tento peptid nebo bílkovina se získají transformací prokaryotické buňky pomocí rekombinantního vektoru, který obsahuje alespoň jednu kopii genu pro uvedenou bílkovinu nebo peptid, s následnou expresí tohoto genu.
Řetězec A může znamenat libovolný řetězec aminokyseliny. S výhodou se však uvnitř tohoto řetězce již nenachází žádné další štěpné místo pro IgA-proteázu.
Předmětem vynálezu je rovněž rekombinantní DNA, která je kódem pro bílkovinu nebo peptid podle vynálezu a která obsahuje alespoň jednu přechodovou oblast s jedním nebo větším počtem štěpných míst pro IgA-proteázu.
Rekombinantní DNA podle vynálezu je možno získat postupy molekulární biologie. K tomuto účelu se obvykle rozštěpí vektor, obsahující kódový řetězec pro řetězec aminokyselin A, působením restrikční endonukleázy v oblasti 5’-zakončení tohoto genu a naváže se oligonukleotid nebo oligonukleotidy s požadovaným řetězcem. Oligonukleotid musí obsahovat řetězec, který je kódem pro místo štěpení IgA-proteázou nebo pro jeho část.
Předmětem vynálezu je rovněž rekombinantní vektor, který obsahuje alespoň jednu kopii rekombinantní DNA podle vynálezu. Základní vektory pro expresi bílkovin v prokaryotických organismech jsou známé. S výhodou se užije vektor, který dovoluje vysokou expresi rekombinantní DNA. Do vektoru je rekombinantní DNA s výhodou zařazena pod řízením indukovatelného signálu pro expresi, například promotoru lambda, tac, lac nebo trp.
Vektor podle vynálezu může být integrován do produkčního organismu extrachromozomálně (například plazmid) nebo také do genomu organismu (například bakteriofág lambda). S výhodou je vektorem plazmid. Vektory, vhodné pro expresi v určitém cílovém organismu, jsou odborníkům v molekulární biologii známé. Může jít o aukaryotický, s výhodou však o prokaryotický vektor. Příkladem pro vektory, použitelné k expresi DNA podle vynálezu v prokaryotických buňkách, mohou být běžně dodávané vektory pUC- a pUR.
Předmětem vynálezu je rovněž buňka, s výhodou prokaryotická buňka, zvláště buňka E. coli, transformovaná rekombinantní DNA podle vynálezu a/nebo vektorem podle vynálezu.
Příkladem bílkovin s N-terminálním zakončením X-Pro, v němž X znamená Thr, Ala nebo Ser a které je možno získat způsobem podle vynálezu v jediném stupni, mohou být lidský erythropoetin, řetězec beta lidského receptoru T-buněk a zejména lidský faktor, stimulující granulocyty (G-CSF).
-7CZ 284774 B6
G-CSF je syntetizován jako lymfokin z aktivovaných monocytů, makrofágů a řady dalších buněčných linií. Lymfokiny se účastní zrání buněk imunologického a krevního systému. Stimulují zrání kmenových buněk v kostní dřeni a jejich diferenciaci. Tak indikuje G-CSF například tvorbu neutrofilů a granulocytů.
Vzhledem ktomu, že G-CSF může zajistit v krátké době podstatné zvýšení množství neutrofilních buněk, má tato látka široké léčebné použití. Je možno ji užít například po chemoterapii zhoubných nádorů, při níž byly sníženy buňky imunologického systému. Dále je možno tuto látku užít při transplantacích kostní dřeně, u těžkých popálenin, při leukémii a v případě náhodných infekcí u lidí se zeslabeným imunologickým systémem.
G-CSF je bílkovina, která je z buňky vylučována. Primární produkt translace tedy obsahuje Nterminální signální řetězec, který je při sekreci odštěpen, takže řetězec G-CSF pak začíná aminokyselinami Thr(+l)-Pro(+2). Při výrobě uvedené látky v prokaryotických organismech se tento signální peptid odštěpuje neúplně nebo se vůbec neodštěpuje, takže k získání G-CSF z těchto organismů bez signálního řetězce je nutno klonovat AUG(Met) jako iniciační kodon před začátkem řetězce DNA, který je kódem pro G-CSF. V důsledku toho dochází v prokaryotických organismech, jako E. coli, k expresi G-CSF s methioninem jako aminokyselinou v poloze -1.
Způsobem podle vynálezu je možno získat G-CSF, prostý methioninového zbytku v poloze -1 z prokaryotických organismů tak, aby řetězec začínal aminokyselinami Thr(+l)-Pro(+2) jednoduchým způsobem.
Tento postup je možno uskutečnit tak, že se vytvoří v prokaryotickém organismu derivát G-CSF, který obsahuje v poloze +1 a +2 řetězec Thr-Pro a před ním od polohy -1 řetězec aminokyselin, který je štěpným místem pro IgA-proteázu a který je možno odštěpit od řetězce, začínajícího aminokyselinami Thr(+l)-Pro(+2).
Ve výhodném provedení obsahuje derivát v poloze -1 i -2 Pro, v polohách -3 až -1 řetězec aminokyselin Arg-Pro-Pro, v poloze -4 až -1 řetězec Pro-Arg-Pro-Pro nebo v polohách -5 až -1 řetězec Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.
Ve zvláště výhodném provedení obsahuje derivát v polohách -6 až -1 následující řetězec:
-6 -5 -4 -3 -2 -1
Pro-Ala-Pro-Art-Pro-Pro.
Pod pojmem G-CSF se ve smyslu vynálezu rozumí přírodně se vyskytující G-CSF, jehož řetězec byl uveden například v Science 232 (1986) 61, a také odvozené deriváty s účinností, stimulující granulocyty, jejichž řetězec aminokyselin začíná X(+l)-Pro(+2). X znamená Thr, Ser nebo Ala, zvláště Thr.
Derivát G-CSF podle vynálezu je možno po expresi v prokaryotických organismech rozštěpit působením IgA-proteázy mezi polohami +1 a -1, tj. mezi Thr(+1) a Pro(-l). Tímto způsobem se získá hydrolýzou v jediném stupni G-CSF, prostý methioninového zbytku v poloze -1, jehož Nterminální zakončení začíná aminokyselinami Thr(+l)-Pro(+2) přírodního řetězce.
Při expresi G-CSF v prokaryotických organismech se tvoří nesnadno rozpustné agregáty, tak zvaná refraktivní tělíska, která jsou neaktivní. Než je možno bílkovinu užít například k léčebným účelům, je nutno ji převést na účinnou formu. Způsobem, který je v oboru znám například z EPA 0 219 874, EP-A 0 114 506, WO 84/03711, se nejprve materiál solubilizuje přidáním denaturačních prostředků, načež se provádí renaturace a popřípadě se materiál dále čistí. Zpracování bílkoviny podle vynálezu působením IgA-proteázy je možno uskutečnit před solubilizací, po ní
-8CZ 284774 B6 nebo až po renaturaci. V případě, že působení IgA-proteázou má být provedeno přímo po solubilizaci, musí být prostředek, použitý pro solubilizaci, například guanidinhydrochlorid nebo močovina, odstraněn před přidáním IgA-proteázy dialýzou. S výhodou se působení IgAproteázy provádí až po renaturaci, protože v tomto případě je možno dosáhnout zvláště vysokého 5 výtěžku G-CSF.
Podmínky pro působení IgA-proteázy na G-CSF nebo jinou bílkovinu, která má být rozštěpena, nejsou příliš kritické. Je však výhodné užít G-CSF nebo jinou bílkovinu a IgA-proteázu v hmotnostním poměru 1:1 až 100: 1. Reakce se s výhodou provádí ve vodném roztoku 10 s obsahem pudru při pH 6,5 až 8,5. Koncentrace pufru se s výhodou pohybuje v rozmezí 50 až
300 mmol/1, popřípadě s přísadou 20 až 100mmol/l chloridu sodného. Štěpení se s výhodou provádí 20 až 60 minut při teplotě místnosti.
Po solubilizaci, renaturaci a rozštěpení působením IgA-proteázy se získaný štěpný produkt čistí, 15 s výhodou na iontoměniči, a pak se podrobí frakcionací podle velikosti. Znečištěniny v takto získaném G-CSF, prostém methioninu v poloze -1, jinými bílkovinami jsou pod 0,1% s výhodou pod 10'3 %.
G-CSF, prostý methioninu v poloze -1, je možno získat štěpením pomocí IgA-proteázy v 20 prakticky kvantitativním výtěžku ze složené bílkoviny, která methionin obsahuje.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat rekombinantní G-CSF z prokaryotických organismů tak, že tato látka je znečištěna pouze 0,1 %, s výhodou méně než 10'3 % jiných bílkovin a je kvantitativně prostá G-CSF z prokaryotických organismů, obsahujících v poloze 1 25 methionin.
Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek na bázi G-CSF, který byl získán z prokaryotických organismů způsobem podle vynálezu. Farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují tuto látku jako takovou nebo spolu s běžnými farmaceutickými nosiči a pomocnými 30 látkami. Tyto farmaceutické prostředky jsou vhodné zejména k léčebnému použití u stavů, při nichž má být zvýšeno množství granulocytů, zvláště neutrofilů.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou s výhodou injekční nebo infuzní roztoky. Může jít o roztoky, připravené pro podání, nebo také o lyofilizovaný materiál. Tento materiál se pak 35 pomocí nosného prostředí nebo roztoků rekonstituuje na injekční roztok. Z injekčních prostředí je vhodná zejména voda a další přísady, jako stabilizátory, látky, napomáhající rozpuštění, pufry a látky, zajišťující izotonický roztok, například chlorid sodný. Dalšími vhodnými přísadami jsou mannit, vinanový nebo citrátový pufr, ethanol, komplexotvomé látky, jako kyselina ethylendiaintetraoctová a její netoxické soli, jakož i vysokomolekulámí polymery, jako kapalný 40 polyethylenoxid k úpravě viskozity. Kapalné nosné látky pro injekční roztoky musí být sterilní a prostředky se s výhodou plní do ampulí.
Vynález se rovněž týká použití G-CSF, prostého methioninu v poloze -1, z prokaryotických buněk k výrobě farmaceutických prostředků.
V případě, že se při štěpení složené bílkoviny způsobem podle vynálezu získá jako výsledný produkt bílkovina X-Pro-A, kde X znamená libovolnou aminokyselinu a A libovolný řetězec aminokyselin, avšak produkt obsahuje na aminoterminálním zakončení nežádoucí dipeptid X-Pro, je možno tento nežádoucí dipeptid v rámci způsobu podle vynálezu odstranit dalším 50 zpracováním pomocí dipeptidylaminopeptidáz (DPAP). Tyto enzymy byly až dosud prokázány u řady mikroorganismů, hmyzů, obojživelníků a v různých lidských tkání. Slouží například k postupnému zpracování různých prekurzorů a z části mají vyjádřenou specifičnost pro odbourání dipeptidu X-Pro na aminoterminální zakončení (X-Pro-DPAPáza, G. Kreil, Trends in
-9CZ 284774 B6
Biochemical Sciences 15, 23-26, 1990). Kombinací igázy a X-Pro-DPAP podle vynálezu je možno získat požadované bílkoviny s libovolnými aminoterminálními aminokyselinami.
Svrchu uvedenou kombinací obou enzymů je nyní možné získat také bílkoviny s jiným N-terminálním zakončením z prokaryotických organismů, přičemž tyto látky jsou prosté methioninu v poloze -1. Postupuje se tak, že se nejprve získá složená bílkovina s obsahem řetězce Met-YPro./.X-Pro-A, přičemž v tomto případě je řetězec A bez obou N-terminálních aminokyselin X— Pro tou látkou, jejíž exprese je požadována.
Produkt exprese v prokaryotické buňce s řetězcem aminokyselin Met-Y-Pro./.X-Pro-A se nejprve štěpí působením IgA-proteázy, takže vzniká první štěpný produkt s řetězcem X-Pro-A.
Tuto bílkovinu je pak možno svrchu uvedeným způsobem zpracovat působením dipeptidylaminopeptidázy, která specificky štěpí řetězec X-Pro za Pro. Tímto způsobem vzniká druhý štěpný produkt s libovolným řetězcem aminokyselin A. Způsob podle vynálezu je tedy možno využít pro výrobu nejrůznějších bílkovin bez N-terminálního methioninového zbytku, způsob nebo omezen pouze na výrobu bílkovin s N-terminálním řetězcem X-Pro, v němž X s výhodou znamená Ser, Thr, Ala.
Konečně se vynález týká také rekombinantní DNA, která obsahuje oblast, která je kódem pro svrchu uvedený štěpný řetězec pro IgA-proteázu a která je vhodná pro zabudování do přechodné části složené bílkoviny. S výhodou jde o chemicky syntetizovaný fragment DNA, na jehož koncích se s výhodou nachází jedno nebo větší počet míst působením restrikčních endonukleáz.
Vysvětlení některých pojmů
Způsob podle vynálezu se týká biotechnologického získávání požadovaných bílkovin. Pod tímto pojmem se rozumí, že se postup pro získání těchto látek nebo jejich meziproduktů provádí při použití prostředků genetické technologie a při použití dalších biotechnologických postupů, například fermentace mikroorganismů.
Požadovanou bílkovinou je meziprodukt nebo výsledný produkt, který může být použit například v lékařství, výzkumu, při ochraně životního prostředí nebo při provádění průmyslových postupů.
Při provádění způsobu podle vynálezu se požadovaný produkt nachází ve složené bílkovině. Pod tímto pojmem se rozumí bílkovina, tvořená větším počtem kovalentně vázaných částí. Alespoň jednou z těchto částí je požadovaná bílkovina. Pořadí jednotlivých částí a jejich případné opakování ve složené bílkovině je libovolné, s výhodou je však složená bílkovina na svém aminoterminálním zakončení tvořena nosnou bílkovinou a na karboxyterminálním zakončení požadovanou bílkovinou.
Nosná bílkovina nebo nosná část slouží k tomu, aby požadovaná bílkovina nabývala ve formě složené bílkoviny zvláštních vlastností. Může například jít o vyšší stálost, například výše odolnost proti buněčným proteázám. Mimoto mohou být v nosné bílkovině obsaženy vlastnosti, které dovolují účinné čištění složené bílkoviny. Jde například o vazbu určitých ligandů v souvislosti s metodami afinitní chromatografie, o ukládání složené bílkoviny do inkluzních tělísek, snadno izolovatelných, a o transport bílkovin na dobře přístupná místa.
Oblast složené bílkoviny, v níž dochází k vazbě složek, tj. nosné bílkoviny a požadované bílkoviny, se nazývá přechodná oblast.
Každá přechodná oblast může být definována jedním nebo větším počtem řetězců aminokyselin.
Tyto řetězce se odečítají a vytváří od aminoterminálního zakončení (vlevo) ve směru ke karboxyterminálnímu zakončení (vpravo).
-10CZ 284774 B6
V rámci způsobu podle vynálezu obsahují tyto přechodové části řetězce aminokyselin, představující místo štěpení IgA-proteázami, tj. štěpné řetězce.
Místo štěpení je to místo mezi dvěma aminokyselinami v řetězci aminokyselin, na němž dochází k rozštěpení složené bílkoviny.
Způsob podle vynálezu zahrnuje enzymatické štěpení složených bílkovin v přechodné oblasti působení IgA-proteázy. V rámci vynálezu se pod pojmem IgA-proteáza nebo igáza rozumí tento enzym z kmene Neisseria gonorrhoeae a všechny ostatní enzymy, používané obdobným způsobem na úrovni nukleotidů. Jde zejména o enzymy z rodů Neisseria a Haemophilus.
Mikroorganismus E. coli ED 8654 byl uložen pod číslem DSM 2102 ve veřejné sbírce Deutschen Sammlung fur Mikroorganismem, Griesebachstrasse 8, 3400 Góttingen.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady v souvislosti s přiloženými výkresy.
Na obr. 1 je schematicky znázorněna složená bílkovina, která je tvořena jako nosnou bílkovinou MS2-polymerázou (99 aminokyselin), druhou bílkovinou je β-oblast (aminokyseliny 1195— 1505) prekurzoru IgA-proteázy z N. gonorrhoeae MS 11. Přechodná oblast mezi oběma částmi je tvořena 12 aminokyselinami a obsahuje štěpný řetězec Pro-Pro./.Thr-Pro- pro igázu. Pro konstrukci štěpného místa byly vestavěny čtyři oligonukleotidy 1 až 4 mezi místo působení restrikčních enzymů Eco RI a HindlII. Získání polypeptidu a rozštěpení čištění ligázou je podrobněji vysvětleno v příkladu 5.
Na obr. 2 je znázorněna složená bílkovina, která je tvořena nosnou bílkovinou jako na obr. 1 (99 aminokyselin MS2-polymerázy a 6 aminokyselin, pro něž je kódem plazmid), druhou částí je 206 aminokyselin bílkoviny CD8 z lidských T-lymfocytů. V této části se nachází přírodní štěpný řetězec, který je možno rozštěpit působením igázy, jak bude dále podrobněji vysvětlen v příkladu 6.
Na obr. 3 je znázorněna složená bílkovina B63x, která byla získána pomocí exprese a sekrece při použití buněčného systému z E. coli. Na aminoterminálním zakončení je tato bílkovina tvořena pod jednotkou B choleratoxinu (103 aminokyselin), pak následuje spojovací oblast (11 aminokyselin) se štěpným místem pro igázu a na karboxyterminálním zakončení (aminokyseliny 1097 - 1160) se nachází β-oblast prekurzoru IgA-proteázy. Místo štěpení pro igázu bylo vestavěno mezi obě bílkoviny pomocí oligonukleotidů Tk006 a Tk007.
Na obr. 4 je schematicky znázorněna dvojice složených bílkovin B49 a B59. Tyto bílkoviny jsou tvořeny podjednotkou choleratoxinu B a β-oblastí prekurzoru IgA-proteázy. Mezi těmito podíly se nacházejí dvě různé přechodové oblasti se dvěma různými řetězci pro štěpení igázou, a to -Pro-Pro-Ala-Pro- a -Pro-Pro-Thr-Pro-. Štěpný řetězec byl zkonstruován pomocí syntetických oligonukleotidů stejně jako na obr. 3.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce plazmidu pro expresi G-CSF, prostého methioninu
Konstrukce se provádí při použití vektoru pro expresi pPZ07-mgllac (WO 88/09373). K tomuto účelu se uvedený vektor rozštěpí enzymem Nco I a zbývající konce se odstraní nukleázou z bodů.
-11CZ 284774 B6
Pak se vektor dále štěpí enzymem Bam HI a řetězec pro štěpení enzymem IgA se na úrovni DNA připraví přes následující oligonukleotidy.
Oligonukleotid A:
5’ AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTF GGC CCT G 3’
Oligonukleotid B:
5’ GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT TAA TTT TTC CTC CGAATT3’
Oba oligonukleotidy se společně použijí v ekvimolámím množství v přibližně stonásobném přebytku vzhledem ke svrchu uvedenému rozštěpenému vektoru. Po opětné vazbě se transformují obvyklým způsobem buňky E. coli K12. Pk se rovněž známým postupem DNA z buněk izoluje a rozštěpí se pomocí enzymů Apa I a Bam HI. Fragment G-CSF o velikosti přibližně 520 pb se izoluje při použití restrikčních endonukleáz Apa I a Bam HI z řetězce G-CSF podle publikace Science 232 (1986), 61 - 65. Tento fragment se pak naváže na vektor, rozštěpený enzymy Apal a BamHI.
Příklad 2
Kromě štěpného řetězce pro enzym IgAl může složená bílkovina obsahovat ještě peptidy, které usnadňují čištění. Tyto peptidy je možno získat pomocí DNA, která je kódem pro streptavidin. K tomuto účelu se gen pro straptavidin (WO 89/03422) klonuje ve správné poloze pro translaci před štěpným řetězcem pro IgA-proteázu.
Příklad 3
Pomocí plazmidu, který byl popsán v příkladu 1, se transformují buňky E. coli K12 (ED 865, DSM 2102), tyto buňky se pak podrobí selekci pomocí značení antibiotikem (Ampicillin) a plazmid se charakterizuje analýzou pomocí restrikčních enzymů. Jeden z klonů se snižuje pro zmnožení a expresi G-CSF. K tomuto účelu se buňky uloží do plného prostředí, které v jednom litru obsahuje 16 g Bactotryptonu (Difco), 10 g extraktu z kvasnic (Difco) a 5g chloridu sodného. Buňky se nechají růst až do optické hustoty OD546 2,0 a pak se exprese indukuje přidáním 10‘3 mol/1 IPTG. Po dalších 4 hodinách se buňky oddělí odstředěním, rozštěpí směsí lysozymu a EDTA a G-CSF se izoluje jako inkluzní tělíska (IB, EP-A 0 219 874).
Denaturace, popřípadě renaturace izolovaných nerozpustných podílů G-CSF se provádí podle EP-A 0 219 874. Denaturace se provádí dialýzou proti 6 mol/1 guanidinhydrochloridu. Je možno odebrat určitý podíl a po dialýze proti 5 mmol/1 pufru s fosforečnanem draselným o pH 7 jej užít pro štěpení pomocí IgA-proteázy (příklad 4).
Denaturaci je možno provádět také v guanidinhydrochloridu dialýzou proti 5 mmol/1 fosforečnanu draselného o pH 7 s obsahem 1 mmol/l GSH a 3 mmol/1 GSSG. Po renaturaci se pak provádí dialýza proti 5 mmol/1 pufru s fosforečnanem draselným o pH 7.
-12CZ 284774 B6
Příklad 4
Štěpení složení bílkoviny IgAl-proteázou k získání nativního G-CSF bez methioninového zbytku v poloze -1
IgAl-proteáza se izoluje způsobem, popsaným v EMBO Jour. 3 (1984), 1595 - 1601. K 10 pg G-CSF po renaturaci nebo denaturaci podle příkladu 3 se přidá 2 až 5 pg IgA-proteázy a směs se inkubuje 30 minut při teplotě místnosti. G-CSF, prostý methioninu je možno izolovat na různých iontoměničových sloupcích, například Mono-Q nebo Mono-S. Analýzou řetězce bílkoviny na aminoterminálním zakončení je možno prokázat, že čištění G-CSF začíná správným řetězcem aminokyselin Thr(+l)-Pro(+2).
Příklad 5
Výroba složené bílkoviny a štěpení nerozpustných agregátů bílkovin z inkluzních tělísek na štěpném místě, specifickém pro igázu
Vektor pro expresi u prokaryotických organismů pEX31C, popsaný vK. Strebel, Joumal of Virology 57, 983 - 991, 1986, se modifikuje takovým způsobem, aby složená bílkovina, produkovaná tímto systémem v buňkách E. coli, byla rozštěpena igázou na nosnou bílkovinu a požadovanou bílkovinu, K tomuto účelu byl vytvořen ze syntetických oligonukleotidů fragment DNA s dvojitým řetězcem, který je kódem pro řetězec Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.ThrPro. Tento fragment DNA byl uložen pomocí genetické technologie do místa štěpení pomocí EcoRi ve vektoru pro expresi pEX31C. Mimoto byly do bezprostřední blízkosti místě štěpení enzymem HindlII uloženy dva další syntetické fragmenty DNA, obsahující vhodná místa štěpení pro restrikční endonukleázy a terminační signály pro expresi bakteriálních enzymů, které se účastní exprese genu. Do takto získaného plazmidu pro expresi pEV37 byl uložen při použití štěpných míst pro enzymy Smál a HindlII fragment DNA, který je kódem pro β-oblast prekurzoru pro IgA-proteázu zNaisseria gonorrhoeae MS11. Tímto vznikl hybridní gen, při jehož expresi byla vE. coli vytvořena složená bílkovina. Tato bílkovina obsahovala na svém aminoterminálním zakončení jako nosnou bílkovinu 99 aminokyselin MS2-polymerázy, za ní centrální přechodovou oblast s obsahem 12 aminokyselin s místem štěpení pro igázu a pak požadovanou β-oblast na karboxyterminálním zakončení, jak je zřejmé z obr. 1. Pomocí čištěné igázy je možno odštěpit β-oblast ze složené bílkoviny v místě Pro./.Thr v přechodní oblasti složené bílkoviny.
Plazmid s hybridním genem byl uložen do buněk E. coli, které obsahovaly řídicí faktory Cl857 z bakteriofágu lambda (E. Remaut, Gene 22, 103 - 113, 1983), aby bylo možno zajistit produkci složené bílkoviny. Zvýšením teploty z 28 na 42 °C byl represor Cl857 inaktivován, čímž došlo k aktivaci produkce bílkoviny v rekombinantních buňkách E. coli. K tomuto účelu bylo 50 ml kultury E. coli, pěstované 12 hodin při 28 °C, přeneseno do 200 ml prostředí, předehřátého na 45 °C a kultivace byla dále prováděna 2 hodiny při teplotě 42 °C. Tím bylo možno získat složenou bílkovinu z buněčné plazmy bakterií ve velkém množství z inkluzních tělísek. Bakterie byly odděleny odstředěním, uvedeny do suspenze ve 20 ml pufru pro rozrušení buněk, který obsahoval 10 % sacharózy, 50 mM Tris/GCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA a po přidání 400 μΐ roztoku lysozymu s obsahem 5 mg/ml této látky byla směs inkubována 30 minut při teplotě 22 °C. Pak bylo přidáno smáčedlo Triton X-100 až do koncentrace 0,1 % a roztok byl inkubován ještě 30 minut. DNA, uvolněná rozrušením buněk, byla zpracována ultrazvukem, nerozpustný podíl, obsahující inkluzní tělíska s obsahem složené bílkoviny, byl odstředěn a promyt 5 ml pufru H1NTE, obsahujícího 1M močoviny, 50 mM chloridu sodného, 50 mM Tris/HCl o pH 8,1 a 1 mM EDTA. Po dalším odstředění byla usazenina uvedena do suspenze pomocí ultrazvuku v 5 ml pufru PBS s obsahem 20 mM fosforečnanu draselného o pH 7,5 a 140 mM NaCl. Tento
-13CZ 284774 B6 postup byl několikrát opakován, aby byla zcela odstraněna močovina. Pak byla nerozpustná frakce s obsahem složené bílkoviny uvedena do suspenze v 5 ml pufru PBS při použití ultrazvuku.
Kvalita a množství složené bílkoviny bylo stanoveno elektroforézou na 12,5% SDS-polyakrylamidovém gelu s následným barvením Coomassieovou modří. K rozštěpení byla suspenze bílkoviny inkubována 3 hodiny při teplotě 37 °C při hmotnostním poměru enzym/substrát s hodnotou 1 : 100. Průběh štěpení znečištěné a nerozpustné složené bílkoviny byl sledován analyticky elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, čímž bylo možno prokázat, že jeden z polypeptidů má velikost, očekávanou pro β-bílkovinu. Tato bílkovina byla přenesena na nitrocelulózovou membránu a byla provedena automatická analýza řetězce. Pomocí koncových aminokyselin bylo prokázáno, že štěpením v místě pro igázu byla získána požadovaná bílkovina.
Tímto štěpením bylo změněno pouze přibližně 50 % celkového množství. Bylo tedy přidáno větší množství ligázy a po delší reakční době bylo možno dosáhnout většího rozštěpení. Tento jev patrně znamenal, že v nerozštěpeném podílu složené bílkoviny není štěpné místo pro igázu dostupné. Hybridní bílkoviny a štěpné produkty zůstávaly i po inkubaci s igázou dále ve formě nerozpustných agregátů, takže je bylo možno izolovat odstředěním.
Výtěžku štěpení vyššího než 90 % bylo možno dosáhnout v případě, že místo znečištěných inkluzních tělísek bylo užito složené bílkoviny po předběžném čištění. K tomuto účelu byl nerozpustný sediment po promytí pufrem H1NTE smísen s 5 ml pufru H7NTE, obsahujícího 7M močoviny, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA. Nerozpustný podíl byl oddělen odstředěním a rozpustná frakce byla dialyzována při teplotě 4 °C proti 5 litrům pufru PBS. Při odstranění močoviny dialýzou se složená bílkovina z roztoku sráží ve formě nerozpustných agregátů. Tyto vysrážené agregáty je možno převést působením ultrazvuku na jemnou suspenzi, štěpit igázou svrchu uvedeným způsobem a analyzovat.
Příklad 6
Specifické štěpení renaturované rozpustné složené bílkoviny působením igázy
Při použití systému pro expresi pEX byla získána hybridní bílkovina (příklad 1), tvořená MS2polymerázou a částí bílkoviny CD8 z lidských cytotoxických T-lymfocytů (obr. 2). Po předběžném čištění a rozpuštění bílkoviny z inkluzních tělísek v pufru H7NTE byl k dalšímu čištění užit 12,5% SDS-polyakrylamidový gel. Složená bílkovina byla izolována jako jednotlivé pásy v gelu po zbarvení modří Coomassie a pak byla oddělena z materiálu podle publikace Hunkapiller, Methods in Enzymology 91, 227 - 235, 1983. Elektroeluce byla prováděna pufrem TAE s obsahem 40 mM Tris/acetát o pH 7,9 s 0,1 % SDS (laurylsíransodný). SDS pak byl později odstraněn dialýzou proti 5 litrům pufru TAE při teplotě 22 °C. Při další dialýze byla bílkovina přenesena do pufru s obsahem 20 mM fosforečnanu draselného o pH 7,5, 140 mM NaCl a 50 % glycerolu. Takto získaná rozpustná složená bílkovina byla inkubována s čištěnou igázou (příklad 5) a tak rozštěpena na dva polypeptidové fragmenty v místě štěpení -ProPro./.Thr-Pro-Ala-(obr. 2) v molekule CD8. Specifičnost štěpení byla přezkoumána analýzou řetězce aminokyselin na aminoterminálním zakončení menšího štěpného produktu. Jak bylo možno očekávat, byl získán řetězec Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile.
-14CZ 284774 B6
Příklad 7
Specifické štěpení rozpustné složené bílkoviny ze živného prostředí pomocí igázy
Složená bílkovina, tvořená podjednotkou B choleratoxinu a částí β-oblasti prekurzoru IgAproteázy (Posice 1097 - 1160, J. Pohlner Nátuře 325, 458 - 462, 1987) z N. gonorrhoeae MS11 v rozpustné formě z živného prostředí, v němž byly pěstovány rekombinantní buňky E. coli. Aby bylo možno oddělit od sebe obě části bílkoviny, byl do přechodné oblasti mezi oběma částmi zařazen pomocí genetické technologie syntetický štěpný řetězec při igázu, a to Pro-Pro./.ThrPro-. K. tomuto účelu byly uloženy oligonukleotidy Tk066 a Tk007 mezi místo štěpení restrikčních enzymů EcoRl a SacII v přechodné oblasti (obr. 3). Složená bílkovina byla dialyzována ve 2 litrech živného prostředí bakteriální kultury, pěstované 12 hodin při 37 °C po vysrážení síranem amonným proti 5 litrům PBS-pufru. K rozštěpení byl materiál inkubován v koncentraci 50 pg/ml v PBS-pufru s čištěnou igázou 2 hodiny při 37 °C při hmotnostním poměru enzymu k substrátu 1 : 50. Imunoblokovou analýzou bylo možno prokázat, že větší fragment po úplném štěpení odpovídal svou molekulovou hmotností a reakcí s antisérem podjednotce B přírodního choleratoxinu.
Příklad 8
Specifické štěpení složené bílkoviny na povrchu gram-negativních bakterií pomocí igázy
Systém pro expresi a sekreci byl užit k exponování složených bílkovin TkB49 a TkB59, tvořených podjednotkou B choleratoxinu a β-oblastí IgA-proteázy na povrchu rekombinantních salmonel. Hybridní gen, který je kódem pro TkB49, obsahoval v přechodové oblasti mezi toxinem a β-oblastí původní štěpný řetězec c), tj. -Pro-Pro./.Ala-Pro- proigázu. Naproti tomu byl do genu pro TkB59 zařazen syntetický fragment DNA, tvořený oligonukleotidy Tk006 a Tk007 mezi místa působení enzymů EcoRl a SacII, tento fragment byl kódem pro štěpný řetězec -Pro-Pro./.Thr-Pro-, jak je zřejmé z obr. 3. V případě, že byly neporušené bakterie, nesoucí na svém povrchu zakotvenou tuto složenou bílkovinu, inkubovány s čištěnou igázou, bylo možno pozorovat specifické štěpení ve štěpném místě pro igázu. Imunoblokovou analýzou bylo možno prokázat, že malé fragmenty, vzniklé při štěpení, odpovídaly svou velikostí a reakcí s antisérem přírodní podjednotce B choleratoxinu.
Příklad 9
Čištění aktivní igázy ze živného prostředí kultury rekombinantních buněk E. coli
Rekombinantní buňky E. coli C600, obsahující plazmid pEX1070 (DE 36 22 221.6) s modifikovaným genem pro IgA-proteázu, vylučují aktivní igázy do živného prostředí. Membránovou filtrací je možno dosáhnout zvýšení koncentrace enzymu v prostředí a pak jej vysrážet z roztoku přidáním síranu amonného v množství 0,42 g/ml. Po odstředění byl sediment rozpuštěn v pufru Biorex s obsahem 50 mM fosforečnanu draselného o pH 7,0 s 8,6 % glycerolu, bylo užito 1 ml pufru na 1 litr živného prostředí, pak bylo dialýzou proti 2 litrům pufru dosaženo rovnovážného stavu a nakonec byl materiál podroben chromatografii na kationtoměniči (Biorex 70). Vázaná IgA-proteáza byla v jednom stupni ze sloupce vymyta pH 7,0 s 8,6% glycerolu a pak byla frakcionována. Frakce s obsahem enzymu pak byly analyzovány elektroforézou na 12,5 % SDS polyalkrylamidovém gelu. V tomto stupni čištění bylo dosaženo čistoty vyšší než 90 %. Pro získání igázy v čisté formě byla provedena filtrace na gelu při použití prostředku Sephacryl HR300 v pufru Biorex, načež byla provedena další chromatografie na kationtoměniči. Účinnost
-15CZ 284774 B6 igázy byla stanovena inkubací s protilátkami proti IgA 1 s následným dělením vzniklých štěpných produktů na SDS-polyakrylamidovém gelu.
Příklad 10
Konstrukce plazmidu pro expresi enterleukinu 3, prostého methioninu
Konstrukce byla provedena za použití vektoru pro expresi pPZO7-mglac (WO 88/09373). K tomuto účelu byl uvedený vektor rozštěpen enzymem Ncol a konce byly odstraněny nukleázou z bobů. Pak byl vektor dále štěpen enzymem Bam HI. Aminoterminální zakončení složené bílkoviny bylo na úrovni DNA připraveno s použitím následujících oligonukleotidů:
Primer IA:
’ AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATG GAG3’
Primer IB:
’ GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCCTC CGAATT3’
Oba oligonukleotidy se přidají vekvimolámím množství a v přibližně lOOnásobném přebytku k rozštěpenému vektoru pPZ07-mgllac. Po vazbě se materiál použije k transformaci E. coli K12. Známým způsobem se z buněk izoluje DNA, rozštěpí se enzymy Sall a BamHI a materiál se užije k vazbě s fragmentem DNA, který obsahuje kódovou oblast pro interleukin 3 bez signálního řetězce (tento řetězec bude dále podrobněji popsán).
Příprava kódové oblasti interleukinu 3 s rozpoznávací oblastí pro IgA-proteázu na úrovni DNA se připravuje známým způsobem tak, že se provádí PCR-reakce s c-DNA interleukinu 3 jako templátem při použití následujících primerů:
Primer 2A:
5’ AAGTTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3’
Primer 2B:
5’ TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3’
Výsledný PCR-fragment se rozštěpí enzymy Sall a BamHI a je tak možno jej přímo uložit do svrchu uvedené DNA vektoru a kovalentně vázat pomocí ligázy.
Po transformaci DNA ve vhodném produkčním organismu, například E. coli K12 C600, je možno získat z E. coli syntetizovaný II 3 ve formě Rb a pak jej izolovat. Tak, jak bylo popsáno pro G-CSF, je možno provést denaturaci a renaturaci bílkoviny a renaturovaný produkt pak štěpit pomocí IgA-proteázy. Takto získaný interleukin 3, prostý methioninového zbytku, je možno užít k léčebným účelům bez dalšího čištění.
-16CZ 284774 B6
Příklad 11
Konstrukce plazmidu pro expresi interleukinu 2, prostého methioninového zbytku
Konstrukce může být provedena při použití vektoru pro expresi pPZO7-mgllac (WO 88/09373) po včlenění primeru 1A a 1B stejným způsobem jako v příkladu 10 s následným štěpením enzymu Sáli a BamHI. Příprava kódové oblasti interleukinu 2 s rozpoznávací oblastí pro IgAproteázu na úrovni DNA se provádí při použití metody PCR tak, že se provádí PCR-reakce při použití c-DNA interleukinu 2 jako templátu a příměrů 3A a 3B, které jsou kódem pro poznávací oblast při IgA-proteázu.
Primer 3A:
5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTCCTACAAAG 3’
Primer 3B:
5’ TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3’
Takto získaný PCR-fragment se rozštěpí enzymy Sáli a BamHI a je možno jej přímo uložit do svrchu uvedené DNA vektoru. Dále se postup provádí stejně jako v případě interleukinu 3. V předchozím příkladu již bylo prokázáno, že vhodným použitím místa působení IgA-proteázy a dalším zpracováním je možno získat bílkoviny, vhodné k léčebným účelům a prosté methioninového zbytku, jejichž řetězec začíná skupinou aminokyselin Ala Pro. Další bílkoviny, které je možno získat analogickým způsobem při použití oligonukleotidů, obsahujících rozpoznávací oblast pro IgA-proteázu a také oblast, která odpovídá zakončení 5’ nebo 3’, a pak PCR-amplifikací, jsou uvedeny v následujících publikacích. Jde o bílkoviny, použitelné k léčebným účelům, které v přírodním stavu začínají skupinou aminokyselin Ala Pro, takže je možno je získat analogickým způsobem.
Cathepsin L. (EC 3.4.22.15), Mason R.W. a další, Biochem. J. 240, 373 - 377, 1986. Erythropoetin, Lai P.H. adalší, J. Biol. Chem. 261, 3116-3121, 1986.
Interleukin-1 beta, Zsabo K.M. a další, Blood 71, 962 - 968, 1988. Osteonectin, Fisher L.W. a další, J. Biol. Chem. 262, 9702 - 9708, 1987.
Kolegenáza typ IV, Collier I.E. a další. J. Biol. Chem. 263, 6579 - 6587, 1988.
Dále je možno získat uvedeným způsobem bílkoviny, které ve své zralé formě začínají skupinou aminokyselin Ser Pro. Jako příklad je možno uvést následující látky:
Alfa-1 antitrypsin, Hilll R.E. a další, Nátuře 311, 175 - 177, 1984.
Atriální faktor, podporující vylučování sodíku močí, Kambayashi Y. a další, FEBS Lett. 259, 341-345,1990.
Další příklady bílkovin, které ve své zralé formě začínají aminokyselinami Thr Pro, jsou uvedeny v následujících publikacích:
Faktor B komplementu, Campell R. D. a další, Proč. Nat. Acad. Sci. 80,4464 - 4468, 1983.
Apolipoprotein A, Eaton D. L. a další, Proč. Nar. Acad. Sci. 84, 322 - 3228, 1987.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin a získávání požadovaných částí těchto složených bílkovin, vyznačující se tím, že se1) modifikuje pomocí genetické technologie přechodná oblast, jíž jsou spojeny dvě části složené bílkoviny, takovým způsobem, že se do této oblasti uloží alespoň jedno rozpoznávací místo pro IgA-proteázu s řetězcem Y-Pro./.X-Pro, v němž X znamená libovolnou aminokyselinu a Y znamená nosnou část složené bílkoviny, obsahující 1 až 100 aminokyselin a končící řetězcem Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro nebo Pro-Ala-Pro-Arg-Pro,
- 2) složená bílkovina, získaná v předchozím stupni, se štěpí IgA-proteázou v rozpoznávacím řetězci v místě, které je označeno ./., a
- 3) po rozštěpení se izoluje jedna nebo větší počet požadovaných částí složené bílkoviny.2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se přechodná oblast složené bílkoviny modifikuje uložením nukleotidového řetězce, který je kódem pro rozpoznávací místo pro IgA-proteázu nebo jeho část, přičemž řetězce nukleotidů se uloží před a/nebo zajeden nebo větší počet úseků DNA, které jsou kódem pro požadované části složené bílkoviny.3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se modifikuje složená bílkovina, která původně neobsahovala žádné místo působení IgA.4. Způsob podle nároků laž3, vyznačující se tím, že se modifikuje přechodná část složené bílkoviny, obsahující kromě požadované části ještě jednu nebo větší počet nosných částí.5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že nosná část složené bílkoviny obsahuje část β-galaktosidázy.6. Způsob podle nároku 4, vyznač u j í cí se tí m , že pro snadnější izolaci polypeptidu obsahuje nosná část složené bílkoviny větší počet aminokyselin, nesoucích náboj a/nebo bílkovinu nebo polypeptid, schopné vázat s vysokou afinitou specifické látky.7. Způsob podle nároků laž6, vyznačující se tím, že X znamená Ser, Thr nebo Ala.8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že X znamená Ser nebo Thr.9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rozpoznávací místo pro IgAproteázu má řetězec aminokyselina) Pro-Ala-Pro./.Ser-Pro,b) Pro-Pro./.Ser-Pro,c) Pro-Arg-Pro-Pro./.Ala-Pro,d) Pro-Pro./.Thr-Pro,e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.Thr-Pro, nebof) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro./.Thr-Pro.-18CZ 284774 B610. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se1) transformuje buňka rekombinantní DNA a/nebo rekombinantním vektorem, přičemž tato DNA nebo tento vektor obsahují alespoň jednu kopii genu, který je kódem pro složenou bílkovinu s obsahem alespoň jednoho rozpoznávacího místa pro IgA-proteázu v přechodné oblasti,2) transformovaná buňka se pěstuje ve vhodném prostředí,3) gen, který je kódem pro složenou bílkovinu, se exprimuje v transformované buňce,
- 4) získaná složená bílkovina se rozštěpí IgA-proteázou, a
- 5) izoluje se jedna nebo větší počet požadovaných částí složené bílkoviny.11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se složená bílkovina štěpí působením IgA-proteázy v prostředí po rozrušení buněk a/nebo po oddělení buněčných bílkovin.12. Způsob podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se krozštěpení složené bílkoviny užije IgA-proteáza, pocházející z patogenních bakterií rodu Neisseria, zejména Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis, nebo z rodu Haemophilu, zvláště Haemophilus influenzae a Haemophilus aegypticus.13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se krozštěpení složené bílkoviny užije IgA-proteáza, získaná z nepatogenního bakteriálního kmene, který ji produkuje ve velkém množství.14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, žesek rozštěpení složené bílkoviny užije IgA-proteáza v imobilizované formě.15. Způsob podle nároků 10 až 14, vyznačující se tím, že se rozštěpí složená bílkovina v rozpustné nebo nerozpustné formě, ve formě spojené s membránou nebo vázané na buňku.16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se štěpí složená bílkovina ve formě nerozpustných vysrážených inkluzních tělísek.17. Způsob podle nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že se kzískání rekombinantních bílkovin bez N-terminálního methioninového zbytku v prokaryotických buňkách užije složená bílkovina s řetězcem vzorce Met-Y-Pro-./.X-Pro-A, kde X znamená libovolnou aminokyselinu, Y končí řetězcem Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro nebo ProAla-Pro-Arg-Pro a A znamená libovolný řetězec aminokyselin, tato složená bílkovina se rozštěpí IgA-proteázou a jako štěpný produkt se získá bílkovina nebo peptid s řetězcem X-Pro-A.18. Způsob podle nároků 17, vyznačující se tím, že požadovaná část složené bílkoviny začíná řetězcem X-Pro.19. Způsob podle nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že X-Pro-A představuje faktor, stimulující kolonie lidských granulocytů G-CSF, nebo jeho derivát.20. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se po rozštěpení IgA-proteázou zpracovává požadovaná část složené bílkoviny v následujícím stupni dipeptidylaminopeptidázou, čímž se odštěpí N-terminální řetězec X-Pro.-19CZ 284774 B621. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se k odštěpení N-terminálního řetězce X-Pro užije X-Pro-dipeptidylaminopeptidáza.22. Složená bílkovina s obsahem většího počtu polypeptidových částí, která obsahuje mezi polypeptidovými částmi v alespoň jedné přechodné oblasti alespoň jedno rozpoznávací místo pro IgA-proteázu s řetězcem aminokyselin Y-Pro./.X-Pro, v němž X znamená libovolnou aminokyselinu, s výhodou Ser, Thr nebo Ala, a Y má význam z nároku 1, za předpokladu, že řetězec složené bílkoviny je odlišný od polypeptidových částí, pro něž je kódem sekvence genu pro prekurzor proteázy IgA s přirozenými rozpoznávacími místy pro proteázu IgA.23. Složená bílkovina podle nároku 22, kterou je možno vyjádřit řetězcem Met-Y-Pro./.X-ProA, kde X a Y mají význam, uvedený v nároku 22, a A znamená libovolný řetězec aminokyseliny.24. Složená bílkovina podle nároku 22 nebo 23, v níž Y na svém C-konci obsahuje Pro, ProAla, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro nebo Pro-Ala-Pro-Arg-Pro.25. Složená bílkovina podle nároků 22 až 24, v níž řetězec X-Pro-A představuje faktor, stimulující kolonie granulocytů G-CSF, nebo jeho derivát.26. Rekombinantní DNA, která je kódem pro složenou bílkovinu podle nároků 22 až 25.27. Rekombinantní vektor, obsahující jednu nebo větší počet kopií rekombinantní DNA podle nároku 26.28. Rekombinantní vektor podle nároku 27, v němž se rekombinantní DNA nachází pod řízením indukovatelného signálu pro expresi.29. Rekombinantní vektor podle nároku 27 nebo 28, kterým je prokaryotický vektor.30. Rekombinantní vektor podle nároků 26 až 28, kterým je plazmid.31. Buňka, transformovaná DNA podle nároku 26, nebo vektorem podle nároků 27 až 30.32. Buňka podle nároku 31, která je prokaiyotickou buňkou.4 výkresy
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4003149 | 1990-02-03 | ||
| DE4015922A DE4015922A1 (de) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Verfahren zur enzymatischen prozessierung von proteinen unter verwendung von iga-proteasen (igase) |
| DE4015921 | 1990-05-17 | ||
| DE4039415A DE4039415A1 (de) | 1990-02-03 | 1990-12-10 | Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine ohne n-terminalen methioninrest |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS9100241A2 CS9100241A2 (en) | 1991-08-13 |
| CZ284774B6 true CZ284774B6 (cs) | 1999-02-17 |
Family
ID=27434868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS91241A CZ284774B6 (cs) | 1990-02-03 | 1991-02-01 | Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5427927A (cs) |
| EP (2) | EP0513073B1 (cs) |
| JP (2) | JPH0789952B2 (cs) |
| KR (1) | KR960011919B1 (cs) |
| AT (2) | ATE219518T1 (cs) |
| AU (1) | AU638309B2 (cs) |
| CA (1) | CA2074943C (cs) |
| CZ (1) | CZ284774B6 (cs) |
| DK (1) | DK0513073T3 (cs) |
| ES (2) | ES2076521T3 (cs) |
| FI (1) | FI109810B (cs) |
| HU (1) | HU217103B (cs) |
| IE (1) | IE64938B1 (cs) |
| IL (1) | IL97119A0 (cs) |
| LV (1) | LV10309B (cs) |
| NO (1) | NO311142B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ236819A (cs) |
| PT (1) | PT96658B (cs) |
| WO (1) | WO1991011520A1 (cs) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| DE4344350C2 (de) * | 1993-12-23 | 1995-09-21 | Max Planck Gesellschaft | Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis |
| US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| AU3651595A (en) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Drug for the prevention and treatment of auto-immune and viral diseases, and diagnostic agents for detecting said diseases |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| DE19549232C2 (de) * | 1995-12-20 | 1998-05-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern |
| GB9618960D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Medical Science Sys Inc | Proteases |
| US6444202B1 (en) | 1996-11-25 | 2002-09-03 | Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit | Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use |
| US20030190740A1 (en) | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
| BR9914519A (pt) * | 1998-10-13 | 2001-07-03 | Univ Georgia Res Found | Peptìdios bioativos estabilizados e métodos de identificação, sìntese e uso |
| KR100356140B1 (ko) * | 1999-07-08 | 2002-10-19 | 한미약품공업 주식회사 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
| US20030190644A1 (en) * | 1999-10-13 | 2003-10-09 | Andreas Braun | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
| CN1774511B (zh) * | 2002-11-27 | 2013-08-21 | 斯昆诺有限公司 | 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统 |
| WO2004094478A2 (en) * | 2003-04-23 | 2004-11-04 | Borean Pharma A/S | Cleavage of fusion proteins using granzyme b protease |
| WO2004097369A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for de novo sequencing |
| US9394565B2 (en) * | 2003-09-05 | 2016-07-19 | Agena Bioscience, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| AU2004283294B2 (en) | 2003-10-23 | 2011-03-17 | Kineta Two, Llc | Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, OAS1 |
| US7220407B2 (en) | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
| SI21639A (sl) * | 2003-12-23 | 2005-06-30 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Farmacevtski pripravek, ki vsebuje nemicelarne sulfobetaine |
| US9249456B2 (en) * | 2004-03-26 | 2016-02-02 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
| WO2006031745A2 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Sequenom, Inc. | Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids |
| EP1817047B1 (en) | 2004-11-05 | 2012-02-08 | Northwestern University | Use of scf and g-csf in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders |
| UA95446C2 (ru) | 2005-05-04 | 2011-08-10 | Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. | Мутаци в генах oas1 |
| EP2059530B1 (en) * | 2006-08-31 | 2012-08-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
| CL2007002502A1 (es) * | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
| AU2008240143B2 (en) * | 2007-04-13 | 2013-10-03 | Agena Bioscience, Inc. | Comparative sequence analysis processes and systems |
| BRPI0815280A2 (pt) | 2007-08-27 | 2018-11-27 | Biogenerix Ag | medicamento que compreende uma formulação líquida aquosa de g-csf, receptáculo para a administração de medicamentos líquidos, seringa ou ampola, kit para a administração parenteral de g-csf |
| DE202007018629U1 (de) | 2007-08-27 | 2008-12-24 | Biogenerix Ag | Flüssigformulierung von G-CSF |
| US8501449B2 (en) | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| WO2009121759A2 (en) * | 2008-04-03 | 2009-10-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of pegylated igf-i variants for the treatment of neuromuscular disorders |
| CN101965516A (zh) * | 2008-04-03 | 2011-02-02 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 聚乙二醇化胰岛素样生长因子测定 |
| US8053222B2 (en) * | 2009-02-12 | 2011-11-08 | Academia Sinica, Taiwan | Protein expression system involving mutated severe respiratory syndrome-associated coronavirus 3C-like protease |
| US20110152188A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
| CN107412737A (zh) | 2010-01-19 | 2017-12-01 | 韩美科学株式会社 | 长效g‑csf缀合物的液体制剂 |
| EP2611921A2 (en) * | 2010-08-30 | 2013-07-10 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Prokaryotic expression construct |
| WO2014187974A1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-11-27 | Novo Nordisk A/S | Fusion protease |
| RU2711322C1 (ru) * | 2013-12-20 | 2020-01-16 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
| HUE057952T2 (hu) | 2015-06-24 | 2022-06-28 | Hoffmann La Roche | Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással |
| JP6657392B2 (ja) | 2015-10-02 | 2020-03-04 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗ヒトｃｄ２０／ヒトトランスフェリン受容体抗体及び使用方法 |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| US10446928B2 (en) | 2017-06-09 | 2019-10-15 | Mitsubishi Electric Corporation | Phased array antenna |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL60184A (en) * | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
| EP0215126B1 (en) * | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| JPS62129298A (ja) * | 1985-12-02 | 1987-06-11 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規ポリペプチド |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| ATE67517T1 (de) * | 1985-09-30 | 1991-10-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| FR2594846B1 (fr) * | 1986-02-21 | 1989-10-20 | Genetica | Procede de preparation de la serum albumine humaine mature |
| US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
| DE3622221A1 (de) * | 1986-07-02 | 1988-01-14 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur gentechnologischen gewinnung von proteinen unter verwendung gramnegativer wirtszellen |
| JPH01500483A (ja) * | 1986-08-11 | 1989-02-23 | シタス コーポレイション | Ｇ‐ｃｓｆ及びそのミューテインの発現 |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| EP0344796B1 (en) * | 1988-06-03 | 1994-09-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Crystalline human granulocyte colony stimulating factor and process for preparing the same |
| PT92479A (pt) * | 1988-12-01 | 1990-06-29 | Univ North Carolina | Processo de preparacao de genes recombinantes e suas proteinas de codificacao |
| US5055555A (en) * | 1989-01-05 | 1991-10-08 | Helmut Sassenfeld | Purification of G-CSF |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
-
1991
- 1991-01-18 NZ NZ236819A patent/NZ236819A/xx unknown
- 1991-01-31 IL IL97119A patent/IL97119A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 WO PCT/EP1991/000192 patent/WO1991011520A1/de active IP Right Grant
- 1991-02-01 EP EP91902956A patent/EP0513073B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 AU AU71496/91A patent/AU638309B2/en not_active Ceased
- 1991-02-01 DK DK91902956.1T patent/DK0513073T3/da active
- 1991-02-01 ES ES91902956T patent/ES2076521T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 HU HU9202511A patent/HU217103B/hu unknown
- 1991-02-01 AT AT93121015T patent/ATE219518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 CZ CS91241A patent/CZ284774B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 PT PT96658A patent/PT96658B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 EP EP93121015A patent/EP0602688B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 KR KR1019920701858A patent/KR960011919B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 ES ES93121015T patent/ES2177536T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 AT AT91902956T patent/ATE124456T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 JP JP3503102A patent/JPH0789952B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 CA CA002074943A patent/CA2074943C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 US US07/917,034 patent/US5427927A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 IE IE35891A patent/IE64938B1/en not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-30 NO NO19923010A patent/NO311142B1/no unknown
- 1992-07-31 FI FI923463A patent/FI109810B/fi active
-
1993
- 1993-09-24 LV LVP-93-1094A patent/LV10309B/lv unknown
-
1995
- 1995-01-04 JP JP7000120A patent/JP2766621B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ284774B6 (cs) | Způsob enzymatického štěpení složených bílkovin | |
| CA1338642C (en) | Bacterial methionine n-terminal peptidase | |
| FR2518572A1 (fr) | Plasmide d'expression permettant l'insertion appropriee d'adn heterologue | |
| JPH06505624A (ja) | ペプチド類の精製指向性クローニング | |
| JPS62500700A (ja) | ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 | |
| JPS6296086A (ja) | 複合プラスミド | |
| JPS5890596A (ja) | α―インターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子系 | |
| US5552302A (en) | Methods and compositions for production of human recombinant placental ribonuclease inhibitor | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| CA1300534C (en) | Human pancreatic elastase | |
| RU2120475C1 (ru) | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) | |
| JPH04502260A (ja) | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ | |
| JP2509410B2 (ja) | 組換えＩｇＡ−プロテア―ゼの製法、組換えＤＮＡ、組換えベクタ―、細胞 | |
| RU2108386C1 (ru) | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| JPH01273591A (ja) | ヒト成長ホルモン分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形質転換体および蛋白質分泌生産法 | |
| RU2009199C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pccs, кодирующая соматостатин-14, штамм бактерий escherichia coli - продуцент соматостатина-14 | |
| JPS62163691A (ja) | ヒト成長ホルモンの生産法 | |
| JPS6178383A (ja) | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 | |
| JPH0588110B2 (cs) | ||
| JPS62175173A (ja) | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ３ｂ | |
| KR20020097082A (ko) | 위치선택적 수식법에 의한 혼성형 단백질 치료제 개발을위한 형질전환 효모 시스템 | |
| JPH0494686A (ja) | トリプシン阻害活性を有するポリペプチドの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070201 |