PT96658B - Processo para a cisao enzimatica de proteinas recombinantes com iga-proteases e de obtencao de proteina fundida, e de composicao farmaceutica - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA presente invento refere-se a um processo para a cisão cos especificidade sequencial de proteínas obtidas biotecnologicadente , utilizando IgA-proteases (também chamadas Ig-ases) e, especialcente₅ a um procssso para a produção de proteínas ou péptidos, rsccràóníróss sís procariotas e à eliminação subsequente de uma ti 'ti'*''** ti *·?—- *'--p· p· 7 ·^Γ·7;-'1

A preparação biotecnológica de proteínas realiza-se, de pref erência, coc, a utilização de microrganismos que podem ser facilmente cultivados s que permitem uma fácil obtenção da proteína produzida, Microrganismos apropriados para este objectivo são, por exemplo, a bactéria gram-negativa Esefasrichla coli, a bactéria çram-positiva Qtreptococcus carnosos, assim como o fervente tíe padeiro Saccharomyces csrevlsiae. No entanto, a expressão de ger.es naturais estranhos em tais microrganismos, ten, muitas vszss, inconvenientes. Na E. coli., por exemplo, o resíduo de metionina do terminal amino de proteínas naturais, que se deve ã tradução, s cindido, na maior parte das vezes, ds aaosi**a eficiente por proteases, No entanto, no caso de se tratar de proteínas estranhas, essa cisão do primeiro resíduo de metionina realiza-se, na maior parte das vezes, apenas parcialmente, Uma maneira apropriada de produzir tais proteínas coa uma sxtreuídade a.-ísino definida é, por isso, produzi-las primeiro sob ferva de proteínas fundidas s cindi-las, a seguir, ds maneira definida, através de uma proteass eom especificidade sequencial.

Em cevparaeão com proteínas naturais, tais proteínas fundidas. podev ter, além disso, a vantagem de se agregar na célula do microrganismo, formando corpos de precipitação, densos, (corpos de inclusão), os quais podem ssr separados de outras partes da célula sem grande esforço, facilitando deste modo o isolamento e a purificação da proteína desejada, Por outro lado, as proteínas •ti suporte, que são fundidas através de processos da tecnologia genética, com uma proteína desejada, conferem ao parceiro da ^usão uma estabilidade particular contra uma decomposição proteclítiea não específica? o problema da decomposição ds

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Ό’* polipéptidos reconhecidos como estranhos diz respeito sobretudo á preparação bíotecnológíca de péptidos pequenos» Outras proteínas de suporte permitem dirigir as proteínas desejadas para compartimentos celulares determinados, a partir dos quais podem ser purificadas de modo particularmente fácil e onde são particularmente estáveis e/ou onde são acessíveis para se efectuar testes» Por fim;, as proteínas de suporte podem ter propriedades especiais que permitem uma purificação eficiente» por exemplo através de cromatografia de afinidade» Para a maioria das aplicações preferem-se proteínas fundidas que têm a proteína de suporte na extremidade amino e a proteína desejada na extremidade carboxilo» Mas também pode ser desejável» em certos casos, a versão contrária ou a ligação da proteína desejada a dois parceiros de fusão» Além disso é possivel que seja vantajosa a repetição da proteína desejada» dentro de uma só fusão»

Para preparar a proteína desejada livre» a partir de tal fusão» é necessário cindir os parceiros de fusão ligados uns aos outros de forma covalente» Em princípio,, isto pode ser conseguido através de processos químicos ou bioquímicos (por enzimas)» Porém» na maior parte dos casos» a reduzida especificidade dos processos até à data disponíveis é uma limitação? para se obter a proteína desejada, importa que uma tal cisão seja feita numa sequência de cisão entre os parceiros de fusão,, quer dizer na região transitória, mas de modo algum dentro da proteína desejada» A cisão dos parceiros de fusão tem que ser feita, por isso, de forma altamente específica»

Os processos químicos utilizados até à data para a cisão com especificidade sequencial de proteínas fundidas são, por exemplo, a cisão através de brometo de ciarioqénío no local do aminoácido metionina, dentro de uma proteína, e a cisão entre os aminoãcidos Asp»l„Pro, em meio ácido, com utilização de ácido fórmico» Estes métodos, porém, só podem ser aplicados se não existir mais nenhum local de cisão específico» na proteína desejada, além do local na região transitória para o parceiro de fusão» Em regra geral, no entanto, é preferível aplicar métodos bioquímicos em vez de químicos, visto que os primeiros podem ser realizados, na

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GI 1266 (3330) maioria dos casos» em condições fisiológicas ou, pelo menos» quimicamente suaves, que não prejudiquem a proteína desejada»

Os métodos bioquímicos para a cisão de proteínas fundidas assentam na utilização de proteases com a maior especificidade possível» Por exemplo, dentro de proteínas, a tripsina cinde as ligações peptídicas, que se seguem aos aminoãcidos arginina ou lisina» Um aumento da especificidade pode conseguii—se por uma modificação química prévia do aminoácido Lys, pelo que é possível reduzir o reconhecimento específico do aminoácido arginina» Uma outra protease utilizada na biotecnologia é clostripaínar, esta enzimei cinde ligações peptídicas entre o aminoácido arginina e qualquer aminoácido seguinte» Uma revisão sobre os métodos de cisão enzimática de proteínas fundidas aplicados até à data foi redigida por F„A«O» Marston (Em Glover, E„j» ONA cloníng 11.1, IRL PRESS Oxford e Washington 00, 1.987)» Os métodos de cisão enzimática são também limitados pelo facto de o(s) aminoácido(s) específico(s) para o local de cisão poderem estar, também, presentes, ao mesmo tempo na própria proteína desejada» Por isso, para a cisão bioquímica de fusões proteicas são, sobretudo adequadas enzimas que reconhecem» para efectuar a cisão» não apenas um aminoácido, mas uma sequência de aminoãcidos jã que a probabilidade de uma terminada sequência de aminoãcidos existir na própria proteína desejada, para além do local de cisão entre os parceiros de fusão, é tantas vezes menor quanto maior for o número de aminoãcidos necessário para o reconhecimento e para a cisão de uma sequência de cisão»

Ccnhecem~se proteases capazes de cindir uma determinada proteína de forma muito específica» A maioria de tais proteases selectivas (existem, por exemplo, nos sistemas do complemento e de coagulação do sangue humano) cinde» precisamente» num local definido do substrato? no entanto» no caso da respectiva região de cisão ser transferida para uma outra proteína (por exemplo» para uma proteína fundida), tais proteases já não conseguem, em regra geral, efectuar a cisão» As razões para isso acontecer sâo múltiplas e assentam, por exemplo, no reconhecimento, pela protease, de uma determinada estrutura secundária ou terciária no

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Gl '1.266 (3330)

Ο— substrato ou na Inacessibilidade do local de cisão ern proteínas fundidas,.

No topo da lista das proteases com especificidade sequencial, utilizadas até à data para a cisão de proteínas fundidas está, presentemente, o factor Xa» Esta protea.se cinde de forma especifica a sequência de cisão Xle-Glu-fâly-Arg-i-X, indicando - i “ o local de cisão e X um aminoácido qualquer. No entanto verifica-se que esta protease também não pode ser utilizada, de modo geral, para a cisão de proteínas fundidas que têm uma tal sequência de cisão na sua região transitória; muitas vezes, substratos deste tipo (isto ©, proteínas fundidas contendo uma proteína desejada ligada de forma covalente a uma proteína de suporte) ou não são cindidos ou apenas o são em pequeno grau, ou só são cindidos em forma solúvel..

A cisão eficiente de proteínas fundidas tem especial importância na produção de proteínas recombínantes em organismos procarióticos. Aí é necessária a clonação de uma sequência de AON que contém um AUG, como codào de iniciação, a montante do início da sequência de ADN propriamente dita,. Em consequência disso é expressa ©m procaríotas como, por exemplo, E„ coli, uma proteína recombinante que contém um resíduo metíonína na posição -1 dos aminoácidos,.

No entanto, em muitos casos torna-se necessário obter proteínas recombInantes sem o resíduo de metíonína na posição -1,

A obtenção de tais proteínas a partir de procaríotas pode realizar—se, por exemplo, por meio de uma peptídase específica para a metíonína, a qual cinde a metíonína N-terminal» Este processo é, no entanto, muito dispendioso, porque a cisão só pode ser controlada através de sequericiaçâo proteica. Além disso, uma separação da proteína que contém metíonína na posição -1, da proteína sem metíonína é muito difícil devido ao facto de terem pesos moleculares quase idênticos, de modo que essa separação apenas se consegue de maneira incompleta.,

Pedido PCT W0S4/02351 revela a cisão de aminoácidos N-tei—

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-6“· - ' (í. 6 minais de uma proteína fundida- Neste contexto é possível eliminar vários aminoácidos da proteína, a partir do terminal N, por uma separaçao progressiva até uma sequência X-Pro através de uma exopeptidase» de preferência leucína-peptidase» A sequência X-Pro é cindida deste produto em dois passos ou numa reacçao em um passo, com utilização de postprolina-dípeptídí1-amínopeptidase (EC 3-4-14»)- Este método tem, no entanto, a desvantagem de, devido á cisão progressiva dos aminoácidos, a partir do terminal N da proteína., não se obter um produto homogéneo, mas, pelo contrário, obter-se sempre uma mistura de produtos, a qual contém, além do produto desejado, proteínas cuja decomposição é incompleta e, também, outras que estão decompostas demais»

Conhece-se um outro processo para a cisão enzimática de uma proteína fundida através da patente europeia NQ 0 020 290» Neste método utiliza-se a enzima colagenase para a separação da parte de fusão de uma proteína de uma determinada sequência de reconhecimento» A seguir é possível separar outros aminoácidos da parte de fusão por um tratamento subsequente com enzimas» Verífícou-se, porém, que a colagenase e também outras endopeptidases apenas têm uma especificidade reduzida (ver Biochim» Biophys, Acta 271 (1972), 133-144)» Além disso, as colagenases são activas apenas em relação a proteínas que possuam uma estrutura tridimensional especifica»

Também se conhece a utilização do referido factor Xa, para a separação se uma parte de fusão N-termínal de proteínas» Mas este método também apresenta, além dos problemas já mencionados de eficiência da cisão, outros inconvenientes de, possivelmente, sequências internas da proteína também serem reconhecidas e cindidas» Além disso, é preciso isolar o factor Xa a partir de soro bovino, pelo qual serão necessárias, na cisão de proteínas para fins terapêuticos uma purificação e análises subsequentes, dispendiosas, para detectar a eventual existência de factores patogénicos ou vírus»

Diversas espécies patogénícas de bactérias (por exemplo, da família Neísseria, como Neisser.ia.......gonorrhoeae. © Noisoería.........menín.z

2.2á

GI 1266 (3330)

-7gitltis ou da família Haemophilus como Haemophilus influenzae © Haemop-h 11.us aegypticus), que crescem na mucosa humana, segregas» proteases que têm sequências muito idênticas umas às outras, as quais são específicas para a Igftl humana e que, por isso, são designadas globalmente por IgA-proteases ou Ig-ases, ft imunoglob;.;lina Tgftl é um componente importante da imunorreacção secretória que procura u«na protecção contra inf seções per tais organismos patogênicos (Revisses Kornfeld e Plaut, Rev, Infect. Dis. 3 (1R81), 521-534). Além disso, a IgA-protease cinde também, por auto-profeólisa, s sua própria proteína precursora. Já foi descrita pormenorizadamente a obtenção da IgA-protease a partir de Neísseria gpnorrhoeas HS11, na estirpe de bactérias autêntica, assim como sm células hospedeiras gram-negativas (DE 36 22 721 ..6).,

A IgA-protease cinde as sequências de reconhecimento seguintes, como ss descreve, por exemplo, em Pohlner et al., (Nature 325 (1937). 458-462):

1. Pro-Ala-Pro'!’Ser-Pro

2. Pro-Pro-’“Ser-Pro

3. Pro-Pro kfila-Pro

4. Pro-Pro*!Thr-Pro

Neste contexto, o símbolo ’!' representa sempre o local da cisão efectuada pela IgA-protease. A clonação da IgA-protease é descrita, per exemplo, em Pohlner et al., 1987, acima referido.

Por isso, 0 presente invento propôs-se resolver o problema de eonsegtdr um processo aperfeiçoado para a cisão bioquímica (enzimática) ds proteínas fundidas, ds modo que proteínas fundidas, produzidas por engenharia genética e consistindo ss quaisquer parceiros de fusão © numa sequência ds cisão específica na região transitória, possam ser utilizadas, como substrato, para a obtenção de proteínas desejadas com o máximo rendimento possível s ds siodo reprodutível.

Este problema foi resolvido por engenharia genética, pela introdução do local de reconhecimento ou sequência de cisão,

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QI 1266 (3330) e^: d-8respectivamente, Pro ! ’Χ-Pro, na região transitória de proteínas fundidas e pela cisão específica desta sequência de cisão por uma IgA-proteasô, no local ds cisão designado por sendo X ds preferência, os aminoácidos Ser, Thr ou Ala, sobretudo Ser ou Thr, mas pudendo ser, também, outros aminoácidos.

Um objectivo do presente invento é, portanto, um processo para a cisão enzimática de proteínas fundidas e para, a obtenção de partas desejadas destas proteínas fundidas, caracterizado por (1) se modificar, através de engenharia genética, uma região transitória, na qual duas partes da proteína fundida esteja*? ligadas, uma â outra, ds modo a formar, nesta região transitória, pelo menos um local de reconhecimento da IgA-protsass, co® a sequência de aminoácidos V-Pro^-! Χ-Pro, r.a qual X pode ser um aminoácido qualquer e Y um ou vários auinoécidcs quaisquer, (2) sc cindir a proteína fundida resultante do passo (1), com IgA-protease, na posição designada por .. do local de recorheciisento e (3) s« obter, após a cisão, uma ou várias partes desejadas da proteína fundida.

De acordo com o presente invento sob a denominação IgA-protease entendera-se professes que cindem IgA especificamente, descritas, por exemplo, em Rev. Infect . Dis, 3 (1981) 521-534.

Mas iguairnente apropriadas são, também, as IgA-proteases recombinantes como as que são descritas, por exemplo, em DE-A 36 22 221, Proc. Natl. Acad, Sei. USA 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 e EMEO Jour. 3 (1934) 1595-1601.

No processo ds acordo coa o invento, a modificação de uma região transitória de proteínas fundidas realiza-se, de preferência, pe’,a inserção de sequências nucleotidicas na região transitória de uma proteína fundida, as quais codificam um local de reconhecimento da IgA-protease ou uma parte dele, sendo estas sequências nucleotidicas inseridas a montante e/ou a jusante de mu cs rãrics segmentos ds ADN que codificam partes desejadas da

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-9fusão proteica. Para este fim utilizam-se, de preferência, sequências nucleotídicas sintetizadas quimicamente.,

Surpreendentemente, verificou-se que o processo de acordo com o invento é também adequado, nomeadamente, à cisão de proteínas fundidas que originalmente (isto é, antes da modificação da região transitória) náo apresentem nenhum local natural de reconhecimento da IgA-protease.

local de reconhecimento da. IgA-protease de acordo com o invento apresenta a sequência de consenso de aminoácidos γ-Pro·ίX-Pro, Neste caso, X pode representar um aminoácido qualquer e Y um ou vários aminoácidos quaisquer. De preferencia, X representa serina, treonina ou alanína, prefere-se sobretudo serina ou treonina. Y substitui, de preferência, vários aminoácidos acabando com a sequência Pro , Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro ou Pro-Ala-Pro-Arg-Pro.

processo de acordo com o invento consiste, por isso, na introdução de um local de reconhecimento da IgA-protease com, peio menos, a sequência de consenso de cisão Pro“1“X-Pro, na região transitória de uma proteína fundida qualquer, por exemplo entre a proteína de suporte e a proteína desejada, local esse qu.e pode ser utilizado para a separação e obtenção da proteína desejada através da IgA-protease. Neste caso, inserem-se, de preferência, ria posição X da sequência de cisão Pro“ 1 X-Pro, os aminoácidos Ser, Ala ou Thr. Para optimizar ainda mais a cisão no local indicado, é possível intercalar, a montante da sequência de cisão, mais aminoácidos especiais, nomeadamente o aminoácido Pro.

Preferem-se sobretudo as sequências de aminoácidos

a )	Pro-Ala-	“Pro-1“Sei—Pro
b)	Pro-Pro	“íSer-Pro
c)	Pro-Arg-	-Pro-Pro”1Ala-Pro
d)	Pro-Pro	“ 1 H “fJlt--prc,
e)	Ala-Pro-	-Arg-Pro-P ro ·* i T hr-P ro ou
f)	Pro-Ala-	-Pro-Arg-Pro-Proi“Thr-Pro.

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GI 1266 (3330) *‘í-ΙΟ — 7 r

Ao se aplicar o processo de acordo com o invento parã cindir proteínas fundidas ern que a proteína desejada esteja colocada a jusante de uma proteína de suporte, obtém-se, após a cisão através da IqA~protea.se, uma proteína cuja extremidade amino é caraeterizada pela sequência X-Pro. Esta sequência pode ser, como parte da proteína desejada, vantajosa, prejudicial, ou insignificante. Em regra geral, esta sequência é vantajosa no caso da proteína desejada, preparada por engenharia genética, conter na sua forma natural, os respectívos dois aminoácidos X-Pro na sua extremidade amino. As proteínas bíotecnologícamente Importantes, caracterizadas por conterem X-Pro na sua extremidade amino, existem na natureza.

processo de acordo com o invento tem, em comparação com todos os outros processos para a cisão de fusões proteicas conhecidos, as vantagens de poder ser aplicado, surpreendentemente, de modo universal, em proteínas fundidas que tenham, na sua região transitória a sequência de cisão indicada, e de poder ser aplicado ígualmente em fusões proteicas Insolúveis, solúveis, associadas à membrana e ligadas à célula. Como vantagem particular, o processo oferece, além disso, a possibilidade de cindir as proteínas fundidas, ou as fusões proteicas sob forma de corpos do precipitação, tais como os que existem ©m microrganismos, a pai— tir de onde podem, como tal, ser facilmente concentradas. Uma outra vantagem do processo consiste na enzima de cisão utilizada, a Ig-ase, poder ser obtida, sem grandes esforços, a partir de meios de cultura de bactérias não patogénicas.

A inserção da sequência de cisão para Ig-ase na região transitória de uma fusão proteica realiza-se através de engenharia genética. Assim, por exemplo, é possível sintetizar quimicamente uma série de nucleótidos ou sequência de nucleótidos, que codifica, respectivamente, uma sequência de cisão ou uma parte dela, e inseri-la entre os segmentos de ADN para uma proteína de suporte e para uma proteína desejada, através de meios conhecidos de engenharia genética. De modo análogo é também possível inserir uma sequência natural de nucleótidos que codifica uma sequência de cisão apropriada ou uma parte dela. 0 gene que codifica uma

1.24 (3.1 1266 (-53-30)

fusão proteica é colocado, de preferência, sob o controlo de sinais de expressão apropriados (de preferência, iriduzíveis), de modo a possibilitar uma produção de proteínas fundidas que corresponda às exigências. Como células hospedeiras para a produção de fusão proteicas podem ser utilizadas células procarióticas ou eucarióticas (tanto vegetais como animais) apropriadas, mas também existe a possibilidade de se utilizarem sistemas sem céluIras. As proteínas de suporte utilizadas neste caso podem conter quaisquer funções, conforme as características que se queiram que proporcionem a uma fusão proteica, como, por exemplo, determinadas funções de transporte, funções que melhoram a purificação da. fusão proteica ou a sua estabilidade e muitas mais. As proteínas de suporte preferidas são exemplificadas mais abaixo.

A cisão de fusões proteicas conforme o processo de acordo com o invento realiza-se, de preferência, através de Ig-ase, a qual é produzida por uma estirpe de bactérias não patogénica, superprodutiva, e obtida a partir da solução sobrenadarte de culturas, por purificação (ver, por exemplo, a 0E-36 2.2 221).

processo de acordo com o invento pode ser aplicado tanto para fins preparativos como para fins analíticos. No caso de ser aplicado preparativamente, o processo serve para a obtenção bíotecnológica de proteínas importantes, as quais podem ser utilizadas, por exemplo, na medicina, na investigação científica, na. protecção do meio ambiente, ou em processos ou produtos industriais. Na aplicação analítica, o processo pode servir, por exemplo, em combinação com sistemas de expressão apropriados, para a análise de rotina de fusões de genes.

Uma forma de realização preferida do processo de acordo com o invento, para a cisão erizírnátíca de proteínas fundidas e a obtenção de partes desejadas destas proteínas fundidas é caracterizada por (1) se transformar uma célula com um AON recombinante ou com um vector recombinante, contendo o AON ou o vector, neste caso,, pelo menos uma cópia de um gene que codifica uma proteína fundida que contém, numa região transitória, pelo menos um

124 fâl 1266 (3330)

C

tf:*' local de reconhecimento da IgA-protease» (2) se cultivar a célula transformada num meio apropriado, (3) se Induzir, na célula transformada, a expressão do gene que codifica a proteína fundida, (4) se cindir a proteína fundida através de IgA-protease e (5) se Isolar uma ou várias partes» desejadas» da proteína fundida»

J

Neste caso, o tratamento da proteína fundida com IgA-protease pode realizar-se no meio (caldo de cultura), após a ruptura celular e/ou após a separação» parcial ou total, de proteínas celulares.

Para o tratamento de uma proteína fundida» de preferência um produto de expressão procaríótico, prefere-se» além disso, imobilizar a IgA-protease de maneira em princípio conhecida pelo perito, como se descreve, por exemplo, na EP-B 0 141 223 ou na EP-B 0 141 224.

Uma aplicação partícularmemte preferida do processo de acordo com o invento é a produção de proteínas ou péptídos recombinantes sem resíduo de metionina N-termínal, a partir de proteínas ou péptídos fundidos com a sequência de aminoácidos Met-Y-ProiX-Pro-A, na qual X representa um aminoácido qualquer, de preferência Thr, Ala ou Ser, Y representa um ou vários aminoácidos quaisquer os quais terminam - no caso de X representar Thr ou Ala - com Pro ou - no caso de X representar Ser - com a sequência Pro-Ala ou Pro-Pro, e A representa uma sequência de aminoácidos qualquer» A proteína ou o péptido fundidos são cindidos através da IgA-protease e obtém-se um produto de cisão com a sequência de aminoácidos X-Pro-A. Este processo para a produção de proteínas recombinantes a partir de células procarióticas sem resíduo de metionina N-termínal compreende, por exemplo, os passos seguintes:

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QI 1266 (3330)

27' er

ÇígSS®

13— (D transformação de uma célula procariótíca com um gene que codifica uma proteína ou um pêptido com a sequência de aminoãcidos Met-Y-Pro“ 1 X-Pro-Α, na qual X, Y © A têm os significados acima indicados.

(2) cultura da célula transformada num meio apropriado e expressão do gene transformado, (3) cisão do produto de expressão da célula transformada, com a sequência de aminoãcidos Met-Y-Pro“lX-Pro-A, através de IgA-protease, e (4) isolamento do produto de cisão resultante com a sequência de aminoãcidos X-Pro-A sem resíduo de metíonina N-terminal„

Através do processo de acordo com o invento, é possível obter, num só passo, com um rendimento surpreendentemente elevado e com uma boa especificidade, proteínas sem resíduo de metíonina N~terminal, as quais possuem a sequência M-termínal X-Pro, na qual X representa, de preferência, Thr, Ala ou Ser.,

A parte de suporte da proteína fundida, Y, representa uma sequência de aminoãcidos de preferência de pelo menos um até 100 - sendo particularmente preferidos 1 a 50 - aminoãcidos, sequência essa que termina com uma sequência de cisão reconhecida pela IgA-protease. No caso de X representar o aminoácido serina, Y termina, de preferência, com a sequência Pro-Ala ou Pro,. No caso de X representar Thr ou Ala, Y termina, de preferência, com Pro, ou melhor, com Arg-Pro, Pro-Arg-Pro ou Ala-Pro-Arg-Pro.,

Numa forma de realizaçao particularmente preferida senta, pelo menos, 5 aminoãcidos, os quais terminam com cia Pro-Ala-Pro-Arg-Pro„ No entanto, para o processo com o invento são, em princípio, apropriados todos os , Y reprea sequênde acordo locais de cisão reconhecidos pela IgA-protease.

A parte de suporte Y pode conter aminoãcidos, em princípio quaisquer, de além disso, outros p ref e rên cia até .100., utili72 124 _c

ΘI 1266 (3330) //

-/7/./

-14- ' ^: sendo parti cu larmente preferido até 50., De pref erência, zam-se, neste caso, sequências de aminoácidos tais que melhorem,, ao nivel do AON, a expressão da proteína Met-Y-Pro-lX-Pro-A, e/ou facilitem, ao nível dos aminoácidos,, a sua purificação a partir da célula.,

A expressão da proteína Met-Y-Pro”1“X-Pro-A, ao nível do AON, pode ser melhorada, por exemplo, pela fusão com fragmentos do gene de β-galactosidase, o que quer dizer que a parte de suporte Y compreende uma parte da proteína de β-galactosidase.. Os peritos conhecem outras possibilidades de aumentar a expressão da proteína Met-Y-ProíX-Pro-A. A purificação e a separação do produto de expressão podem ser facilitadas por uma fusão com outros polipéptidos, sobretudo com aqueles de carga elevada (por exemplo, poli(Lys, Arg)) ou com polipéptidos ou proteínas que se ligam com alta afinidade a determinadas substâncias (por exemplo, ostreptavídiria), (ver, por exemplo, a LP-A 0 089 626, e a EP-A 0 306 610)Um outro objecto do presente Invento é uma proteína fundida que contém várias partes polipeptídicas e que apresenta, inseridos em, pelo menos, uma região transitória entre diferentes partes polipeptídicas, um ou vários locais de reconhecimento da IgA-protease com a sequência de amírioácidos Pro”I”X-Pro, na qual X representa um aminoácido qualquer, de preferência, no entanto, Ser, Thr ou Ala. Prefere-se particularmente que o local ds reconhecimento possua a sequência de aminoácidos (a) Pro-Ala™ P r o ” ί Ser-Pro, (b) Pro-Pro·!“Ser-Pro, (c) Pro-Arg-ProProí*Ala-Pro, (d) Pro-ProíThi—Pro, (e) Ala-Pro-Arg-Pro™

Pro*!’Thr-Pro ou (f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-ProíThi—Pro, na qual ”í índica o local de cisão, presente invento compreende também uma proteína ou um peptido com a sequência de aminoácidos Met-Y-Pro“íX-Pro-A, na qual X representa, de preferência, Thr, Ala ou Ser, Y representa um ou vários aminoácidos quaisquer e termina - no caso de X representar Thr ou Ala ™ com Pro ou - no caso de X representar Sercom a sequência Pro-Ala ou Pro, e A representa uma sequência de ta 72 124

GI 1266 (3330)

-15aminoácidos qualquer. Uma tal proteína ou péptido ê expressa, de acordo com o processo de acordo com o invento, pela transformação de uma célula procariótica coe um vector recombinante que contém, pelo menos uma cópia de um gene que codifica tal proteína ou péptido. A sequência A pode representar uma sequência de aminoácidos qualquer. No entanto convém não haver, dentro desta sequência de aminoácidos, nenhum outro local de cisão para a IgA-protease,

Um outro objecto do presente invento é um ADN recombinante que codifica uma proteína ou um péptido de acordo com o invento, existindo em, pelo menos uma região transitória da proteína fundida inserções^de um ou vários locais de reconhecimento ou sequências de cisão,· respectivamente, de IgA-protease.

Um ADN recombinante de acordo com o invento pode ser obtido por méledos que o perito no domínio da biologia molecular conhece. Para isso cinde-se, habitualmente, um vector que contém uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos A, através de endonuclease(s) de restrição, na região do terminal 5* deste gene, religado a oligonucleótidos que contêm a sequência desejada. 0 oligonucleótido tem que conter, neste caso, uma sequência que codifica um local de cisão da IgA-protease ou uma parte dele.

Também é outro objecto do presente invento ura vector recombinante que contém, pelo menos, uma cópia de um ADN recombinante de acordo com o invento. Os peritos conhecem os vectores básicos apropriados para a expressão da proteína em organismos procarióticos. Convém que tal vector seja um que permita uma elevada expressão do ADN recombinante de acordo com o invento. G ADN recombinante está no vector, de preferência, sob o controlo de um sinal de expressão capaz de ser induzido (por exemplo, lambda, promotores tac, lac ou trp).

vector de acordo com o invento pode estar integrado tanto de forma ex tr acromossomal (por exemplo, plasmídeo) como no genoma do organismo hospedeiro (por exemplo, bacteriófago lambda). 0

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GI 1266 (3330) lo z..

vector de acordo com o invento é, de preferência, um plasmídeo,, 0 perito em biologia molecular conhece vectores apropriados para a expressão de genes num determinado organismo hospedeiro,. Pode tratar-se de um vector eucariotico, mas de preferência, é procariótico. Como exemplos de vectores possíveis, próprios para a expressão do AON de acordo com o invento, em procariotas, podem mencionar—se vectores pUC e pUR de tipo comercial.

Um outro objecto do presente invento é uma célula, de preferência uma célula procariótica - prefere-se partícularmente uma célula de E. coli - transformada com o AON recombinante de acordo com o invento e/ou com um vector recombinante de acordo com o invento.

Exemplos para proteínas que possuam a sequência N-terminal X~Pro, na qual X representa Thr, Ala ou Ser, e que possam ser obtidas num só passo através do processo de acordo com o invento, são, por exemplo, eritropoietina humana, a cadeia ti do receptor de células T humanas e, particularmente, o facto estimulador de granulócitos humano (G-GSF).

G-CSF é sintetizado como linfoquina, por monocitos, macrófagos assim como por uma série de outras linhas celulares. As 1infequinas participam no amadurecimento de células do sistema imunitário ou das células sanguíneas. Estimulam o amadurecimento de células de base da medula óssea em células diferenciadas. Assim, por exemplo, o G-CSF induz a formação de neutrófilos e granulócitos.

Como o G-CSF é capaz de aumentar, significativamente, dentro de um curto período de tempo a população de células neutrófíIas, para o G-CSF resultam campos de aplicação terapêutica importantes. Assim, por exemplo, seria possível aplicar o G-CSF após uma quimioterapia, no tratamento do cancro, na qual as células do sistema imunitário são destruídas. Além disso, o G-CSF poderia ser utilizado em transplantações d© medula óssea, em queimaduras graves, em infecçoes oportunistas, qu® se devem a uma deficiência, imunitária, e em leucemia.

124

1266 (3330) . ~-2 ”'' tf^;·'

-170 G-CSF é uma molécula proteica de secreção. 0 primeiro produto de tradução contém, por isso, uma sequência de sinalização N-terminal, a qual é cindida na secreção de modo a que a sequência de Q-C3F maduro começa com os aminoácidos Thr(+1 )“Pío(+2) (posições de aminoácidos -5-1 s -5-2). Na produção de G-CSF, em procariotas, este péptido de sinalização não é cindido, ou só o ê com dificuldade, de modo que para se obter, a partir de procariotas, G-CSF sem sequência de sinalização, é necessário clonar um AUG(Met), como codão de iniciação, a montante da sequência ds ADN que codifica o G-CSF maduro, sequência essa que começa com Thr(+l)-Pro(+2). Era consequência disso exprime-se, em procariotas como, por exemplo em E. coli, um, G-CSF que contém metionina na posição de aminoácidos -1.

Através do processo de acordo com o invento é possível produzir de maneira fácil, a partir de procariotas, um G-CSF isento de metionina na posição de aminoácidos -1, o qual começa com os aminoácidos Thr(+l)-Pro(+2).

Isso faz-se por se obter, a partir de procariotas, um derivado do G-CSF, que contém, nas posições +1 e -5-2 da sequência de aminoácidos os aminoácidos Thr(-5-1 )-Pro(+2), e a montante, em relação à posição -1 da sequência de aminoácidos, uma sequência de aminoácidos reconhecida por IgA-protease, podendo ser separada da sequêncioa de aminoácidos do G-CSF a qual começa com Thr(+l)-Pro(+2),

Numa forma de realização preferida, o derivado contém, nas posições -1 e -2, um Pro, da posição -3 á posição -1 a sequência de aminoácidos Arg-Pro-Pro, das posições -4 a -1 a sequência de aminoácidos Pro-Arg-Pro-Pro, ou da posição -5 à posição -1, a sequência de aminoácidos Ala-Pro-Arg-Pro-Pro,

Numa forma de realização particularmente preferida, o derivado contém, da posição -6 à posição -1, a sequência de aminoácidos

-6 -5 -4 -3 -2 -1

Pr o-A1a-Pro-Arg-Pr o-Pro.

fi. /

124

SI 1266 (3330)

-ÍSNo presente invento, por G-CSF entende-se G-CSF existente na natureza, cuja sequência é descrita, por exemplo, em Science 232 (1936) 61, assim como os seus derivados com eficácia na estimulação de granulócitos, cujas sequências de aminoãcidos começam com X(+l)-Pro(+2). X representa Thr, Ser ou Ala, prefere-se particularmente Thr.

O derivado de e-CSF de acordo co® o invento pode ser cindido, após a expressão em procariotas, por um tratamento com IgA-protease, entre as posições eí e -1 (entre Thr 0-1) e Pro(-l)). Assim obtém-se, através de um só passo hidrolitico, um G-CSF isento de metionina na posição -1, cuja sequência ds aminoãcidos começa, no terminal N, com os aminoãcidos Thr(+1)-Pro(+2) do G-CSF existente na natureza.

Na expressão de G-CSF em procariotas formam-se agregados dificilmente solúveis (refractile bodies), que são inaetivos. Antes de a proteína poder ser utilizada, por exemplo, para fins terapêuticos, é preciso transformá-la na sua forma activa. Nos processos familiares ao perito (ver, por exemplo, EP-A 0 219 874, EP-A 0 114 506, HO 84/03711), realiza-se em primeiro lugar, uma solubilização através da adição de desnaturantes, seguida por uma renaturação e, eventualmente, por outros passos de purificação. 0 tratamento da proteína de acordo com o invento com IgA-protease pode ser realizado antes da solubilização, após a solubilização ou apenas cipós a renaturação. No caso de se querer realizar o tratamento com IgA-protease imediatamente após a solubilização, é preciso separar o agente de solubilização (por exemplo, hidrocloreto de guanidina ou ureia) através de uma diálise, antes de se adicionar a IgA-protease. No entanto, o tratamento coa IgA-protease é realizado, de preferência, após a renaturação, por o rendimento de G-CSF, neste caso, ser particularmente elevado.

As condições para o tratamento com IgA-proteases de G-CSF ou de uma outra proteína a ser cindida são, no fundo» pouco críticas. Prefere-se, no entanto, aplicar o G-CSF (ou uma outra proteína), em relação à IgA-protease, numa proporção em peso de

1.:.1 a 100:1» A transf ormação reali2a-se, de preferência, ea

124 θI. 1266 ( 333 Ο )

-19solução tampão aquosa com um pH entre 6.,5 e 8.5. A concentração do tampão encontra-se, de preferêneia, entre 50 e 300 mmol/1, eventualmente com adição de 20 - 100 rnmo'1/1 de cloreto de sódio,. A cisão é realizada;, de preferência. â temperatura ambiente, durante 20 - 60 minutos.

Depois da solubilização, renaturação e cisão com IgA-protease, o produto de cisão assim obtido é purificado, de preferência., através de permuta iónica e fraccíanamento segundo o tamanho» Devido á. presença de outras proteínas a impureza do G-CSF isento de metionina ria posição -1, obtido deste modo, é inferior a 0,1%« de preferência inferior a 10“°%„

G-CSF isento de metíonína na posição -1 pode, portanto, ser separado da proteína fundida que contém metionina ou purificado, praticamente de forma quantitativa, através de uma cisão por meio de igA-protease.,

Através do processo de acordo com o invento é possível obter, a partir de procariotas, um fâ-CSF recombinante contaminado por outras proteínas ά menos de 0,1%, de preferência a menos de 10 e quantitativamente isento de um G-CSE que contem metionina na posição -1, obtido a partir de procariotas»

Um objecto do presente invento é também um produto farmacêutico com base num G-CSF. como substância activa, obtido a partir de procariotas, .através do processo de acordo com o invento, eventualmente em combinação com veículos e substâncias de enchimento e auxiliares farmaceuticamente usuais., Um produto farmacêutico deste tipo é adequado, sobretudo, para tratamentes farmacêuticos em que se pretende estimular a formação de granulõcitos particularmente de neutrófilos»

As preparações farmacêuticas de acordo com o invento são aplicadas, de preferência, como soluçoes para injecção © infusão,.

Isto pode ser feito obtendo-se uma solução que já esteja preparada para ser injectada, a qual tenha a composição de acordo com o invento. No entanto é também possível obterem-se as h'.‘t

72. 124 (31 1266 (3330)

-20preparações farmacêuticas sob forma de líofilízados. Estes são, então, reconstituídos através de agentes ou soluções, em principio conhecidos, próprios para serem irijectados. Como meio de injecção aplica-se, de preferência, água que contenha os aditivos usuais para soluções injectãveís como, por exemplo, agentes de estabilização, solubilizarites, tampões e aditivos xsotónícos como, por exemplo, NaCl em concentração fisiológica,. Aditivos deste tipo cão, por exemplo, manitol, tampões de tartarato ou citrato, etanol, formadores de complexos como, por exemplo, ácido etilenodiaminotetraacétíco e os seus sais não tóxicos, bem como polímeros de peso molecular elevado como, por exemplo, óxido de polietileno líquido, para a regulação da viscosidade» Substâncias liquidas que servem para veículos para soluções injectãveís têm que ser estéreis e são colocadas, de preferência, em ampolas.

Finalmente, o presente invento compreende também, a utilização de C3-CSF-, isento de metionina na posição -1, obtido a partir de procariotas para a produção de preparações farmacêuticas de acordo com o invento. No caso de se obter, como produto resultante da cisão de uma qualquer proteína fundida através do processo de acordo com o invento, uma proteína X-Pro-A (ria qual X representa um aminoãcído qualquer e A uma· sequência qualquer de aminoácidos), a qual tem no entanto, na sua extremidade amino, um dipéptído não desejado X-Pro, este dipéptído não desejado pode ser separado, como parte do processo de acordo com o invento, pelo tratamento subsequente com dípeptídílamíno-peptídases (DPAP)„ As dípeptídílamíno-peptídases foram encontradas, até agora, numa série de microrganismos, insectos, anfíbios e em vários tecidos humanos. Servem, por exemplo, para o processamento, passo a passo, de proteínas precursoras e possuem, ern parte, uma especificidade acentuada para a decomposição do terminal amino do dipéptído X-Pro (X-Pro-DPAPase; G„ Kreil, Trends in Bíochemical Sciences 15, 23-26, 1990). Pela combinação, de acordo com o invento, de Ig-ase

X~Pro-DPAP assim, possível produzir proteínas desejadas com quaisquer aminoácidos amino-terminais.

Através da combinação acima descrita de Ig-ase e X-Pro-DPAP consegue-se, então, produzir também, a partir de procariotas.

s'28*

1.24

166 (3330)

-21coííi uma outra sequência de aminoácidos N-terminal sem na posição -í. Para este fim obtém-se, primeiro, uma fundida que possui a sequência de aminoácidos X-Pro-A, sendo, neste caso, a sequência de amino, sem os dois aminoácidos N-tsrminais X-Pro, a parte da proteína a exprimir.

proteínas metieni na proteí na Met-V-Pro ácidos A desejada produto de expressão da célula procariótica, cosa a sequência ds aminoácidos Met-V-Pro’!’Χ-Pro-A cinde-se, em primeiro lugar, por meio de IgA-protease, de modo a resultar um primeiro produto de cisão com a sequência de aminoácidos X-Pro-A»

Esta proteína pode, então, ser tratada como acima descrito, com uma dipeptidilamino-peptidase, que reconhece de maneira específica a sequência X-Pro, cindindo-a a jusante de Pro. Desta maneira, obtém-se um segundo produto de cisão com a sequência de ã!:íirsoácivk>s, em princípio arbitrária, A. 0 processo de acordo co® o invento revela-se, assim, como extremamente útil para a produção de proteínas sem o resíduo de metíonína N-terminal, muito diferentes, não se limitando só ã produção de proteínas com a sequência N-terminal X-Pro, na qual X representa, de preferência, Ser, Thr ou Ala.

Finalmente, o presente invento compreende também um ADN recombinante que contém uma região que codifica um local de reconhecimento de IgA-protease (acima definido) e que é apropriado para ser inserido num local de transição ds proteínas fundidas. De preferencia, trata-se de um fragmento de ADN sintetizado quimicamente, em cujos terminais se encontrem, vantajosamente, um ou vários locais de restrição apropriados.

Definições terminológicas:

o processo de acordo com o invento compreende a obtenção biotecnológica de proteínas desejadas» Biotecnológica quer dizer, neste contexto, que se obtém uma proteína desejada ou um produto intermediário da mesma, com utilização de meios ds engenharia genética s por outros processos biotecnológicos (por exemplo.

124 tí I 1266 (4330 )

fermentação de microrganismos),,

Uma proteína desejada é um produto intermediário ou um produto acabado que pode ser utilizado, por exemplo, na medicina;, na Investigação, na protecçâo do meio ambiente, ou em processos ou produtos industriais» processo de acordo com o invento compreende a formação de uma proteína desejada a partir de uma proteína fundida (também designada por fusão proteica), a proteína fundida, ou a fusão proteica, sendo compostas por vários parceiros de fusão ligados uns aos outros de forma covalente» Neste contexto, pelo menos um dos parceiros de fusão é uma proteína desejada» A ordem dos parceiros de fusão e o seu grau de repetição numa proteína fundida são arbitrários; de preferência, porém, consiste numa proteína de suporte no terminal amino e numa proteína desejada no carbox.1»

Uma proteína de suporte ou uma parte de suporte, respectiva·mente, servem para proporcionar à proteína desejada, sob forma duma proteína fundida, propriedades particulares» Tais propriedades podem manifestar-se, por exemplo, num aumento de estabilidade das proteínas fundidas assentes em particularidades estruturais e, em consequência disso, numa resistência maior às proteases celulares, ou também, no transporte das proteínas fundidas para um ambiente de actividade proteolxtica reduzida» Além disso podem existir, na proteína de suporte, propriedades que permitam uma purificação gra-se, por eficaz das proteínas fundidas» Neste contexto Iriteexemplo, a ligação de certos lígantes em relação com métodos de cromatografia de afinidade, o depósito das proteínas fundidas em corpos de precipitação facilmente separáveis e o transporte das proteínas para locais facilmente acessíveis»

As regiões dentro de uma proteína fundida nas quais os componentes (proteínas de suporte e proteínas desejadas) de uma proteína fundida entram em contacto uns com os outros, são chamadas regiões transitórias»

Cada uma das regiões transitórias pode ser definida por uma

124

GI. 1266 (,3330.)

23ou várias sequências de aminoãcidos» As sequências de aminoácidos (como também todas as outras cadeias de aminoácidos e proteínas) sao compreendidas © representadas a partir da extremidade amino (à esquerda), e em direcçâo à extremidade carboxilo (à direita)»

Nos limites do processo de acordo com o invento, todas as sequências de aminoãcidos em regiões transitórias aptas para serem cindidas por IgA-proteases contêm a sequência de cisão ou sequência de reconhecimento,.

local entre dois aminoãcidos de uma sequência de aminoãcidos no qual se realiza a cisão de proteínas fundidas, ou fusões proteicas, é designado por local de cisão» processo de acordo com o invento compreende a cisão enzimática de proteínas fundidas nas regiões transitórias, através de IgA-protease» Por IgA-protease, ou Ig-ase, entendem-se, nos limites do processo de acordo com o invento, a

IgA-protease da estirpe Neisseria_____gonor.rhoe.ae_.......MS.11 e todas as outras enzimas relacionadas com esta protease ao nível nucleotídico e pelo seu processo de formação» A este grupo pertencem, também, riomeadamente as IgA-proteases das espécies Nelsseria © Haemophil.us.» microrganismo E» coli ED 8654 foi depositado com o número OSM 2102, na Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen” (Colecção Alemã de Microorganismos), Gríesebachstrafle 8, 3400 Gottingen»

Os exemplos seguintes ilustram, em combinação com as figuras, o invento,,

As figuras representam?

A figura 1 mostra esquematicamente a fusão proteica entre a proteína de suporte MS2-polimerase (99 aminoãcidos) e o domínio β (posições de aminoácidos 1195-1505) do precursor de IgA-protease originário de N».....gonorrhoeae HS11» A região transitória entre estas duas partes consiste em 12 aminoãcidos e

1.24

Ci I 1266 (3330) ι-V

contém a sequência d© cisão -Pro-Pro í “Thi—Propara Ig-ase» Para a construção do local de cisão foram inseridos os quatro oligonucleôtidos (1) a (4) entre os locais d® restrição Eco RI e HindIII» A produção do polípéptido e a cisão por meio d® Ig-ase purificada são exemplificadas mais pormenorizadamente no exemplo 5«

A figura 2

A Figura 3

A figura 4 mostra uma fusão proteica entre a proteína de suporte (99 aminoácidos da MS2-polinerase e 6 aminoácidos codificados por ura plasmídeo e 206 aminoácidos da proteína CD8 de li nfócitos T humanos» Na sequência de aminoácidos da proteína COS hã uma sequência natural de cisão que se cinde por meio de IgA-protease (ver o exemplo 6)» mostra a fusão proteica B63*, que foi produzida por meio de um sistema de expressão-secreção, por células de E„ coli» Ela consiste, na extremidade amino na sub-unidado toxina B da cólera (103 aminoácidos), seguida por uma região de ligação (11 aminoácidos) com o local de cisão de Ig-ase, e, na extremidade carboxilo, numa parte (posições de aminoácidos 1097-1160) do domínio β do precui— sor de IgA-protease» 0 local de cisão de Ig-ase foi inserido entre os dois domínios de proteína, por meio dos dois oligonucleôtidos TkOOó e Tk007„ mostra esquematicamente as fusões proteicas 849 e B59» Consistem na sub-unídade toxina B da cólera e no domínio β do precursor de IgA-protease. Entre estas existem duas regiões transitórias diferentes, com duas sequências diferentes de cisão de Ig-ase (-Pro-Pro-Ala-Pro- e -Pro-Pro-Thr-Pro-)» A sequência d© cisão foi construída por meio de oligonucleôtidos sintéticos (ver a figura 3).

124

1266 (3330)

Exemplo.....1

Cpnst.ruçáo....de.....um plasmídeo para.....a.....expressão.....de... um.....Q.zCSF.....í.sento....de metionina

A construção é realizada utilizando o vector de expressão pPZOT-mgllac (WQ 38/09373). Para esta finalidade, o vector de expressão pPZG7-mgllac é cincfido por meio de Nco I, e as extremidades salientes são eliminadas por meio de nuclease de feijão mungo. A seguir, torna-se a cindir o vector por meio de Bam Hl. A sequência de reconhecimento de IgA é obtida, ao nível do AON, através dos olígonucleótidos seguintes.

Oligonucleotido A: 5^;‘ A AT TCG GAG GAA CTG 00C CCT G 3^!i

AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA

Oligonucleotido B:

GAT CC A0G 0CC CAG T00 TGT AGQ AG0 TCG CAG TGG TGT CAT TAA TTT

TTC CTC CGA ATT 3’

Os dois olígonucleótidos eguimolares e inseridos, num « são adicionados em quantidades xcesso de .100 vezes, no vector pPZOT-mgllae cindido como acima descrito. Após se uma religaçâo, transformam-se células de E. coli ter efectuado K12, tornadas competentes de maneira usual. Oe acordo com métodos AON é isolado das células e cindido por meio de Apa conhecidos, I e Bam Hl.

isolado um fragmento de G-CSF, com um comprimento de cerca de 520 pb, a partir da sequência de G-CSF (Science utilizando para este fim as endonucleases d« BamHI. Este fragmento é ligado dentro do cindido por meio de Apal e BamHI.

:32 (1.986), 61-65), restrição Apa I e vector igualmente

Exemplo.....2.

sequência de reconhecimento de IgAl, a proteína conter também péptidos como auxiliares para a Estes podem consistir no AON que codifica estreptaeste fim clona-se um gene de estreptavidina (WO 39/

Além da fundida pode purificação, vidína. Para

124

QI 1266 (3330)

-26/03422) na estrutura de tradução correcta, sequência de reconhecimento de IgA-protease.,

' / 3' * ‘

t.? Lá a montante da

Exemplo.....3

São transformadas, por meio do plasmídeo descrito no exemplo 1, células de E, colí K12 (l~0 8654, DSM 2102), seleccionadas no marcador de antibióticos (ampícillína) e o plasmídeo é caracterizado por análise de restrição. cultura e a expressão de G-CSF., As integral., Este meio contém, por (Difco), g de extracto de levedura (Dífco) e ste clone é utilizado para a células são cultivadas em meio litro, .16 g de bactotriptona g de cloreto de sódio,. Deixam-se crescer as células até a uma a 546 de 2,0, submetendo-as a uma 4 horas, as células com lisozima/EDTA e inclusão (IB, ver a indução através de IPTG 10^ mol/1. são recolhidas por centrifugação o C3-CSF é isolado sob forma d®

EP-A 0 219 874)

Após mais rompidas corpos de

A desnaturação ou renaturação, respectivamente, das partículas de fusão de (3-CSF :i descreve a EP-A 219 874.

nsolúveis, isoladas, realiza-se como o A desnaturação é realizada através de diálise contra hidrocloreto de guanidina a 6 mol/1. Pode retirar-se uma alíquota que pode ser aplicada, depois de uma diálise contra tampão de fosfato de potássio a 5 mmol/1, com pH 7, para a cisão através de IgA-protease (exemplo 4).,

Alternativamente, é possível realizar, após a desnaturação em hidrocloreto de guanidina, uma diálise contra um tampão de fosfato de potássio a 5 mrnol/1, com pH 7, o qual contém (38H a 1 mmol/1 e GSSG a 3 mmol/1. Após uma renaturação, realiza-se, também, neste caso uma diálise contra tampão de fosfato de potássio a 5 mmol/1, com pH 7.,

Exemplo.....4

Cisão........da........proteína........fundida por.........meio.....de......IgAl-protease.......para........a,

P.r.Ç.dg..ç.ão.„.de.....um... 6-CSF.. nativo.....sem.....metí.on..in.a.....n..a....p,ps..i.ç.á.o.....,-l.

A IgAl-protease é isolada como se descreve em EMBO dour

124 / ^?

GI 1266 (3330)

-27(1984), 1595-1601. São adicionados 2-5 μα de IgA-protease a 10 pg de G-CSF renaturado ou desnaturado de acordo com o exemplo 3 fazendo-se uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. 0 G-CSF isento de metionína pode ser isolado através de diferentes colunas de permuta iónica como, por exemplo, Mono-Q ou Mono-S. Uma sequenciação proteica da extremidade amino dá como resultado que o G-CSF purificado começa com a sequência de aminoácidos correcta Thr(+l)-Pro(+2).

Exemplo.....5.

Produção........de........uma.........fusão.......proteica....._.e_______cisão......de........agregados________proteicos.

insolúveis.....o.ri.g.i.n,ã.ri.os.......de......corpos..,,,, de......inclusão,........num........local.......de.......cisão.

e.speçí.f.iç.o....de......Ig.-ase...

vector de expressão procariótico pEXSlC (K. Strebel, úournal of Virology 57, 983-991, 1986) foi modificado de modo que uma fusão proteica produzida em excesso com este sistema em células de F. coli pudesse ser cindida, através d® Ig-ase, na proteína de suporte e na proteína desejada. Para este fim, foi composto, a partir de oligonucleõtidos produzidos sinteticamente, um fragmento de ADN de cadeia dupla, o qual codifica a sequência de aminoácidos Thi—Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-ProiThi—Pro. Este fragmento de AON foi inserido, através de métodos de engenharia genética, no local de cisão de EcoRI do vector de expressão pFX31C. Além disso foram Inseridos, Imediatamente a seguir, no local de cisão de HindIII, dois outros fragmentos de ADN sintéticos contendo uma série de locais de cisão apropriados para endoriucleases de restrição e sinais de bacteríanas que participam na expressão expressão pEV37 formado desta maneira paragem para as enzimas do gerie. No plasmídeo d® foi inserido, usando os locais de cisão para Smal e HindIII, um fragmento de ADN que codifica o domínio β da proteína precursora de IgA-protease, originária de N.ei sseria.....gonor r.h oeae.....M81.1..

Desta forma, foi formado um gene híbrido cuja expressão em

F. coli deu origem à produção de uma proteína fundida. Esta continha, na extremidade amino, como proteína de suporte, 99 aminoácidos da HS2-polimerase, seguidos por uma região transito72 1.24 (31 1266 ¢3330)

tf'-·ria central de 12 aminoácidos com a sequência de cisão de em na extremidade carboxilo, o domínio β desejado (ver a 1) » Por meio de Ig-ase purificada, o domínio lâ da extre carboxilo da fusão proteica pôde ser separado pela cisão no de cisão Pro„l„Thr dentro da região transitória»

Ig-ase figura midade local plasmideo com o gene híbrido foi introduzido, através de transformação, em células de E„ coli que continham, para a superprodução regulável da fusão proteica, o factor regulado CI^Ô^^?Í originário do bacteriofago lambda (E. Remaut, Gene 22, 103.113, 1983). Pelo aumento da temperatura de 28°C a 42”C, ínactivou-se o repressor de CI

857 e activou-se, em consequência disso, a produção de proteína nas células de E„ coli recombinantes. Para este fim, foram transferidos 50 ml de uma cultura de E.. coli, desenvolvida durante 12 horas a 28^OC, para 200 ml de um meio previamente aquecido a 45°C, e prosseguiu-se a cultura durante 2 horas a 42°C. Durante este passo, a fusão proteica foi concentrada no citoplasma das bactérias, em grandes quantidades, sob forma de corpos de inclusão. As bactérias foram recolhidas, a seguir, por centrifugação, suspensas em 20 ml (10% de sacarose, Tris/HCl 50 mH com pH 8,0, uma adição de 400 μ.1 de solução de lisozíma (5 de tampão de lise EOTA 1 mM) e, após mg/m1)), incubadas durante 30 minutos a 22°C. 0 detergente Triton X-100 foi adicionado até atingir uma concentração final de 0,1%, e a solução foi novamente incubada durante 30 minutos. 0 AON libertado durante a lise das células foi fragmentado por um tratamento com ultra-som, os componentes insolúveis - a fusão proteica presente sob forma de corpos de precipitação, entre outros - foram separados por centrifugação e, a seguir, lavados em 5 ml de tampão H1MTE (ureia

N, NaCl 50 mM, Tris/HCl 50 mH, com pH 8,0, EOTA 1 mM) „ Depois de ser separado de novo por centrifugação, o sedimento foi suspenso, por exposição a ondas sónicas, em 5 ml de tampão PBS (fosfato de potássio 20 mH com pH 7,5, NaCl 140 rnM), e lavado. Este processo foi repetido várias vezes, para eliminar completamente resíduos de ureia,. Finalmente, a fracção insolúvel contendo a proteína fundida foi suspensa, por exposição a ondas sónicas, em ml de tampão PBS

124

GI 1266 (3330) “29tf

A qualidade e a quantidade de fusão proteica suspensa foram determinadas através de electroforese em SDS-gel de poliacrílamida (12,5%) e coloração subsequente com azul de Coomassíe. Para efectuar a cisão, a suspensão proteica foi incubada durante 3 horas a 37*0, oom uma razão enzíma/substrato de 1/100 (p/p). A cisão efectuada foi examinada por uma electroforse analítica em SDS-gel de políacrílamida, a qual deu como resultado a formação de um polipéptido dc tamanho esperado para a proteína β. Esta proteína foi transferida para uma membrana de nitrocelulose e submetida a uma análise sequencial «automatizada. A sequência de aminoãcidos terminais confirmou a sua formação a partir de fusão proteica através de uma cisão correcta no local de cisão de Ig-ase existente.

No entanto, foram transformados, na cisão, apenas até, aproximadamente, 50% da quantidade total do substrato aplicado.

Pela «adição de maiores quantidades de Ig-ase e tempos de reacção, nâo foi possível conseguir percentagem. Isto é um indício de, proteína fundida, o local de cisão não pelo aumento dos um aumento dessa na parte não cindida ser acessível à lg-ase da

A proteína híbrida e os produtos de cisão continuavam a estar presentes, após a incubação com Ig-ase, sob forma de agregados insolúveis, e podiam, em consequência disso, ser sedimentados da suspensão pela centrifugação. Na cisão foram obtidos rendimentos até 90%, no caso inclusão suja, de se utilizar, em vez da fraeção de corpos de uma fusão proteica que já tinha passado «antes por uma fase adicional de purificação. Para este fim, o sedimento insolúvel foi «absorvido, «após uma lavagem em tampão Μ.1ΝΪΈ (ver acima), em 5 ml de tampão H7NTE (ureia 7 M, NaCl 50 mM, Trís/HCl 50 mM com pH 8,0, EDTA 1 mM). As partes insolúveis foram separadas por centrifugação e a fraeção solúvel foi dialisada a 4°C, contra 5 1 de tampão PBS. Durante a eliminação da ureia através de diálíse, a proteína fundida precipitou da solução sob forma de agregados insolúveis. Os agregados precipitados foram transformados, por um tratamento com ondas ultrassónicas, numa suspensão fina e, como acima descrito, cindidos por meio de Ig-ase e analisados.

2 12 4

1266 (3330)

Exomplo.....6

C.:isãp........específ. iça........de........uma________fusão.......proteica........ronatu.rada„s.olúvel..,...........por.

meio de.....Ig-ase

Utilizando o sistema de expressão pEX, produziu-se uma proteína híbrida (ver o exemplo 1) , a qual consiste na MS2-polímerase e numa parte da proteína C08 de linfócitos T citotóxioos humanos (ver a figura 2)» Após a pré-purificação e a lise da proteína obtida a partir dos corpos de inclusão, em tampão Η7ΝΊΈ, foi aplicado, como mais uma fase de purificação, um SOS-gel de poliacrilamida preparativo 12,5%» Após a coloração com azul de Coomassie, a fusão proteica foi recortada do gel como banda isolada, e isolada do material do gel através do método de Hunkapíller (Methods in Enzymology 91, 227-235, .1983)» A electroeluiçao foi realizada, neste caso, em tampão TAE (Tris/acetato 40 mM, com pH 7,9) com a adição de 0,1% de SOS (dodecilsulfato de sódio)» 0 SOS foi depois eliminado pela diãlise contra 5 1 de tampão TAE a 22°C» Numa outra diãlise, a proteína foi transferida p«ara um tampão de conservação (fosfato de potássio 20 mM, com pH 7,5, NaCl .140 mM, 50% de glicerina)» A proteína fundida solúvel assim obtida foi incubada com Ig-ase purificada (ver o exemplo 5), e cindida totalmente, num local de cisão que a molécula de

008 contem (-Pro-Proi“Thr—Pro-Ala-, ver a figura .2), em dois fragmentos polipeptídícos» A especificidade da cisão foi verificada pela análise da sequência, de aminoácidos na extremidade amina do produto de cisão mais pequeno» Oeu como resultado, tal como se tinha esperado, a sequência Thi—Pro-Ala-Pro-Thi—Ile»

Exemplo.....7

Cisão.....específ. .í.ç.a.....de.....uma.....fusão.....pr.oteí.ça....s.p.lú.ve.l.....obtida.....a.....içartir ...da.

solução.....sob.rfôria,dan.te.....de.....culturas.,......por.....m.e.í.o......d.fô......I.g.-a.s.e

Uma fusão proteica que consiste na sub-unidade de toxina B de cólera e numa parte do domínio B (pos» .1097-1160? J„ Pohlner, Nature 325, 458-462, 1987) do precursor de IgA-protease originária de N.».....gonorrhoeae M8.1.1. foi obtida sob forma solúvel, a partir da solução sobrenadante de culturas de células de E» coli recombinantes.. Para poder separar as duas partes proteicas uma da

124

1266 (3330) —31— 'S M <*f'‘ outra, tinha sido inserida na região transitória, entre a sub~unidade de toxina. B de cólera e o domínio β, através de processos de engenharia genética, uma sequência de cisão artificial de Ig-ase (Pro-Pro 1 “Thi—Pro-),, Para esta finalidade, tinham sido inseridos os oligonucleótidos Tk006 e Tk007, entre os locais de restrição EcoRI e SacII na região transitória (ver a figura 3). A proteína fundida foi concentrada através de precipitação com sulfato de amónio, a partir de 2 I de solução sobrenadante de uma cultura de bactérias feita crescer durante 12 h, a 37°C, e., a seguir, dialisada contra 5 1 de tampão PBS.. Para ser cindida, ela foi. incubada, numa concentração de 50 pg/ml, em tampão PI3S, numa razão de enzíma/substrato de 1/50 (p/p), com Ig-ase purificada durante 2 h, aos 37^0. Uma anãlise d© ímunomancha (”Immunoblot) revelou que o maior fragmento de cisão resultante da cisão completa correspondia, no que diz respeito ao seu peso molecular e à sua reacção com antissoro, à sub-unidade de toxina B de cólera natural„

Exemplo.....3.

Cisão.....espeçíf íca..„de.....f usões.....proteíças.,......na.........§u.p.e..rf.íçíe....de.....bactérias gram-negativas.,......por.....meig....de.....Igra.se sa r

Foi utilizado um sistema de expressãoas fusões proteicas TK849 e TKB59 secreção para expres, que consistem na sub-unidade de toxina B de cólera e no domínio β da IgA-protease, na superfície de salmonelas recombinantes. 0 gene híbrido que codifica TkB49 continha, na região transitória, entre o domínio da toxina e o domínio β, a sequência original de cisão (c) (-Pro-Pro·íAla-Pro-) para a Ig-ase. Em contrapartida, foi inserido, no gene codificador de TkB59, entre os locais de restrição de EcoRI e SacII, um fragmento de AON artificial que consiste nos oligonucleótidos TR006 e Tk007, fragmento esse que codificava a sequência de cisão (-Pro-Pro i Thi—Pro-) (ver a figura 3). Por incubação com Ig-ase purificada das bactérias intactas, na superfície das quais foram fixadas tais fusões proteicas, verificava-se a cisão específica nos locais de cisão de Ig-ase„ Através de análises de Ímunomancha foi verificado que os fragmentos de cisão pequenos resultantes da cisão correspondiam.

124 tí I 1266 (3330) · * tf-z ~ó2~ no que diz respeito ao seu tamanho e à sua reacção com antissoro, à sub-uriidade de toxina B de cólera natural.

Exemplo.....9

Pyrif.iCjasl.ja......de......Ig-ase......activa.......a......part ir......da.......sol.u,çâq......sob.renadant.e.......cte culturas.....de.....células... de E,. coli. recombi nantes

Células de E. coli C600 recombinantes contendo o plasmídeo PEX1070 (DE 36 22 221.6) com um gene de IgA-protease modificado segregam a ig-ase activa para a solução sobrenadante da cultura. Através de uma filtração por membrana, foi possível concentrar a enzima na solução sobrenadante da cultura e precípitá-la, ía seguir, a partir da solução por meio de sulfato de amónio (0,42 g/ml)„ Após uma centrifugação, dissolveu-se o sedimento em tampão Biorex (fosfato de potássio 50 mM, com pH 7,0, 8,6% de glicerina) (1 ml de tampão por l 1 de solução sobrenadante de cultura), foi equilibrado por diálise contra 2 1 de tampão e submetido, a seguir, a uma cromatografía de permuta catiónica (BiorexTO). A IgA-protease ligada foi eluída da coluna por meio de tampão de eluição (fosfato de potássio 500 mM com pH 7,0, 8,6% de glicerina) e fraccionada num só passo. As fracções que continham IgA-protease foram, a seguir, analisadas através de electroforese em SDS-ge 1 po 1 i acr ί 1 am í da (.12,5%),. Neste ponto da pu rí f i cação, o grau de pureza médio era >90%. Para preparar a Ig-ase sob forma pura, realizou-se uma filtração sobre gel, com Sephacryl HR300 em tampão de Biorex, seguida por mais uma cromatografia de permuta catiónica (ver acima). A actividade da Ig-ase foi testada pela incubação com anticorpos de IgA 1 e separação dos produtos de cisão resultantes sobre o SDS-gel poliacrilamida.

Exemplo.....10.

Ccrist.ru.çã.o...de.....um plasmídeo para.....a.....expressão.....de uma.....inter.leucina.....3 isenta de metioninar.

A construção é realizada utilizando o vector de expressão pPZ07-mgllac (WO 88/09373). Para este fim, o vector de expressão pPZ07-mgllac é cindido por meio de NCOI e as extremidades salientes são eliminados por meio de nuclease de feijão mungo.

72. 124

GI 1266 (3330.) fyó™*

A seguir, o vector é cindido novamente com Bam HI„ A região do terminal amino, optímizada, da proteína fundida é obtida ao nível do AON, através dos oligonucleôtidos seguintes:

Iniciador IA:

AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATGGAG 3^!

Iniciador IB:

GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCCTCCGAA

TT

Juntam-se ambos os oligonucleôtidos em quantidades equimolares e íntroduzem-se, num excesso de, aproximadamente 100:1, no vector pPZ07-mgllac cindido como acima descrito. Após a ligação, são transformadas células E. coli K12 que foram tornadas competentes de maneira usual» De acordo com métodos usuais, o ADN é isolado das células, cindido por meio de Sall/Bam Hl, e ligado a um fragmento de ADN que contém a região codificadora de interleucina 3, sem sequência de sinalização, (descrita a seguir)»

A obtenção da região codificadora de interleucina 3 com a região de reconhecimento de IgA-protease, ao nivel do ADN, realiza-se através da técnica usual de PCR, a gual consiste em se realizar uma reacção de PCR com o ADNc de interleucina 3, como molde e com os iniciadores a seguir descritos:

Iniciador 2As

5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3^!

Iniciador 2Bs

TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCQAGGCTCAAAGT 3^: fragmento resultante de PCR é novamente cindido, por meio das enzimas Sal I e Bam Hl, e pode ser, assim, inserido directamente no ADN do vector» acima descrito, e ser ligado, de forma covalente, por meio de lígase» ,</· Λ Λ cp 124

1266 (3330)

-34Após ά transformação do ADN num hospedeiro apropriado, por exemplo e® E, coli KÍ2 C600, a 11 3 pods ssr sintetizada, sob forca de Rb, sssi E« coli e, a seguir, isolada. Como foi descrito no caso do 2-CSF, realiza-se uma desnaturação e renaturação ds proteína s cinds-ss a proteína renaturada por meio de IgA-protease. Após outras fases de purificação, & II 3 isenta ds metionina assim produzida pode ser aplicada terapeuticamente»

Exeiiipio 11:

Construção de .um plasmideo para a expressão de uma intsrlsucina 2 (senta de aetionina

A construção pode ser realizada utilizando o vector ds expressão pPZ07-mgllac (H088/09373), o qual, após a inserção dos iniciadores IA s 13, foi cindido por meio de Sal I/Bam Hl, como nc exemplo 10 descrito, A obtenção da região codificadora de infenloucins 2 coa a região de reconhecimento de IgA-protease, ao nível do A3N, realiza-se através do método de PCR, o qual consiste em se realizar uma reacção de PCR com o ADNc de interlsucina 2 ccmo molde e os iniciadores 3A e 33, os quais codificam ignalxnefe e região de rsconhecime-nto de. IgA-protease» . nico ao iodo?- “n '

3’ AAGCTTêTCGACCCftCGTCCACCACCACCTACTTCAAeTTCTACAAAG 3’ xoioiador 32;

S’ TTCPTT99ATCCTCAAQ7TAQTST7SAQATQATeCTT7 3 fragmento d-s PCR assim obtido é novaments meio das enzimas Sall e Ba® Hl e pode, =sLm, direetaments no ADM do vector acima descrito, cindido, por ser inserido 1 maneira de proceder a seguir é como a que foi descrita no caso de 11 3, No exemplo precedente foi descrito como é possível produzir, através de uma utilização apropriada do Iccal IgA-proteas® s o processo subsequente, metionina próprias para a terapia, as de reconhecimento proteínas quais começam com a sequência de aminoácidos Ala-Pro. Podem ssr produzidas outras p! 'U ‘X nas isentas ds metionina por íia coísí os exemplos acima

124

9Τ 1266 *'33301

-35•descritos, utilizando oligonucleõtidos que contêm, por um lado, s região de reconhecimento da IgA-protease, s uma região que corresponde, analogamente, às extremidades 5’ e 3’, respectivamente, do sequência publicada, e que, em consequência disso, podem ssr obtidas através d© uma amplificação por PC.9. A seguir sã-o eencioradas outras proteínas ds relevância terapêutica, as quais o^-rcçam, na sua forma madura existente na natureza, coa Ala-Pro, e que, por isso, podem ser produzidas analogamente através dc processo de acordo com o presente invento:

Cathepsín L (EC 3.4.22.15), Mason, R.hL st al. Biochem. J, 24C, 373-377, 1986.

Erythropoietin, Lai, P,H. et al. J. Biol. Chem. 261, 3116-3121,

1.786.

Intsrlsukin-1 beta, Zsebo, K.M. et al. Blood 71, 962-968, 1988 = nsteonectin, Fisher, L,W. et al. J. Biol. Chem. 262, 9702-9708,

1927.

Type TV collagsnase, Collier I.E. et al, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587, 1988»

Al-é.ii disso, é possível produzir, desta maneira, proteínas que ccxsçsa na sua forma madura com os aminoácidos Ser, Pro. Como uxecplos IS© que mencionar-se aqui:

Alpha-4 antitrypsin, Kill, R.E. et al., Nature 311, 175-177,

1984.

Afrial uâtríuretic factor, Kambayashi, Y. st al., FEBS Lett. 259, 341-315, 1990.

Futres exemplos de proteínas que começam, na sua forma xadura, ccc Thr Pro, e que podem ter relevância terapêutica, são, p_O.- exejYfpTo:

Claims (2)

1. R E I V I N D I Ç β Ç g E S

   1 - Processo para a cisão enzimática de proteínas fundidas e obtenção de partes determinadas destas proteínas fundidas carac™ terizado por (3,) se modificar,, através de meios de engenharia genética, uma região transitória, na gual duas partes da proteína fundida estejam ligadas uma à outra, de modo a formar, nesta região transitória, pelo merios um local de reconhecimento da IgA-protease com a sequência de aminoácidos V~Pro»í»X-Pro, na qual. X pode ser um aminoácido qualquer e Y um ou vários aminoácidos quaisquer.
2. (2) por se cindir a proteína fundida resultante do passo (1) com IgA-protease, na posição designada por „ i „ do local de reconhecimento e (3) por se obter, após a cisão, uma ou várias partes determinadas da proteína fundida»

   2 ·· Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se modificar a região transitória de uma proteína fundida por inserção de sequências nucleotídicas que codificam um local de reconhecimento da IgA-protease ou uma parte deste local, sendo as sequências nucleotídicas inseridas antes e/ou depois de um ou vários segmentos de AON que codificam as part proteína de fusão» desejadas da

   3 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se modificar uma proteína de fusão que inicialmente não apresenta nenhum local de reconhecimento natural de IgA-protease»

   4 - Processo de acordo com urna das reivindicações precedentes, caracterizado por se modificar a região transitória de uma proteína fundida que contém, além de uma parte desejada, uma ou ‘vC’ ϊ' de suporte.

   5 - Processo ds acordo com a reivindicação 4, a parte ds suporte da proteína fundida conter caracteri zado laia porção da β-galartoei das®.

   t - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a parte de supor'te da proteína fundida conter vários aminoácidos carregados e/ου uma proteína ou polipsptido qus se 1 igam, ccm slsvads afinidade, a substâncias específicas.

   ~ Prccãsso ds acordo com uma das reivindicação precedentes, cacárterirado por X significar Ser, Thr ou Ala.

   d - Processo de acordo cos? a reivindicação 7, caracter izado ,.c ¥ -_:d.gr.i fic~o Ser ou Thr,

   - - Prvcesso de acordo com uma das reivindicações precedentes, raractsrirado por ¥ terminar com a sequência Pro, Pro-Als, Arg-^rc, Pr-j-rg-Pro_s Als-Pro-Arg-Pro ou Pro-Ala-Prc-ftrg-Pro,

   10 -- Processo de acordo com a reivindicação 9. caracterizado por o local de reconhecimento· da IgA-protease possuir a sequência de aminoácidos

   a.) Pro-Ala-Pro ’ -Ser-Pro,

   b) ro-??-c ’ ”Ssr-Pro,

   c) Prc-Grc-Pro’Aia-Pro,

   d) Prc-Pro·‘“Thr-Pro, c; Ala-Prc-fírç-Pro-Pro-?“Thr-Fro, cu

   f) Pro-Ala~Pro-fírg-Pro-Pro'!-Thr-Pro.

   11 -- Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por (1; se trotistormar uma célula com um ADN recombinante e/ou ut

   --sete·· recombinante, contendo o ADN cu o vector, neste caso, ptic rores uma cópia de um gens que codifica uma proteína

   7 2 124 t!I 1266 (3330) fundida que contém, numa região transitória, peio menos um locai de reconhecimento da IgA-protease, (2) se cultivar a célula transformada, num meio apropriado, (3) efectuar, na célula transformada, a expressão do gene que codifica a proteína fundida, (4) se cindir a proteína fundida com IgA-protease e (5) se isolar uma ou várias das partes, desejadas, da proteína fundida.,

   12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se cindir, no meio, após a ruptura celular e/ou separação de proteínas celulares, a proteína fundida, com uma IgA-protease,,

   13 - Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se utilizar, para a cisão da proteína fundida, uma IgA-protease que é obtida de espécies patogénicas de bactérias da família Ne.isse.r.i.a,., nomeadamente de Neisseria„......gonorrhoe.ae e de Neisseria..........men.í.n.g..itidis ou da família Haemgp.hilus., nomeadamente Haemgphi. 1 us........i.nflu.enzae e Haemophí 1 us.......aegy.pticus, ou uma proteína derivada de uma tal IgA-protease por modificação.

   14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se utilizar uma IgA-protease proveniente de uma estirpe bacteriana superprodutiva, nao patogénica para a cisão da proteína fundida.

   15 - Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por se utilizar a IgA-protease sob forma imobilizada para a cisão da proteína fundida.,,

   16 - Processo de acordo com uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado por se cindir uma proteína fundida presente sob forma solúvel, insolúvel, associada à membrana ou ligada à

   Gí 1266 ¢3330)

   -39célula.

   17 - Processo de acordo com a reivindicação 16» caracterizado por se cindir uma proteína fundida presente como corpo de precipitação insolúvel,, tes, acordo com uma das reivindicações preceden» para produzir proteínas recombinantes, se

   18 - Processo de caracterizado por cindir, com uma IgA-protease» uma proteína proveniente de células procarióticas sem o resíduo metionina N-terminal» fundida com a sequência Met-Y-Proí“X-Pro-A, na qual X significa um aminoácido qualquer, Y um ou vários aminoãcidos quaisquer e A uma sequência de aminoãcidos qualquer, sendo o produto da cisão uma proteína ou um péptido com a sequência d® aminoãcidos X-Pro-A»

   19 - Processo de acordo com a reivindicação 18» caracterizado por a parte desejada da proteína fundida começar pela sequência de aminoãcidos X-Pro»

   20 - Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por X-Pro-A significar factor estimulador de colónia de granulócitos humanos (G-CSF) ou um dos seus derivados,,

   21 - Processo de acordo com a reivindicação 18» caracterizado por se tratar, após cisão com IgA-protease» a parte desejada da proteína fundida, num passo subsequente» com uma dipeptidil-aminopeptídase, separando desta maneira a sequência X-Pro N~ -terminai„

   22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por se utilizar uma X-Pro-dipeptidil-aminopeptidas®, para a separação da sequência X-Pro N-terminal»

   23 - Processo para a obtenção de uma proteína fundida que contém várias partes polipeptídicas, caracterizado por se modificar, através de meios de engenharia genética» pelo menos, uma região transitória, entre as respectivas partes polipeptídicas, de modo que esta região transitória apresente um ou vários locais /2 .124 £31 1266 (3330) de reconhecimento de IgA-protease, com a sequência de aminoácidos Y-Pro“1 -X-Pro, na qual X significa um aminoácido qualquer, de preferência Ser, fhr ou Ala, e Y um ou vários aminoácidos quaisquer,,

   24 ~ Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se modificar a região transitória de uma proteína fundida de modo que esta possua a sequência de aminoácidos Met-Y-Pro-ί“X-Pro-A, na qual X e Y têm o significado acima mencionado e A significa uma sequência de aminoácidos qualquer.

   25 - Processo de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado por se obter uma proteína na qual Y contém, no seu terminal, a sequência Pro, Pro-Ala, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro ou

   Pro-Ala-Pro-Arg-Pro.

   26 - Processo de acordo com uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado por se obter uma proteína na qual a sequência de aminoácidos X-Pro-A representa um factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) ou um dos seus derivados,,

   27 - Processo para a produção de um G-CSF recombinante, caracterizado por se cindir, com IgA-protease, uma proteína obtida de acordo com a reivindicação 26, e se purificar a porção G-CSF, obtendo-se assim um G-CSF que estã substancial e quantitatívamente isento de um G-CSF com um resíduo metionírta N-terminal.

   28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se obter um G-CSF contaminado com menos de 0,1 % de outras proteínas,,

   29 Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se obter um G-CSF contaminado com menos de 10”^ώ% de outras proteínas e quantitativamente isento de um G-CSF com um resíduo metionina N-terminal,.

   30 - Processo de preparação de um produto farmacêutico, caracterizado por se associar como substância activa, um G-CSF ou um derivado de G-CSF, produzidos de acordo com uma das reivindicações 27 a 29, com substâncias farmacêuticas adicionais, auxiliares e /ou veículos usuais,,

   31 - Processo para a produção de um vector recombinante, caracterizado por se inserir, num vector, uma ou várias cópias de um AON recombinante que codifica uma proteína fundida obtida de acordo com uma das reivindicações 23 a 27.

   4172 124

   ΘI 1266 (3330)

   32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por se produzir um vector recombinante, em que o ADN recombinante está sob controlo de um sinal de expressão indutível.,

   33 - Processo de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por o vector produzido ser um vector procariõtico recombínante»

   34 - Processo de acordo com a reivindicação 31 © 32, caracterizado por o vector recombinante produzido ser um plasmídeo.

   35 - Processo para a produção de uma célula transformada, caracterizado por se transformar uma célula com um ADN que codifica uma proteína fundida obtida de acordo com uma das reivindicações 23 a 27, ou com um vector produzido de acordo com as reivindicações 31 a 34.

   36 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por a célula transformada produzida ser uma célula procariótica transformada.