JPH074254B2 - ヒト成長ホルモンの製法 - Google Patents
ヒト成長ホルモンの製法Info
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- JPH074254B2 JPH074254B2 JP63194701A JP19470188A JPH074254B2 JP H074254 B2 JPH074254 B2 JP H074254B2 JP 63194701 A JP63194701 A JP 63194701A JP 19470188 A JP19470188 A JP 19470188A JP H074254 B2 JPH074254 B2 JP H074254B2
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- Japan
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- hgh
- human growth
- plasmid
- hybrid plasmid
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えDNA法による天然形ヒト成長ホルモン
（hGH）の製法に係る。
（hGH）の製法に係る。
さらに詳述すれば、本発明は、枯草菌（Bacillus subti
lis）において天然形ヒト成長ホルモンの発現及び分泌
を誘発し得るハイブリッドプラスミド及び該ハイブリッ
ドプラスミドによって形質転換させた枯草菌を適切な培
養環境で生育させることによる天然形ヒト成長ホルモン
の製法に係る。
lis）において天然形ヒト成長ホルモンの発現及び分泌
を誘発し得るハイブリッドプラスミド及び該ハイブリッ
ドプラスミドによって形質転換させた枯草菌を適切な培
養環境で生育させることによる天然形ヒト成長ホルモン
の製法に係る。
hGHはアミノ酸191個、分子量22000ドルトンのタンパク
質であり、各個人の生存中を通して下垂体（腺下垂体）
の前葉で生産される（ただし、成人前の期間では、より
多量生産される）。
質であり、各個人の生存中を通して下垂体（腺下垂体）
の前葉で生産される（ただし、成人前の期間では、より
多量生産される）。
成長ホルモンは前駆体の形で合成され、変化を受けた
後、細胞から分泌される。
後、細胞から分泌される。
その作用機序は未だ不明であるが、hGHは骨格の成長、
窒素の固定及びタンパク質の合成を促進し、脂質及び炭
水化物の代謝に影響を及ぼす。
窒素の固定及びタンパク質の合成を促進し、脂質及び炭
水化物の代謝に影響を及ぼす。
hGHは、該ホルモンの欠乏に関連する小人症の治療に使
用され、肥満症の処置及びやけど及び創傷の治療にも使
用される。
用され、肥満症の処置及びやけど及び創傷の治療にも使
用される。
数年前までは、該ホルモンの利用できる源は死体の下垂
体であり、複雑かつ高価な方法によって抽出されてい
た。
体であり、複雑かつ高価な方法によって抽出されてい
た。
最近になって、組換えDNA法によって形質転換した宿主
微生物を使用する発酵によってhGHを製造する方法が開
発されてきた。
微生物を使用する発酵によってhGHを製造する方法が開
発されてきた。
特に、英国特許第2,055,982号及びヨーロッパ特許第20,
147号には、転写及び翻訳の過程で必要なプロモーター
及び認識部位の下流に位置し、ATGトリプレット（すべ
てのタンパク質の翻訳の開始シグナルであることから必
要とされるメチオニンをコードづけする）に並置された
成熟hGHをコードづけするDNAの構造配列を含有するハイ
ブリッドプラスミドによって形質転換された大腸菌（Es
cherichia coli）を生育することからなる成長ホルモン
の製法が記載されている。
147号には、転写及び翻訳の過程で必要なプロモーター
及び認識部位の下流に位置し、ATGトリプレット（すべ
てのタンパク質の翻訳の開始シグナルであることから必
要とされるメチオニンをコードづけする）に並置された
成熟hGHをコードづけするDNAの構造配列を含有するハイ
ブリッドプラスミドによって形質転換された大腸菌（Es
cherichia coli）を生育することからなる成長ホルモン
の製法が記載されている。
しかしながら、これらの公知の方法を使用する場合、合
成されたホルモンの分離及び精製が困難であり、一方、
不正確なアミノ酸配列を有するhGHが生産される。
成されたホルモンの分離及び精製が困難であり、一方、
不正確なアミノ酸配列を有するhGHが生産される。
実際、hGHのアミン末端におけるメチオニンの存在は分
子の立体配置を変化させ、これにより、その活性及び免
疫特性が影響を受ける。
子の立体配置を変化させ、これにより、その活性及び免
疫特性が影響を受ける。
さらに、大腸菌（ヒトに対して病原性であり、発現生成
物を外部環境に分泌する細菌である）の使用は方法自体
を煩わしいものとし、特にhGHの分離及び回収を複雑な
ものとしている。
物を外部環境に分泌する細菌である）の使用は方法自体
を煩わしいものとし、特にhGHの分離及び回収を複雑な
ものとしている。
このため、当分野では、hGHの製造にあたり枯草菌（ヒ
トに対して非病原性であり、培養基内にタンパク質を分
泌し得る細菌である）の使用を必須要件とする他の方法
が提案されている。
トに対して非病原性であり、培養基内にタンパク質を分
泌し得る細菌である）の使用を必須要件とする他の方法
が提案されている。
これに関連して、A.Nakayamaらの文献「ジャーナル・オ
ブ・バイオテクノロジー（J.of Biotechnol.）」５、17
1−179（1987）を参照する。該文献は、枯草菌のクロー
ニングベクターを、タンパク質の分泌をコードづけする
バシラス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloli
quefaciens）のニュートラルプロテアーゼ遺伝子のプレ
プロペプチド（prepropeptide）のイニシャル配列に結
合した天然形hGHをコードづけする配列と結合させて得
られたハイブリッドプラスミドによって形質転換させた
枯草菌細胞からヒト成長ホルモンの発現及び分泌させる
方法に係る。
ブ・バイオテクノロジー（J.of Biotechnol.）」５、17
1−179（1987）を参照する。該文献は、枯草菌のクロー
ニングベクターを、タンパク質の分泌をコードづけする
バシラス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloli
quefaciens）のニュートラルプロテアーゼ遺伝子のプレ
プロペプチド（prepropeptide）のイニシャル配列に結
合した天然形hGHをコードづけする配列と結合させて得
られたハイブリッドプラスミドによって形質転換させた
枯草菌細胞からヒト成長ホルモンの発現及び分泌させる
方法に係る。
しかしながら、この方法によれば、ヒト成長ホルモンは
融合タンパク質（すなわち、成熟hGH及びアミノ酸配列
で構成される）の形で分泌される。これは、プレプロペ
プチドをコードづけする領域とhGHの構造遺伝子との結
合による。
融合タンパク質（すなわち、成熟hGH及びアミノ酸配列
で構成される）の形で分泌される。これは、プレプロペ
プチドをコードづけする領域とhGHの構造遺伝子との結
合による。
この結果、該方法は工業的規模での利用にはあまり魅力
的ではない。
的ではない。
新たに、従来法の問題点を解消できるハイブリッドプラ
スミドを構成できた。
スミドを構成できた。
従って、本発明の目的は、天然形ヒト成長ホルモンを発
現及び分泌し得るハイブリッドプラスミドにある。
現及び分泌し得るハイブリッドプラスミドにある。
本発明の他の目的は、該ハイブリッドプラスミドによっ
て形質転換させた枯草菌の発酵による天然形ヒト成長ホ
ルモンの製法にある。
て形質転換させた枯草菌の発酵による天然形ヒト成長ホ
ルモンの製法にある。
本発明のさらに他の目的は、このようにして得られたホ
ルモンを治療及び診断の分野で使用することにある。
ルモンを治療及び診断の分野で使用することにある。
さらに本発明の他の目的は、該ホルモンを治療上有効な
量で含有してなる医薬組成物にある。
量で含有してなる医薬組成物にある。
本発明の他の目的は、以下の記載及び実施例から明らか
になるであろう。
になるであろう。
本発明によるハイブリッドプラスミドは、枯草菌のクロ
ーニングベクターを、セリンプロテアーゼの分泌シグナ
ルをコードづけする配列に５′末端で融合した成熟hGH
をコードづけする遺伝子と結合させることによって得ら
れる。
ーニングベクターを、セリンプロテアーゼの分泌シグナ
ルをコードづけする配列に５′末端で融合した成熟hGH
をコードづけする遺伝子と結合させることによって得ら
れる。
特に、かかるプラスミドは、 ａ）枯草菌クローニングベクターを適当な制限酵素で消
化し； ｂ）ハイブリッドプラスミドpSM209を制限酵素FnuD II
及びHind IIIで消化して、530bpフラグメントを単離
し； ｃ）セリンプロテアーゼの分泌及びhGHの１−16アミノ
酸配列に応答するシグナル配列をコードづけする人工オ
リゴヌクレオチドを合成し； ｄ）前記工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたDNAフラグ
メントをT4DNAリガーゼの存在下で結合させ、最後に、 ｅ）所望の特性を有するハイブリッドプラスミドを単離
する、 ことからなる方法によって構成される。
化し； ｂ）ハイブリッドプラスミドpSM209を制限酵素FnuD II
及びHind IIIで消化して、530bpフラグメントを単離
し； ｃ）セリンプロテアーゼの分泌及びhGHの１−16アミノ
酸配列に応答するシグナル配列をコードづけする人工オ
リゴヌクレオチドを合成し； ｄ）前記工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたDNAフラグ
メントをT4DNAリガーゼの存在下で結合させ、最後に、 ｅ）所望の特性を有するハイブリッドプラスミドを単離
する、 ことからなる方法によって構成される。
本発明の目的に好適なベクターは当分野で公知のものの
中から選ばれる。
中から選ばれる。
好ましくは、pSM214ベクターを使用できる（pSM214はSM
S118（pSM214）ATCC67320として寄託されている）。こ
のベクターは、枯草菌において良好な安定性を示すこと
を特徴とし、異種タンパク質の充分な発現を誘発し得
る。このベクター特開平１−104179号に記載された方法
により調製される）は、枯草菌及び大腸菌において、カ
イナマイシン、アンピシリン及びクロラムフェニコール
に対する耐性をコードづけする各Km、Bla及びCat遺伝子
の複製を可能にするpUB110及びpBR322の複製開始点、Bl
a及びCat遺伝子配列を包含するジシストロン性メッセン
ジャーRNA（mRNA）の転写を指示する強力な人工プロモ
ーター及びCat遺伝子の下流に位置する大腸菌のλファ
ージのターミネーターを含有する。
S118（pSM214）ATCC67320として寄託されている）。こ
のベクターは、枯草菌において良好な安定性を示すこと
を特徴とし、異種タンパク質の充分な発現を誘発し得
る。このベクター特開平１−104179号に記載された方法
により調製される）は、枯草菌及び大腸菌において、カ
イナマイシン、アンピシリン及びクロラムフェニコール
に対する耐性をコードづけする各Km、Bla及びCat遺伝子
の複製を可能にするpUB110及びpBR322の複製開始点、Bl
a及びCat遺伝子配列を包含するジシストロン性メッセン
ジャーRNA（mRNA）の転写を指示する強力な人工プロモ
ーター及びCat遺伝子の下流に位置する大腸菌のλファ
ージのターミネーターを含有する。
制限酵素EcoR I及びHind IIIによるベクターからのBla
遺伝子の取り出し、つづく異種遺伝子の該部位への導入
により、遺伝子の転写がクロラムフェニコールに基づく
選択を介して保証される（単一のプロモーターの存在に
よる）ハイブリッドプラスミドの構成が可能となる。
遺伝子の取り出し、つづく異種遺伝子の該部位への導入
により、遺伝子の転写がクロラムフェニコールに基づく
選択を介して保証される（単一のプロモーターの存在に
よる）ハイブリッドプラスミドの構成が可能となる。
従って、本発明によれば、異種遺伝子は、セリンプロテ
アーゼの分泌に応答するシグナル配列をコードづけする
DNAに５′末端で融合された成熟hGHタンパク質をコード
づけするものである。特に、プロテアーゼは、枯草菌に
よって生産される細胞外タンパク分解酵素であるサブチ
リシンである（Millet J.「ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バクテリオロジー（J.Appl.Bacteriol.）」33、2
07−219（1970）;Markland F.S.ら「ジ・エンザイムズ
（The Enzymes）」Bayer P.D.編、Vol.3、561−608（19
71）、Academic Press社発行）。
アーゼの分泌に応答するシグナル配列をコードづけする
DNAに５′末端で融合された成熟hGHタンパク質をコード
づけするものである。特に、プロテアーゼは、枯草菌に
よって生産される細胞外タンパク分解酵素であるサブチ
リシンである（Millet J.「ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バクテリオロジー（J.Appl.Bacteriol.）」33、2
07−219（1970）;Markland F.S.ら「ジ・エンザイムズ
（The Enzymes）」Bayer P.D.編、Vol.3、561−608（19
71）、Academic Press社発行）。
サブチリシン（枯草菌によってプレプロエンザイム（pr
eproenzyme）として生産される）は、Ｎ末端に、膜を通
してのタンパク質の移動の活性化に応答するアミノ酸29
個でなるシグナル配列（リーダーペプチド）を含有す
る。
eproenzyme）として生産される）は、Ｎ末端に、膜を通
してのタンパク質の移動の活性化に応答するアミノ酸29
個でなるシグナル配列（リーダーペプチド）を含有す
る。
このシグナル配列は、切断部位としてAla-Gln-Ala↓ア
ミノ酸配列を認識する特殊なエンドペプチダーゼの活性
によって取り出される。
ミノ酸配列を認識する特殊なエンドペプチダーゼの活性
によって取り出される。
従って、本発明によるハイブリッドプラスミドを構成す
るに必要なサブチリシンのリーダーペプチドをコードづ
けするDNAを複製するオリゴヌクレオチドを合成でき
る。
るに必要なサブチリシンのリーダーペプチドをコードづ
けするDNAを複製するオリゴヌクレオチドを合成でき
る。
異種タンパク質を分泌させるハイブリッドプラスミドの
調製にあたり、リーダーペプチドを使用することは当分
野において公知であるが（「ヌクレイック・アッシズ・
リサーチ（Nucleic Acids Research）」Vol.9、11、257
7（1981）；「ジーン（Gene）」15、43（1981））、こ
れら配列が異種遺伝子に結合された際に分泌を誘発する
ことは予測されない。
調製にあたり、リーダーペプチドを使用することは当分
野において公知であるが（「ヌクレイック・アッシズ・
リサーチ（Nucleic Acids Research）」Vol.9、11、257
7（1981）；「ジーン（Gene）」15、43（1981））、こ
れら配列が異種遺伝子に結合された際に分泌を誘発する
ことは予測されない。
本発明に従って、メチオニンイニシエーターからAla−G
ln−Alaエンドペプチダーゼ用の切断部位（直後にhGHの
１−16アミノ酸をコードづけする配列が続く）までのサ
ブチリシンのリーダーペプチドをコードづけする配列を
複製する人工のオリゴヌクレオチドを形成する。
ln−Alaエンドペプチダーゼ用の切断部位（直後にhGHの
１−16アミノ酸をコードづけする配列が続く）までのサ
ブチリシンのリーダーペプチドをコードづけする配列を
複製する人工のオリゴヌクレオチドを形成する。
自動合成装置を使用し、公知の方法に従ってオリゴヌク
レオチドを合成する。合成オリゴヌクレオチドは下記の
配列を有する。
レオチドを合成する。合成オリゴヌクレオチドは下記の
配列を有する。
ついで、特開昭63−185385号に記載されているようにし
て、hGHの17−191アミノ酸をコードづけする530bpフラ
グメントをプラスミドgSM209から取り出す。
て、hGHの17−191アミノ酸をコードづけする530bpフラ
グメントをプラスミドgSM209から取り出す。
実際には、このプラスミドを、制限酵素FnuD II及びHin
d III（BIOLABS）により、これら酵素の供給者が推奨す
る条件下で操作して処理し、ポリアクリルアミド上での
電気泳動によって分離する。
d III（BIOLABS）により、これら酵素の供給者が推奨す
る条件下で操作して処理し、ポリアクリルアミド上での
電気泳動によって分離する。
次に、本発明に従い、pSM214のEcoR I/Hind III6500塩
基対フラグメント、FnuD II/Hind III530塩基対フラグ
メント及び人工オリゴヌクレオチドの間でのリゲーショ
ン（ligation）を行う。T4DNAリガーゼの存在下、フラ
グメントの比＝1:3:3で反応を行う。反応終了後、全混
合物を使用し、Contente及びDubrauの方法（「Mol.Gen.
Genet.」167、251−258（1979）によってコンピテント
した枯草菌細胞を形質転換させる。
基対フラグメント、FnuD II/Hind III530塩基対フラグ
メント及び人工オリゴヌクレオチドの間でのリゲーショ
ン（ligation）を行う。T4DNAリガーゼの存在下、フラ
グメントの比＝1:3:3で反応を行う。反応終了後、全混
合物を使用し、Contente及びDubrauの方法（「Mol.Gen.
Genet.」167、251−258（1979）によってコンピテント
した枯草菌細胞を形質転換させる。
この目的には、枯草菌の各種の菌株を使用できる。
特に、ニュートラルプロテアーゼ（−）及びセリンプロ
テアーゼ（−）（leu,pyr Di,npr-,spr-）の枯草菌SMS1
18を使用できる。
テアーゼ（−）（leu,pyr Di,npr-,spr-）の枯草菌SMS1
18を使用できる。
ついで、クロラムフェニコールを添加したVY培地（選択
的）で形質転換された細胞を培養する。
的）で形質転換された細胞を培養する。
このようにして操作することにより、得られた（＋）の
クローンの１つから、電気泳動及び配列の分析において
所望の特性を示すハイブリッドプラスミドpSM260を単離
できた。
クローンの１つから、電気泳動及び配列の分析において
所望の特性を示すハイブリッドプラスミドpSM260を単離
できた。
このプラスミド（枯草菌SMS118（pSM260））について
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・センターにATCC
67473として寄託している（1987年７月24日）。
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・センターにATCC
67473として寄託している（1987年７月24日）。
次に、天然形hGHを発現及び分泌する該ハイブリッドプ
ラスミドの能力をチェックするため、pSM260で形質転換
させた枯草菌SMS118を、炭素源及びクロラムフェニコー
ル（インデューサー）の存在下、好適な液状培地で生育
する。
ラスミドの能力をチェックするため、pSM260で形質転換
させた枯草菌SMS118を、炭素源及びクロラムフェニコー
ル（インデューサー）の存在下、好適な液状培地で生育
する。
好ましくは、枯草菌SMS118（pSM260）細胞を、グルコー
スの存在下、VY培地（Veal Infusion Broth（DIFCO）、
Yeast Extract（DIFCO）において温度約37℃で生育させ
る。
スの存在下、VY培地（Veal Infusion Broth（DIFCO）、
Yeast Extract（DIFCO）において温度約37℃で生育させ
る。
細胞抽出物及び培地の上澄み液中に存在するタンパク質
を、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分
析する（Laemmli「ネーチャー（Nature）」277、680（1
970））。hGHは、クマシーブルーによる発色（「ゲル・
エレクトロホレシス・オブ・プロテインズ：ア・プラク
ティカル・アプローチ（Gel Electrophoresis of Prote
ins:a practical approach）」B.D.Hames及びD.Rickwoo
d編、IRL Press Limited発行）、及びニトロセルロース
フィルターへの移動及びつづく該フィルターの抗−hGH
抗体による処理の両方で存在が示される。
を、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分
析する（Laemmli「ネーチャー（Nature）」277、680（1
970））。hGHは、クマシーブルーによる発色（「ゲル・
エレクトロホレシス・オブ・プロテインズ：ア・プラク
ティカル・アプローチ（Gel Electrophoresis of Prote
ins:a practical approach）」B.D.Hames及びD.Rickwoo
d編、IRL Press Limited発行）、及びニトロセルロース
フィルターへの移動及びつづく該フィルターの抗−hGH
抗体による処理の両方で存在が示される。
得られた結果は、上澄み液中に、標準hGH（Calbioche
m）と共に移動し、抗−hGH抗体との反応で（＋）を示す
タンパク質が存在することを示した。
m）と共に移動し、抗−hGH抗体との反応で（＋）を示す
タンパク質が存在することを示した。
しかしながら、細胞溶解質中には、成熟hGHよりもわず
かに大きい分子量を有し、hGH前駆体（サブチリシンリ
ーダーペプチド＋成熟hGH）の部分消化によるものと考
えられるタンパク質が見られる。
かに大きい分子量を有し、hGH前駆体（サブチリシンリ
ーダーペプチド＋成熟hGH）の部分消化によるものと考
えられるタンパク質が見られる。
分泌された前駆体及びhGHの量の比（SDS−PAGEにおける
２種類のタンパク質の強度を評価することにより決定）
は、分泌活性が80ないし90％であることを示した。
２種類のタンパク質の強度を評価することにより決定）
は、分泌活性が80ないし90％であることを示した。
このようにして分泌されたhGHのアミノ末端配列（自動
アミノシークエンサー モデルB90A（Beckman）を使用
し、Edman P.らの方法（「ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（J.Biochem.）」80−91（1967））によって
決定）は、天然ホルモンについて期待される配列を示
し、これにより、本発明によるプラスミドを用いて形質
転換させた枯草菌から合成された前駆体が正確に変化さ
れることが確認された。
アミノシークエンサー モデルB90A（Beckman）を使用
し、Edman P.らの方法（「ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（J.Biochem.）」80−91（1967））によって
決定）は、天然ホルモンについて期待される配列を示
し、これにより、本発明によるプラスミドを用いて形質
転換させた枯草菌から合成された前駆体が正確に変化さ
れることが確認された。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限
定するものではない。
定するものではない。
実施例１ ハイブリッドプラスミドpSM260の構成（第１図参照） ａ）hGH遺伝子の構成及びプラスミドpSM214への挿入 プラスミドpSM214（SMS118（pSM214）ATCC67320として
寄託されている）２μｇを、50mMTric−HCl（pH7.5）、
6mM MgCl2及び50mM NaClを含有する緩衝液50ml中、37℃
において制限酵素EcoR I及びHind III 2単位（Ｕ）によ
り１時間消化した。
寄託されている）２μｇを、50mMTric−HCl（pH7.5）、
6mM MgCl2及び50mM NaClを含有する緩衝液50ml中、37℃
において制限酵素EcoR I及びHind III 2単位（Ｕ）によ
り１時間消化した。
反応混合物をフェノール−クロロホルム（1:1、V/V）及
びクロロホルム−イソアミル（24:1、V/V）で抽出する
ことによって酵素反応を停止させ、−20℃においてDNA
をエタノールで沈殿させ、Eppendorf遠心分離機におい
て12000rpmで20分間遠沈して分離した。ついで、プラス
ミドDNAをTE緩衝液（50mM Tris−HCl、1mM EDTA;pH8.
0）10μに懸濁させ、0.6％アーガロースゲル上に負荷
し、100Vで１時間泳動させた。
びクロロホルム−イソアミル（24:1、V/V）で抽出する
ことによって酵素反応を停止させ、−20℃においてDNA
をエタノールで沈殿させ、Eppendorf遠心分離機におい
て12000rpmで20分間遠沈して分離した。ついで、プラス
ミドDNAをTE緩衝液（50mM Tris−HCl、1mM EDTA;pH8.
0）10μに懸濁させ、0.6％アーガロースゲル上に負荷
し、100Vで１時間泳動させた。
6500bpDNAフラグメントに相当するバンドを、125V、90
分間でエレクトロ溶出した。
分間でエレクトロ溶出した。
並行して、hGH17−191をコードづけする配列を含有する
530bpフラグメントを、ハイブリッドプラスミドpSM209
から単離した特開昭63−185385号参照）。
530bpフラグメントを、ハイブリッドプラスミドpSM209
から単離した特開昭63−185385号参照）。
この目的のため、pSM209 50μｇを、6mM Tris−HCl（pH
7.4）、6mM NaCl、6mM MgCl2及び6mMメルカプトエタノ
ールを含有する反応混合物200μ中、37℃においてFnu
D II（DNAをアミノ酸配列16及び17の間で切断する）（B
IOLABS）50Uにより１時間消化した。
7.4）、6mM NaCl、6mM MgCl2及び6mMメルカプトエタノ
ールを含有する反応混合物200μ中、37℃においてFnu
D II（DNAをアミノ酸配列16及び17の間で切断する）（B
IOLABS）50Uにより１時間消化した。
酵素を70℃、10分間で脱活性化した後、溶液を50mM Tri
s−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2及び50mM NaClの濃度と
し、Hind III（Boehringer）50Uの存在下、37℃で１時
間インキュベートした。酵素を脱活性化した後、６％ア
クリルアミドゲル上、130V、３時間でDNAを分離した。
s−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2及び50mM NaClの濃度と
し、Hind III（Boehringer）50Uの存在下、37℃で１時
間インキュベートした。酵素を脱活性化した後、６％ア
クリルアミドゲル上、130V、３時間でDNAを分離した。
ついで、約530塩基対のバンドを、Maxam及びGilbertに
よって開示された如くして（「メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）」Vol.65、p499
−560（1980））溶出した。
よって開示された如くして（「メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）」Vol.65、p499
−560（1980））溶出した。
最後に、下記に示すDNAフラグメントを、System One DN
A合成装置（Beckman）によって合成した。
A合成装置（Beckman）によって合成した。
このフラグメントは、サブチリシンのペプチドリーダー
のアミノ酸29個でなる配列及びhGHの１−16アミノ酸を
コードづけする。ついで、この人工のフラグメント１μ
ｇを、66mM Tris−HCl（pH7.6）、1mMスペルミジン、10
mM MgCl2、15mM DTT、0.1mM EDTA及びT4キナーゼ（Biol
oabs）2Uを含有する緩衝液20μ中、37℃において１時
間加リン酸処理した。65℃、10分間で酵素を脱活性化し
た。
のアミノ酸29個でなる配列及びhGHの１−16アミノ酸を
コードづけする。ついで、この人工のフラグメント１μ
ｇを、66mM Tris−HCl（pH7.6）、1mMスペルミジン、10
mM MgCl2、15mM DTT、0.1mM EDTA及びT4キナーゼ（Biol
oabs）2Uを含有する緩衝液20μ中、37℃において１時
間加リン酸処理した。65℃、10分間で酵素を脱活性化し
た。
530bp FnuD II−Hind IIIフラグメント400ng、上述の如
く加リン酸処理した人工のフラグメント100ng及びpSM21
4の6500bp EcoR I−Hind IIIフラグメント1.5μｇを、6
6mM Tris−HCl（pH7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2及び10m
Mジチオトレイトール（DTT）を含有する緩衝液10μ中
で混合し、T4 DNAリガーゼ2Uの存在下、14℃において18
時間結合させた。
く加リン酸処理した人工のフラグメント100ng及びpSM21
4の6500bp EcoR I−Hind IIIフラグメント1.5μｇを、6
6mM Tris−HCl（pH7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2及び10m
Mジチオトレイトール（DTT）を含有する緩衝液10μ中
で混合し、T4 DNAリガーゼ2Uの存在下、14℃において18
時間結合させた。
このようにして得られたリガーゼ混合物を、Contente及
びDubrauの方法（「Mol.Gen.Genet.」167、251−258（1
979））によってコンピテントとした枯草菌SMS118の形
質転換に使用した。
びDubrauの方法（「Mol.Gen.Genet.」167、251−258（1
979））によってコンピテントとした枯草菌SMS118の形
質転換に使用した。
ついで、形質転換した細胞を、クロラムフェニコール
（Cm）５μg/mlを含有するTBAB（Tryptose Blood Agar
Base）プレートにおいて37℃で18時間生育して選別し
た。
（Cm）５μg/mlを含有するTBAB（Tryptose Blood Agar
Base）プレートにおいて37℃で18時間生育して選別し
た。
（＋）のクローンの１つから所望のハイブリッドプラス
ミド（制限地図を第２図に示す）（pSM260）を単離し
た。
ミド（制限地図を第２図に示す）（pSM260）を単離し
た。
実施例２ 枯草菌SMS118におけるhGHの発現及び分泌 ハイブリッドプラスミドpSM260で形質転換させた枯草菌
SMS118（枯草菌SMS118（pSM260））の細胞を、クロラム
フェニコール５μg/ml及びグルコース３％を添加したVY
培地（Veal Infusion Broth（DIFCO）25g/、Yeast Ex
tract（DIFCO）5g/）10mlにおいて、37℃で18時間生
育させた。
SMS118（枯草菌SMS118（pSM260））の細胞を、クロラム
フェニコール５μg/ml及びグルコース３％を添加したVY
培地（Veal Infusion Broth（DIFCO）25g/、Yeast Ex
tract（DIFCO）5g/）10mlにおいて、37℃で18時間生
育させた。
ついで、培養基1mlをEppendorf遠心分離機で遠沈し（10
分間、1000rpm）、細胞を30mM Tris−HCl（pH7.5）、50
mM NaCl緩衝液1mlで２回洗浄し、再度遠沈し、SET緩衝
液（20％スクロース、50mM Tris−HCl（pH7.6）、50mM
EDTA）100μ中に懸濁化させ、リゾチーム（SIGMA）50
mg/mlを含有する水溶液20μを添加して37℃で５分間
溶解させた。この混合物に、緩衝液Ａ（125mM Tris−HC
l（pH6.9）、３％SDS、３％β−メルカプトエタノール
及び20％グリセリン）130μを添加し、得られた混合
物を90℃で５分間インキュベートした。
分間、1000rpm）、細胞を30mM Tris−HCl（pH7.5）、50
mM NaCl緩衝液1mlで２回洗浄し、再度遠沈し、SET緩衝
液（20％スクロース、50mM Tris−HCl（pH7.6）、50mM
EDTA）100μ中に懸濁化させ、リゾチーム（SIGMA）50
mg/mlを含有する水溶液20μを添加して37℃で５分間
溶解させた。この混合物に、緩衝液Ａ（125mM Tris−HC
l（pH6.9）、３％SDS、３％β−メルカプトエタノール
及び20％グリセリン）130μを添加し、得られた混合
物を90℃で５分間インキュベートした。
並行して、枯草菌SMS118（pSM260）の上澄み液に含有さ
れるタンパク質を４℃、60分間で沈殿させ、培養基0.8m
l、20％TCA（トリクロロ酢酸）0.3mlに添加した。
れるタンパク質を４℃、60分間で沈殿させ、培養基0.8m
l、20％TCA（トリクロロ酢酸）0.3mlに添加した。
沈殿物をアセトンで２−３回洗浄し、遠心分離した後、
SET緩衝液30μに再度懸濁させ、緩衝液A 50μを添
加した後、90℃で５分間インキュベートした。
SET緩衝液30μに再度懸濁させ、緩衝液A 50μを添
加した後、90℃で５分間インキュベートした。
細胞溶解物25μ及び上澄み液のタンパク質溶液20μ
を12.5％SDS−アクリルアミドゲル（Laemmli「ネーチャ
ー」277、680（1970））に負荷し、25mAで３時間電気泳
動した後、クマシーブルー（「ゲル・エレクトロホレシ
ス・オブ・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプロ
ーチ」B.D.Hames及びD.Rickwood編、IRL Press Limited
発行）、及びニトロセルロースフィルター（Shleiher＆
Shull孔サイズ45μm Towbin）への移動及びウサギ抗−h
GH抗体（Miles）及びペルオキシダーゼと結合したヤギ
抗−ウサギ−IgG抗体（Miles）による該フィルターの処
理によってタンパク質の存在が明らかになった。
を12.5％SDS−アクリルアミドゲル（Laemmli「ネーチャ
ー」277、680（1970））に負荷し、25mAで３時間電気泳
動した後、クマシーブルー（「ゲル・エレクトロホレシ
ス・オブ・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプロ
ーチ」B.D.Hames及びD.Rickwood編、IRL Press Limited
発行）、及びニトロセルロースフィルター（Shleiher＆
Shull孔サイズ45μm Towbin）への移動及びウサギ抗−h
GH抗体（Miles）及びペルオキシダーゼと結合したヤギ
抗−ウサギ−IgG抗体（Miles）による該フィルターの処
理によってタンパク質の存在が明らかになった。
クマシーブルーで発色させた後、枯草菌SMS118（pSM26
0）の培養基の上澄み液中に、標準hGH（Calbiochem）と
共に移動するタンパク質が存在することが明らかになっ
た。
0）の培養基の上澄み液中に、標準hGH（Calbiochem）と
共に移動するタンパク質が存在することが明らかになっ
た。
このタンパク質は、抗−hGH抗体との免疫反応（＋）で
ある（第３図参照）。なお、第３図は枯草菌から抽出し
た全タンパク質及び培養基に分泌されたフラクションの
ウエスタンブロットを示す図である。図中、ＡはSMS118
（pSM214）の全タンパク質に係り、ＢはSMS118（pSM21
4）の細胞外タンパク質フラクション、ＣはSMS118（pSM
260）の全タンパク質、ＤはSMS118（pSM260）の細胞外
タンパク質フラクション及びＥはmet−hGHに係る。
ある（第３図参照）。なお、第３図は枯草菌から抽出し
た全タンパク質及び培養基に分泌されたフラクションの
ウエスタンブロットを示す図である。図中、ＡはSMS118
（pSM214）の全タンパク質に係り、ＢはSMS118（pSM21
4）の細胞外タンパク質フラクション、ＣはSMS118（pSM
260）の全タンパク質、ＤはSMS118（pSM260）の細胞外
タンパク質フラクション及びＥはmet−hGHに係る。
溶菌後得られたタンパク質の分析では、抗−hGH抗体に
対して反応性であり、その分子量が部分的に変化された
サブチリシンLS＋hGH前駆体に相当する残留タンパク質
の存在を示した。
対して反応性であり、その分子量が部分的に変化された
サブチリシンLS＋hGH前駆体に相当する残留タンパク質
の存在を示した。
分泌されたhGH前駆体とhGHタンパク質との間の比（抗体
と接触させた際の２つの（＋）のバンドの強度を評価す
ることによって決定）は、枯草菌SMS118（pSM260）によ
って発現されたホルモンの80％に相当する分泌率を示し
た。
と接触させた際の２つの（＋）のバンドの強度を評価す
ることによって決定）は、枯草菌SMS118（pSM260）によ
って発現されたホルモンの80％に相当する分泌率を示し
た。
実施例３ 分泌されたhGHの精製 グリセリン処理しかつ−80℃で保存した枯草菌SMS118
（pSM260）培養物を使用して、クロラムフェニコール５
μg/mlを含有するＬ寒天培地上で各コロニーを得た。
（pSM260）培養物を使用して、クロラムフェニコール５
μg/mlを含有するＬ寒天培地上で各コロニーを得た。
ついで、Cm耐性コロニーを使用し、クロラムフェニコー
ル５μg/ml及び３％グルコースを補足したVY培地1lに摂
取した。
ル５μg/ml及び３％グルコースを補足したVY培地1lに摂
取した。
ゆるやかに撹拌しながら、37℃で18時間生育させた。
Sorvallローター内で遠沈（10分間、7000rpm）して、培
養物の上澄み液を分離した。
養物の上澄み液を分離した。
４℃で上澄み液に硫酸アンモニウム（60％飽和）（MERC
K）0.39g/mlを添加することによってタンパク質を沈殿
させ、24時間後、5000rpmで10分間遠沈して沈殿物を集
めた。
K）0.39g/mlを添加することによってタンパク質を沈殿
させ、24時間後、5000rpmで10分間遠沈して沈殿物を集
めた。
ついで、沈殿物を20mM Tris−HCl（pH8.0）35ml中に溶
解し、同じ緩衝液に対して広範囲にわたって透析した。
20mM Tris−HCl（pH8.0）（流量70ml/時間）で平衡化し
た。DEAE Cl−68 Sepharose（Pharmacia）のカラム（20
×2.6cm;総容量106ml）にタンパク質溶液を負荷した。
解し、同じ緩衝液に対して広範囲にわたって透析した。
20mM Tris−HCl（pH8.0）（流量70ml/時間）で平衡化し
た。DEAE Cl−68 Sepharose（Pharmacia）のカラム（20
×2.6cm;総容量106ml）にタンパク質溶液を負荷した。
カラムを平衡化緩衝液で３回洗浄した後、20mM Tris−H
Cl（pH8.0）、0.1M NaCl緩衝液でタンパク質を溶出し
た。
Cl（pH8.0）、0.1M NaCl緩衝液でタンパク質を溶出し
た。
hGHを含有するフラクションを集め、上述の如く硫酸ア
ンモニウムを添加することによってホルモンを濃縮し
た。
ンモニウムを添加することによってホルモンを濃縮し
た。
電気泳動（SDS−PAGE）での分析では、hCHは純度95％以
上であり、収率（負荷したhGHと溶出されたhGHとの間の
比率として算定）は80％であった。
上であり、収率（負荷したhGHと溶出されたhGHとの間の
比率として算定）は80％であった。
疎水性及びアフィニティークロマトグラフィー及びゲル
過によって、さらに精製を行うこともできる。
過によって、さらに精製を行うこともできる。
このようにして精製したhGHを、アミノ酸配列の決定に
使用した。自動シークェンサー モデル890M（Beckma
n）を使用し、Edman法により自動的に減成させることに
よってアミノ酸配列の決定を行った。
使用した。自動シークェンサー モデル890M（Beckma
n）を使用し、Edman法により自動的に減成させることに
よってアミノ酸配列の決定を行った。
得られた結果は、hGHに関して予想したものと同一のア
ミノ酸配列を有するタンパク質であることを示した。
ミノ酸配列を有するタンパク質であることを示した。
第１図はプラスミドpSM260の構成法を概略的に示す図、
第２図はプラスミドpSM260の制限地図を表す図、第３図
はウエスタンブロットの結果を示す写真である。
第２図はプラスミドpSM260の制限地図を表す図、第３図
はウエスタンブロットの結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 シルビア・アストルア・テストーリ イタリー国ミラノ市コルソ・クリストフォ ーロ・コロンボ 10 (56)参考文献 特開 昭62−163691（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−70075（ＪＰ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】サブチリシンの分泌シグナル配列をコード
づけする配列 のDNAとその３′末端で融合したヒト成長ホルモンをコ
ードづけする構造遺伝子を、枯草菌クローニングベクタ
ーに結合させることによって得られた、枯草菌において
天然形ヒト成長ホルモンの発現及び分泌を誘発するハイ
ブリッドプラスミド。 - 【請求項２】請求項１記載のものにおいて、前記クロー
ニングベクターがプラスミドpSM214である、ハイブリッ
ドプラスミド。 - 【請求項３】アメリカン・タイプ・カルチャー・センタ
ーに枯草菌SMS118（pSM260）ATCC67473として寄託され
たものに含有されたものである請求項１又は２記載のハ
イブリッドプラスミド。 - 【請求項４】ａ）クローニングベクターpSM214を制限酵
素EcoR I及びHind IIIで消化して、6500塩基対のEcoR I
/Hind IIIフラグメントを分離し、ｂ）プラスミドpSM20
9を制限酵素FnuD II及びHind IIIで消化して、ヒト成長
ホルモンの17〜191アミノ酸配列をコードづけする530塩
基対FnuD II/Hind IIIフラグメントを分離し、ｃ）サブ
チリシンの分泌シグナル配列及びヒト成長ホルモンの１
〜16アミノ酸配列に応答する配列をコードづけする配列 のオリゴヌクレオチドを合成し、ｄ）前記工程ａ）、
ｂ）及びｃ）で得られたDNAフラグメントを酵素T4 DNA
リガーゼの存在下で結合させ、最後にｅ）所望のハイブ
リッドプラスミドを単離することからなる方法によって
得られた、請求項１記載のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項５】枯草菌の中から選ばれ、請求項１記載のハ
イブリッドプラスミドによって形質転換された微生物。 - 【請求項６】請求項５記載のものにおいて、枯草菌が、
ニュートラルプロテアーゼ（−）及びセリンプロテアー
ゼ（−）の菌株SMS 118である、形質転換微生物。 - 【請求項７】炭素源及びインデューサーとしてのクロラ
ムフェニコールの存在下、適切な環境において請求項１
記載のハイブリッドプラスミドによって形質転換させた
枯草菌を生育させ、分泌されたホルモンを培養基の上澄
み液から分離することを特徴とする、天然形ヒト成長ホ
ルモンの製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT21616A/87 | 1987-08-07 | ||
| IT8721616A IT1228925B (it) | 1987-08-07 | 1987-08-07 | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02446A JPH02446A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH074254B2 true JPH074254B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=11184375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63194701A Expired - Lifetime JPH074254B2 (ja) | 1987-08-07 | 1988-08-05 | ヒト成長ホルモンの製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0306673B1 (ja) |
| JP (1) | JPH074254B2 (ja) |
| AT (1) | ATE87654T1 (ja) |
| DE (1) | DE3879823T2 (ja) |
| ES (1) | ES2053635T3 (ja) |
| IT (1) | IT1228925B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| IT1231156B (it) * | 1989-07-19 | 1991-11-19 | Eniricerche Spa | Espressione e secrezione di interleuchina 1 beta umana matura in bacillus subtilis e mezzi e metodi per il suo ottenimento. |
| IT1270866B (it) * | 1993-03-10 | 1997-05-13 | Eniricerche Spa | Vettore ricombinante e suo impiego per la preparazione esocellulare di anticorpi in forma di singola molecola da bacillus subtilis |
| JP3869874B2 (ja) * | 1995-11-15 | 2007-01-17 | 大日本住友製薬株式会社 | 急性肝不全治療剤 |
| US20030040467A1 (en) | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
| US6936439B2 (en) | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
| CA2358862A1 (en) * | 1995-11-22 | 1997-05-29 | Amgen Inc. | Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| DE69833652T2 (de) * | 1997-06-10 | 2006-09-21 | Takara Bio Inc., Otsu | System zum exprimieren einer hyperthermostabilen protease |
| AU731758B2 (en) * | 1998-07-08 | 2001-04-05 | Mitsui Chemicals, Inc. | Method for secretory production of human growth hormone |
| JP5160878B2 (ja) * | 2007-12-21 | 2013-03-13 | 浜松ホトニクス株式会社 | 試料同定装置および試料同定方法 |
| JP6231559B2 (ja) * | 2012-06-05 | 2017-11-15 | シージェイ ヘルスケア コーポレイションＣｊ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンタンパク質の製造方法及び精製方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| JP2500312B2 (ja) * | 1986-01-13 | 1996-05-29 | 工業技術院長 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
| EP0245218B1 (en) * | 1986-05-07 | 1993-12-29 | ENIRICERCHE S.p.A. | A plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
-
1987
- 1987-08-07 IT IT8721616A patent/IT1228925B/it active
-
1988
- 1988-07-22 EP EP88111842A patent/EP0306673B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-22 ES ES88111842T patent/ES2053635T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-22 AT AT88111842T patent/ATE87654T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-22 DE DE8888111842T patent/DE3879823T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-05 JP JP63194701A patent/JPH074254B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3879823D1 (de) | 1993-05-06 |
| ATE87654T1 (de) | 1993-04-15 |
| ES2053635T3 (es) | 1994-08-01 |
| DE3879823T2 (de) | 1993-07-08 |
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