HU217103B - Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására - Google Patents
Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU217103B HU217103B HU9202511A HU251192A HU217103B HU 217103 B HU217103 B HU 217103B HU 9202511 A HU9202511 A HU 9202511A HU 251192 A HU251192 A HU 251192A HU 217103 B HU217103 B HU 217103B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pro
- priority
- protein
- fusion protein
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 101
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 37
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 16
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 108
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 107
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 44
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 12
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 claims description 8
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 5
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 5
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 5
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 claims description 3
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 11
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims 1
- 239000008023 pharmaceutical filler Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 95
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 46
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 30
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 17
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 7
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 108010048188 MS2 polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000617670 Escherichia coli K2 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000591115 Homo sapiens RNA-binding protein Musashi homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 1
- 102100034026 RNA-binding protein Musashi homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- -1 pro amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5403—IL-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5409—IL-5
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Fúziós fehérje és eljárás rekőmbináns fehérjék fúziós fehérjékenzimatikűs hasítással történő előállítására, amely abban áll, hőgy i)géntechnőlógiai eszközökkel a fúziós fehérje két részét összekötőátmeneti régiót úgy módősítják, hőgy ebben az átmeneti régióbanlegalább egy, Y–Prő·!·X–Prő aminősavszekvenciájú IgA-prőteáz-felismerőhelyet alakítanak ki, ahől X egy tetszőleges aminősav, és Y egy vagytöbb tetszőleges aminősav lehet, ii) az i) lépésben kapőtt fúziósfehérjét a felismerőhely ·!· jellel jelölt pőzíciójában IgA-prőteázzalhasítják, és iii) hasítás űtán a kívánt fehérjét kinyerik. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás biotechnológiai úton nyert fehérjék szekvenciaspecifikus hasítására IgA-proteázok (melyeket „Igase”-oknak is neveznek) felhasználásával, különösképpen eljárás rekombináns fehérjék, illetve peptidek prokariótákban történő előállítására és az N-terminális szekvencia ezt követő eltávolítására.
A fehéijék biotechnológiai előállítása előnyösen olyan mikroorganizmusok segítségével történik, amelyek könnyen tenyészthetők, és a termelt fehérjék egyszerű módon kinyerhetők. Erre a célra alkalmas mikroorganizmus például a baktériumok közül a gramnegatív Escherichia coli, a grampozitív Streptococcus camosus, valamint az élesztők közül a sütőélesztő, Saccharomyces cerevisiae. Autentikus idegen gének kifejezése az ilyen mikroorganizmusokban mégis gyakran hátrányokkal jár. E. coliban például a természetes fehéijék transzlációfüggő N-terminális metionincsoportja legtöbbször proteázok révén nagyrészt lehasad. Idegen fehérjék esetén azonban az első metionincsoportnak ez a lehasadása többnyire csak részleges. Következésképpen alkalmas útnak mutatkozik, hogy az ilyen fehérjéket egy meghatározott aminovéggel állítsák elő, elsősorban fúziós fehéijék formájában, és ezt követően egy szekvenciaspecifikus proteázzal adott helyen hasítsák.
Az ilyen fúziós fehéijék ezen túlmenően az autentikus fehérjékkel szemben azon előnnyel is rendelkezhetnek, hogy a mikroorganizmus sejtjében aggregálódnak és sűrű csapadékot („Inclusion Bodies”) képeznek, amely az egyéb sejtrészecskéktől csekély ráfordítással leválasztható, és ezáltal a kívánt fehéije izolálását és tisztítását megkönnyítik.
Másrészről a hordozófehéqék, amelyeket géntechnológiai eljárás segítségével először a tulajdonképpen előállítandó fehéijéhez fuzionálnak, különleges stabilitást biztosítanak a fúziós partnernek a nem specifikus proteolitikus lebontással szemben. A sejt számára idegen polipeptidek lebontásának problémája különösen a kis peptidek géntechnológiai előállítását érinti. Ugyanakkor más hordozófehéqék lehetővé teszik, hogy a kívánt fehéijék meghatározott sejtrészekbe irányuljanak, amelyekből különösen könnyen kinyerhetők, ahol különösen stabilak és/vagy ahol tesztcélokra hozzáférhetőek. Végül a hordozófehéqék speciális tulajdonságokkal is rendelkezhetnek, amelyek például affmitáskromatográfiával történő tisztítást tesznek lehetővé. A legtöbb felhasználási területen a fúziós fehérjéket részesítik előnyben, melyek a hordozófehérjét az aminovégen és a kívánt fehéqét a karboxivégen tartalmazzák. De bizonyos esetekben a fordított változat vagy a kívánt fehéqe két fúziós partnerrel történő összekapcsolása is kívánatos lehet. Továbbá a kívánt fehéqe reiterációja a fúzión belül is előnyös lehet.
Egy ilyen jellegű fúzióból a kívánt peptid szabad formában történő előállításához a kovalensen kötött fúziós partnerek hasítása szükséges. Ez elvileg kémiai vagy biokémiai (enzimatikus) eljárásokkal érhető el. Az eddig rendelkezésre álló eljárások limitált specifitása azonban a hasítást többnyire korlátozza, mert fontos a kívánt fehérje elnyerése céljából, hogy egy ilyen jellegű hasítás a fúziós partnerek közötti hasadószekvenciában, tehát az átmeneti régióban, de semmi esetre sem továbbmenően magán a kívánt fehérjén belül következzen be. Ezért a fúziós partnerek hasítását igen specifikusan kell elvégezni.
A fúziós fehéijék szekvenciaspecifikus szétválasztására az eddig alkalmazott kémiai eljárások például egy fehérjén belüli metionin aminosavrész bróm-ciánnal történő hasítása és az Asp ·! Pro aminosavak között savas közegben, hangyasavval történő hasítás. Ezek az eljárások azonban csak akkor alkalmazhatók, ha a kívánt fehérjében a specifikus hasítóhely, eltekintve a fúziós partnerhez vivő átmeneti régiótól, csak egyszer fordul elő. Általában a kémiai eljárásokkal szemben azonban a biokémiai eljárásokat részesítik előnyben, mivel az utóbbiak többnyire fiziológiai vagy legalábbis enyhe kémiai reakciókörülmények között kivitelezhetők, amelyek a kívánt fehéqét nem károsítják.
A fúziós fehéijék hasítására szolgáló biokémiai eljárások leginkább specifikus proteázok felhasználásán alapulnak. Például a tripszin az arginint vagy a lizint követő peptidkötéseket hasítja a fehérjéken belül. A lizin előzetes kémiai módosításával a specifitás növelhető, és ezáltal az arginin specifikus felismerése csökkenthető (redukálható). Egy további, a biotechnológiában alkalmazott proteáz a Clostripain, ez az enzim a peptidkötéseket az arginin és az ezt követő, tetszőleges aminosav között hasítja. Azon enzimes eljárásokról, amelyeket eddig a fúziós fehérjék hasítására alkalmaztak, egy áttekintés olvasható F. A. O. Marsion összefoglalójában (D. M. Glover, E.: DNA cloning III, IRL PRESS Oxford és Washington DC, 1987). Az enzimes hasító eljárások felhasználása is korlátozódik azáltal, hogy a hasítóhelyekre jellemző specifikus aminosav(ak) egyidejűleg az előállítandó fehérjében magában is előfordulhatnak.
A fehéijefüziók biokémiai hasítására ezért különösen olyan enzimek alkalmasak, amelyek a hasításhoz nemcsak egy aminosavat ismernek fel, hanem az aminosavak sorrendjét is felismerik, mert annak a valószínűsége, hogy egy bizonyos aminosavsorrend a fúziós partnerek közötti hasítóhelyen kívül magában, a kívánt fehérjében is még egyszer előfordul, annál csekélyebb, minél nagyobb a hasítószekvencia felismeréséhez és hasításához szükséges aminosavak száma.
Ismertek olyan proteázok, amelyek egy bizonyos fehérjét nagyon specifikusan hasítanak. Bár az ilyen szelektív proteázok többsége (amelyek például az emberi komplement- és véralvadásrendszerben előfordulnak) a szubsztrát egy meghatározott helyén hasít, a megfelelő hasító régió egy másik fehérjébe (például fúziós fehérje) történő átvitele esetén, az ilyen jellegű proteázok rendszerint még sincsenek abban a helyzetben, hogy hasítsanak. Ennek a jelenségnek sokféle oka van, melyek például a szubsztrát meghatározott szekunder vagy tercier struktúrájának a proteáz által történő felismerésén vagy a fúziós fehérjékben a hasítóhelyek hozzáférhetőségén alapulnak.
A szekvenciaspecifikus proteázok sora, amelyeket eddig a fúziós fehérjék hasítására feltételesen alkalmaztak, jelenleg az Xa faktorral kezdődik. Ez a proteáz
HU 217 103 Β specifikusan hasítja az Ile-Glu-Gly-Arg-! X szekvenciát, ahol ·! · a hasítóhely és X egy tetszőleges aminosav. Azonban bebizonyosodott, hogy általánosan a fúziós fehérjék - amelyek a megfelelő hasítószekvenciát az átmeneti régiójukban hordozzák - hasítására ez a proteáz sem alkalmazható. Az ilyen szubsztrátok (azaz a fúziós fehéijék, amelyekben a kívánt fehéije a hordozó fehérjében kovalensen kötött) gyakran egyáltalán nem vagy csak csekély mértékben, vagy csak oldott formában hasadnak.
A fúziós fehéijék hatékony hasításának különös jelentősége van a rekombináns fehéijék prokarióta szervezetekben történő előállításánál. Ennek során ugyanis szükséges egy olyan DNS-szekvencia klónozása, amely a tulajdonképpeni DNS-szekvencia előtt kezdő ködönként egy AUG kodont tartalmaz. Ennek következtében prokariótákban, mint például E. coliban egy olyan rekombináns fehéije fejeződik ki, amely az első aminosav helyén (1-es pozícióban) metioninrészt tartalmaz. Sok esetben azonban az szükséges, hogy az 1-es pozícióban metioninmentes rekombináns fehérjéket állítsanak elő. Az ilyen fehérjék kinyerése például egy metioninspecifikus peptidáz segítségével történhet, amely az N-terminális metionint hasítja. Ez az eljárás azonban nagyon költséges, mivel a lehasadás (mértéke) csak fehérjeszekvenálás által állapítható meg. Ezenkívül az 1-es pozícióban metionintartalmú és a metioninmentes fehéije elválasztása a majdnem azonos molekulasúlyuk miatt igen nehéz, és nem valósítható meg tökéletesen.
A 84/02351 számon nyilvánosságra hozott PCTbeli szabadalmi bejelentésből megismerhető egy Nterminális aminosav lehasítása egy fúziós fehérjéről. Az eljárás során egy exopeptidázzal, előnyösen leucin peptidázzal, lépcsőzetes hasítással távolítják el a fehérje aminosavait az N-terminálistól kezdődően egészen az X-Pro szekvenciáig. Ebből a termékből az X-Pro szekvenciát vagy két lépésben, vagy egy egylépéses reakcióban, postprolin-dipeptidál-amino-peptidáz (EC. 3.4.14) alkalmazásával távolítják el. Ez az eljárás azonban azzal a hátránnyal jár, hogy a fehéije aminosavainak N-terminálistól kezdődő, lépcsőzetes lehasítása következtében nem egységes termék, hanem minden esetben egy termékkeverék keletkezik, amely a kívánt termék mellett nem teljes fehérjéket, valamint nagymértékben lebontott fehéijéket is tartalmaz.
A 020 290 számú európai szabadalomból egy további eljárás ismert a fúziós fehérjék enzimatikus hasítására. Ezen eljárás során a fehéije fúziós részeinek hasításához a kollagenáz enzimet alkalmazzák egy meghatározott felismerőszekvencia segítségével. Majd a fúziós részek aminosavait egy ezt követő, további enzimatikus kezeléssel távolítják el. Megállapították azonban, hogy a kollagenáz és egyéb endopeptidázok is csak csekély specifitással rendelkeznek [lásd Biochim. Biophys. Acta 271, 133-144 (1972)]. Továbbá ezen túlmenően a kollagenázok csak azon fehérjék esetén aktívak, amelyek egy specifikus térbeli struktúrával rendelkeznek.
Ismert az is, hogy a fehérjék N-terminális fúziós részeinek hasításához a már említett Xa faktort is felhasználják. A hasítási hatékonyság már említett problémája mellett azonban ez az eljárás is mutat további hátrányokat, éspedig azáltal, hogy esetleg a fehéije belső szekvenciái is felismerhetők és hasadnak. Ezen túlmenően az Xa faktort marhaszérumból kell izolálni, melynek következtében a terápiásán alkalmazott fehérjék hasítását követően szükség van egy költséges tisztításra és analitikai eljárásra, hogy az esetleg előforduló patogén faktorokat, illetve vírusokat kimutassák.
Különböző patogén baktériumfajok (mint például a Neisseria gonorrhoea és Neisseria meningititis a Neisseria nemzetségből, vagy mint a Haemophilus influenzáé és H. aegypticus a Haemophilus nemzetségből), amelyek az emberi nyálkahártyán növekszenek, rokon szekvenciájú proteázokat választanak ki, amelyek a humán IgAl-re specifikusak, és ezért összefoglalóan IgAproteázoknak vagy „Igase”-oknak is nevezik őket. Az immunglobulin IgAl igen fontos komponense a kiváltott immunválasznak, amelynek az ilyen patogén organizmusok infekcióival szemben kell védelmet nyújtania. [Áttekintés: Komfeld és Plánt, Rév. Infect. Dis., 3, 521-534 (1981)]. Emellett az IgA-protáz autoproteolízis révén a saját előfehéijéjét is hasítja. A Neisseria gonorrhoea MSI 1-ből származó IgA-proteáz képződését autentikus baktériumtörzsben, valamint gramnegatív gazdasejtekben már részletesen leírták (DE 36 22 221.6).
Az IgA-proteáz a következő felismerőszekvenciákat hasítja, amelyeket például Pohlner és munkatársai [Natúré, 325,458-462 (1987)] leírtak:
1. Pro-Alá-Pro·! Ser-Pro
2. Pro-Pro ·! · Ser-Pro
3. Pro-Pro ! -Ala-Pro
4. Pro-Pro ! Thr-Pro
- ahol a ! · szimbólum az IgA-proteáz általi hasítóhelyet jelenti. Az IgA-proteáz klónozását is leírták ugyanott Pohlner és munkatársai (1987).
A jelen találmány célja tehát a fúziós fehéijék biokémiai (enzimatikus) hasítására egy javított eljárás kidolgozása, mely szerint a géntechnológiai úton előállított fúziós fehérjéket, amelyek tetszőleges fúziós partnerekből és az átmeneti régióban egy specifikus hasítószekvenciából állnak mint szubsztrátokat alkalmazzuk a kívánt fehérjék lehetőleg magasabb hozammal és reprodukálhatóan történő kinyeréséhez.
Ezt a feladatot géntechnológiai úton oldottuk meg oly módon, hogy a fúziós fehérjék átmeneti régiójába bevezettük a Pro ! - X-Pro felismerőhelyet, illetve hasítószekvenciát, és ezen hasítószekvenciát specifikusan hasítottuk egy IgA-proteázzal a ·! · szimbólummal jelölt hasítóhelyen, ahol X helyén előnyösen Ser, Thr és Alá, és különösen előnyösen Ser vagy Thr áll, de más aminosav is állhat.
A találmány tárgya tehát eljárás fúziós fehérjék enzimatikus hasítására és ezen fúziós fehérjék kívánt részének kinyerésére, amely azzal jellemezhető, hogy (l)egy átmeneti régiót - amely a fúziós fehérje két részét egymással összekapcsolja - géntechnológiai eszközökkel úgy módosítunk, hogy ebben az átmeneti régióban egy Y-Pro·! X-Pro aminosavszekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hely keletkezzen,
HU 217 103 Β ahol X egy tetszőleges aminosav és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet, (2) az (1) lépésben keletkező fúziós fehérjét a felismerőhely ·! jellel jelölt pozíciójában IgA-proteázzal hasítjuk, és (3) hasítás után a fúziós fehérje egy vagy több kívánt részét kinyerjük.
Az „IgA-proteáz” fogalmába a találmány szerint mindazon proteázok beletartoznak, amelyek az IgA-t specifikusan hasítják, amelyek például a Rév. Infekt. Dis., 3, 521-539 (1981) irodalmi helyen vannak leírva. Ugyancsak alkalmasak a rekombináns IgA-proteázok is, amelyeket például a 36 22 221 NSZK-beli közrebocsátási iratban, a Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
79, 7881-7885 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80, 2681-2685 (1983); Natúré, 325, 458-462 (1987) és EMBO Jour., 31, 1595-1601 (1984) cikkekben írtak le.
A fúziós fehérjék átmeneti régiójának módosítása a találmány szerinti eljárással előnyösen úgy valósítható meg, hogy a fúziós fehérjék átmeneti régiójába beépítünk egy DNS-szekvenciát, amely az IgA-proteáz-felismerő helyet vagy annak egy részét kódolja, ahol ez a DNS-szekvencia előtt és/vagy után egy vagy több, a fehéijefüzió kívánt részeit kódoló DNS-szakasz van beépítve. Erre a célra előnyösen kémiai ütőn szintetizált nukleotidszakaszt alkalmazunk.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas olyan fúziós fehérjék hasítására is, amelyek eredetileg (azaz az átmeneti régió módosítása előtt) semmilyen természetes IgAproteáz-felismerő hellyel nem rendelkeztek.
A találmány szerinti eljárásban az IgA-proteáz-felismerő hely az Y-Pro ! X-Pro konszenzus aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol X egy tetszőleges aminosavat és Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent. X jelentése előnyösen szerin, treonin vagy alanin. Y jelentésére több aminosavszekvencia állhat, amelyek Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával végződnek.
A találmány szerinti eljárás tehát magában foglalja a legalább Pro ! X-Pro konszenzus hasítószekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hely bevezetését egy tetszőleges fúziós fehérje átmeneti régiójába, például a hordozó fehérje és a kívánt fehérje közé, majd a hasítást és a kívánt fehérje kinyerését egy IgA-proteáz felhasználása által. A Pro ! X-Pro hasítószekvenciában X helyén előnyösen Ser, Alá vagy Thr aminosav állhat. A hasítás további optimalizálásához a hasítószekvencia megjelölt helyére további speciális aminosavakat lehet beiktatni, különösen Pro-t.
Különösen előnyösek az alábbi aminosavszekvenciák:
a) Pro-Ala-Pro ! · Ser-Pro,
b) Pro-Pro ·! · Ser-Pro,
c) Pro-Arg-Pro-Pro ·! · Ala-Pro,
d) Pro-Pro ! Thr-Pro,
e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro! -Thr-Pro oder,
f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! Thr-Pro.
Amennyiben a találmány szerinti eljárást olyan fúziós fehéijék hasítására alkalmazzuk, amelyekben a kívánt fehérje a hordozó fehérje után következik, az IgAproteázzal történő hasítás során olyan fehérje keletkezik, amelynek aminoterminálisa az X-Pro szekvenciával jellemezhető. Ez a szekvencia lehet a kívánt fehérje része előtagként, utótagként. Ez a szekvencia általában akkor szerepel előtagként, ha a géntechnológiai úton előállított kívánt fehérje természetes formájában is tartalmazza az aminoterminálisán az X-Pro-nak megfelelő mindkét aminosavat. Az aminoterminálison X-Proval jellemzett fehérjék, amelyek a biotechnológiában fontosak, a természetben is előfordulnak.
A találmány szerinti eljárás minden más, a fúziós fehérjék hasítására szolgáló ismert eljárással szemben azon előnyökkel rendelkezik, hogy meglepő módon általánosan alkalmazható minden olyan fúziós fehérjére, amelyek a megadott hasítószekvenciát az átmeneti régiójukban hordozzák, és hogy az oldhatatlan, oldott, membránasszociált és a sejthez kötött fehérjefúzióknál is alkalmazható. Különös előnye az eljárásnak ezen túlmenően, hogy lehetőséget nyújt olyan fúziós fehérjék, illetve fehérjefúziók hasítására, amelyek a mikroorganizmusokban precipitátumok formájában keletkeznek, és amelyekből azok - mint ilyenek - könnyen dúsíthatok. Az eljárás egy további előnye abban áll, hogy az alkalmazott hasító enzim, az „Igase” nem patogén baktériumok tenyészetéből csekély ráfordítással kinyerhető.
Az „Igase” számára szükséges hasítószekvencia beépítése a fehérjefúzió átmeneti régiójába géntechnológiai eszközökkel kivitelezhető. így például a nukleotidoknak egy sorrendje, illetve egy nukleotidszekvencia, amely a hasítószekvenciát vagy annak egy részét kódolja, kémiai úton szintetizálható, és egy kívánt fehérje DNS-szakaszai közé ismert géntechnológiai eszközök segítségével beépíthető. A nukleotidok egy természetes sorrendje is ennek megfelelően, amely az alkalmas hasrtószekvenciát vagy annak egy részét kódolja, beépíthető. A fehérjefúziót kódoló gén előnyösen egy alkalmas (előnyösen indukálható) expressziós szignálszekvencia kontrollja alatt áll, úgy, hogy a követelményeknek megfelelő fúziósfehérje-termék fejeződik ki. A fehérjefúziók termelésére szolgáló gazdasejtekként alkalmas prokarióta és eukarióta (növényi, valamint állati) sejtek felhasználhatók, azonban sejtmentes rendszerek is alkalmazhatók. Az eljárás során alkalmazott hordozófehérjék bármilyen fúnkciójúak lehetnek, attól függően, milyen tulajdonságokat kell a fehérjefúzióknak kölcsönözniük, mint például meghatározott transzport funkciók, vagy funkciók, amelyek a fehérjefúziók tisztítását vagy azok stabilitását megjavítják, és még sok egyéb. Az előnyösen alkalmazott hordozófehérjéket az alábbiakban ismertetjük.
A fehéijefúziók hasítása a találmány szerinti eljárásnak megfelelően előnyösen „Igase”-okkal történik, amelyek egy túltermelődő nem patogén baktériumtörzsben képződnek, és a többlettenyészetből tisztítással kinyerhetők (lásd például DE-3622 221).
A találmány szerinti eljárás preparatív, valamint analitikai célokra is felhasználható. Preparatív alkalma4
HU 217 103 Β zás esetén az eljárás fontos fehérjék biotechnológiai előállítására szolgál, amelyek például a gyógyászatban, a kutatásban, a környezetvédelemben vagy ipari eljárásoknál, illetve termékeknél találhatnak felhasználásra. Analitikai alkalmazás esetén az eljárás - például alkalmas expressziós rendszerekkel összekapcsolva - génfúziók rutinvizsgálatára szolgálhat.
A fúziós fehérjék enzimatikus hatására és ezen fúziós fehérjék kívánt részeinek kinyerésére szolgáló találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módját az jellemzi, hogy
1) valamely sejtet egy rekombináns DNS-sel vagy egy rekombináns vektorral transzformálunk, ahol a DNS, illetve a vektor legalább egy gén kópiáját tartalmazza, amely egy fúziós fehéijét kódol, amely az átmeneti régióban legalább egy IgA-proteáz-felismerő helyet tartalmaz,
2) a transzformált sejtet egy alkalmas közegben tenyésztjük,
3) a fúziós fehérjét kódoló gént a transzformált sejtben kifejezésre juttatjuk,
4) a fúziós fehérjét IgA-proteázzal hasítjuk, és
5) a fúziós fehérjék egy vagy több kívánt részét izoláljuk.
Az eljárás során a fúziós fehéijék IgA-proteázzal történő kezelése a közegben (tenyészlében) a sejtfeltárás után és/vagy a sejtes fehérjék részleges vagy teljes elválasztása után történhet.
Egy fúziós fehérje, mindenekelőtt egy prokarióta expressziós termék kezelésére továbbá előnyös, hogy az IgA-proteázokat a szakember számára ismert módon, például a 0 141 223 vagy a 0 141 224 számú európai szabadalmakban leírtak szerint immobilizáljuk.
A találmány szerinti eljárás különösen előnyösen alkalmazható olyan rekombináns fehéijék, illetve peptidek előállítására, amelyek az N-terminálison metioninmaradékot nem tartalmaznak, olyan fúziós fehérjékből, illetve peptidekből, amelyek a Met-Y-Pro-!-X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkeznek, ahol X helyén egy tetszés szerinti aminosav, előnyösen Thr, Ala vagy Ser áll, Y pedig egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, amely előnyösen, ha X jelentése Thr vagy Ala, Pro-val végződik, vagy ha X jelentése Ser, akkor Pro-Ala vagy Pro-Pro szekvenciával végződik, és A egy tetszés szerinti aminosavszekvenciát jelent. Az eljárás folyamán a fúziós fehérjét, illetve peptidet IgAproteázzal hasítjuk, és egy X-Pro-A aminosavszekvenciájú hasítási terméket nyerünk.
Ezen eljárás például a prokarióta sejtekből származó, az N-terminálison metioninmaradék nélküli rekombináns fehérjék hasítására a következő lépéseket foglalja magában:
1) egy prokarióta sejtnek egy olyan génnel való transzformálását, amely egy Met-Y-Pro! X-Pro-A aminosavszekvenciájú fehéijét, illetve peptidet kódol, melyben X, Y és A jelentése a fentiekben megadott,
2) a transzformált sejt tenyésztését egy alkalmas közegben, és a transzformált gén kifejeződését,
3) a Met-Y-Pro-! X-Pro-A aminosavszekvenciával transzformált sejtből kifejeződött termék IgAproteázzal történő hasítását, és
4) a kapott X-Pro-A aminosavszekvenciájú, az Nterminálison metionint nem tartalmazó hasítási termék izolálását.
A találmány szerinti eljárással meglepő módon magas hozammal és jó specifitással, egy lépésben lehet az N-terminálison metioninrészt nem tartalmazó fehérjéket kinyerni, amelyek az N-terminálison az X-Pro szekvenciát hordozzák, ahol X jelentése előnyösen Thr, Ala vagy Ser.
A fúziós fehérje Y hordozó része egy legalább 1, előnyösen 1-100, különösen 1-50 tagszámú aminosavszekvenciát jelent, amely egy IgA-proteáz által felismerhető hasítószekvenciával végződik. Ha X helyén Ser áll, akkor Y előnyösen a Pro-Ala szekvenciával vagy Pro-val végződik. Ha X jelentésére Thr vagy Ala áll, akkor Y előnyösen Pro-val, még előnyösebben Arg-Pro, Pro-Arg-Pro vagy Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával fejeződik be.
Egy különösen előnyös kivitelezési mód esetén az Y helyén legalább 5 aminosav áll, amelyek a Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával végződnek. A találmány szerinti eljáráshoz azonban minden, az IgA-proteáz által felismert hasítóhely alkalmas.
Az Y hordozórész emellett még további, előnyösen 100, még előnyösebben 50-ig teqedő tetszőleges aminosavat tartalmaz. Erre előnyösen olyan aminosavszekvenciák alkalmasak, amelyek a DNS-szintjén a Met-Y-Pro-! X-Pro-A fehéije expresszióját javítják és/vagy az aminosavszinten a sejtből történő kinyerését megkönnyítik.
A Met-Y-Pro-!-X-Pro-A protein expressziója DNS-szinten például a béta-galaktozidáz gén fragmenseinek fúziója révén javítható, azaz az Y hordozórész felöleli a béta-galaktozidáz protein egy részét. Más lehetőségek a Met-Y-Pro·!-X-Pro-A protein expressziójának növelésére a szakember számára ismertek. Például egyéb - különösen hosszú - polipeptidek fúziója által [például poli(Lys, Arg)] vagy egy nagy affinitású bizonyos szubsztrátra (például sztreptavidin) való kötés által lehet az expressziós termék tisztítását és elválasztását megkönnyíteni (lásd például 0 089 626 és 0306610 számú európai közrebocsátási iratot).
A találmány tárgya továbbá egy fúziós fehéije, amely több polipeptidrészt tartalmaz, és amely a különböző polipeptidrészek közötti legalább egy átmeneti régióba beépített egy vagy több Pro·!-X-Pro szekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hellyel rendelkezik, ahol X jelentése egy tetszőleges aminosav, előnyösen azonban Ser, Thr vagy Ala. Felismerő helyként különösen az alábbi aminosavszekvenciák előnyösek:
a) Pro-Ala-Pro ! Ser-Pro,
b) Pro-Pro·! · Ser-Pro,
c) Pro-Arg-Pro-Pro -! Ala-Pro,
d) Pro-Pro -! -Thr-Pro,
e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro -! - Thr-Pro vagy
f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! - Thr-Pro, ahol ! · a hasítóhelyet jelenti.
HU 217 103 Β
A jelen találmány magában foglal különösképpen egy fehérjét, illetve peptidet is, amely a Met-Y-Pro·! X-Pro-A aminosavszekvenciával jellemezhető, ahol X jelentésére előnyösen Thr, Alá vagy Ser áll, Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, és előnyösen, ha X jelentése Thr vagy Alá, Pro-val végződik, ha X jelentése Ser, akkor Pro-Alá szekvenciával vagy Pro-val végződik, és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent. Egy ilyen jellegű fehéije vagy peptid fejeződik ki a találmány szerinti eljárásban egy prokarióta sejt egy rekombináns vektorral történő transzformációja által, amely vektor legalább egy gén kópiáját hordozza, és ez a gén a fenti fehérjét, illetve peptidet kódolja.
A találmány tárgya továbbá egy rekombináns DNS, amely a találmány szerinti fehéijét, illetve peptidet kódolja, ahol a fúziós fehéije legalább egy átmeneti régiójába egy vagy több IgA-proteáz-felismerő hely, illetve hasítószekvencia van beépítve.
A találmány szerinti rekombináns DNS a molekuláris biológia területén jártas szakember számára ismert módon előállítható. Hasonlóképpen előállítható ehhez egy vektor, amely az A aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, ezen gén 5’-végének területén restrikciós endonukleázzal vagy -nukleázokkal történő hasításával, és az oligonukleotidok, amelyek a kívánt szekvenciát tartalmazzák, újraligálásával. Az oligonukleotidnak ennélfogva egy olyan szekvenciát kell tartalmaznia, amely az IgA-proteáz hasítóhelyét vagy annak egy részét kódolja.
A találmány tárgya továbbá egy rekombináns vektor is, amely a találmány szerinti rekombináns DNS legalább egy kópiáját tartalmazza. A prokarióta szervezetekben lejátszódó fehérjeexpresszióhoz alkalmas bázisvektorok a szakember számára ismertek. Ez a vektor kedvező módon egy olyan vektor, amely lehetővé teszi a találmány szerinti rekombináns DNS magas szintű kifejeződését. Előnyösen a rekombináns DNS a vektorban egy indukálható expressziós szignál (például lambda, tac, lac vagy trp promoter) kontrollja alatt áll.
A találmány szerinti vektor lehet extrakromoszomális is (például plazmid), és a gazdasejt genomjába integrált is (például lambda bakteriofág). A találmány szerinti vektor előnyösen egy plazmid. Azok a vektorok, amelyek egy meghatározott mikroorganizmusban a génexpresszióra alkalmasak, a molekuláris biológia területén jártas szakember számára ismertek. Szóba jöhet egy eukarióta, különösen pedig egy prokarióta vektor. A találmány szerinti DNS prokariótákban történő kifejezéséhez alkalmas vektorok például a kereskedelmi forgalomban kapható pUC és pUR vektorok.
A találmány tárgya továbbá egy sejt, előnyösen egy prokarióta sejt, különösen előnyösen egy E. coli sejt, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-sel és/vagy a találmány szerinti rekombináns vektorral van transzformálva.
A találmány szerinti eljárással egy lépésben nyerhető fehéijék, amelyek az N-terminálison az X-Pro szekvenciát hordozzák, ahol X jelentése Thr, Alá vagy Ser, például a humán eritropoietin, a humán T-sejt-receptor béta-lánca és különösen a humán granulocita stimuláló faktor (G-CSF).
A G-CSF-t mint limfokint az aktivált monociták, makrofágok és egyéb sejtvonalak egész sora szintetizálja. A limfokinek az immun-, illetőleg vérsejtes rendszer sejtjeinek érési folyamataiban vesznek részt. Stimulálják a sejtekhez diffundáló csontvelő őssejtek érését. így indukálja a G-CSF például a neutrofilek és granulociták képződését.
Mivel a G-CSF abban a helyzetben van, hogy a neutrofil sejtek populációját rövid időn belül lényegesen fokozza, ebből jelentős terápiás felhasználási terület adódik a G-CSF számára. így például a ráknál alkalmazott kemoterápia után, amikor is az immunrendszer sejtjei széttörnek, felhasználható. Továbbá alkalmazható a G-CSF csontvelő-transzplantációknál, súlyos égési sebeknél, immungyengeség által keletkező opportunista infekcióknál és leukémiánál.
A G-CSF egy szekréciós fehérjemolekula. A primer transzlációs termék ezért egy N-terminális szignálszekvenciát tartalmaz, amely a szekréció során lehasad úgy, hogy az érett G-CSF szekvenciája a +l-es és +2-es aminosavpozíciókban Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik. A prokariótákban történő G-CSF-termelődés során ez a szignálpeptid csak rosszul vagy egyáltalán nem hasad le, úgyhogy prokariótából a szignálszekvencia nélküli G-CSF előállításához az érett G-CSF-t kódoló DNS-szekvencia kezdete elé, amely fehéijeszinten Thr(+l)-Pro(+2)-vel kezdődik, iniciációs ködönként egy AUG(Met) kodont kell klónozni. Ennek következtében prokariótákban, mint E. coliban, egy olyan G-CSF fejeződik ki, amely a -1 aminosavpozícióban egy metionint tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással egyszerű módon előállítható prokariótákból a -1 aminosavpozícióban metioninmentes G-CSF, amely a Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik.
Ez úgy történik, hogy prokariótákból egy G-CSFszármazékot nyerünk, amely az aminosavszekvencia + l-es és +2-es pozíciójában a Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakat tartalmazza, és ez előtt a -1 pozíciótól kezdve egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyik az IgA-proteáz által felismerhető, és a G-CSF aminosavszekvenciájától, amely Thr(+l)-Pro(+2)-vel kezdődik, lehasítható.
Egy előnyös kiviteli mód szerint ez a származék a -1 és -2 pozíció mindegyikében Pro-t, a -3 pozíciótól a -1 pozícióig az Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát, a -4 pozíciótól a -1-ig a Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát, vagy a -5 pozíciótól a -1-ig az Ala-Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát tartalmazza.
Egy különösen előnyös kiviteli mód szerint ez a derivát a -6 pozíciótól a -1 pozícióig a -6 -5 -4 -3 -2 -1
Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát tartalmazza.
A találmány értelmében G-CSF alatt a természetes G-CSF-t, amelynek szekvenciája például a Science, 232, 61 (1986) helyen vált ismertté, valamint az ebből
HU 217 103 Β levezetett granulocita stimuláló hatású származékokat értjük, amelyek aminosavszekvenciája X(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik. X jelentésére Thr, Ser vagy Alá, különösen előnyösen Thr áll.
A találmány szerinti G-CSF-származékok a prokariótákban történő expresszió után hasíthatok IgA-proteázokkal a +1 és -1 pozíció között [Thr( +1) és Pro(-1) között]. így egyetlen hidrolízis lépéssel egy, a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF-t kapunk, melynek Nterminális aminosavszekvenciája a természetes G-CSF aminosavaival [Thr(+l)-Pro(+2)] kezdődik.
A G-CSF prokariótákban történő expressziója során nehezen oldódó aggregátumok (refractile bodies) képződnek, amelyek inaktívak. Mielőtt a proteint például terápiás célokra felhasználnánk, át kell alakítani aktív formájába. A szakember számára közismert eljárások (lásd például 0219874 és 0114506 számú európai közrebocsátási iratok, 84/03 711 számú PCT-beli közrebocsátási irat) során mindenekelőtt denaturálószerek hozzáadásával a proteint oldhatóvá tesszük (szolubilizáljuk), ezen lépéshez renaturálás és adott esetben további tisztítási lépések csatlakoznak. A találmány szerinti proteinek IgA-proteázzal történő kezelését véghezvihetjük a szolubilizálás előtt vagy után, vagy csak a renaturálás után. Némely esetben közvetlenül a szolubilizálás után kell az IgA-proteázos kezelést elvégezni, ekkor a szolubilizálószert (például guanidin-hidroklorid vagy karbamid) az IgA-proteáz hozzáadása előtt dialízissel el kell távolítani. Előnyösen azonban az IgA-proteázos kezelést a renaturálás után végezzük, mivel ebben az esetben különösen magas a G-CSF-kitermelés.
A G-CSF, illetve egy másik hasadó fehéije IgAproteázos kezelésének a feltételei önmagukban nem kritikusak. Előnyös mégis, ha a G-CSF-t (illetve egy másik fehérjét) az IgA-proteázhoz viszonyítva 1:1-100:1 arányban alkalmazzuk. Az átalakítást előnyösen pufferolt vizes oldatban pH=6,5-8,5 értéknél végezzük. A pufferkoncentráció előnyösen 50-300 mmol/1, adott esetben 20-100 mmol/1 nátriumklorid hozzáadása mellett. A hasítás előnyösen szobahőmérsékleten, 20-60 perc alatt megy végbe.
A szolubilizálás, a renaturálás és az IgA-proteázzal történő hasítás után az így kapott hasítási terméket előnyösen ioncserélővel és méret szerinti írakcionálással tisztítjuk. Az ilyen módon előállított és a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF a szennyező egyéb fehérjéket 0,1% alatt, előnyösen ICE3 %-ban tartalmazza.
A -1 pozícióban metioninmentes G-CSF-t az IgAproteázos hasítással tehát gyakorlatilag kvantitatíve el lehet választani, illetve megtisztítani a metionint tartalmazó fúziós fehéij éktől.
A találmány szerinti eljárással prokariótákból egy rekombináns G-CSF-t lehet nyerni, amely kevésbé, mint 0,1%, különösen kevésbé, mint 10~3% szennyezett egyéb fehéijékkel, és kvantitatíve mentes egy olyan prokariótákból származó G-CSF-től, amely -1 pozícióban metionint tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá egy gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként a találmány szerinti eljárással prokariótákból nyert G-CSF-t tartalmazza, adott esetben egyéb, a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, töltő- és segédanyagokkal együtt. Egy ilyen gyógyszerkészítmény különösen olyan terápiás kezelésekre alkalmas, ahol a granulociták, különösen a neutrofílek képződését elő kell segíteni.
A találmány szerinti gyógyászati készítményeket előnyösen injekció és infúziós oldat formájában lehet alkalmazni. Ez olyan módon történhet, hogy egy már beadásra kész oldatot állítunk össze, amely a találmány szerinti összetétellel bír. Az is lehetséges azonban, hogy a gyógyszerkészítményt liofilizátum formájában szereljük ki. Ezeket lehet aztán önmagában ismert, injekciós célra alkalmas anyagokkal vagy oldatokkal rekonstruálni. Injekciós közegként előnyösen vizet alkalmaznak, amely az injekciós oldatoknál szokásosan alkalmazott adalékokat, így stabilizálószert, oldódást elősegítő puffért és izotóniás adalékokat, például egy fiziológiás NaCl-oldatot tartalmaz. Hasonló jellegű adalékok például a mannit, tartarát- és citrátpuffer, etanol, komplexképzők, mint például az etilén-diamin-tetraecetsav és ennek nem toxikus sói, valamint nagy molekulájú polimerek, mint a folyékony polietilén-oxid a viszkozitás szabályozására. A folyékony hordozóanyagokat az injekciós oldatokhoz sterilizáljuk és előnyösen ampullákba töltjük.
Végül a jelen találmány magában foglalja a prokariótákból származó, a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF felhasználását is a találmány szerinti gyógyászati készítmények előállítására.
Abban az esetben, ha egy tetszőleges fúziós protein találmány szerinti eljárással történő hasítása során az eljárás eredményeként egy X-Pro-A proteint kapunk (ahol X egy tetszőleges aminosavat és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent), amely az N-terminálisán azonban egy nem kívánt X-Pro dipeptidet hordoz, lehet ezt a nemkívánatos dipeptidet - a találmány szerinti eljárás részeként - egy további, dipeptidil-aminopeptidázos (DPAP) kezeléssel leválasztani. Dipeptidilamino-peptidázokat eddig egy egész sor mikroorganizmusban, rovarban, kétéltűben és különböző humán szövetben találtak. Ezek például az előfehéijék lépcsőzetes képződésére szolgálnak és részben kifejezetten specifikusak az X-Pro dipeptid aminoterminális lebontására (X-Pro-DPAPase, G. Kreil, Trends in Biochemical Sciences, 15, 23-26, 1990). Az „Igase”-nak és az X-Pro-DPAP-nek a találmány szerinti kombinációja által ezért a kívánt fehéij éket tetszőleges aminosawal lehet az aminoterminálison előállítani.
Az „Igase”-nak és az X-Pro-DPAP-nek a fent leírt kombinációjával most sikerült prokariótákból eltérő Nterminális aminosavszekvenciájú, a -1 pozícióban metioninmentes fehérjéket is előállítani. Ehhez elsősorban egy fúziós proteint kell előállítani, amely a Met-Y-Pro ! X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol ebben az esetben a kifejeződő fehéije kívánt részének A aminosavszekvenciája mindkét X-Pro N-terminális aminosavtól mentes.
A prokarióta sejtek Met-Y-Pro-!-X-Pro-A aminosavszekvenciájú expressziós termékét legelőször IgA-proteázzal hasítjuk úgy, hogy egy X-Pro-A szek7
HU 217 103 Β venciájú első hasítási hely keletkezzen. Ezt a fehéijét lehet aztán a fent leírtak szerint egy dipeptidil-aminopeptidázzal kezelni, amely specifikusan felismeri az X-Pro szekvenciát és a Pro után hasítja. Ezáltal egy második hasítási termék keletkezik, az önmagában tetszőleges A aminosavszekvenciával. A találmány szerinti eljárás ezáltal különösen hasznosnak bizonyul az N-terminálison metioninmaradékot nem tartalmazó különböző fehéijék előállítására, és nincs korlátozva csak olyan fehérjék előállítására, amelyek az N-terminálison X-Pro szekvenciájúak, ahol X előnyösen Ser, Thr vagy Alá.
Végül a találmány vonatkozik egy rekombináns DNS-re is, amely egy - a fentiekben definiált - IgAproteáz-felismerő helyet kódoló területet tartalmaz, és beépíthető egy fúziós fehérje átmeneti régiójába.
Előnyösként egy kémiai úton szintetizált DNS-ffagmens jön szóba, melynek végein kedvező módon egy vagy több alkalmas restrikciós hasítóhely található.
A fogalmak definíciói:
A találmány szerinti eljárás a kívánt fehéijék biotechnológiai úton való előállítását foglalja magában. Biotechnológiai út alatt - ezzel összefüggésben - azt értjük, hogy egy kívánt fehéije vagy ugyanannak egy köztiterméke géntechnológiai eszközök és egyéb biotechnológiai eljárások felhasználásával (például mikroorganizmusok fermentációja) keletkezik.
Egy kívánt peptid egy köztitermék vagy egy végtermék, amely például a gyógyászat, kutatás területén, a környezetvédelemben vagy az ipari eljárásoknál vagy termékeknél felhasználásra találhat.
A találmány szerinti eljárás magában foglalja egy fúziós proteinből (amit fehérjefúziónak is nevezünk) egy kívánt fehéije képződését, ahol a fúziós fehérje, illetve fehéijefúzió több, egymással kovalensen összekötött fúziós partnerből tevődik össze. A fúziós partnerek közül legalább az egyik a kívánt fehéije. A fúziós fehérjén belül a fúziós partnerek sorrendje és azok ismétlődési száma tetszőleges, mégis előnyösen a fúziós protein egy aminoterminálison lévő hordozó- és egy karboxiterminálison lévő kívánt proteinből áll.
A hordozófehéqe, illetve annak egy része arra szolgál, hogy a fúziós protein formában lévő kívánt fehérének különleges tulajdonságokat kölcsönözzön. Ilyen tulajdonságok fejeződnek ki például a fúziós fehéijék megnövekedett stabilitásában, amely a szerkezeti sajátosságokon alapul, és ezáltal nagyobb rezisztenciát biztosít a sejten belüli proteázokkal szemben, vagy pedig a fúziós proteinek egy csekélyebb proteolitikus aktivitású területre történő transzportján alapul. Továbbá a hordozó fehérjében kialakíthatók olyan tulajdonságok, amelyek a fúziós fehéije hatékony tisztítását teszik lehetővé. Ezek közé tartozik például egy meghatározott ligandum megkötése az affinitáskromatográfiás módszerekkel összefüggésben, a fúziós proteinek leválása a csekély ráfordítással leválasztható csapadékrészecskékbe és a fehérjék könnyen hozzáférhető helyekre történő transzportja.
Azokat a területeket a fúziós fehérjén belül, amelyekben a fúziós fehéije komponensei (a hordozófehérje és a kívánt fehéije) egymással összeköttetésbe lépnek, átmeneti régióknak nevezzük. Minden egyes átmeneti régió egy vagy több aminosavsorrenddel definiálható. Az aminosavsorrendeket (mint az aminosavak és fehéijék minden más sorrendjét is) az aminoterminálistól (balról) a karboxiterminális irányába (jobbra) értelmezzük és állítjuk elő.
A találmány szerinti eljárás keretébe tartozó minden olyan, az átmeneti régióban lévő aminosavsorrendet, amelyet az IgA-proteázoknak hasítaniuk kell, a találmány szerinti hasítószekvenciának, illetve felismerőszekvenciának nevezünk.
Mindazon helyet egy aminosavsorrend két aminosavrésze között, amelyen a fúziós protein, illetve fehérjefúzió hasítása végbemegy, hasítóhelynek nevezzük.
A találmány szerinti eljárás magában foglalja a fúziós fehéijék IgA-proteáz által történő enzimatikus hasítását az átmeneti régiókban. IgA-proteázok, illetve „Igase”-ok alatt a találmány szerinti eljárásban a Neisseria gonorrhoeae MSI 1 törzsből származó IgA-proteázt és minden egyéb, ezzel a proteázzal nukleotidszinten és képződési folyamatban rokon enzimet értünk. Ezek közé soroljuk különösen a Neisseria és Haemophilus nemzetség IgAproteázait.
Az E. coli ED 8654 mikroorganizmus DSM 2102 számon, a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (Griesebachstrasse 8, 3400 Göttingen) deponáló helyen lett letétbe helyezve.
A találmányt a következő példákkal - az ábrákkal együtt - világítjuk meg.
Az ábrák ismertetése:
Az 1. ábra az MS2-polimeráz hordozófehérje (99 aminosav) és az N. gonorrhoeae MSI 1-ből származó IgA-proteáz előfehérje β-doménje (aminosavpozíció 1195-1505) közötti fehérjefúziót mutatja be sematikusan.
Ezen két rész közötti átmeneti régió 12 aminosavból áll, és tartalmazza az IgA-proteáz számára a -Pro-Pro·! Thr-Pro- hasítószekvenciát. A hasítóhely megkonstruálására az EcoRI és HindlII restrikciós hasítóhelyek közé 4 oligonukleotid (1)-(4) lett beépítve. A polipeptid előállítását és tisztított „Igase”-zal történő hasítását közelebbről az 5. példa szemlélteti.
A 2. ábra egy proteinfüziót mutat be, amely hordozófehérjéből (az MS2-polimeráz 99 aminosavából és 6 plazmidkódolta aminosavból áll) és a humán T-limfociták CD8-proteinjének 206 aminosavából áll. A CD8protein aminosavsorrendjében megtalálható a természetes hasítószekvencia, amely az „Igase” által hasítható (lásd 6. példa).
A 3. ábra a B63* fehéijefúziót mutatja be, amelyet E. coli sejtek expressziós-szekréciós rendszerének segítségével állítottunk elő. Ez a fúzió az aminovégen a koleratoxin B alegységből (103 aminosav) áll, ezt követi egy kötőrégió (11 aminosav) az „Igase” hasítóhellyel, majd következik a karboxivégen az IgA-proteáz előfehéije β-doménjének egy része (aminosavpozíció 1097-1160). A hasítóhelyet mindkét oligonukleotid (TK 006 és TK 007) segítségével mindkét proteindoménbe beépítettük.
HU 217 103 Β
A 4. ábra a B49 és B59 fehéqefüziókat mutatja sematikusan. Azok a koleratoxin B alegységből és az IgAproteáz előfehéije β-doménjéből állnak. A két fehéije között két különböző átmeneti régiót tartalmaznak, két különböző „Igase” hasítószekvenciával (-Pro-Pro-Ala-Pro- és -Pro-Pro-Thr-Pro-). A hasítószekvenciát szintetikus oligonukleotidokkal konstruáltuk (lásd 3. ábra).
1. példa
Plazmid szerkesztése metioninmentes G-CSF kifejezésére
A szerkesztéshez a pPZ07-mgllac jelű expressziós vektort (WO 88/09373) használtuk fel. Ehhez a pPZ07mgllac jelű expressziós vektort Ncol enzimmel hasítottuk, és a kiálló végeket Mung-bean nukleázzal eltávolítottuk. Ezt követően a vektort BamHI-gyel hasítottuk. Az IgA felismerőszekvenciához DNS-szinten a következő oligonukleotidokat készítettük el.
Oligonukleotid A:
5’ AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA
CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTG GGC
CCTG3’.
Oligonukleotid B:
5’ GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG
AGG TCG CAG TGG CAT TAA TTT TTC CTC
CGA ATT 3’.
Mindkét oligonukleotidot ekvimoláris mennyiségben összekeveijük, és körülbelül 100-szoros feleslegben a fent leírt módon hasított pPZ07-mgllac jelű vektorba bevezetjük. Ligálás után a szokásos módon kompetenssé tett E. coli K12 sejteket transzformáltuk. A sejtekből a DNS-t ismert módszerek szerint izoláltuk és Apai-gyei és BamHI-gyel hasítottuk. Egy körülbelül 520 bp hosszúságú G-CSF-fragmenst a G-CSF-szekvenciából (Science, 232, 61-65, 1986) az Apai és BamHI restrikciós endonukleázok felhasználásával izoláltunk. Ezt a fragmenst a hasonlóképpen Apai és BamHI-gyel hasított vektorba ligáltuk.
2. példa
A fúziós fehéije az IgA 1-felismerőszekvencián túlmenően még peptideket is tartalmazhat, amelyek a tisztítást segítik. Ezek a sztreptavidint kódoló DNS-ből állhatnak. Ebben a sztreptavidin gént (WO 89/03422) a helyes leolvasási keretbe az IgA-proteáz-felismerő hely elé klónoztuk.
3. példa
Az 1. példában leírt plazmiddal E. coli KI 2 sejteket (ED 8654, DSM 2102) transzformáltunk, antibiotikum markerre (ampicillin) szelektáltuk azokat, és a plazmidot restrikciós analízis útján jellemeztük. Egy ilyen kiónt használtunk fel a tenyésztésre és a G-CSF expresszálására. A sejteket teljes tápközegben tenyésztjük. Ez a tápközeg literenként 16 g bactotryptont (Difco), 10 g élesztőextraktumot (Difco) és 5 g nátrium-kloridot tartalmazott. A sejteket növekedni hagytuk, míg az OD-érték 2-ről 546-ra nőtt, és ekkor 10-3 mol/1 IPTGvel (izopropil^-D-tiogalaktopiranozid) indukáltuk. További 4 óra elteltével a sejteket centrifugálással elválasztottuk, lizozim/EDTA segítségével feltártuk, és a
G-CSF-t mint zárványtesteket (inclusion bodies) izoláltuk (IB’s, lásd 0219 874 európai közrebocsátási irat).
Az izolált, oldhatatlan G-CSF fúziós részecskék denaturálását, illetve renaturálását a 0219 874 számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint hajtottuk végre. A denaturálást dialízissel végeztük 6 mol/1 guanidin-hidrokloriddal szemben. Ezután egy alikvotot vettünk ki, és 5 mmol/1 kálium-foszfát-pufferrel szembeni dialízis után pH 7-en IgA-proteázzal hasítottuk (lásd 4. példa).
Alternatív megoldás, ha a denaturálás után, melyet guanidin-hidrokloridban hajtottunk végre, egy dialízist végzünk 5 mmol/1 kálium-foszfát pufferrel szemben pH 7 értéken, amely 1 mmol/1 GSH-t (glutation, redukált) és 3 mmol/1 GSSG-t (glutation, oxidált) tartalmazott. Denaturálás után hasonlóképpen egy dialízis következik 5 mmol/1 kálium-foszfát pufferrel szemben, pH 7 értéken.
4. példa
Fúziós fehérje IgA 1-proteázzal történő hasítása natív, a-l pozícióban metionint nem tartalmazó G-CSF előállítására
Az IgAl-proteázt az EMBO Jour., 3, 1595-1601 (1984) cikkben leírtak szerint izoláltuk. 10 pg, a 3. példa szerint előállított renaturált, illetve denaturált G-CSF-hoz 2-5 pg IgA-proteázt adtunk és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Különböző ioncserélő oszlopokon, mint a Mono-Q vagy Mono-S a metioninmentes G-CSF-t izoláltuk. Az aminoterminális vég fehérjeszekvenálása igazolta, hogy a tisztított G-CSF a korrekt aminosavsorrenddel Thr(+l)-Pro(+2) kezdődik.
5. példa
Fehérjefúzió előállítása és a zárványtestekből származó oldhatatlan fehérjeaggregátum hasítása egy „Igase-specifikus hasítóhelyen
A pEX31C jelű prokarióta expressziós vektort (K. Strebel: Journal of Virology, 57, 983-991, 1986) oly módon módosítottuk, hogy egy, ezzel a rendszerrel E. coli sejtekben termelődött fehéijefuzió a hordozófehérje és a kívánt fehéije között „Igase” által hasítható legyen. E célból szintetikusan előállított oligonukleotidokból egy duplaszálú DNS-fragmenst állítottunk elő, amely a Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! Thr-Pro aminosavszekvenciát kódolja. Ezt a DNS-fragmenst a pEX31C jelű expressziós vektor EcoRI hasítóhelyére géntechnológiai módszerekkel behelyeztük. Ez után közvetlenül a HindllI hasítóhely mellé két további szintetikus DNS-fragmenst vezettünk be, amelyek egy sor alkalmas hasítóhelyet tartalmaztak a restrikciós endonukleázok számára, és terminációs szignálokat a génexpresszióban részt vevő bakteriális enzimek számára. Az így keletkezett pEV37 jelű expressziós plazmidba az Smal és HindllI hasítóhelyek használata révén egy DNS-fragmenst építettünk be, amely a Neisseria gonorrhoeae MSI 1-ből származó IgA-proteáz
HU 217 103 Β előpeptid béta-doménjét kódolta. Ezáltal egy hibrid gén keletkezett, amelynek E. coliban történő kifejeződése során egy fúziós fehérje képződött. Ez a fúziós fehérje az aminovégen hordozófehérjeként az MS2-polimeráz 99 aminosavát tartalmazta, ezután következett egy 12 aminosavból álló centrális átmeneti régió az „Igase” hasítószekvenciával és a kívánt béta-domén a karboxilvégen (lásd 1. ábra). A béta-domén a fehéijefűzió karboxilvégéről a Pro ·! · Thr hasítóhelyen az átmeneti régión belül lehasítható.
A hibrid gént tartalmazó plazmidot transzformációval vittük be az E. coli sejtekbe, amelyek a lambda bakteriofágból származó Cl857 regulációs faktort tartalmazták, mellyel a fehéijefuzió túltermelése szabályozható (E. Remant, Gene, 22, 103-113, 1983). A CI837represszort a hőmérséklet 28 °C-ról 42 °C-ra történő emelésével inaktiváltuk, és ennek következtében a fehérjetermék a rekombináns E. coli sejtekben aktiválódott. Ehhez 50 ml, 12 órán át 28 °C-ra növesztett E. coli tenyészetet adtunk 200 ml, előzőleg 45 °C-ra előmelegített tápközeghez, és 2 órán át 42 °C-on tovább tenyésztettük. Ebben a lépésben a fehéijefuzió nagyrészt a baktériumok citoplazmájában, zárványtestek formájában felszaporodik. A baktériumokat ez után centrifugálással elválasztottuk, 20 ml lizálópufferben (10% szacharóz, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) szuszpendáltuk és 400 μΐ lizozimoldat hozzáadása után (5 mg/ml) 30 percig 22 °C-on inkubáltuk. Majd 0,1% végkoncentráció eléréséig Triton X-100 detergenst adtunk az oldathoz és ismét 30 percig inkubáltuk. A sejtek lizálásával szabaddá tett DNS-t ultrahangos kezeléssel széttördeltük, az oldhatatlan alkotórészeket, azaz a precipitációs részecskékben jelen lévő fúziós fehéijét lecentrifugáltuk, és végül 5 ml HINTE-pufferrel (1 M karbamid, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) mostuk. Újabb centrifügálás után a maradékot ultrahangos kezeléssel 5 ml PBS-pufferben (20 mM kálium-foszfát, pH 7,5, 130 mM NaCl) szuszpendáltuk és mostuk. Ezt a műveletet többször megismételtük, hogy a karbamidnyomokat teljesen eltávolítsuk. Végül az oldhatatlan frakciót, amely a fúziós fehéijét tartalmazta, ultrahangos kezeléssel 5 ml PBSpufferben szuszpendáltuk.
A szuszpendált fúziós fehéije mennyiségét és minőségét SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (12,5%) és azt követően Coomassie-kék színezéssel határoztuk meg. A fehéijeszuszpenziót a hasításban 1/100 (W/W) enzim/szubsztrát arányban 3 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A nem tisztított és oldhatatlan fehéqefűzió bekövetkezett hasítását SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáltuk, ahol az adódott, hogy egy polipeptid a béta-fehérjére várt mennyiségben keletkezett. Ezt a fehéijét átvittük egy nitro-cellulóz membránra és automatizált szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A terminális aminosavak sorrendje igazolta, hogy a fehérje valóban a fehérjefúzióból keletkezett, a jelen lévő „Igase” hasítóhelyen történő pontos hasítás által.
A hasításkor azonban csak a bevitt szubsztrát összmennyiségének körülbelül 50%-a alakult át. Nagyobb mennyiségű „Igase” hozzáadásával és hosszabb reakcióidővel nem lehetett növekedést elérni. Ez azt jelentette, hogy a fúziós fehérje nem hasadó részében nem hozzáférhető a hasítóhely az „Igase” részére. A hibrid fehérje és a hasítási termékek az enzimes inkubálás után továbbra is oldhatatlan aggregátum formájában fordultak elő, és ennek következtében centrifugálással a szuszpenzióból le lehetett választani őket. A hasítás hozama elérte a 90%-ot, ha egy nem tisztított zárványtestfrakció helyett egy olyan fúziós fehérjét alkalmaztunk, amelyet előzőleg egy kiegészítő tisztítási lépésnek vetettünk alá. E célból az oldhatatlan szedimentációs maradékot HlNTE-pufferben történő mosás után (lásd fent) 5 ml H7NTE-pufferben (7 M karbamid, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) felvettük. Az oldhatatlan részeket centrifugálással leválasztottuk, és az oldható frakciót 5 1 PBS-pufferrel szemben 4 °C-on dializáltuk. A karbamid eltávolításával a dialízis során a fúziós fehérje kicsapódott az oldatból oldhatatlan aggregátum formájában. A kiváló aggregátumot átalakítottuk ultrahangos kezeléssel finom szuszpenzióvá, és a fent leírt módon „Igase”-zal kezeltük, és analizáltuk.
6. példa
Egy renaturált, oldható fehérjefúzió „Igase”-zal történő specifikus hasítása
A pEX expressziós rendszer felhasználásával egy hibrid fehérjét állítottunk elő (lásd 1. példa), amely az MS2-polimeráz és a humán citotoxikus T-limfociták CD8-proteinjének egy részéből áll (lásd 2. ábra). A fehérjét előtisztítás után a zárványtestekből oldottuk H7NTE-pufferben, és további tisztítási lépésként beiktattunk egy preparativ 12,5% SDS-poliakrilamid gélelektroforézist. A fehéijefúziót mint egyetlen kötést, a Coomassie-kékkel való színezés után a gélből kivágtuk, és ezt követően Hunkapiller módszere szerint (Methods in Ensymology, 91, 227-235, 1983) a gél anyagától elválasztottuk. Ennek során elektroelúció ment végbe TAE-pufferben (40 mM Tris/acetát, pH 7,9), amelyet 0,1% SDS-hez (nátrium-lauril-szulfát) adtuk hozzá. Később az SDS-t dialízissel, szemben 5 1 TAE-pufferrel, 22 °C-on eltávolítottuk. Egy további dialízisben a fehérjét átvittük a megőrző pufferbe (20 mM káliumfoszfát, pH 7,5, 140 mM NaCl, 50% glicerin). Az így kapott oldható fúziós fehérjét tisztított „Igase”-zal inkubáltuk (lásd 5. példa), és ezáltal a CD8-molekulában lévő hasítóhelyen (-Pro-Pro·!-Thr-Pro-Alá-, lásd 2. ábra) a két polipeptidffagmens között teljesen hasítottuk. A hasítás specifikusságát a kis hasítási termékek aminovégén az aminosavsorrend analízisével vizsgáltuk. Ennél a várt szekvenciát, Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile, kaptuk.
7. példa
Egy oldható, a tenyészet felülúszójából nyert fehérjefúzió „Igase”-zal történő specifikus hasítása A koleratoxin B alegység és az N. gonorrhoeae
MSI 1-ből származó IgA-proteáz előfehéqe béta-doménjének egy részéből (Pos. 1097-1160; J. Pohlner, Natúré, 325, 458-462, 1987) álló fehéijefúziót oldható formában
HU 217 103 Β rekombináns E. coli sejtek tenyészetének felülúszójából nyertük. Hogy a két fehéqerészt egymástól elválaszthassuk, behelyeztünk géntechnológiai módszerekkel egy, az „Igase” számára alkalmas mesterséges hasítószekvenciát (Pro-Pro ! Thr-Pro-) a koleratoxin B alegység és a 5 béta-domén közötti átmeneti régióba. Erre a célra a Tk 006 és Tk 007 oligonukleotidokat beépítettük az EcoRI és SacII restrikciós hasítóhelyek közé az átmeneti régióba (lásd 3. ábra). A fúziós fehéijét egy 2 órán át, °C-on növesztett baktériumtenyészet 2 1-nyi felül- 10 úszójából ammónium-szulfátos kicsapással feldúsítottuk, és ezt követően 5 1 PBS-pufferrel szemben dializáltuk.
A hasítást tisztított „Igase”-zal, 50 gg/ml koncentrációban, PBS-pufferben, 1/50 (W/W) enzim/szulfát arány mellett, 2 órán át, 37 °C-on inkubálással végeztük. Az 15 immun-blot analízis megmutatta, hogy a teljes hasításkor keletkező nagyobb hasítási fragmens molekulasúlyában és az antiszérummal lejátszódó reakcióban megfelel a természetes koleratoxin B alegységnek.
8. példa
Fehérjefúziók „Igase”-zal történő specifikus hasítása gramnegatív baktériumok felszínén Egy megfelelő expressziós-szekréciós rendszert használunk, hogy a TKB 49 és TKB 59 fehérjefuziókat, amelyek a koleratoxin B alegységből és az IgA-proteáz β-doménjéből állnak, rekombináns Salmonella baktériumok felszínére kijuttassuk. A TKB 49 fúziós fehérjét kódoló hibrid gén a toxin és a β-domén között az átmeneti régióban az „Igase” számára az eredeti hasítószekvenciát [c) -Pro-Pro·! -Ala-Pro-] tartalmazza. Ezzel szemben a TKB 59-et kódoló génbe az EcoRI és SacII restrikciós hasítóhelyek közé beiktattunk egy mesterséges DNS-fragmenst, amely a Tk 006 és Tk 007 oligonukleotidokból áll és a hasítószekvenciát 35 (-Pro-Pro·! Thr-Pro-) kódolja (lásd 3. ábra). Ha az ilyen, a felszínükön rögzített fehérjefüziót hordozó, intakt baktériumokat tisztított „Igase”-zal inkubáltuk, akkor az Igase-hasító helyen specifikus hasítást lehetett megfigyelni. Az immun-blot analízissel ugyanis kimu- 40 tattuk, hogy a hasításkor keletkező kis hasított fragmensek nagyságukat és antiszérummal való reakciójukat tekintve megfelelnek a természetes koleratoxin B alegységnek.
9. példa
Rekombináns E. coli sejttenyészet felülúszójából származó aktív „Igase” tisztítása Rekombináns E. coli C600 sejtek, amelyek egy módosított IgA-proteáz gént hordozó pEX1070 jelű plazmidot (DE 36 22 221.6) tartalmaznak, a tenyészközegbe aktív Igase-enzimet választanak ki. Az enzimet a sejttenyészet felülúszójában membránszűréssel feldúsítottuk, és ezt követően ammónium-szulfáttal (0,42 g/ml) az oldatból kicsaptuk. Centrifügálás után a maradékot Biorex-pufferben (50 mM kálium-foszfát, pH 7,0, 8,6% glicerin) feloldottuk (1 ml puffer, 1 1 felülúszó), dialízis során 2 1 pufferrel szemben kiegyensúlyoztuk, majd kationcserélő kromatográfiának (Biorex 70) vetettük alá. A megkötött IgA-proteázt egy lépésben az elúciós pufferrel (500 mM kálium-foszfát, pH 7,0, 8,6% glicerin) az oszlopról eluáltuk és frakcionáltuk. Az IgA-proteáztartalmú frakciókat ezt követően SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (12,5%) analizáltuk. A tisztítás ezen pontján átlagos tisztítási foknak >90% adódott. Az „Igase” tiszta formában történő előállítására egy 25 gélszűrést, melyet Sephacryl HR300-zal Biorex-pufferben kiviteleztünk, majd egy további kationcserélő kromatográfiát (lásd fent) hajtottunk végre. Az „Igase” aktivitását IgA-antitestekkel történő inkubálással és a keletkezett hasítási termékek SDS-poliakrilamid gélben 30 történő szétválasztásával teszteltük.
10. példa
Plazmid szerkesztése metioninmentes interleukin-3 kifejezéséhez
A plazmid szerkesztését a pPZ07-mgllac jelű (WO 88/09373) expressziós vektor felhasználásával végeztük. Ekkor a pPZ07-mgllac expressziós vektort Ncolgyel hasítottuk, és a kiálló végeket Mung-bean nukleázzal eltávolítottuk. Ezt követően a vektort BamHI-gyel ismét hasítottuk. A fúziós fehéije optimális aminoterminális régiója számára DNS-szinten a következő oligonukleotidokat készítettük el:
Primer IA:
5’ AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATG GAG 3’
Primer 1B:
5’ GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCC TCCGAATT 3’
Mindkét oligonukleotidot ekvimoláris mennyiségben összekevertük, és körülbelül 100-szoros feleslegben a pPZ07-mgllac vektorba, amelyet a fent leírt módon hasítottunk, bevezettük. Ligálás után a szokásos módon kompetenssé tett E. coli KI 2 sejteket transzformáltuk. A sejtekből a DNS-t ismert módon izoláltuk, Sall/BamHI-gyel hasítottuk, és DNS-fragmenssel, amely az interleukin kódoló régióját a szignálszekvencia nélkül tartalmazta (alábbiakban leírva), ligáltuk.
Az interleukin 3 kódoló régiójának elkészítése az IgA-proteázt felismerő régióval, DNS-szinten a PCR is55 mert technika szerint történt, melyben egy PCR-reakciót hajtottunk végre interleukin 3 cDNS-sel mint templáttal, és az alábbiakban leírt primerekkel:
Primer 2A:
5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3’
HU 217 103 Β
Primer 2B:
5’ TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3’
A reakció eredményeként kapott PCR-fragmenst Sáli és BamHI enzimekkel utólag hasítottuk, és így közvetlenül a fent leírt vektor DNS-be bevezettük és ligáz segítségével kovalensen kötöttük.
A DNS-t egy alkalmas gazdasejtbe, például E. coli KI2 C600, transzformáltuk, az E. coli sejtekben az 11-3 Rb’s formájában szintetizáltuk, és ezt követően izoláltuk. Amint azt a G-CSF-nál leírtuk, a fehérjét deés renaturáltuk, és a renaturált fehérjét IgA-proteázzal hasítottuk. Az így előállított Met-mentes II 3-at további tisztítási lépések után a terápiában alkalmaztuk.
11. példa
Plazmid szerkesztése metioninmentes interleukin—2 kifejezésére
A szerkesztést a pPZ07-mgllac (WO 88/09373) jelű expressziós vektor felhasználásával végeztük, amelyet a primer 1A és IB inszerciója után, mint azt a 10.
példában leírtuk, Sall/BamHI-gyel hasítottunk. Az interleukin 2 kódoló régiójának az elkészítése az IgAproteáz-felismerő régióval a PCR-módszer szerint történt, amelyben egy PCR-reakciót hajtottunk végre az interleukin 2 cDNS-sel mint templáttal és a 3A és 3B primerekkel, amelyek ebben az esetben az IgA-proteázfelismerő régiót kódolták:
Primer 3 A:
5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3’ Primer 3B:
5’ TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3’
Az így kapott PCR-fragmenst Sáli és BamHI enzimekkel utólag hasítottuk, és így közvetlenül be tudtuk vezetni a fent leírt vektor DNS-be. A továbbiakban az eljárást az II 3-nál leírtak szerint végeztük.
Az előző példákban leírtuk, hogyan lehet az IgAproteázt felismerő hasítóhelyek alkalmas felhasználásával és további eljárásokkal metioninmentes terápiás hatású fehéijéket előállítani, amelyek az Ala-Pro aminosavszekvenciával kezdődnek. További fehérjék, amelyek az eddig leírt példákkal analóg módon metioninmentesek, is előállíthatók, és - bár oligonukleotidok felhasználása által - egyrészt az IgA-proteáz számára a felismerő régiót, valamint egy régiót tartalmaznak, amely megfelel, illetve analóg a publikált szekvencia 5’-, illetve 3’-végével és ezáltal PCR-amplifikálással előállíthatók. A következőkben további, terápiásán alkalmazható releváns proteineket sorolunk fel, amelyek érett, természetes módon előforduló formában Ala-Pro-val kezdődnek, és ezért a találmány szerinti eljárással analóg módon előállíthatók:
Katepszin L (EC. 3.4.22.15), Mason, R. W. és munkatársai: Biochem. J., 240, 373-377, 1986.
Eritropoietin, Lai, P. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 261, 3116-3121, 1986.
Interleukin-1 béta, Zsebo, K. M. és munkatársai: Blood, 71, 962-968, 1988.
Oszteonektin, Fisher, L. W. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 262, 9702-9708, 1987.
IV típusú kollagenáz, Collier I. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 263,6579-6587, 1988.
Továbbá ezen a módon előállíthatók olyan fehéijék, amelyek érett formában Ser-Pro aminosavszekvenciával kezdődnek. Mint például az alábbiakban megnevezettek:
Alfa-1 antitripszin, Hill, R. E. és munkatársai: Natúré, 311, 175-177, 1984.
Atrialis nátriuretikus faktor, Kambayashi, Y. és munkatársai: FEBS Lett., 259, 341-345, 1990.
További példák fehérjékre, amelyek érett formájukban Thr-Pro szekvenciával kezdődnek és terápiásán relevánsak lehetnek, például:
Komplement faktor B, Campell, R. D. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 80,4464-4468, 1983. Apolipoprotein A, Eaton, D. L. és munkatársai:
Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3224-3228, 1987.
Claims (38)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás fehérjék fúziós fehéijék enzimatikus hatá35 sával történő előállítására, azzal jellemezve, hogyi) géntechnológiai eszközökkel a fúziós fehéije két részét egymással összekötő átmeneti régiót úgy módosítjuk, hogy ebben az átmeneti régióban legalább egy, Υ-Pro ! Χ-Pro aminosavszekvenciájú IgA40 proteáz-felismerő helyet alakítunk ki, ahol X egy tetszőleges aminosav és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet, ii) az i) lépésben kapott fúziós fehérjét a felismerőhely ! jellel jelölt pozíciójában IgA-proteázzal hasít45 juk, és iii) hasítás után a kívánt fehérjét kinyerjük. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje átmeneti régiójának módosítását50 egy, az IgA-proteáz-felismerő helyet vagy annak egy részét kódoló nukleotidszekvencia beépítésével végezzük, ahol a nukleotidszekvencia elé és/vagy után a kívánt fehérjét kódoló egy vagy több DNS-szakaszt építünk be. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)55
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy eredetileg semmilyen természetes IgA-felismerő hellyel nem rendelkező fúziós fehérjét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,60 azzal jellemezve, hogy egy, a kívánt rész mellett még egyHU 217 103 Β vagy több hordozórészt tartalmazó fúziós fehéije átmeneti régióját módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozórészként a béta-galaktozidáz egy részét tartalmazó fúziós fehéijét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
- 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozórészként több töltéssel rendelkező aminosavat és/vagy egy specifikus anyagra nagy affinitással kötődő proteint vagy polipeptidet tartalmazó fúziós fehéijét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy X-et Ser, Thr vagy Alá aminosavra módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy X-et Ser vagy Thr aminosavra módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y végződéseként a Pro, Pro-Alá, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbia) Pro-Ala-Pro ! · Ser-Pro,b) Pro-Pro!-Ser-Pro,c) Pro-Arg-Pro-Pro ! Ala-Pro,d) Pro-Pro ! ·Thr-Proe) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ·! · Thr-Pro vagyf) P ro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro! -Thr-Pro aminosavszekvenciával rendelkező IgA-proteáz-felismerő helyet alakítunk ki. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogyi) valamely sejtet egy rekombináns DNS-sel és/vagy egy rekombináns vektorral transzformálunk, ahol a DNS vagy vektor a fúziós fehéijét kódoló gén legalább egy kópiáját tartalmazza, amely az átmeneti régióban legalább egy IgA-proteáz-felismerő helyet hordoz, ii) a transzformált sejtet alkalmas tápközegben tenyésztjük, iii) a fúziós fehérjét kódoló gént a transzformált sejtben kifejezésre juttatjuk, iv) a fúziós fehérjét IgA-proteázzal hasítjuk, ésv) a fúziós fehéije egy vagy több kívánt részét izoláljuk. (Elsőbbsége: 1990.05.17.)
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehéijét az IgA-proteázzal a tápközegben a sejtfeltárás és/vagy a celluláris fehéijék leválasztása után hasítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fúziós fehérje hasításához a Neisseria nemzetség patogén baktériumfajaiból, különösen Neisseria gonorrhoeae és Neisseria meningititisből vagy a Haemophilus nemzetségből, különösen Haemophilus influenzáé és Haemophilus egypticusból vagy egy hasonló jellegű IgA-proteáz módosításával levezetett fehérjéből származó IgA-proteázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje hasításához egy túltermelő, nem patogén baktériumtörzsből nyert IgA-proteázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje hasításához az IgAproteázt immobilizált formában alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990.02.03.)
- 16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy oldható, oldhatatlan, membránasszociált vagy sejthez kötött formában lévő fúziós fehéijét hasítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy oldhatatlan csapadékrészecskék formájában jelen lévő fúziós fehéijét hasítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta sejtekből származó, az N-terminálison metioninrészt nem tartalmazó rekombináns fehérjék előállítására egy Met-Y-Pro! X-Pro-A szekvenciájú fúziós fehéijét, ahol X egy tetszőleges aminosavat és Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, IgA-proteázzal hasítunk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje X-Pro aminosavszekvenciával kezdődik. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 20. Az 1 -19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kívánt fehéreként a humán granulocita kolónia stimuláló faktort (G-CSF) vagy annak egy származékát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
- 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehéije előállítandó részét IgA-proteázzal történő hasítás után egy további lépésben egy dipeptidil-amino-peptidázzal kezeljük, és ily módon az N-terminális X-Pro szekvenciát lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-terminális X-Pro szekvencia lehasítására egy X-Pro-dipeptidil-amino-peptidázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 23. Fúziós fehérje, amely több polipeptidrészt tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a fehérje legalább egy átmeneti régióban a mindenkori polipeptidrészek között egy vagy több Y-Pro·! -X-Pro aminosavszekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hellyel rendelkezik, ahol X egy tetszőleges aminosavat, előnyösen Ser-t, Thr-t vagy Ala-t jelent és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 24. A 23. igénypont szerinti fúziós fehéije, azzal jellemezve, hogy a Met-Y-Pro·!-X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol X és Y jelentése a fentiekben megadott és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti fúziós fehéije, azzal jellemezve, hogy Y Pro, Pro-Ala, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával fejeződik be. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)HU 217 103 Β
- 26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy az X—Pro-A aminosavszekvencia egy granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF) vagy annak egy származéka. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 27. A 26. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy lényegében kvantitatíve mentes az N-terminálison metioninmaradékot tartalmazó G-CSF-tól. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy kevesebb, mint 0,1% egyéb fehéijével szennyezett. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 29. A 26. vagy 27. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy kevesebb, mint 0,001% egyéb fehérjével szennyezett és kvantitatíve mentes az olyan G-CSF-tól, amely az N-terminálison metioninmaradékot hordoz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 30. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként a 26-29. igénypont bármelyike szerinti G-CSF-t vagy egy G-CSF-származékot és adott esetben a szokásos gyógyszerészeti adalék-, segéd- és/vagy hordozóanyagokat tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 31. Eljárás a 26-29. igénypontok bármelyike szerinti G-CSF-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot adott esetben a szokásos gyógyszerészeti adalék-, segéd-, töltő- és/vagy hordozóanyagokkal összekeverjük, és a keveréket formázzuk. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 32. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az a 23-29. igénypontok egyike szerinti fúziós fehéqét kódolja. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 33. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti rekombináns DNS egy vagy több kópiáját tartalmazza. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 34. A 33. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS egy indukálható expressziós szignál kontrollja alatt áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 35. A 33. vagy 34. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy prokariotikus vektor. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 36. A 32-34. igénypontok egyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy plazmid. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 37. Sejt, azzal jellemezve, hogy egy 32. igénypont szerinti vektorral van transzformálva. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 38. A 37. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy egy prokarióta sejt. (Módosítási elsőbbsége:
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4003149 | 1990-02-03 | ||
| DE4015922A DE4015922A1 (de) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Verfahren zur enzymatischen prozessierung von proteinen unter verwendung von iga-proteasen (igase) |
| DE4015921 | 1990-05-17 | ||
| DE4039415A DE4039415A1 (de) | 1990-02-03 | 1990-12-10 | Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine ohne n-terminalen methioninrest |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202511D0 HU9202511D0 (en) | 1992-10-28 |
| HUT63195A HUT63195A (en) | 1993-07-28 |
| HU217103B true HU217103B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=27434868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202511A HU217103B (hu) | 1990-02-03 | 1991-02-01 | Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5427927A (hu) |
| EP (2) | EP0513073B1 (hu) |
| JP (2) | JPH0789952B2 (hu) |
| KR (1) | KR960011919B1 (hu) |
| AT (2) | ATE219518T1 (hu) |
| AU (1) | AU638309B2 (hu) |
| CA (1) | CA2074943C (hu) |
| CZ (1) | CZ284774B6 (hu) |
| DK (1) | DK0513073T3 (hu) |
| ES (2) | ES2177536T3 (hu) |
| FI (1) | FI109810B (hu) |
| HU (1) | HU217103B (hu) |
| IE (1) | IE64938B1 (hu) |
| IL (1) | IL97119A0 (hu) |
| LV (1) | LV10309B (hu) |
| NO (1) | NO311142B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ236819A (hu) |
| PT (1) | PT96658B (hu) |
| WO (1) | WO1991011520A1 (hu) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| DE4344350C2 (de) * | 1993-12-23 | 1995-09-21 | Max Planck Gesellschaft | Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis |
| US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| AU3651595A (en) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Drug for the prevention and treatment of auto-immune and viral diseases, and diagnostic agents for detecting said diseases |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| DE19549232C2 (de) * | 1995-12-20 | 1998-05-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern |
| GB9618960D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Medical Science Sys Inc | Proteases |
| US6444202B1 (en) | 1996-11-25 | 2002-09-03 | Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit | Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use |
| US20030190740A1 (en) | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
| WO2000022112A1 (en) * | 1998-10-13 | 2000-04-20 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis and use |
| KR100356140B1 (ko) * | 1999-07-08 | 2002-10-19 | 한미약품공업 주식회사 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
| US7332275B2 (en) * | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
| CA2507189C (en) * | 2002-11-27 | 2018-06-12 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery |
| EP1618135B1 (en) | 2003-04-23 | 2013-06-26 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Cleavage of fusion proteins using granzyme b protease |
| AU2004235331B2 (en) * | 2003-04-25 | 2008-12-18 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for De Novo sequencing |
| WO2005024068A2 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| EP2267154A1 (en) | 2003-10-23 | 2010-12-29 | Illumigen Biosciences, Inc. | Oligoadenylate synthetase |
| US7220407B2 (en) | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
| SI21639A (sl) * | 2003-12-23 | 2005-06-30 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Farmacevtski pripravek, ki vsebuje nemicelarne sulfobetaine |
| US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
| EP2395098B1 (en) * | 2004-03-26 | 2015-07-15 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| CA2580070A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Sequenom, Inc. | Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids |
| ATE544463T1 (de) | 2004-11-05 | 2012-02-15 | Univ Northwestern | Verwendung von scf und g-scf bei der behandlung von hirnischämie und neurologischen störungen |
| UA95446C2 (ru) | 2005-05-04 | 2011-08-10 | Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. | Мутаци в генах oas1 |
| CL2007002502A1 (es) * | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
| AU2007291501B2 (en) * | 2006-08-31 | 2012-07-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-I |
| CA2684217C (en) * | 2007-04-13 | 2016-12-13 | Sequenom, Inc. | Comparative sequence analysis processes and systems |
| DE202007018629U1 (de) | 2007-08-27 | 2008-12-24 | Biogenerix Ag | Flüssigformulierung von G-CSF |
| MX2010002348A (es) | 2007-08-27 | 2010-07-30 | Biogenerix Ag | Formulacion liquida de g-csf. |
| US8501449B2 (en) | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| MX2010010313A (es) * | 2008-04-03 | 2010-11-05 | Hoffmann La Roche | Analisis de factor de crecimiento pegilado similar a insulina. |
| ES2388827T3 (es) * | 2008-04-03 | 2012-10-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Uso de variantes de IGF-I PEGiladas para el tratamiento de trastornos neuromusculares |
| US8053222B2 (en) * | 2009-02-12 | 2011-11-08 | Academia Sinica, Taiwan | Protein expression system involving mutated severe respiratory syndrome-associated coronavirus 3C-like protease |
| US20110152188A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
| RU2519031C1 (ru) | 2010-01-19 | 2014-06-10 | Ханми Сайенс Ко., Лтд. | Жидкие препаративные формы для длительно действующего конъюгата g-csf |
| EP2611921A2 (en) * | 2010-08-30 | 2013-07-10 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Prokaryotic expression construct |
| US20160122793A1 (en) * | 2013-05-24 | 2016-05-05 | Novo Nordisk A/S | Fusion Protease |
| CA2929149A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved recombinant polypeptide production methods |
| HRP20220304T1 (hr) | 2015-06-24 | 2022-05-13 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Anti-transferinska receptorska protutijela s prilagođenim afinitetom |
| PE20181004A1 (es) | 2015-10-02 | 2018-06-26 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| WO2018225824A1 (ja) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | 三菱電機株式会社 | フェーズドアレイアンテナ |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL60184A (en) * | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
| JPS62129298A (ja) * | 1985-12-02 | 1987-06-11 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規ポリペプチド |
| EP0215126B1 (en) * | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| EP0220520B1 (en) * | 1985-09-30 | 1991-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| FR2594846B1 (fr) * | 1986-02-21 | 1989-10-20 | Genetica | Procede de preparation de la serum albumine humaine mature |
| US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
| DE3622221A1 (de) * | 1986-07-02 | 1988-01-14 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur gentechnologischen gewinnung von proteinen unter verwendung gramnegativer wirtszellen |
| JPH01500483A (ja) * | 1986-08-11 | 1989-02-23 | シタス コーポレイション | Ｇ‐ｃｓｆ及びそのミューテインの発現 |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| ATE111921T1 (de) * | 1988-06-03 | 1994-10-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher kristallinischer granulocyt- koloniestimulierungsfaktor und dessen herstellung. |
| PT92479A (pt) * | 1988-12-01 | 1990-06-29 | Univ North Carolina | Processo de preparacao de genes recombinantes e suas proteinas de codificacao |
| US5055555A (en) * | 1989-01-05 | 1991-10-08 | Helmut Sassenfeld | Purification of G-CSF |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
-
1991
- 1991-01-18 NZ NZ236819A patent/NZ236819A/xx unknown
- 1991-01-31 IL IL97119A patent/IL97119A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 IE IE35891A patent/IE64938B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 CZ CS91241A patent/CZ284774B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 DK DK91902956.1T patent/DK0513073T3/da active
- 1991-02-01 KR KR1019920701858A patent/KR960011919B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 AT AT93121015T patent/ATE219518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 HU HU9202511A patent/HU217103B/hu unknown
- 1991-02-01 EP EP91902956A patent/EP0513073B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 EP EP93121015A patent/EP0602688B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 JP JP3503102A patent/JPH0789952B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 ES ES93121015T patent/ES2177536T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 CA CA002074943A patent/CA2074943C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 PT PT96658A patent/PT96658B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 ES ES91902956T patent/ES2076521T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 AT AT91902956T patent/ATE124456T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 US US07/917,034 patent/US5427927A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 AU AU71496/91A patent/AU638309B2/en not_active Ceased
- 1991-02-01 WO PCT/EP1991/000192 patent/WO1991011520A1/de active IP Right Grant
-
1992
- 1992-07-30 NO NO19923010A patent/NO311142B1/no unknown
- 1992-07-31 FI FI923463A patent/FI109810B/fi active
-
1993
- 1993-09-24 LV LVP-93-1094A patent/LV10309B/lv unknown
-
1995
- 1995-01-04 JP JP7000120A patent/JP2766621B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217103B (hu) | Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására | |
| KR860001230B1 (ko) | 이중 가닥 dna의 분할 방법 | |
| KR860001305B1 (ko) | 특이적 절단 링커를 사용하는 융합 단백질의 제조방법 | |
| FR2518572A1 (fr) | Plasmide d'expression permettant l'insertion appropriee d'adn heterologue | |
| JPH0776599A (ja) | ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 | |
| JPH08333395A (ja) | ヒトプロインスリン誘導体およびヒトインスリンの製造方法 | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| AU607930B2 (en) | Homogeneous recombinant immune interferon fragments | |
| US5459051A (en) | Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells | |
| CA2058872C (en) | Recombinant iga protease | |
| RU2120475C1 (ru) | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) | |
| RU2108386C1 (ru) | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце | |
| EP0352387B1 (en) | Method for preparing a hirudin | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| CN1128222C (zh) | 新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用 | |
| US5965424A (en) | Methods for making neisseria or hemophilus IgA protease and DNA encoding the proteases | |
| WO2009054754A1 (fr) | Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine | |
| JPH01273591A (ja) | ヒト成長ホルモン分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形質転換体および蛋白質分泌生産法 | |
| JPS61212288A (ja) | 蛋白製造法 | |
| JPH0494686A (ja) | トリプシン阻害活性を有するポリペプチドの製造法 | |
| JPH0588110B2 (hu) | ||
| JPH09286800A (ja) | 新規タンパク質及び該タンパク質をコード する遺伝子並びに該タンパク質の製造法 | |
| JPH02138982A (ja) | ベクター |