PT92479A - Processo de preparacao de genes recombinantes e suas proteinas de codificacao - Google Patents

Description

2 J 70336505.3-06Q-118

MEMÓRIA DESCRITIVA

1. INTRODUÇÃO O presente invento refere-se ao processo de preparação de genes e das suas proteínas de codificação, as quais são a ín-terleucina-6 recombinante madura (daqui em diante IL-6) e uma proteína sintética livre de cisteína que conserva actividade de 1L-6. Estas proteínas são expressas em hospedeiros unicelulares como a porção peptídica do terminal amino ou carboxi de uma proteína de fusão tri-híbrida compreendendo quer a inter1eucina-6 quer a sua forma sintética modificada, em conjunto com uma porção de um sítio de clivagem e ADN portador. A proteína de fusão recombinante é purificada e digerida in vitro com uma protease que é específica para o sítio de clivagem a fim de libertar o pêptido com ac-tividade de IL - 6, o qual é facilmente separado da proteína de J3--galactosidade grande expressa pelo ADN portador. 0 pêptido purificado pode ser utilizado para estimular a produção de proteínas, incluindo imunog1obu1inas e proteínas hepáticas, e pode ser utilizado para prevenir infecções virais. A proteína também pode ser adicionada a preparações de vacinas como um adjuvante. 2. ôiII£IRyiII=2£=i:^iiI2

2.1 REGULADORES PEPTÍDLCQS

Aos agentes fisiológicos que regulam a actividade metabólica de células distantes foi dado o nome de hormona pelos cientistas ingleses Bayliss e Starlinger em 1909. Estes agentes consistem em derivados aminoãcidos, esteróides e péptidos. Mais recentemente, uma variedade de péptidos que activam e/ou inibem a proliferação celular foram identificados e denominados factores estimuladores ou factores de crescimento. Um termo geral alternativo para os referidos factores celulares e citocina, embora uma terminologia mais específica indique a célula de origem, isto é, línfocinas que são produzidas por linfõcitos. As linfocinas também pertencem ã classe de moléculas de interleucina que modulam a proliferação de células no sistema imune. Outros péptidos pro- - 3 - 70336 5053--06.0-1 1 8. duzidos pelo sistema imune resultam em actividades antlviraís específicas; tais peptidos são denominados interferões. Para ser qualificado como um ínterferão, um factor deve ser uma proteína que exerce actividade antiviral através de processos metabólicos celulares envolvendo a síntese quer do ARN quer da proteína (Com-mittee on tnterferon Nonmenclature, 1980, Nature 86(2):110). 2.2 1NTERLEUC[NA-6

Inter1eucina-6 (IL-6) é o termo dado a um péptido descrito alternativamente como tFN]32A, BSF-2, HSF, G-CSF, C S — 3 0 9 » HPGF, ou proteína de 26 KDa por uma multiplicidade de investigadores. Estes factores originais agora conhecidos como IL-b incluem: 1) interferão -J32 (Zilberstein e colab., 1986, EMBO J.5^2529) ou proteína 26 KDa (Haegeman e colab., 1986, Eur. J. Biochem.159-625), o qual foi primeiro detectado em fibroblastos estimulados com poli(rl) poli (rC); 2) uma linfocina derivada de célula T potente denominada factor-2 de estimulação da célula B (BSF-2) (H i -rano e colab. 1986, Nature 3.24:73); 3) um produto de fibroblasto denominado factor de crescimento de p1asmacitoma/hibridoma de célula-B (HPGF ou HGF) (Van Snick. e colab. 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. ^3.:9679 ; Billiau, 1987, Immunol . Today jB:84; Van Damme e colab. 1987 , Eur. J.Biochem. 168: 543; Tosato e colab. 1988, Scien-ce 239:5Q2); e 4) uma proteína de monõcito do sangue periférico denominada factor de estimulação do hepatõeito (HSF) (Gualdie e colab. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 7251) ♦

As funções que foram atribuídas ao péptido de IL-6 são básicas tanto para a resposta imune como para a inflamatória em patalogia humana. Aquelas funções são distintas e dependem do tipo de células sob exame. A IL-6 é expressa em leucócitos, células epiteli-ais, fibroblastos tratados com I.L-I, hepatõeitos, células endote-liais vasculares, tecido de mixoma cardíaco, certos carcinomas da bexiga, certas células de cancro cervical e células gliais. A IL--6 é um dos peptidos envolvidos na interaccção de células T com células B para resultar na proliferação e diferenciação de células produtoras de anticorpos. A IL-6 aumenta significativamente a - i, - J 70336 5Q53-060-1 1.8 secreção de imunog1obu1ibas em células B activadas (Muraguchi e colab. 1.988, J . Exp . Med . 167 (2) : 332; Tosato e colab. 19 8 8, Science 239:502; Hira.no e colab. 1935, Proc. Natí . - Acad. Sei. 82:5^90) ·

Quanto ã actividade antivíral responsável pela identificação inicial da IL-6 como um interferão, a transformação de células de ovário de hamster Chinês com um plasmídeo de IL-6 recom-binante que permitiu a expressão constitutiva de IL-6 resultou não apenas na detecção do péptido no meio, mas também resultou na detecçio de actividade antivíral (Zilberstein e colab. 1986, EMBO J. 5:2529).

Tem estado sujeito a debate na lítaratura científica se a IL-6 natural tem ou não actividade antivíral. As actividades an-tivirais específicas foram primeiro descritas por Weissenbach et al., (1980 , Proc. Natl. Acad. Sei. ; 715 2); e membros deste gru po científico continuaram a descrever actividades antivirais nas suas preparações (Content et al., 1985, Eur. J.Biochem. 152:253; May e colab. 19 88, J. Biol. Chem. 263:7760). Os valores descritos para a actividade antivíral variam desde 5-10 x 10 U/mg de pro-' _ 2 teína ate tão baixo como 1-3 x 10 U/mg. Em contraste, um grande número de outros investigadores descreveram efeitos antivirais não significativos associados com as suas preparações de IL-6 recom-binante purificada. (Poupart e colab. 1987, EMBO J. 6:1219; Van Damme e colab. 1988, J. immunol. 140:1534; Reis e colab. 1988, J. Immunol. \k0(5):1566 ; Hirano e colab. 1988, immunol. Lett. 17(1) : *1). A IL-6 parece suprimir a acção do TNF (Kohase e colab. 1987, Mol . Ce 11 Biol. 7.:273)- Contudo, ela estimula 0 crescimento de células 1infoblastõídes B humanas infectadas com o EBV (Tosato e colab. 1988 Science 239: 5 0 2) , e de linfõcitos T e timóci-tos humanos (Lotz e colab. 1988, J'. Exp. Med. 167(3) :1 253) . Foi identificada como um factor de crescimento para linhas celulares de hidridomas murinos (Poupart e colab. 19 8 7, EMBO J. 6:1219) e de plasmocitoma hibridoma.: (Van Damme e colab. 1987, J. Exp. Med. 16 5: 91*0- Em combinação com a IL-3, a IL-6 suporta a proliferação de células progenitoras hematopoiéticas (Van Damme e colab. 1987, J. - 5 - 70336 5053-060-118

Exp. Med. J_65.:9l4; L kebuch i e colab. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 8^:9035), e modula a síntese de uma subserie de proteínas de he-patócito em resposta ã lesão e infecção (Gauldie e colab. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:7251; Andus e colab. 1987, FEBS Lett. 22J_:18). A multiplicidade das suas próprias acções, e as suas in-teraeções com outros reguladores peptTdicos como 1L-1, TNF, 1 FNp e PDGF, conduziram i sugestão que a IL-6 joga um papel essencial numa rede complexa de citocinas necessária para o controlo home-ostitíco das funções celulares (Kohase e colab. 1987, Mol. Cel1 Biol. 7:273; Sehgal e colab. 1987, Science 235:731 ; Billiau, 1987, 1 mmuno 1 . Today _8:8A; Sporn e Roberts, 1988, Nature 332:217). 2.3 SEqUÊNCiA DE ADN DA PROTEÍNA DE INTERLEUCINA-6 A comparação da estrutura primária de factores que foram origina 1mente caracterizados por diversos investigadores com base nas actividades biológicas diferentes, revelou a identidade das suas sequências de aminoicidos e resultou na renomeaçao dos péptidos como inter1eucina-6 (IL-6). Os fibroblastos tratados quer com poli(r1)*(rC) quer com ciclo-heximi da e actinomicina D, produziram uma molécula de ARNm de l4s que codificou para uma proteína capaz de induzir actividade antiviral, denominada IFNB2 (Weis-senbach e colab. 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. 77:7152;Patente Britânica N? 2 O63 882). Os clones produzidos a partir de cópias de ADNc desta fraeção de ARNm induzida forneceram uma sequência parcial do promotor de IFNJB2 que era claramente diferente de IFNjSl, 1FN7«-A, e l FNoçD (Cher na j ovsky e colab. 1984, DNA _3; 297 ; Revel e colab. 1983, Interferon J?:205 1. Gresser ed., Academic Press, N.Y.). A sequência de IFNJ32 completa derivada de diversos clones de ADN definiu uma proteína de 212 aminoãcidos de comprimento além de uma sequência de partida ATG provável, sítios de poliadeni1 ação, caixas de TATA e o sítio de partida do ARNm, o qual foi revelado por mapeamento de nuclease de S1 (Zilberstein e colab. 1986, EMBO J. 5/.2529 ; Pedido de Patente Europeia 0220574A1, Data de Publicação 06-05-1987)· Numa análise diferente da sequência do IFN£2, May e colab. 1986, Proc. Natl. Acad. Scí . 831:8957» também definiram a sequência da proteína de 212 aminoãcidos utilizando um cio- - 6 - 70336 5 0 5 3-Q 6 α-118 ne de ADNc de comprimento total em vez dos clones de ADNc parcial de Zilberstein e colab. 1986, EMBO J. £:2529. Estes investigadores também observaram que ο I FNyB2 era induzido pelo TNF.

Apesar da sua proteína de 26 KDa não apresentar activi-dade antiviral detectãvel, Haegemann e colab, 1986, Eur. J. Bio-chem. 159:625 reconheceram que a sequência da sua proteína de 2b KDa, induzida em fibroblastos por tratamento com cíc1o-heximi da ou inter1eucina-1, era idêntica i do I FN^32 de Zilberstein e colab 1936, EMBO J. 5:2529. Dado que o terminal 5' da proteína faltava na colecçio do clone ADNc, uma análise de uma biblioteca de gene humano , testando quanto ã complementaridade com uma sequência de ADNc interna do péptido de 26 KDa, produziu clones genõmicos que forneceram a sequência de 212 aminoácidos completa, assim como a sequência de ADN de um íntrio de 162 pb na região do terminal 5' do gene humano. A busca de uma base de dados de proteínas contendo 3309 sequências peptídicas individuais falhou em revelar quais quer semelhanças significativas com proteínas na base de dados.

Num estudo separado (Hirano e colab, 1986, Nature }2k: 73), a proteína de BSF-2 foi purificada a partir de uma linha de células T humanas que produzia constitutivamente o factor e foi determinada utilizando o vírus HTLV-1. Os dados da sequência de aminoácidos de nove fragmentos de péptidos forneceu a i nfo rmaçio necessária para produzir oligõmeros sintéticos, os quais foram uitlizados para exa-minar bibliotecas de ADNc. Os clones de ADNc foram sequenciados, tal como foi o terminal amino da proteína de IL-6 purificada. A extremidade da sequência proteica madura era pro-val-pro-pro, indicando que o prê-péptido de 212 aminoácidos que foi previsto a partir da sequência de ácidos nucleicos, continha um péptido de sinal de 28 aminoácidos de comprimento, o qual ê clivado para produzir a proteína de BSF-2 (IL-6) madura natural A análise da sequência continuada do ADN genómico do BSF-2 (IL-6) inteiro demonstrou que 0 segmento cromossÕmico continha cinco exões e quatro intrões (Yasukawa e colab, 1987, EMBO J. £:2939). A organização do gene do BSF-2 (IL-6) foi surpreenden temente semelhante ã do G-CSF, quando os dois genes foram compa- - 7 - 70336 5053-Q6Q-118 rados.

Após conclusão da sequência de HGF (Brakenhoff e colab,

1987, J. Immunol. 1 3 9: 116) , foi confirmada a identidade de HGF e IL-6. Além disso, um estudo das diferenças da sequência em todas as análises descritas do gene de IL-6 (como HGF, IFNp2, a proteína de 26 KDa ou BSF-2) revelou poucas trocas de base única. Nenhuma das duas trocas que ocorreram dentro do quadro de leitura do péptido produziu uma troca de aminoãcido. Van Damme e colab, 1988, J. Immunol. 140:153^ também verificaram que a sequência do terminal amino do HGF era idêntica ã do 1FN£2, da proteína de 26 KDa e do BSF-2.

Clark e colab. ( Pedido Internacional número PCT/ US87/Q1611, Numero de Publicação W083/00206, publicado em \k de Janeiro de 1988) também descrevem a sequência do ADNc de IL-6. l.k CONSERVAÇÃO DOS RESÍDUOS DE CISTEÍNA NA IL-6

Todas as posições de resíduo de cisteína estão conservadas entre as duas proteínas, BSF-2 (IL-6) e G-CSF. Após verificarem esta semelhança, Hirano e colab, 1986, Nature 32^:73, sugeriram que as ligações dissulfeto 1ntramo 1ecu1 ares seriam importantes na estrutura de BSF-2 (IL-6) e G-CSF. A sua sugestão foi baseada na comparação da sequência do BSF-2 (IL-6) com outras sequências numa base de dados pessoal de diversos factores de crescimento, ίnter1eucinas e~interferões, a qual revelou que 0 BSF-2 (IL-6) estava remotamente relacionado ao G-CSF. Contudo, a comparação com a base de dados da "National Biomedical Research Foundation" ou do "Genetic Sequence Data Bank" não revelou semelhança significativa com outras proteínas destes bancos de dados. A conservação das cisteínas também foi sugerida por Van Snick e colab. 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. 83^9679· Eles sequenciaram o HP-1 murino e descobriram homologia conservada com a IL-6 humana. Também examinaram as posições das cisteínas de HP-1, IL-6 e G-CSF, e verificaram que as posições de cisteína estavam conservadas dentro dos três péptidos. - 8 - 70336 50.53--0.6.0.-11.8

Tal como descrito por Yasuícawa e colab, acima, a organização de exões e intrões dentro do gene de BSF-2 (IL-6) era surpreendentemente semelhante à do G-CSF, quando os dois genes eram comparados. Este achado forneceu suporte adicional para a história evolutiva partilhada das duas proteínas (ver também Kishimoto, 1987 , J. Clin. immunol. 7(5):3^3) . A presença de císteínas numa proteína pode causar problemas no processamento quando a proteína esta a ser produzida de forma recombinante num hospedeiro bacteriano. As proteínas contendo císteína produzidas microbíanamente podem tender a formar mul-tímeros, os quais complicam grandemente a purificação do produto proteico. Diversos passos de purificação adicional, tais como redução e re-oxídação da proteína recombinante, podem ser necessários para obter a proteína na conformação apropriada. Seria desejável a remoção de um ou ma i s dos resíduos de císteína, com a substituição símultanea por um aminoãcído neutro quimicamente equivalente, a fim de simplificar o isolamento e purificação da molécula de iL-6. Contudo, a remoção bem sucedida de císteínas de moléculas biologicamente actívas não é previsível, dado que a estrutura terciária, na ausência das pontes dissulfeto normal mente formadas, pode ser substancia 1 mente alterada. E muitas vezes o caso que um ou mais destes resíduos pode ser essencial para manter ac-tividade desejada.

Crê-se que os resíduos de císteína naturais sejam particularmente críticos para as citocinas como IL-6, dado que as cis-teínas de IL-6 foram conservadas (ver acima). Além disso, foi descrito que a activídade biológica de outras citocinas é afectada se as císteínas são removidas. Por exemplo, apenas um resíduo de císteína em cada três pode ser removido sem afectar a activídade biológica do IFN-jS (ver Patente dos EUA N? k 737 462). De forma semelhante, apenas uma de cada quatro císteínas do IFN]51 pode ser removida sem perda completa da activídade (Mark e colab, 1984,

Proc. Natl. Acad. Sei. 81:5662). - 9 - 70336 5 0 5 3 - 0 6.Q -118

2.5 produção da interleucina-6 natural COMO UMA PROTEÍNA RECOMB[NANTE

2.5.1 TECNOLOGIA DE RECOMBlNAÇftO DO ADN E EXPRESSflO DE GENE A tecnologia de recombinaçao do ADN envolve a inserção de sequências de ADN especfficas num veículo de ADN (vector) para formar uma molécula de ADN recombinante a qual é capaz de re-plicação numa célula-hospedeira. Na generalidade, a sequência de ADN inserida é estranha ao veículo de ADN recipiente, isto é, a sequência de ADN inserida e o vector de ADN são derivados de organismos que, na natureza, não trocam informação genética, ou a sequência de ADN inserida pode ser, completa ou parcia 1mente, fabricada sinteticamente. Foram desenvolvidos diversos processos gerais que permitem a construção de moléculas de ADN recombinan-tes. 1 ndependetemente do método utilizado para a construção, a molécula de ADN recombinante deve ser compatível com a células-hospedeira , isto é, capaz de replicação autónoma numa célula--hospedeira ou integrada de forma estivei em um ou ma i s dos cromossomas das células-hospedeiras. A molécula de ADN recombinan-te também deve ter, preferivelmente, uma função marcadora a qual permita a selecção da molécula(s) de ADN recombinante desejadas. Além disso, se todos os sinais de replicação, transcrição e tradução adequados estão arranjados correctamente no vector recombinante, o gene estranho será convenientemente expresso, por exemplo, nas células hacterianas transformadas, no caso de plasmfdeos de expressão bacteriana, ou em hospedeiros ou linhas de células permissivas infectadas com um vírus recombinante ou sendo portadoras de um plasmídeo recombinante tendo a origem de replicação apropr i ada.

Sinais geneticos e eventos de processamento diferentes controlam os níveis de expressão do gene, tais como a transcrição do ADN e a tradução do ARN mensageiro (ARNm). A transcrição do ADN i dependente da presença de um promotor, o qual é uma sequência de ADN que dirige a ligação da polimerase de ARN e, desse mo- - 10 - 70336 5053-06(1-1 18 do, promove a síntese do ARNm. As sequências de ADN dos promotores eucaríotas diferem daquelas dos promotores procaríotas. Além disso, os promotores eucaríotas e os sinais genéticos acompanhantes podem não ser reconhecidos ou podem não funcionar num sistema procariota, e ademais, os promotores procaríotas não são reconhecidos e não funcionam em células eucaríotas.

De modo semelhante, a tradução do ARNm em procaríotas depende da presença dos sinais procaríotas adequados, os quais diferem dos dos eucaríotas. A tradução eficiente do ARNm em procaríotas requer um sítio de ligação ao ribossoma, denominado sequência de Shine-Da 1 garno (S/D), no ARNm (Shine, J. e Dalgarno, L. 1975» Nature 254:34). Esta sequência é uma sequência de nucleó-tidos curta de ARNm, que está localizada antes do codão de partida, geralmente AUG, que codifica para a metionina do terminal a-mino da proteína. As sequências S/D são complementares da extremidade 3' do ARNr (ARN ribossómico) de 16 S, e provavelmente promovem a ligação do ARNm aos ribossomas por empareihamento com o ARNr a fim de permitir o posicionamento correcto do ribossoma.

Apesar da sequência de Shine/Da1garno, constituída por alguns nucleõtidos de complementaridade entre o ARN ribossómico de 16,5 e o ARNm, ter sido identificada como uma característica importante do sítio de ligação ao ribossoma (Shine e Dalgarno, 1975, Nature 254:34; Steitz, 1980, em Ribosomes: Structure, Func-tion and Genetics e-d. Chambliss e colab. Baltimore, Md. Universi-ty Park Press pãgs. 479-495), a análise de computador indicou que aproximadamente cem nucleõtidos em redor do codão de iniciação AUG estão envolvidos na interacção ribossoma/ARNm, tal como indicado pelo prognóstico apropriado dos sinais de partida da tradução (Stormer e colab. 1982, Nucl . Acids Res . _1_0:2971; Gold e colab. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 8_1_:7061 ). Não pode ser feito qualquer prognóstico do que, na realidade, fornece o melhor e mais completo sítio de ligação ao ribossoma para a tradução máxima de uma proteína específica (ver Joyce e colab, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei . jjQ: 1830) .

Schoner e Schoner reconheceram a importância da região 70336 5053-060-118 - 1 1 - de interacção ribossoma/ARNm inteira no desenvolvimento de vec-tores de expressão recombinantes na sua caracterização de uma sequência de 72 pb denominada sequência de "minicistrão" (ver a Figura 1 de Schoner e colab, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 8506}. Uma delecçio de uma base no primeiro cistrão da sequência de "mi ηicistrão" foi suficiente para aumentar a produção da proteína recombinante a jusante Met-£A1â}bGH de 0,4¾ para 24¾ da proteína celular total (ver Figura 4, p C Z14 3 comparado com p C Z14 5 > Schoner e colab, i d) .

Alternativamente, uma inserção de duas bases também resul tou na expressão significativa do péptido de codificação codificado pelo segundo cistrão. As experiências de controlo indicaram que as diferenças na expressão foram devidas a diferenças da tradução dado que os níveis de ARNm nessas construções eram essencia 1mente equivalentes (não mais do que 3 vezes diferentes) quando comparados com as diferenças da proteína expressa (as quais eram de a-proximadamente 50 vezes). A conclusão foi que a posição do codão de paragem que termina a tradução do primeiro cistrão da sequência de mínicistrão afectou a eficiência de tradução do segundo cistrão, contendo a sequência de codificação da proteína recombi-nante. Ma is importante ainda, o trabalho indicou que trocas de uma ou duas bases na sequência precedendo imediatamente a sequência de codificação de uma proteína recombinante podem ter efeitos tremendos na expressão a jusante. A expressão bem sucedida de um gene clonado requer a transcrição suficiente do ADN, a tradução do ARNm, e em alguns casos, a modificação após a tradução da proteína. Os vectores de expressão foram utilizados para expressar genes sob o controlo de um promotor activo num hospedeiro adequado, e para aumentar a produção proteica.

2.5.2 PRODUÇÃO NÃO-BACTER LANA DA INTERLEUCINA-6 RECOMBINANTE

Embora Weissenbach e colab, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. 77 = 7152 tivessem traduzido ADNc em oõcitos para produzir ο I FN]32 recombinante i n v i t ro, Zilberstein e colab, 1986, EMBO J. 5:2529 - 12 - 70336 5053-060-118 descreveram o primeiro exemplo de expressão do ADNc do IFN|32A (I L--6) i n vivo. 0 fragmento de restrição, contendo os ADNcs fundidos de clones primários diferentes foi posicionado a jusante do promotor precoce de SV40 para produzir o plasmídeo pSVCIFB2. Neste plasmídeo, a sequência do ADNc do I FN]32A inteira e alguns nu-cleótidos adjacentes do vector de clonagem original seguiram o promotor precoce de SV40 e os primeiros 60 nucleõtidos do ARN do antigénio T. A sequência do I FNj32A era seguida pela região de junção e sítio de po1iadehi1 ação do antigénio T. Após os passos de transfecção para células de cultura de tecido de ovário de hamster

Chinês (CHO) e selecção de amplificação de metotrexato, os clones 35 de células CHO marcados com C S3 foram peneirados quanto a produção da proteína do IFNjB2 radioactiva por imunoprecipitação utilizando quantidades não saturadas de anticorpos. No mesmo estudo, as construções de plasmídeo, em que a sequência do ADNc do IFNJ32A inteira foi fundida com o promotor da polimerase de ARN de T7, também foram transcritas ? n vi tro para produzir o ARNm, que foi subsequentemente traduzido em lisados de reticu 1õcitos de coelho. Após a i munoprec i p i tação do lisado, a proteína de 1FNJB2 (I L--6) do tamanho adequado põde ser detectada em geles de SDS-poli-a c r i 1 a m i d a . 0 BSF-2 (IL-6) foi funcionalmente expresso em células C0S7 após transfecção de um plasmídeo contendo a região de codificação inteira do BSF-2 adjacente ao promotor precoce de SV40 (H i -rano e colab, 1986, Nature 324:73). A actividade do BSF-2 pode ser detectada após purificação e concentração do meio das células transfectadas utilizando métodos de imuno-afinidade em gel. A IL--6 recombinante produzida utilizando este método foi utilizada para analisar a regulação do ARNm de fibrinogénio e de albumina em células FAO (Andus e colab, 1987, FEBS Letts. 221:18).

Clark e colab. (Publicação Internacional N? W088/00206, publicada em 14 de Janeiro de 1988) descreveram a construção do pCSF309 em que a sequência do ADNc da IL-6 foi ligada ao plasmídeo p91023B o qual contém o incrementador de SV4i), o promotor tardio principal do adenovírus, a sequência de codificação de DHFR, o sí- 70336 5 Q 5-3 - 0 6 Q -113 - Π - tio de adição de poli-A de mensagem tardia do SV-40 e o gene de VAI. Quando as células COS são transfectadas com este plasmídeo, a actividade de estimulação hematopoiétíca da IL-b pode ser recuperada a uma dílução de 10-4 do meio das células de cultura de tecido condicionado. Este tipo de preparação recombinante foi u-tilizado numa análise do efeito da IL-6 sobre a proliferação de células T em presença, quer de ConA quer de pérolas de agarose unidas com anticorpos IgGZa, F23.1, de ratinho anti [segmentos 8.1, 8.2, e 8.3 da região variável da cadeia B do receptor das células T de ratinho] (Garman e colab. 1 987 , Proc. Natl . Acad. Sei. 84: 7629). A preparação da IL-6 recombinante também foi utilizada num estudo do efeito da IL-6 sobre a diferenciação de linfócitos ci-tolfticos Ly-2+ de timõeitos murinos em presença de inter1eucina--2 (Takai e colab, 1988, J. Immunol. 14 0:5 0 8) . Métodos alternativos de produção celular mais elevada da IL-6 recombinante incluem a síntese i n vi tro após a injecção de ARNm de IL-b em oõcitos de Xenopus (Weissenbach e colab, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 7152; Coulie e colab, 1 987, Eur. J. Immunol. J_7 : 1 435 ; Poupart e colab, 1987, EMBO J. 6_ :1219), por tradução do ARNm da I L-6 em reticu 1õcitos de coelho (Poupart e colab, 1987, EMBO J. £:1219), ou por expressão do ADNc em levedura (J_ja Pierre e colab, 1988, J. Exp. Med. J_67.:794) .

2.5.3 PRODUÇRO BACTERI ANA DA I NTERLEUCINA-6 RECOMBINANTE

Clark e colab. (Publicação Internacional N? W088/002Q6, publicada em 14 de Janeiro de 1988) descreveram a expressão e produção da IL-6 recombinante em E. Co1i utilizando o pCSF3Q9 (depositado em 11 de Julho de 1986, como 0 número de acesso ã ATCC 67 153)· Contudo, a concretização preferida aí descrita modificou seiectivamente a sequência do pCSF309 a) de 1eccionando a sua sequência líder do péptido de sinal e a sua sequência de não codificação 3'; e b) acoplando a sequência de codificação para a proteína a um promotor P^ induzido pela temperatura em associação com um repressor C| sensível ã temperatura. Esta estirpe, . contendo o plasmídeo pAL309C~78l, não foi depositada com a ATCC. Nesta estirpe, a proteína expressa pela bactéria foi produzida numa for- 70336 5Q53-Q6Q-118 - η - ma insolúvel, a qual teve primeiro de ser solubilízada e, em seguida, de novo dobrada (ver exemplo V do seu pedido de pa tente). Alternativamente, foi construído o plasmídeo denominado pAL-Sec-ILó-181 para produzir a IL-6 por acoplamento da sequência do ADNc da IL — 6 a uma sequência líder do péptido de sinal sintético sob o controlo do promotor P^. Após a indução por alta temperatura do promotor numa éstirpe de repressor Cj sensível i temperatura, a IL-6 foi isolada a partir do periplasma das células transformadas como uma proteína homogénea a partir da qual o péptido de sinal foi removido. Não foi descrito qualquer rendimento da proteína purificada.

Brakenhoff e colab, 1987, J. ímmunol. 139 :4116, descreveram a expressão do HGF, factor de crescimento de hibridona (IL--6), em estirpes diferentes de E. Coli contendo qualquer um dos sete clones do ADNc da t1-6 específicos. Os meios foram peneirados para actividade de IL-6 a fim de identificar os clones produzindo a IL-6. A actividade variou, pelo menos, 500Q vezes entre os clones. A construção mais activa (clone 7) faltavam os primeiros 43 aminoãcidos do péptido, .mas essa construção produziu mais do que 20X tanta actividade quanto o clone activo seguinte. As construções contendo a região de codificação dos aminoãcidos completa de HGF (1L — 6) tinham a menor actividade (por exemplo, o clone 15 iniciando-se na posição -62 a partir do sítio de partida ATG tinha 1,7 KU/ml de actividade comparado com o clone 7 o qual tinha 10 000 KU/ml). A fím de detectar a actividade, a IL-6 recom-binante foi, primeiro, separada das proteínas do citossol dos clones 7 e 15· A actividade foi analisada unicamente após eluição de placas de SDS-PAGE individuais. Embora a actividade tenha sido de-tectada, nenhuma proteína de lL-6 foi aparente no perfil de proteína proteico no gel.

Tosato e colab, 1988, Science 239:502, descreveram a produção de um anti-soro após imunização com lL-6 recombinante que foi produzido em E, Coli, mas não foram publicados os detalhes -- _ quer quer sobre os processos para a produção do anti-soro/sobre a síntese e purificação da proteína de IL-6 recombinante (ver a sua re- - 15 -

- 15 - J 70336 505.3-06(1-1 1.8. ferência 10, descrita como manuscrito na preparação). 0 BSF-2 (IL-6) recombínante foi produzido em E. Co1i utilizando o pTBCDF-12 (Hirano e colab, 1988, immunol. Letters J_7:4l). A indução deste plasmTdeo resultou na produção de uma proteína de fusão na qual o péptído de IL-6 recombínante foi fundido com o péptído de IL-2. As digestões com protease utilizando calicrefna e amíno peptidase-P foram necessárias para obter a proteína de IL-6 madura. Contudo, os detalhes deste procedimento diferentes dos desta descrição foram para publicação noutro local (ver 0 seu manuscrito na citação da preparação).

May e colab, 1988, J. Biol. Chem. 263:776o descreveram a produção de uma forma insolúvel de IL-6 em bactérias após a fusão do ADNc da IL-6 num vector de expressão REV (Repligen Corp. Cambrídge, MA) para produzir um produto contendo 3^ aminoãcidos de um péptido líder procariota fundido com uma porção do péptído de IL-6 de 182 aminoãcidos. A proteína expressa foi recuperada numa pelota insolúvel, a qual foi solubilizada em ureia 8M, DTT 5 mM e /3-mercaptoetano 1 10 mM num tampão baseado em tris. 0 produto da fusão foi parcialmente purificado a partir das numerosas outras proteínas da pelota de E. Col? por cromatografia de coluna de DEAE-Sepharose utilizando um gradiente salino com o tampão de so1ubί1ização, seguida quer por cromatografia de imunoafinidade com um anticorpo monoclonal para o péptido líder procariota quer por FPLC com uma coluna de Mono Q (Pharmacia). Não foram descritos quaisquer rendimentos da proteína purificada. A fracção do pico de DEAE-Sepharose exibiu actividade antiviral de 0,5 — 1 Ul/ml utilizando um ensaio de redução do efeito citopãtico em culturas de células FS-h e vírus da estomatite vesicular. A proteína de IL-ó re-combinante fundida foi injectada em coelhos para produzir um anti--soro policlonal. 0 anti-soro policlonal foi utilizado para carácter i za r a proteína de IL-6 natural em células FS4 fibroblásticas após indução por TNF ou ciclo-heximi da da IL-6 ou em monõcitos humanos. A incubação do anti-soro com o meio de células FSk preveniu a indução de imunog1obu1ínas em células CESS.

Diversos investigadores descreveram uma proteína de IL-6 16

16 J 70336 5053-Q60-118 recombinante feita em E. Co1í, mas não foi fornecida qualquer descrição da metodologia para a produção da fL-6 recombinante (Taga e colab, 1987, J . Exp. Hed. 166 (4):967; Gauldie e colab, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:7251; Lotz e colab,1988, J. Exp. Med. 167(3) : 1253; Muraguchi e colab, 1988, J. Exp. Med. 167 (2):332 ;

Reis e colab., 1988, J. Immunol. 140 (5):1 566). BI II M.ai ,

2.5.4 A PRODUÇÃO DE ALTOS RENDIMENTOS DE INTERLEUClNA-6 RECOMBINANTE É DIFÍCIL

Embora existam descrições não completas da produção de IL-6 natural em bactérias (ver secção 2.5.3), a produção de rendimentos altos da proteína natural em bactérias não foi bem sucedida mesmo utilizando métodos de bio-engenharia de ADN recombinan-te (Asagoe e colab, 1988, Bíotechno1ogy 6^:806) (ver também a secção 5-1 deste pedido ). 0 estudo de Asagoe descreve a inca pacidade para produzir a IL-6 natural como uma proteína detectã-vel em extractos celulares induzidos utilizando uma construção de plasmídeo muito reminiscente àquela descrita na secção 2.5.3, acima. 0 plasmídeo de expressão de Asagoe mal sucedido continha a sequência de codificação para a proteína de BSF-2 (IL-6) processada madura adjacente e em quadro com o promotor e a sequência de partida ATG. Embora o plasmídeo fosse analisado numa variedade de antecedentes da estirpe, . a proteína de IL-6 não foi detectada apôs a indução. Quantidades significativas de actividade de IL-6 recombinante insolúvel foram produzidas, por Asagoe e colab, somente após indução de um plasmídeo contendo uma proteína de fusão mu 11i-híbrida , na qual 1) o promotor Ργ^γρ e 0 sítio de partida ATG foram fundidos com a sequência de codificação para a hormona de crescimento humana; 2) a sequência da hormona de crescimento humana foi fundida com uma sequência de oligonucleõtidos produzindo um sítio de reconhecimento do péptido do factor Xa (i1e-g1u-g1y--arg) ; e 3) o sítio de reconhecimento do factor Xa foi então fundido quer com uma sequência glu-phe-met-BSF-2 quer com uma sequência de codificação para ala-BSF-2.

Este péptido de IL-6 (ou BSF-2) recombinante era deste 17 i 70336 5a5.3-Q6.il- .118 modo, a porção do terminal carboxi do produto de fusão híbrido de BSF-2/sequência do factor Xa/hormona de crescimento humana nesta construção. A activídade da Π-6 recombinante, existindo quer como o péptido g1u-phe-met-BSF-2 numa construção de plasmídeo quer como o péptido ala-BSF-2 noutra, pôde ser purificada somente apôs so1ubί1ização da proteína de fusão em ureia 8M. A clivagem da proteína de fusão com o factor Xa requereu a redobragem da proteína de fusão purificada por diãlise extensiva. 0 processo de redobragem foi incompleto dado que a preparação da proteína de fusão foi apenas incompletamente digerida pelo factor Xa. A clivagem do factor Xa produziu uma mistura heterogénea contendo a proteína de fusão íntacta, os péptidos da IL-b re-combinantes e o péptido da hormona de crescimento humana, além de outros produtos de clivagem parcial. A fim de recuperar a activi-dade de IL-6 no produto purificado, a mistura clivagem/factor Xa teve, primeiro, de ser desnaturada com cloridrato de guanidinio 6M. Após purificação cromatogrifíca do péptido de IL-6 recombinante, este foi submetido a um cic1 o adiciona1 de diãlise extensiva a fim de recuperar um péptido activo redobrado. Os péptidos recom-binantes resultantes, quer g1u-phe-met-BSF-2 quer ala-BSF-2, foram examinados apenas quanto a sua activídade num ensaio de factor estimulador de célula B. 0 rendimento descrito para o processo de produção foi de, aproximadamente, 5¾ (3 mg de activídade purificada foram recuperados a partir dos 100 mq iniciais da proteína de fusão, dos quais 58 mg eram de péptido de IL-6; 3/58 = 5,17¾).

Existe ainda a necessidade para um processo conveniente e relativamente económico de produção de altos rendimentos de IL--6. Os processos recombinantes utilizando células de mamífero tendem a ser bastante caros. Embora a produção bacteriana seja uma alternativa de menor custo, as tentativas anteriores para produzir a IL-6 em bactérias transformadas não resultaram em rendimentos comercia 1 mente viáveis. 0 presente invento fornece construções de ADN e processos para a produção de IL-6 em bactérias que permitem a produção da proteína com rendimentos altos, tipicamente cerca de 20¾ da proteína total do citossol. 0 invento também fornece - 18 - ^ 70336 5α5.3-α6α-.11.8 uma forma de lL-6 Hvre de císteína, a qual retém a actividade biológica da molécula de tL-6 nativa.

3. SUMARIOJO^NVENTO 0 presente invento refere-se i produção económica de proteínas de IL-6 recombinantes sintéticas livres de cistefna produzidas por bactérias, assim como de fragmentos peptTdicos activos de cada uma das proteínas. As proteínas produzidas são quer contendo cistefna quer livres de císteína, e retêm a actividade biológica de IL-6. As culturas bacteríanas expressam cada proteína recombinante como uma alta percentagem, geralmente pelo menos 20%, da proteína do citossol solúvel total. A proteína de IL-6 recom- de binante nao necessita/tratamento com agentes desnaturantes fortes como ureia 8M, ou j5-mercaptoetano 1 , para solubílizar a proteína a partir da pelota. Tal como utilizado ao longo da presente especificação e reivindicações, a frase "substancialmente solúvel em ã-gua" refere-se a esta propriedade.

No presente invento, a IL-6 é produzida de forma recombinante num hospedeiro unicelular por expressão de uma proteína de fusão tripartida. A proteína de fusão compreende uma primeira, uma segunda e uma terceira porções peptídicas. A primeira porção péptica tem a actividade de IL-6; a segunda porção peptídica é umasequência clivada química ou enzimaticamente que liga a primeira porção peptídica ã terceira porção peptídica; a terceira porção peptídica é uma proteína ou porção da mesma que é capaz de ser expressa pelo hospedeiro unicelular, e que tem, preferivelmente, uma função detectãvel. As tris porções peptídicas são referidas como "primeira", "segunda" ou "terceira" somente por conveniência, e não devem ser interpretadas como requerendo uma ordem específica, em relação ao promotor que controla a expressão da proteína: as posições das primeira e terceira porções peptídicas são inter-cambiãveis. A terceira porção peptídica fornece uma proteína ou porção da mesma que pode ser produzida pela célula-hospedeira unicelular. A presença do ADN portador que expressa o terceiro péptido 19 19 i 70336 5053-060-11.8 facilita a produção da proteína de tL-6 eucariota. Na sua função detectivel (por exemplo, actividade enzimãtíca), a terceira porção peptfdíca também fornece um meio pelo qual os clones transformados produzindo a proteína de fusão podem ser rapidamente identificados e isolados. A primeira porção peptídica, que possui a actividade biológica desejada, é separada do resto da proteína de fusão por clivagem da segunda porção peptídica. 0 pêptido de IL--6 recombinante é então separado e purificado a partir da mistura proteica por processos conhecidos na especialidade, tal como cro-matografia líquida de alto rendimento (HPLC), originando uma proteína pura que é actíva nos ensaios da IL-6. 0 presente invento também abrange as sequências de nucleótidos que codificam para a proteína de fusão, os vectores recombInantes compreendendo estas sequências de nucleótidos, assim como os hospedeiros unicelulares transformados com estes vectores.

Numa concretização particular, é produzido um péptido sintético tendo actividade de ÍL-6 com todas as quatro cisteínas da sequência de 1L-6 nativa substituídas por resíduos de serina. Salvo se especificado doutro modo, 0 termo IL-6 sintética livre de cisteína ou IL-6 recombinante livre de cisteína é utilizado, na especificação e reivindicações, para identificar um pêptido sintético tendo actividade de t L-6 com todas as quatro cisteínas da sequência de IL-6 nativa substituídas por resíduos de serina. 0 péptido assim produzido retém, surpreendentemente, a sua actividade biológica. Por exemplo, mostrou-se que a forma livre de cisteína da IL-6 exibia activação de hepatócitos e estimulação de células B. As proteínas de acordo com o presente invento podem ter actividade anti.virai e podem prevenir a infecção virai das células. A proteína sintética livre de cisteína pode ser não piroginica ou, pelo menos, significativamente menos pirogénica do que a proteína de IL-6 nat i va.

As proteínas de acordo com o presente invento também incluem péptidos de 1L — 6 contendo cisteína e livres de cisteína diferentes, os quais eliminaram até 27 resíduos de aminoicidos do terminal amino da IL — 6, e/ou adicionaram até 50 resíduos de amino-ãcidos ao terminal amino e/ou até 350 aminoãcidos ao terminal car- 20

20 J 70336 5Q 5.3-Q-6.01-11.8 boxllo da sequência de [L-6, e conservaram a actividade biológica pertinente. Assim, surpreendentemente, e ao contrario de muitos outros péptidos bid-iog i camen te actfvos, a sequência de IL-6 básica pode ser substancia 1 mente modificada sem qualquer perda significativa de actividade. 0 invento, por consequência, abrange as sequências dos genes codificantes para os péptidos livres de cis-tefna, assim como para péptidos, extensivos e truncados, contendo cisteína e livres de cistefna, os quais conservam a actividade de i L-6. 0 presente invento representa um aperfeiçoamento de processos de recombinação conhecidos para a produção de IL-6, visto que fornece meios para a produção da ΓL—6 em quantidades comerciais num sistema vector/recombínante. As anteriores construções da proteína de fusão de IL-6, tal como aquela descrita por Asagoe, acima, não foram bem sucedidas na obtenção de expressão da proteína em grandes quantidades, e alem disso necessitam de processos de redobragem e purificação fortes a fim de se obter uma proteína funcional. Este tratamento com agentes desnaturantes fortes não ê, contudo, necessário no processo presente, nem é necessário a redobragem quer da proteína de fusão quer da proteína de clivagem.

Os péptidos produzidos por cultura destes hospedeiros recombinantes mantêm a actividade de IL-6 característica nos seus efeitos estimulantes sobre o sistema imune e sobre a actividade celular terapêutica. 0 presente invento também abrange processos de tratamento de doença virai, imunodeficiências e distúrbios hepáticos, assim como de modulação global da resposta imune, por administração do péptido de IL-6 sintético reivindicado.

3.1 DEFINIÇÕES ATTC: Colecção .de culturas tipo americana pb: par de bases

BSF-2: Factor de estimulação das células B ADNC: ADN complementar CHO: Ovário de Hamster Chinês - 21 -

- 21 - J 70336 5Q53-Q6.0L-11.0 CSF: DHFR: DNase: ELISA: G-CSF: HGF: HPGF: HPLC: HSF: IGF: IgG, Ig M: IL-1 , IL-ou IL-6: I PTG: INF: KDa: Kb: LB: ARNm: PAGE: PBS : PDGF: Poli (rl) PL: PR: P P TAC' TRC RNase: SDS : Sequinc1 a SH: TNF: X-ga1: YT:

Factor de estimulação de colónias di-hidrofolato redutase nuclease de ácído desoxírríbonuc1eico

Ensaio de imuno-sorvente ligado a enzima

Factor de estimulação de colónias de granulócitos

Factor de crescimento de hepatócitos

Factor de crescimento de Plasmacitoma Hibridona

Cromatografía líquida de Alto Rendimento

Factor de estimulação de hepatócitos

Factor de crescimento semelhante ã insulina

Imunog1obuII na G, M lnter1eucina-1, -3 ou -6

Isopropiltíogalactosido

Interferão

Quilo Dalton

Quilo bases

Caldo de Luríà ARN mensageiro EIectroforese em gel de po1iacrί1amida

Solução salina tamponada com fosfato

Factor de crescimento derivado das plaquetas (rC): ARN com uma cadeia de ribo-lnosina emparelhada com uma cadeia de ribo-CitosÍna

Promotor Esquerdo de Lambda

Promotor Direito de Lambda

Promotor sintético da Combinação Triptofano-Lac nuclease de ácido ribonucleico Dodeci1 sul fato de sódio S/D: Sequência de Shine-Da1garno S u l f i d r i 1 o

Factor de Necrose de Tumor

Bromo-cloro-indol i 1-jB-D-galactopi ranosido

Meio de crescimento de tríptona de levedura - 22 -

- 22 - J 70336

5Q5.3--CL6.Q-118 b. BREVE_DESÇR|£$Q_DA|_RGURAS F1G. 1 - Diagrama da construção do p3oQ. 0 plasmídeo p360 ê um vector de expressão de plasmídeo construído para espres-sar o péptído semelhante a IL-é sintético livre de cisteína como uma proteína de aproximadamente 22-23 KDa em E. Co1i . Os olegonu-cleõtidos 737 UAGC TGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA CCA TGG CTG CA 3'3 e 738 LGCC ATG GTT ATT CCT CCT TAT TTA ATC 3'J foram fundidos e substituíram o fragmento de Hind lil- Pst 1 de pBS(+), um fagomí-deo adquirido de Stratagene Systems, para formar o p350. A sequência para o péptído semelhante a IL—6 sintética livre de cisteína do plasmídeo p337-1> o qual contém um codão de terminação do pép-tido, substituiu o fragmento de Nco Ι-Eco RI do p350 produzindo o plasmídeo p360. No p360, a expressão do promotor de lac induzida através da sequência do minicístrão e através da sequência semelhante a IL-6 sintética livre de cisteína e incapaz de produzir um péptído do tamanho da IL-6 em extractos de E, Coli (ver Figura 3 para gel das proteínas expressas). FIG. 2 - Diagrama da construção do p369. 0 fragmento contendo a sequência para o péptído semelhante a 1L-6 sintética livre de cisteína do plasmídeo p365, a qual não contém qualquer codao de terminação do péptído nesta construção, substituiu o fragmento de Nco I - Bam Hl do p350 (descrito na Figura 1) para formar o plasmídeo p 369, em que a sequência semelhante a IL-6 sintética livre de cisteína foi fundida em quadro com o fragmento complementar alfa de β-ga1actosidase. A induçaõ do promotor de lac do p369 ê incapaz de produzir um pêptido detectãvel que seria o produto de fusão entre o péptído semelhante a IL-6 sintético e a porção complementar alfa de β-ga1actosidase (ver Figura 3 para gel das proteínas expressas). FIG. 3 " Expressão e não-expressão das construções do plasmídeo contendo sequências para o péptído de IL-6 sintético livre de cisteína. Culturas de células de E. Co 1 i portadoras de plas-mídeos diferentes foram induzidas com IPTG. Amostras das culturas celulares foram lisadas e submetidas a electroforese em geles de SDS-poliacri1amída. Os geles foram corados com azul de Coomasie 23

23 J 70336 5 Q 5.3--06.0-118 para visualizar as proteínas. As faixas a e b são al 'quotas duplicadas de tubos diferentes da mesma cultura. As faixas la e b são de células portadoras do plasmídeo p369. A proteína de indução esperada deveria ser uma proteína de fusão da porção complementar alfa de β-ga1actosidase e o péptido semelhante a 1L-6 sintético. Não está presente qualquer proteína de grande peso molecular representando a fusão. As faixas 2a e b sao de células portadoras do plasmídeo p367, o vector de expressão bem sucedido para o produto de fusão do péptido semelhante a t L-6 sintético/co1agêneo/β--ga1actosidase. Notar a grande quantidade de proteína de fusão de alto peso molecular aproxi.madamente na posição de 130 KDa do gel. As faixas 3a e b são de células portadoras do plasmídeo p 3 6 0 , as quais se esperava que produzissem um péptido de 22-23,UDa, 0 tamanho da IL — 6 desg1icosí1ada. As setas marcam a posição do péptido pequeno esperado. FIG.4 - Diagrama da construção do p340-1. Os passos na construção do p340-1 estão descritos na secção 5.2.0 oligonu-cleótido 237 era IAAT. TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTA AGG AGG TTT AAC CAT GGA GAT CTG 3'3 . 0 o 1igonuc1eótído 238 era CGAT CCA GAT CTC CAT GGT TAA ACC TCC TTA CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG 3'1. 0 oli-gonucleÕt i do 703 era L CAT GTA TCG ATT AAA TAA GGA GGA ATA ACC 3'1. 0 oligonucleótido 704 era C CAT GGG TTA TTC CTC CTT ATT TAA TCG ATA 3'H· 0 PyRç é um promotor híbrido de triptofano/lac. "Term" representa o codão de terminação que está no mesmo quadro de leitura que o codão de metionina de Intel ação precedente. ApD repre-senta o promotor direito do bacteriõfago lambda. Amp representa o marcador da resistência ã ampicilina do pBR322. Ori representa a origem do plasmídeo de replicação do ADN do pBR322. β-gal representa a região do gene da jS-ga 1 actos i dase de E . Co 1 i . FIG. 5 - Sequência de nucleótídos (5 * ~ 31) completa do gene da IL-6 recombinante sintético e a sua sequência previsível de aminoacidos. A sequência de codificação do gene fundido inicia--se no nucleõtido 3 (Met). A sequência de aminoacidos da proteína de IL-6 recombinante estende-se até ao nucleõtido 557 (Met), onde está fundida com o ligante de colagénio da proteína de fusão por

J 70336 505.3-060-1 13 2k meio de um resíduo de serina., 0 asterisco designa a localização do codão de paragem TAG normalmente encontrado na sequência de ADNc nativa. Os resíduos de aminoicido modificados são apresentados em cursivo abaixo da sequência. FIG. 6 - Montagem do gene para o péptido semelhante a IL-6 sintético livre de císteína. Os oligonucleõtidos sintéticos foram tratados por aquecimento/arrefecimento e ligados para formar os quatro sub-fragmentos sintéticos de cadeia dupla do gene sintético. 0 inserto contido no p333 foi formado pela ligação de dois pares de olígonucleõtídos complementares, cada um deles sendo portador de projecções complementares 5' de cinco bases (nu-cleõtidos 59-63 na Figura 5). A construção p33^ foi composta a partir de três pares de o 1igonuc1eõtidos tratados por aquecímen-to/arrefecimento ligados nos resíduos 162-167 e 220-225. As projecções complementares para a montagem do p331 foram localizados nos nucleõtídos 312-315 e 353“361. A construção do p332 foi ligada nas posições ^57-^61 e 512-517·

Os fragmentos sintéticos foram clonados num vector Stra-togene pBS M13 modificado por inserção no sítio de clonagem múltiplo do vector ci rcular por meio de projecções de ^-6 bases sintéticas (representadas pelas caixas sombreadas). A sequência de codificação para o gene semelhante a IL-6 sintético livre de cis-teína está representada a preto. As caixas abertas representam as sequências M13+ do pBS modificadas. Os fragmentos foram montados por digestão com enzimas apropriados, purificação das bandas desejadas por electro eluiçio a partir de geles de agarose e religa-ção. A remoção do codão de terminação no p337 foi efectuada por substituição por um segundo fragmento sintético contendo um resíduo de serina e uma projecção de Eco RI (Rl) compatível. A ligação deste fragmento, para produzir a construção do p 3 6 5, resultou na adição de outro sítio de Bgl II e na perda do sítio de Eco Rl. 0 nucleótido 56^ identifica a posição da última base contida no sítio de Bgl II necessária para fundir o inserto no p365 com o li-gante de colagéneo do vector de expressão. Os sítios de restrição são identificados como se segue: B, Bam, Hl; Bg, Bgl l|; ri, Eco Rl; RV, Eco R \l.) H, HínD llí; N, Nco I; S, Stu I; X, Xba I. - 25 -

- 25 - J 70336 5053-0 6 Q-11g FIG. 7 ” Diagrama representando a construção do plas- mídeo P367, o vector de expressão bem sucedido para a produção do peptido de IL-6 sintét ico livre de cisteína. Os passos na construção do p367 estão descritos nas secções 5.2 - 5*5 no texto. FIG. 8a - Mapa de plasmfdeo do plasmídeo recombinante P3&7 mostrando a localização da sequência de IL-6 (designada HSF). 0 gene de IL-6 recombinante sintético livre de cisteína montado contido num inserto (Nco I - Bgl II), foi introduzido entre os sítios de restrição de Nco I e Bam Hl do vector. A caixa aberta (C) indica a localização do ligante de colagéneo de 60 aminoãci-dos, através do qual a IL-6 recombinante é fundida com a jS-galac-tosidase. A expressão do gene de fusão completo produz uma proteína híbrida de 130 KDa. FIG. 8b - Mapa de plasmídeo do plasmídeo recombinante P367 mostrando a localização da sequência para o pêptido semelhante a IL-6 sintético livre de cisteína (designado HSF). 0 vector apresentado é uma versão significativamente modificada do pJG200 tal como descrito no pedido na secção 5* 0 gene semelhante a IL-6 sintético montado contido num inserto (Nco I - Bgl II) foi introduzido entre os sítios de restrição de Nco I e Bam Hl do vector. A caixa aberta (C) indica a localização do ligante de colagéneo de 60 aminoãcidos através do qual o péptido semelhante a I L-sintético é fundido com a jB-ga 1 actos i dase. A expressão do gene de fusão completo produz uma proteína híbrida de aproximadamen-te 130 KDa (ver Figura 3 para expressão do plasmídeo em E. Co1i induzida). FIG. 9 - Análise de NaDodSO^ - PAGE da purificação da proteína de IL-6 sintética livre de cisteína. As amostras recolhi das em vários estágios de purificação foram submetidas a electro-forese em geles de NaDodSO^ - poliacri1amida a 10¾ sob condições redutoras, como apresentado. Os marcadores do peso molecular da proteína estão representados nas faixas M. As células de E. Co1i cultivadas em cultura descontínua de 10 1 foram lisadas pela adição de lisozima seguida por sonicação breve (faixa 1). A proteína - 26 - 70336 5053-060-118 de fusão ínvulgarmente hídrófoba foi purificada por precipitação repetida em sulfato de amónio após so1ubí1ização em pBS - SarKosyl (Faixa 2). A proteína de fusão parcialmente purificada foi então digerida com colagénase libertando a porção da IL-6 recombinante de 23 K-Da (Faixa 3) - Após remoção da maioria da jB-gal actosi dase solúvel clivada por precipitação em sulfato de amõnio a kQ%, a 1L--6 sintética foi recuperada numa forma quase homogénea como uma película, por aumento da concentração do sulfato de amónio até 70¾ de saturação (Faixa 4). A HPLC de fase invertida foi utilizada no passo final da purificação. A proteína foi recuperada numa fracção de pico único eluindo a acetonitrilo a 54¾ (Faixa 5)· F1G. 10 - Estimulação da síntese de fibrinogénio por IL-6 recombinante sintética livre de cisteína tal como preparada de acordo com os processos descritos nos §§ 5.2 a 5.8. As monoca-madas de células FAZA confluentes foram tratadas com concentrações variáveis de IL — 6 recombinante livre de císteína purificada em presença de dexametasona 10 ^M. Após cinco horas de estimulação, o meio celular foi recuperado e filtrado através de uma membrana de ni trocei ulose utilizando um aparelho de ponto-mancha. Os níveis de fibrinogénio secretados foram determinados por imunoensaio de fase sólida utilizando um anti-soro de fibrinogénio policlonal como anticorpo primário e anti-soro anti-lgG conjugado com fosfata-se alcalina como anticorpo secundário. 0 anticorpo ligado foi visualizado pela adição de substractos cromogénicos (BC1P e NBT) is manchas. As concentrações da proteína secretadas foram determinadas por densitometria "laser" de varrimento e comparação das intensidades do sinal contra diluições de um padrão de fibrinogénio de ratazana purificado.

FiG. 11 - Ensaio de diferenciação de células B. Célu las CH12.LX (2 x 105 célu1as/cavidade). foram co-cu1tivadas em presença ou na ausência de antígénio (SRBC) antes do tratamento com virias concentrações de IL-6 recombinante sintética livre de cisteína, tal como preparada de acordo com os processos descritos no §§ 5.2 a 5.8. Após 48 horas, as alíquotas de CH12.LX tratadas foram misturadas com uma suspensão recentemente lavada de SRBC con- - 27 - 70336 505.3-Qb.Q-11.8 tendo complemento de cobaía, e transferidas para câmaras de Cun-ningham para incubação a 37°C. Apõs 30 minutos, as células retornaram ã temperatura ambiente permitindo o desenvolvimento de placas hemoiíticas. Os resultados do ensaio são expressos como colónias formadoras de placas por milhão de células viáveis (apresentadas como Pfc no eixo dos yy). 0 1ípopolissacãrido bacteriano, incluído no ensaio como um controlo estimulador positivo, originou uma resposta de 10,726 pfc/mílhão de células. Os resultados apresentados representam valores médios de ensaios duplicados. FIG. 12a e b - Ilustração esquemática da construção de pTrpE/EK/cfIL-6. Os detalhes da construção podem ser encontrados no texto na secção 5*10*1. FIG. 13 “ Representação gráfica do Ensaio de Colónia de Tempo 0 para estimulação de células progenitoras por vários factores de crescimento e combínações dos mesmos. FIG. \k - Número de células não-aderentes após 7 dias de cultura líquida. Este ensaio é descrito no Exemplo 11. FIG. 15 " Inclone vs. IL-6 endógena em 71d.1. FIG. 16 - 1nc1one vs. 1 L-6 de bm em 71d.1. FIG. 17 - Inclone vs. IL-6 de Genzyme utilizando 71d.1. FIG. enteroqu i nase 18 -desde a A sequência sequência do no pTrpE/EK/cf1L-6 do sítio de terminal amino da IL-6 livre de cisteína até ao terminal carboxilo natural da IL-6, seguida de tris codões de paragem.

5 * des CRi£AO = DETALHADA=DO=J!NVENTO 5.1 CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO INtCIAiS

As tentativas para expressar níveis elevados de interleu - 28 -

- 28 - J 70336 5053-060-118 cina-6 em células bacterianas não resultaram na produção de quantidades da proteína detectãveís ou comercia 1 mente vantajosas. Uma tentativa para produzir quantidades de proteína comercI a 1 mente úteis resultou na síntese do plasmídeo p360. Neste vector de expressão, as sequências de IL-6 sintéticas livres de císteína do p337“l foram, inseridas imediatamente a jusante da sequência do mi-nicistrão produzida pela fusão do oligo 737 CAGCTGATTAAATAAGGAGGA ATAACCATGGCTGCA -3'3 e do oligo 738 L GCCATGGTTATTCCTCCTTATTTAATC--3'U. Nesta construção, o péptído de IL-6 sintético tinha um co-dao de terminação e não estava fundido com a proteína de β-galac-tosidase. Esperava-se que a indução produzisse um péptído de IL-6 sintético não-g1icosi1ado ligeiramente maior do que 22 KDa. A construção do plasmídeo p360 está esquematizada graficamente, mas não ã escala, na Figura 1. A indução da expressão do péptído de IL-6 sintético pela adição de IPTG a células portadoras do p360 não resultou em qualquer péptído detectlvel (ver Figura 3, faixas 3a e 3b para ausência de proteína na seta) .

De forma semelhante, a indução de uma éstirpe portadora do plasmídeo p369, construído tal como esquematizado na Figura 2, em que o péptido semelhante a IL-6 sintético foi fundido em quadro com o fragmento complementar alfa de β-galactosidase, não resultou em qualquer proteína detectãvel (ver faixas la e b, Figura 3) .

Estas ten~tativas mal sucedidas para produzir a IL-6 sintética podem ser comparadas, na Figura 3» com a produção bem sucedida, tal como descrita abaixo, da proteína de fusão de IL-6 sintética livre de c i s te í na/col agéneo/^B-ga 1 actos i dase (ver a grande quantidade da proteína de 130 KDa nas faixas 2a e b da Figura 3). 5.2 CONSTRUÇÃO DE UM VECTOR DE EXPRESSÃO DE IL-6

5.2.1. 0 VECTOR INICIAL pJG20Q 0 plasmídeo pJG200 foi o material de partida que foi modificado para produzir um vector de expressão de IL-6 bem sucedido. 0 plasmídeo inicial, pJG200, continha cistrões alvo que foram - 29 - - 29 - i 70336 5053-060-118 fundidos, no quadro de leitura correcto, com um péptido marcador com uma activídade detectável por melo de um fragmento de ADN que codifica para um péptido ligante sensível ã protease (Germino e Bastia, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8j_:4692; Germino e colab, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_0:6848). 0 promotor no vector original pJ G20 0 foi o prornotor do fago lambda. Adjacente ao promotor está o repressor termolãbil C j 857, seguido pelo sítio de ligação ao ribossoma e pelo trípleto iniciador AUG do gene Cro do fago lambda. Germino e Bastia inseriram um fragmento contendo a região helicoidal tripla do gene pro-2 de colagénio de galinha no sítio de restrição de Bam Hl próximo do iniciador ATG, produzindo um vector no qual a sequência de colagénio foi fundida com a sequência do gene da |3-ga 1 actos i dase lacZ na fase de tradução cor-recta. Um único sítio de restrição de Bam Hl foi regenerado e utilizado para inserir a sequência de codificação da proteína iniciadora da replicação RóK do plasmídeo. 0 plasmídeo pJG200 exprimiu a proteína iniciadora repli-cadora R6K como um produto de fusão híbrido após uma mudança de temperatura que inactívou o repressor C ^ 8 5 7 e permitiu a iniciação da transcrição a partir do promotor P^. Ambos, a construção do vector de origem com o iniciador ATG adjacente a e em quadro com a fusão (vector não inserido) col agéneo/)S-ga 1 actos i dase, e o pJG200 contendo a proteína iniciadora replicadora R6K ligada em quadro ao codão iniciador ATG (5‘) e a fusão (vector inserido) colagéneo/ jB-ga 1 actos i dase (31)» produziram activídade de β-ga1actosidase em células bacterianas transformadas com os plasmídeos. Como consequência, as 'estirpes contendo plasmídeos com os insertos não são distinguíveis das estirpes contendo o vector de origem sem in-se rto.

5.2.2 REMOQftO DO REPRESSOR ^ 857 DO PR E DO TERMINAL AM I NO DE CRO A primeira alteração do pJG200 neste invento foi a remoção e substituição do fragmento de Eco RI - Bam Hl que continha o promotor P^, o repressor C j 8 5 7 e o terminal amino da proteína cro, o qual fornecia o sítio de partida ATG para as proteínas de fusão. - 30 - 70.336 5053-060-118

Foi inserido um ligante de o 1ígonuc1eótído para produzir o plas-mídeo p258, o qual manteve o sítio de Eco RI e também codificou para as sequências de ADN adicionais reconhecidas pelas endonucle-ases de restrição Nco i, Bgl II e Bam Hl. Esta modificação forneceu um novo codão de partida ATG que estava fora de quadro com a fusão colagéneo/^-ga1actosidase. Como consequência, não há acti-vidade de j§-ga 1 actos idase nas células transformadas com o plasmí-deo p258. Além disso, esta modificação removeu o terminal amino da proteína cro, de modo que quaisquer produtos resultantes da fusão recombinante inseridos adjacentes ao codão de partida ATG não apresentarão aminoácidos codificados por cro no seu terminal amino. Em contraste, as proteínas recombin-ntes expressas a partir do vector pJG200 original apresentam todas aminoácidos codificados por cro no seu terminal amino.

5.2.3 ADIÇÃO DO PROMOTOR PTAC> SEQUENC1A SH1NE-DALGARNO E CODÃO ATG

No segundo passo de construção do vector de expressão de IL-6, um fragmento de restrição, o fragmento de Eco RI - Nco I do pKK233"2 (Pharmacia Bíochemicals, Milwaukee, WI), foi inserido nos sítios de restrição de Eco RI - Nco I do plasmídeo p258 para produzir o plasmídeo p 2 7 7 · Como consequência, o plasmídeo p 2 7 7 continha o promotor PjAC (também conhecido como P ) do pKK233-2, o sítio de ligação ao ribossoma lacZ e um codão de iniciação ATG. No plasmídeo p 2 7 7, β inserção de uma sequência proteica alvo permite a sua transcriçaõ a partir de um promotor induzido por IPTG num fundo da estirpe apropriada. 0 fundo da estirpe apropriada fornece proteína repressora lac suficiente para inibir a transcrição a partir do promotor não-i nd uz i do. Dado que as célu las podem ser induzidas pela simples adição de pequenas quantidades do IPTG químico, o plasmídeo p277 fornece uma vantagem comercial significativa sobre os promotores que requerem mudanças de temperatura para indução, tal como o promotor P do pJG200. A in-duçio de quantidades comerciais de culturas celulares contendo promotores induzidos pela temperatura deveria, por outro lado, necessitar do aquecimento de grandes volumes de células e meio para produzir a mudança de temperatura necessária para a indução. Por - 31 - 70336 5Q53-0Ó0.-118 exemplo, a Indução pelo promotor requer uma mudança de temperatura para inactívar o promotor do repressor Cj357 de inibição do pJG2Q0. Um benefício adicional da troca de promotor é que as células não são submetidas a altas temperaturas ou a mudanças de temperatura. As altas temperaturas e as mudanças de temperatura resultam numa resposta de choque de calor e na induçaõ de protea-ses de resposta de choque de calor capazes de degradar as proteínas recombinantes assim como as proteínas do hospedeiro (ver Gros-sman e colab, 1984, Ce 1 1 28:383; Baker e colab, 1984, Proc. Natl . Acad. Sei. íh :6779).

5.2.4 APERFEIÇOAMENTO DO SÍTIO DE LIGAÇÃO AO RIBOSSOMA 0 vector de expressão p277 foi adiciona1 mente modificado pela inserção de vinte e nove pares de bases, nomeadamente 51CATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAC31, no sítio de Nco I do p277 para produzir o plasmídeo p 3 4 0 . Esta sequência está relacionada com, mas é diferente de, uma porção da sequência do "minicist rio" de Schoner (descrita na secção 2.5.1). A inclusão destes 29 pares de bases fornece um óptimo sítio de Shine/Da1garno para a interaeção ribossoma/ARNm. 0 vector p340 final difere signifícativamente do pJG200, dado que contêm um promotor altamente induzido adequado para os altos rendimentos necessários para preparações comercais, e uma região do sítio de ligação ao ribossoma sintética aperfeiçoada para ape rf e i çoa r- a tradução, e os meios para fornecer um in dicador visual da inserção do fragmento. Os passos na construção do p340-1 estão esquematizados na Figura 4. 5-3 MODIFICAÇÕES DA SEQUÊNCIA DA INTERLEUCINA-6 A sequência de codificação utilizada para a expressão da IL-6 recombinante sintética livre de cistefna foi baseada na sequência do ADNc da IL-6 humana. A sequência de codificação foi construída utilizando 11 pares de oligonucleótidos sintéticos complementares. Foram introduzidas diversas mutações na sequência de codificação para a IL-6 recombinante durante a síntese dos oligo-nucleõtidos para permitir, por um lado, uma montagem adequada dos - 32 - 7113.36 50 5-3-Q 6.0-1 ] 8 subfragmentos do gene, e por outro lado, para assegurar a expressão eficiente do gene montado. As modificações da sequência de nucleõtidos, designadas para introduzir novos sítios de restrição para utilização na ligação dos subfragmentos do gene, foram incorporadas na sequência de codificação de forma a evitar a alteração da composição de aminoicidos do gene sintético em relação ã sequência da proteína de iL-6 nativa. As modificações incluem: 1) substituição dos 118 nucleõtidos do terminal 5‘, que codificam para os 28 aminoãcidos da sequência de sinal normalmente encontrada nó gene 1 L-6 nativo, com um codão de metionina (nucleõtidos 3"5); ii) substituição do resíduo de PPro3 na sequência da proteína de IL-6 sintética com CGlyJ (nucleõtidos 6-8) na sequência de IL—6 sintética; iii) substituição do codão de paragem TAG normal com um codão de serina (nucleõtidos 558-560} para efectuar a fusão da proteína de IL-β sintética com o ligante de colagéneo; e ίν) substituição dos quatro resíduos de cisteína internos com serinas (nucleõtidos 135-137» 153-155, 222-224, 252-254) para produzir uma proteína de IL-6 sintética que é incapaz de formar ligações dis-sulfeto. A sequência da proteína sintética modificada livre de cisteína está incluída na Figura 5. Os especialistas na matéria reconhecerão que outras modificações na sequência do péptido sintético são úteis no presente invento. 0 invento como esperado inclui a modificação de outros aminoãcidos da sequência do péptido e de outros nucleõtidos da sequência do ADN.

5.4 SÍNTESE E REUNIÃO DOS OL1GONUCLEOTI DOS A montagem dos oligonucleótidos foi levada a cabo em três passos. 1nicia 1 mente, os oligonuc1eõtidos portadores de pro-jecções complementares foram tratados por aquecimento/arrefecimento e ligados para produzir quatro fragmentos de cadeia dupla distintos, um composto por quatro o 1igonuc1eõtidos (2 por cadeia) e três compostos por seis olígonucleõtidos cada (3 por cadeia). Antes da montagem, os oligõmeros sintéticos foram quinasados com 10 unidades de po1inucleõtido quinase de T4. Para prevenir a conca-tenação durante a ligação, os oligõmeros do terminal 5' em qualquer das duas cadeias não foram fosfori1ados. Sub-sêries destes - 33 - 70336 5 05.3-Ο 6.0-11.6. ο 1igonucleotidos de cadeia dupla foram montados em reacções de aquecimento/arrefecimento e ligação distintas a fim de produzir quatro sub-fragmentos, cada um deles representando aproximada-mente um quarto da sequência de codificação para IL-6 recombinan-te sintética livre de cisteína.

Foi construído um plasmídeo modificado para tomar em consideração a amplificação do ADN e facilitar no sequenciamento de cada oligõmero. Um vector de clonagem pBS M13+ (Stratagene) foi modificado por inserção de um adaptador de oligonucleõtido de 28 bases (51AGCTTCCATGGTCGCGACTCGAGCTGCA-3') entre os sítios de Hind III e Pst I da sua região de clonagem múltipla. Como consequência-o plasmídeo modificado, designado p287, já não contém o seu sítio de restrição de Sph I original mas codifica para sítios adicionais para Nco I, Nru 1 e Xho í.

Os oligõmeros sintéticos foram clonados separadamente no vector de pBS M13 modificado, p287> para permitir a amplificação do ADN e a verificação da sequência por sequenciamento de di-desoxinuc1eotido. A inserção dos fragmentos montados no vector modificado produziu os plasmídeos recombinantes p333>p33^, p331 e p332, cada um deles contendo uma porção da região de cod i f i cação para a proteína de IL-6 sintética livre de cisteína avançando do terminal amino para o carboxi, respectivamente. Após a ligação, cada plasmídeo de ADN foi transformado separadamente na E. Coli JM101 competente. 0 segundo passo da montagem envolveu a construção de dois vectores que codificaram para as metades amino e carboxi da IL-6 sintética livre de cisteína. Estes foram obtidos por ligação dos insertos de p333 e p33^> para produzir o vector de codificação para o terminal N p336 , e por ligação dos insertos de p332 e p331, para formar o vector de codificação para o terminal C p 3 3 5 -

No terceiro e último passo da construção, os insertos foram subsequentemente combinados para produzir a sequência de codificação inteira do gene de IL-6 recombinante sintética livre de cisteína. 0 inserto1ibertado do palsmídeo p335 foi ligado ao p33ó 70336 50 53-06.0-1 1.8 - 3b - O plasmídeo resultante p365 continha a sequência de codificação completa de í L—6 sintética inserida entre os sítios de Nco l e EcoRI do vector pBs Μ13 modificado, p287* As construções estão representadas esquematicamente na Figura 6.

5-5 CONSTRUÇÃO DO VECTOR p367 PARA EXPRESSÃO DO PRODUTO DE FUSÃO DE IL-6 S tΝΤΕΤI CA/C0LAGENE0/j3-GALACT0S I DASE 0 gene de IL- 6 recombínante livre de cisteTna montado foi excisado do p3659 e inserido no plasmídeo p3^0 entre o sítio de Nco I, o qual inclui a metionína de iniciação, e o sítio de Bam Hl adjacente ao ligante de colagéneo, tal como representado na Figura 7· 0 vector p367 resultante, esquematizado na Figura 8 mas não i escala, foi utilizado para transformar a E. Coli JM101. As colónias recombInantes foram seleccíonadas com base na resistência a antibiótico e pelo aparecimento de coloração azul em presença de X-Gal. 0 tamanho do ínserto de ADN foi confirmado por extracção do miní-lisado seguida por electroforese em gel de poli-a c r ί 1 a m i d a .

Uma proteína de fusão tripartida composta por IL-6 sintética livre de cisteína, um ligante de colagéneo de sessenta ami-noácidos e β-galactosidase, foi produzida em bactérias transformadas (ver Figura 3 e Figura 9). Tal como prognosticado a partir da sequência do gene, os transformantes resistentes a ampicilina portadores do plasmídeo de expressão da IL-6 modificado produziram colónias azuis após adição do agente indutor IPTG e do subs-tracto de β-ga1actosidase cromogénico X-Ga1. A síntese da proteína de fusão por transformantes induzidos por IPTG foi confirmada independentemente por análise de mancha de Western de um Usado de E. Co 1i total utilizando um anticorpo anti-β-ga1actosídase monoclo nal obtido de Promega Biotec. 0 anticorpo anti-β-ga1actosidase mo-noclonal utilizado na mancha de Western reconheceu uma banda com um peso molecular aparente de 130 000 KDa. 35

35 J 70336 5 Q 53-060-1 1 8.

5.6 INDUÇÃO DE GRANDES quantidades da prqtetna DE FUSÃO DE INTERLEUCINA-6 MODIFICADA

As JM101 transformadas contendo o plasmídeo p367 foram cultivadas em culturas descontínuas de 10 1 utilizando um fermen-tador Magnaferm (New Brunswick Scientific). As células foram cultivadas em 2 x YT contendo 100 yttg/ml de ampicilína e induzidas a A550 = 1,5 pela adição de isopropí1tio-B-D-galactopíranosido 5 mM (1TPG, Sigma). Oito a doze horas após a inoculação, quando os números de células e a activídade de β-ga1actosidase tinham alcançado níveis máximos, as células foram sedimentadas por centrifugação a 5000 x g e armazenadas congeladas a -20°C até serem necessárias.

5.7 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO

As pelotas de células de E. Coli congeladas foram processadas em alfquotas de 100 g (peso húmido) por lavagem com tampão de TNS (tris.Cl 30 mM, pH 7,4; NaCl 30 mM, 0,05¾ de lauroil-sarcosina de sódio). As células lavadas foram lisadas em 450 ml de TNS contendo EDTA 1,5 mM e 0,5 mg/ml de lisozima. Após incubação da suspensão em gelo durante 30 minutos, foi assegurada a li-se completa submetendo as células a três ciclos de congelação-descongelação e sonicaçaõ breve. As proteínas solúveis, destituídas de activídade de )3-gal actos i dase, foram removidas por três lavagens repetidas em TNS seguidas por centrifugação a 10 000 x g durante 20 minutos. A pelota final, pesando aproximadamente 40 g, foi re-suspensa em 60 ml de sarcosilo a 10¾ e diluída até 2,4 litros com solução salina tamponada com fosfato (PBS) . 0 material insolúvel foi removido por centrifugação e o sobrenadante tornado 40¾ em relação a uma solução saturada de sulfato de amónio. Após incubação do extracto em gelo durante 30 minutos, a proteína precipitada foi novamente recuperada por centrifugação e submetida a dois ciclos adicionais de precipitação em sulfato de amónio. 0 extracto final foi ressuspenso em 250 ml de tris.Cl 20 mM, pH 7,4 e NaCl 150 mM, dividido em alfquotas de 4 ml e armazenado a -20°C até estar pronto para o processamento posterior. - 36 -

- 36 - J 70336 505.3-060-118

5.8 CLIVAGEM DA PROTEÍNA DE FUSÃO E PURIFICAÇÃO DA 1NTERLEUCINA-6 SINTÉTICA LIVRE DE CISTEÍNA A proteína de í L-6 reeombínante sintética livre de cis-teína foi purificada até ã homogeneidade utilizando HPLC de fase invertida. 0 extracto descongelado (h ml) foi sonicado brevemente para dispersar os agregados, adicionado a colagenase pré-tratada, e Incubado durante h5 minutos ã temperatura ambiente. A maioria da β-ga1actosídase clivada foi removida pela adição de 0,5'volu-mes de sulfato de amónio saturado, incubação em gelo durante 30 minutos e sedimentação do material insolúvel. A IL-6 reeombínante livre de cisteína clivada foi concentrada levando o volume total do sobrenadante até 13 ml com sulfato de amónio saturado, incubando em gelo durante 30 minutos e centrifugando para compactar a proteína Insolúvel numa película flutuante. 0 líquido foi drenado por prefuração do tubo, e a película remanescente foi ressuspensa em 0,5 ml de solução sa1ína . tamponada com tris. A IL-6 reeombínante livre de cisteína ressuspensa foi preparada por HPLC de fase invertida pela adição de um volume igual de acetonitrilo a 60%, ácido trif1uoroacético a 0,1%. 0 material insolúvel foi sedimentado e o sobrenadante clarificado foi carregado para uma coluna de fase invertida de 250 mm e k,6 mm de Dl (Vydac, 218Tp, C18, 10 jum- Alltech Associates) num volume de in-jecção de 0,5 a 1 ml. A fase móvel consistiu em concentrações variáveis de solvente B (acetonitrilo a óO% e ácido trif1uoroacéti-co a 0,1%) em relação ao solvente A (ácido trifluoroacético a 0,1%). 0 caudal foi de 0,5 ml/minuto, e o sistema programado para entregar dois gradientes lineares consecutivos, de 25% a 80% de B em cinco minutos, e 80% a 100% de B durante minutos. A proteína eluída a partir da coluna a acetonitrilo a 5^% e recolhida numa fraeção de pico único foi o péptido de inter 1 eucína-6 sintética livre de cisteína purificado, o qual migrou a 23 KDa após SDS-PAGE. Os passos da purificação estão indicados na Figura 9 e os rendimentos de cada passo são fornecidos na Tabela 1. 70336 5053-060-118 - 37 -TABELA 1

PySiEiÇA£Ã0=DE =srL-6BsSsINTETJ!ÇAeLsr|VRE_DE__Çt>SIElNA Rendi mento Passo de purificação Cm/10 0 g de peso celular húmido) Proteína Proteína Ga 1actosidase 1L-6 r Total de Fusão Células inteiras 12000 1080 156a Lisado 1avadob 1420 570 81a ç Lisado colagenado 1220 491 75 Sóbrenadante digerido^ 80 22 27 Fracção de HPLCe 16 16 Purificação Relativa Passo de purificação (fracção da proteína total D Proteína de Fusão Ga 1actos i dase 1 L-6 r Células inteiras 0,09 _ _ _ 0,013a Lisado lavado^ 0,40 — 0,057a ç Lisado colagenado — 0,40 0,061 Sóbrenadante digerido — 0,27 0,34 Fracção de HPLCe --- — 1,0 a Valor hipotético baseado numa razão de peso molecular calculado de cerca de 1:7 para IL-ér: proteína de fusão

Material celular insolúvel apôs lavagem com o tampão TNS, solubi1ização com detergente, e precipitação repetida em sulfato de amónio

Fracção de lisado lavado após 1 hora de digestão com colagenase

Fracção do sóbrenadante após precipitação do lisado colagenado com sulfato de amónio saturado a 32%

Fracção contendo IL-6r após passagem do sóbrenadante digerido em coluna de HPLC de fase invertida - 38 - 70336 505-3-06.0-1 13 A fím de confirmar a identidade da proteína de 23 KDa, o material purificado com HPLC foi submetido a sequencíamento di-recto automático das proteínas do terminal N. Os resíduos de ami-noicido (MGVPPGED) identificados após sete ciclos de degradação sequencial coincidiram com a composição prevista de aminoãcidos do terminal N da proteína recombinante tal como deduzida a partir do gene da IL-6 recombinante sintética livre de cistefna. A confirmação da sequência da proteína revelou que a preparação continha uma pequena fracção da proteína de IL-6 recombinante livre de cisteína com um resíduo terminal de metionina.

Numa concretização particular, a fracção activa isolada consistiu numa mistura de proteínas de IL-6 sintéticas livres de cisteína contendo metionina no terminal amino e livre de meti-onina no terminal amino. A análise da sequência de aminoãcidos indica que numa preparação da mistura, 90¾ da mistura era livre de metionina no terminal amino e 10¾ continha uma metionina no terminal amino. Nesta concretização, a preparação activa da proteína livre de cisteína varia desde a í L — 6 natural em que 1) não ocorrem quaisquer ligações dissulfeto ίntramo 1ecu1 ares; 2) um amino-ãcido metionina na posição um na proteína submetida a bio-engenha-ria substitui os aminoácidos da sequência de sinal 1-28 da proteína natural não processada; 3) o aminoácido dois da proteína submetida a bio-engenharía, glícina, substitui o aminoácido prolina presente na proteína de IL-6 natural; A) o terminal carboxi contêm aminoãcidos adicionais. A colagenase geralmente cliva a seguir a Y na sequência p-Y-G-P em que Y representa um aminoácido neutro. Ver Keil e colab FEBS Letters 56^:292-296 (1975). No exemplo presente da proteína de fusão com sequências de IL-é, o aminoácido neutro representado por Y é valina. Consequentemente, espera-se que o terminal carboxi da proteína produzida po-r indução da proteína de fusão codificada pelo vector p367 após digestão da proteína de fusão com colagenase seja essencíalmente ... P-G-P-V-G-P-V e ou ... P-G-P-V.

Se estiver presente colagenase suficiente sob condições suficientemente rigorosas, o terminal carboxi é exclusivamente ...P-G-P-V. Se a sequência de aminoãcidos inícíando-se com o terceiro aminoáci - 39 - 70336 5053-060-118 do (isto é, v) na Figura 5 e terminando com o décimo quarto amino-ãcido da extremidade (isto é, Mj é denominada pep, os péptidos seguintes são abrangidos pelo presente invento. (P rote ína I) (ProteTna I I) (Proteína I I I) (Proteína IV)

G-pep-SDPGPVGPV

G-pep-SDPGPV

MG-pep-SDPGPVGPV

MG-pep-SDPGPV

Esta preparação foi utilizada nos exemplos descritos nos §§ 1, 8 e 9. A presença ou ausência de metionina no terminal amino, e a presença ou ausência de G-P-V no terminal carboxi não afecta a actividade da IL-6

5.9 PROCESSOS ALTERNATIVOS DE PREPARAÇÃO DA IL-6 SINTÉTICA LIVRE DE CISTEÍNA A descrição anterior não é mais do que um exemplo específico de um processo útil pelo qual o péptido de I L-6 sintética livre de cisteína de acordo com o presente invento pode ser preparado. Contudo, os especialistas na matéria reconhecerão prontamente que outras construções de vector, assim como outros hospedeiros unicelulares, também são úteis no processo de acordo com o presente invento. Em termos muito gerais, por exemplo, o perito na arte reconhecerá que, para efectuar eventua 1mente a transcrição e tradução do gene inserido, o gene deve estar colocado sob o controlo de um promotor compatível com a célula-hospedeira escolhida. Um promotor ê uma região de ADN à qual a polimerase de ARN se liga e inicia a transcrição. 0 promotor seleccionado pode ser qualquer um que tenha sido isolado a partir do organismo da célula-hospedeira. Por exemplo, E. Co1i, um sistema hospedeiro habitua 1 mente utilizado, tem numerosos promotores tais com o promotor 1ac ou recA associados com ele, os seus bacteriõfagos ou os seus plasmídeos. Do mesmo modo, promotores produzidos de forma sintética ou recombi-nante, tais como promotores PD e P. do fago Λ, podem ser utiliza-dos para dirigir o alto nível de produção dos segmentos de ADN ad- - 40 - 70336 5053-060-118 jacentes a eles. Também foram identificados promotores semelhantes para outras bactérias e células eucariotas.

Os sinais também são necessários a fim de alcançar trans crição e tradução eficientes do gene. Por exemplo, no ARNm de E. Co1i, um sítio de ligação ao ribossoma inclui o codão de partida da tradução (AUG ou GUG) e outra sequência complementar is bases da extremidade 3' do ARN ribossõmico de 16$. Diversas destas últimas sequências (Shine-Da1 grano ou S-D) foram identificadas em E. Co1i e noutros tipos de células-hospedeiras adequadas. Qualquer sequência S-D que seja compatível com o sistema da cilula-hospe-deira pode ser empregue. Estas sequências de SD_ATG incluem, mas não estão limitadas ãs sequências de SD_ATG do gene cro ou do gene N do colifago lambda, ou dos genes de triptofano E, D, C, B ou A de E. Co1i.

Existe um certo número de processos para a inserção de fragmentos de ADN nos vectores de clonagem ? n v i tro. A ligase de ADN é um enzima que sela entalhes de cadeia única entre nucleõti-dos adjacentes numa cadeia de ADN dupla; este enzima pode, portanto, ser utilizado para ligar de forma covalente as extremidades coesas, tratadas por aquecímento/arrefecimento produzidas por certos enzimas de restrição. Alternativamente, a ligase de ADN pode ser utilizada para catalisar a formação de ligações fosfodiéster entre os fragmentos de extremidade cega. Finalmente, a enzima de-sox i r r i bonucl eot i d i l’t ransf erase terminal pode ser empregue para for mar caudas de cadeia única 3' homopo1iméricas nas extremidades dos fragmentos, pela adição de sequências oligo (dA) ã extremidade 3' de uma população, e de blocos oligo (dT) ãs extremidades 3l de uma segunda população, os dois tipos de moléculas podem ligar-se para formar círculos diméricos. Qualquer destes processos pode ser utilizado para ligar os elementos de controlo a sítios específicos no vector. Assim, a sequência codificando para a proteína de fusão de IL-ó, contendo cisteína ou livre de cisteína, está ligada, no vector escolhido, com uma relação específica ao promotor e aos elementos de controlo do vector, de modo que a sequência esteja no quadro de leitura correcto em relação ã sequência ATG do vector

J 70336 50 53-.Q6.Q.-11.8 - k\ -0 vector empregue terã tipicamente uma função marcadora, tal como resistência ã ampicllina ou resistência ã tetracic1ina, de modo que as células transformadas possam ser Identificadas. 0 processo empregue pode ser qualquer dos vectores de expressão conhecidos ou os seus derivados; entre os mais frequentemente utilizados estão os vectores de plasmídeo tais como pBR 322, pAC 105, pVA 5, pACYC 177, pKH kl, pACYC 18A, pUB 110, pmB9, pBR325, col El, p S C101 , pBR313, pML21, RSF2124, pCR] ou Rp*í; os vectores de bacte-riõfago tais como lambda gtl1 , lambda gt-WES-1ambda B, cadeia 28, cadeia k, lambda gt-l-lambda BC, lambda-gt-1 lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9; SVkO e vectores.de adenovírus; e os vectores de levedura. 0 vector ê seleccionado pela sua compatibilidade com o sistema de célula-hospedeira escolhido. Embora as bactérias, particularmente a E, Coli, tenham provado ser muito úteis na produção de alto rendimento do péptído de IL-b sintético, e sejam o hospedeiro preferido, o invento não esta desse modo limitado. 0 presente invento abrange a utilização de qualquer organismo unicelular cultivãvel como hospedeiro; por exemplo, hospedeiros euca-riotas tais como células de levedura, insecto ou mamífero, também são hospedeiros potenciais para a produção de IL — 6. A selecção de um sistema de expressão apropriado, baseado na escolha da célula hospedeira, encontra-se bem dentro da capacidade dos peritos na arte.

Um especialista no assunto reconhecerá prontamente que são possíveis variações na proteína de fusão descrita. Por exemplo, a ordem da primeira e terceira porções peptídicas pode ser invertida, de modo que o terceiro segmento peptídico esteja posicionado no terminal amino e a sequência de codificação para os pêptidos com actividade de IL-6 esteja no terminal carboxilo permanecendo a segunda porção peptídica clivãvel como uma ligação entre os dois segmentos. A identidade de cada um destes segmentos também pode ser modificada. Por exemplo, é possível uma variação substancial dentro e em redor da sequência peptídica de IL-6 básica. Uma observação particularmente interessante ê que uma porção substancial do terminal amino pode ser apagada, não sõ sem perda de actividade,

J 70336 5Q5.3-Q6.0-i 1.8 - hz - mas com um aumento resultante, de 2-3 vezes na actlvídade nas sequências de IL-6 quer contendo crsteína quer livres de cisteTna. Contudo, a remoçaõ dos últimos 20 resíduos na sequência resulta numa perda completa de actividade, quer nas formas contendo cisr teína quer nas formas livres de cisteína. De igual modo, como mencionado acima, a presença de resíduos de aminoácido adicionais no terminal carboxi do péptido de IL-ó não afecta a actividade biológica da molécula.

Também será compreendido pelos especialistas no assunto que qualquer aminoácido na sequência conhecida da IL-6 pode ser substituído com um aminoácido quimicamente equivalente. Noutras palavras, podem ser feitas "trocas silenciosas" na sequência de aminoácidos sem afectar a actividade da molécula como um todo. Por exemplo, tal como foi mostrado, a substituição de todos os resíduos de cisteína com resíduos de cisteína permite que a molécula de IL-6 modificada conserve a sua actividade biológica. Escolhas alternativas como substitutos para a cisteína são outros amino-ácidos neutros tais como valina, prolina, isoleucina e glicina, serina, treonina e tirosina. Resíduos carregados negativamente, tais como ácido aspártico e ácido glutimico, podem ser permutados, tal como podem serresíduos carregados positivamente, como lisina ou a rg i n i na . Res fduos hidrófobos, i ncl u i ndo tripto.fano , fenilalani-na, leucina, isoleucina, valina e alanina, também podem ser permutados. A alteração da sequência por adiçaõ, delecção ou substituição de aminoácidos, e a análise subsequente da molécula resultante para determinar se a actividade biológica está conservada, encontra-se bem dentro da capacidade de um especialista na matéria, sem necessidade de excessiva experimentação. A identidade da sequência do péptido ligante clivável também é uma questão de escolha e pode ser concluída utilizando meios químicos ou enzimiticos. A sequência empregue pode ser qualquer uma que possa ser clivada quimicamente, de modo que o péptido com a actividade biológica de IL-6 possa ser libertado do resto da proteína de fusão. Numa concretização preferida, a sequência clivável é uma que seja degradãvel enzímaticamente. Uma sequên cia susceptível ã colagenase não é mais do que um exemplo. Outros 70336 5053-060-11.8 - kl - sítios úteis incluem o sítio clivavel pelo Factor Xa ou pela ente-roquinase. Por exemplo, a enteroquinase cliva depois da lisina na sequência Asp-Asp-Asp-Lys. 0 Factor Xa é específico para um sítio tendo a sequência l1e-G1u-G1y-Arg, e cliva depois da argini-na. Outro sítio de clivagem útil ê o da trombina, a qual reconhece a sequência Leu-Va1-Pro-Arg-G1y-Ser-Pro. A trombina cliva entre os resíduos de Arg e de Gly. Outros sítios clivaveispor enzimas também serão reconhecidos pelos especialistas na matéria. Alternativamente, a sequência pode ser seleccíonada de modo a conter um sítio clivavel pelo brometo de cianogénio; o brometo de ciano-génio ataca os resíduos de metionina numa sequência peptídica. E preferível, embora não essencial, seleccionar uma sequência de ligante a qual, quando clivada, deixe um número mínimo de resíduos ligados ã sequência de IL-6, de modo que o terminal do péptido activo de ÍL-6 libertado seja tão próximo quanto possível da sequência nativa. Numa concretização particular, a porção activa de IL-6 está na extremidade do terminal carboxi da proteína de fusão, e o sítio de clivagem é específico para uma protease que é capaz de deixar a sequência peptídica natural do terminal amino pro-val-pro. Exemplos de tais sítios de clivagem são aqueles que são clivados pela enteroquínase ou pelo Factor Xa. A identidade da sequência do terceiro péptido pode também ser modificada. Esta porção da estrutura tripartida serve potencialmente dois objectivos: (1) a utilização de uma proteína correctamente seleccíonada, capaz de ser expressa no hospedeiro escolhido, pode colocar a produção de péptidos tendo actividade de IL-6 sob o controlo de um promotor forte, e desse modo facilitar a produção desses péptidos; e (2) pode fornecer um meio conveniente para identificação dos clones transformados produzindo a proteína de fusão. Por exemplo, na discussão fornecida acima, foi utilizada a sequência integral codificando para a j8-ga 1 actos i dase; esta proteína fornece um melo visual de detecção pela adição de um substracto adequado.

Alternativamente, a terceira porção peptídica pode ser uma fracção de uma tal proteína, desde que a porção remanescente

J 70336 5d5.3-Ct60.-i 18 - kk - ainda seja prontamente expressa pela célula hospedeira. Esta porção também pode ser um péptído, o qual não é necessariamente de-tectãvel visualmente, mas cuja presença pode ser detectãvel por outros meios, tais como por cálculo do peso molecular esperado da proteína de fusão ou por Inserção num vector com um marcador detectãvel. Uma outra sequência alternativa útil para utilização num hospedeiro procariota é o produto do gene trpE, ou uma porção do mesmo (Kleíd e colab, Science 214:1125-1129, 1981 ). Escolhas adicionais incluem sequências codificando para o gene cro do fago Á ou outras porções dos genes lac que não a sequência lacZ codificando para a β-ga1actosídase. Os especialistas na matéria reconhecerão escolhas adicionais que podem fornecer a base para a terceira porção peptíd.ica da proteína de fusão reivindicada.

5.10 CONSTRUÇÕES DE ADN ALTERNATIVAS

Os exemplos seguintes ilustram a preparação de construções de ADN nas quais as posições das primeira e terceira porções peptídicas das proteínas de fusão tripartidas estão invertidas. Também é ilustrada a utilização de ligantes e de terceiras porções peptídicas alternativas. A quantidade da produção da proteína de IL —6 utilizando esta construção é também elevada, variando desde cerca de 1-20¾ da proteína celular solúvel total. 5.10.1 TrpE - SÍTIO DE CLIVAGEM DA ENTEROQU[NASE--PROTEÍNA DE FUSÃO DE MUTEINA DE IL-6 (a) Uma proteína de fusão que codifica para a beta-Galac-tosidase, seguida por um sítio de clivagem enzimitica, imediatamente seguido por uma sequência do péptído de IL-6 sintético tendo as extremidades do terminal C e do terminal N do péptído de 1L-6 natural e todas as quatro císteínas substituídas por serinas, é expressa por um novo plasmídeo recombínante p-beta-Ga1/cflL-6. Para preparar o p-beta-Gal/cflL-6, o plasmídeo p365 - o qual foi descrito na secção 5.5 e na Figura 6 desta especificação - é digerido com os enzimas EcoRtL (para cortar o sítio de EcoRil que está localizado 14 bases a partir do sítio de Ncof. 5‘] e Rg 1 l l (para cor- - 45 - 70336 5Q53-Q6.Q-.118 tar o sítio de Bgl li que está representado na Figura 13 como Bgl II1), 0 piasnudeo é digerido com 5 unidades de cada um dos enzimas por 10 M-g de plasmídeo, a 37°C durante 2 horas. 0 fragmento de EcoR l.L/Bgl Li de 0,492 Kb é isolado por processos padrão tal como electro-eluiçlo. Este fragmento de 0,492 Kb é denominado sequência A. Esta sequência A e as sequências subsequentes anotadas no texto seguinte desta secção referem-se ãs ilustrações na Figura 12. (b) Uma alfquota adicional do plasmídeo p365 (aproxima-damente 10 ^g) é digerida com Hind MI e Bgl II, tal como descrito acima, a pH 7,5 num tampão de TrisHCl 25 mM, Mg C1^ 100mM, 10 mg/ml de BSA e BME 2 mM. 0 fragmento grande (3,0 Kb), que resulta do corte do sítio de Hind lil único e do sítio de Bgl II referido na Figura 13 como Bgl II', é denominado sequência B.

(c) Um o 1igonuc1eõtído de cadeia dupla sintético (sequên cia C) é preparado e ligado i sequência A e ã sequência B. 0 o 1i-gonucleótido inicia-se com a sobreposição dos sítios de Hind III e Bcl I, codifica para uma sequência de aminoãcidos contendo um sítio de clivagem da enteroquínase seguido imediatamente pelos pri meiros três aminoãcidos da tL-é natural, Pro-Val-Pro (PVP), e termina com um sítio de EcoR II. A sequência do o 1igonucleõtido é:

Bel l Sítio de EK.

5'AG CTT GAT CAG GCG GAT CCG GAA GGT GGT AGC GAC GAC GAC GAC AAA 3' A CTA GTC CGC CTA GGC CTT CCA CCA TCG CTG CTG CTG CTG TTT PVP 3'

CCG GTT CCG GGC CAA GGC GGT CC 5"

EcoRII

Cada cadeia do o 1igonuc1eõtido é preparada separadamente, tratada com polinucleõtido quinase em presença de ATPr 1mM num tampão de reacção adequado, a 37°C durante 30 minutos, e tratada por aquecimento a 85°C durante 5 minutos, seguido por arrefecimento lento até 25°C.

Para ligar a sequência C ãs sequências A e B, aproxima- 46

46 J 70336 5Q5.3-~0L6.Q-118 damente 1 ,/tg do fragmento de EcoR U/Bgl 11 de IL-6 sintético livre de cisteTna (sequência AÍ é co-precíp1tado com 2Q0 ng do o 1í-gonucleotído sintético (sequência C] e ligado ao componente do vector de Hind ΠΙ/Bgl ti (sequência B) do p365, A ligação é realizada num volume reacctonal de 2Q ^(.1 , contendo Tris HC1 2Q mM, pH 7,6, ATPr 0,5 mM, MgC^ 10 mM, DTT 5 mM, a 16°C durante toda a noite. 0 novo plasmídeo ê pABC. 0 pABC é clonado pela adição de uma alíquota de 5 /il da mistura reaccional i bactéria HB101 competente. As colónias resistentes a ampicilina são se 1eccionadas após incubação a 37°C durante toda a noite. (d) A extremidade 3‘ do gene de lL—6 recombinante sintética livre de cisteTna expressa no p365 é reconstruída para codificar para o terminal carboxí de !L-6 natural, o qual termina com met i on i na.

Para efectuar Isto, o o 1ígonucleõtido seguinte é sintetizado como acima:

5' GA TCT TTC AAA GAA TTC CTG CAG TCC TCC CTG CGT GCT CTG CGT 3' A AAG TTT CTT AAG GAC GTC AGG AGG GAC GTA CGA GAC GCA CAG ATG TAA TGA TAG GTA C 3' GTC TAC ATT ACT ATC 5'

Este o 1igonuc1eótido, lido da esquerda para a direita, inicia-se com um sítio de Bgl 11,. codifica para a sequência de aminoãcidos natural de IL-6 que se segue ao sítio de Bgl 11' do p365, e termina com um resíduo de metionina que é imediatamente seguido por três codões de paragem e um sítio de Κρη I (sequência D) . (e) 0 pABC (passo C) é digerido com Hind III e Bgl II (sequência E) (f) PATH23 (disponível a partir de A. Tzajaloff, Colum-bia University, New York City) é um plasmídeo de resistência ã ampicilina contendo um gene que codifica para os 337 aminoãcidos do terminal amíno do TrpE (componente l dasfntetase de antranilato) adjacente, e em quadro de leitura na sua extremidade 3' com um sítio de Hind lil contendo um polilígante. Pode ser encontrada uma - 47"- 70336 5053-060-118 descríção geral do operao de TrpE em Mil ler e Reznikoff, eds, The Operon, Cold Spring Harbor LaBoratory, pags. 263“302 (1978). Outras fontes de ADN que codifica para a totalidade ou parte de TrpE e lacZ estão prontamente disponíveis. As referidas outras fontes podem ser encontradas, por exemplo, em Pouwels e colab, Cloning Vectors, A Laboratory Manual, Elsevier, 1985. Por exemplo, as sequências de TrpE podem ser isoladas a partir de plasmídeos tendo os seguintes códigos de identificação no manual de Pouwe1s e colab: l-A-ii-3 (pDF4l e 42), l-A-iv-23 (pRK353), l-B-ii-4 (pMB L24), l-B-ii-1 (ptrpED5-l), l-D-r-3 (pEP70-pEP75) , e l-D-i-4 (pEP165 e pEP168). 10 μg de PATH23 são digeridos com 5 unidades de cada um de Hind III e de Κρη I, a 37°C durante 2 horas. 0 fragmento grande é isolado por cromatografia em gel, seguida por e1ectro-e1ui-ção e precipitação em etanol (sequência F). (g) Aproxímadamente 200 ng da sequência D são misturados com aproxi madamente 1 /tg da sequência E. A mistura resultante é co-precipitada com etanol em presença da sequência F e ligada tal como descrito acima. 0 fragmento resultante é denominado pTrpE/EK/cfIL-6. (h) Células-hospedeiras de E. Coli competentes são transformadas com pTrpE/EK/cfIL-6. Por exemplo, numa concretização é utilizada como céluja-hospedeira a estirpe de E. Coli HB101. As colónias resistentes ã ampicilina são reunidas. Estas colónias expressam uma proteína de fusão compreendendo um segmento de TrpE, um segmento de aminoãcidos reconhecido e clivado pela enteroquina-se, e a sequência de aminoãcidos de IL — 6 sintética livre de cisteí-na que tem os terminais em ambas as extremidades carboxi e amino do pêptido de IL—6 natural, iniciando-se com PVP e terminando com M.

5.10.2 PROTEÍNA DE FUSÃO DE MUTELNA DE IL-6 SINTÉTICA ISENTA DE CiSTEÍNA COM SÍTIO DE CLIVAGEM DE BETA-GALACTOSIDASE-EN-TEROQl) I NAS E í seguido o protocolo descrito na secção 5-10.1 para pro- 7(1336 5 Q 5 3-0 6Q-1Ί 8 - i»8 - duçio da proteína de fusão de rautetna de IL-6 sintética isenta de cisteína com um sítio de clivagem de enteroquina se, excepto por ο PATH23 ser substituído pelo vector pEx-1, 0 pEx-1 é digerido com BamHI e Kpn1. BamHI e Bell têm sítios de restrição compatíveis. A construção resultante contém um gene da j5-ga 1 actos i dase termo--induzido seguido por um poliligante de clonagem. 0 gene truncado produz um péptido que é aproximadamente 48 Kd da proteína de be-ta-ga1actosidase (Stanley, K.K. e Luzío, J.P, 1984, EMBO J, Vol . 3, pags. 1429-1434). A construção resultante é denominada ppgal/EK/ cflL-6. Outra fonte do ADN de beta-ga1actosida se inclui o pHg 2000 descrito no § 5.2.1. A proteína de fusão é produzida após transformação de células de E. Coli N4830 com o ppga1/EK/cfIL-6 e termo-indução. 0 plasmídeo é replicado na es.ti.rpe de E. Col i N 9 9. N99 e N4830 estão disponíveis a partir de Pharmacia. A proteína de fusão é clivada pela enteroquinase utilizando métodos conhecidos e utilizados na especialidade. Ê rotina clivar proteínas tendo um sítio de reconhecimento da enteroquinase com enteroquinase. Ver, por exemplo, Hoop e colab, Biotechno1ogy 6^1204-1210 (1988). 5.10.3 PROTEÍNAS DE FUSÃO COM SÍTIO DE CLIVAGEM D0 FACTOR Xa

Um sítio de enteroquinase é substituído por um sítio de Factor Xa por modificação do passo C da secção 5-10.1 e 2. 0 oli-gonucleõtido sintético (sequência C) apresentado no passo (C) da secção 5.10.1 compreende uma sequência de ADN que codifica para Asp.Asp.Asp.Asp.Lys. Esta sequência de ADN é modificada de modo a codificar para o sítio de reconhecimento da clivagem do factor Xa, I1e.G1u.G1y.Arg. A construção resultante é denominada pBgal/Xa/ cflL-6. Os plasmídeos pTrpE/EK/cf I L-6 e pjSga 1 /Xa/cf I L-6 são expressos tal como descrito no § 5.10.1 e § 5.10.2. As proteínas de fusão resultantes são clivadas com o factor Xa, o qual cliva depois da arg no seu sítio de reconhecimento por métodos conhecidos na especialidade. Ver, por exemplo, Nagal & Thogerson, Nature 309; 810-812 (1984).

J 70336 5Q53-.06.Q-J 18 - kS -

5.11 ENSAtOS DE ACT[V[PAPES DA PROTEÍNA StNTETiCA ISENTA DE C1STEÍNA 5.11.1 ENSA[0 DE ESTIMULAÇÃO DO HEPATÕCtTO Células de hepatona de ratazana FAZA 9é7 foram cultivadas em DMEM/F12 suplementado com 10¾ de NuSerum (Collaborative Research), penicilina e estreptomícI na. Os ensaios foram efectuados sobre monocamadas confluentes de um dia cultivadas em placas de 48 cavidades (Costar). Antes do tratamento com IL-6 recombinante livre de císteína, preparado de acordo com os processos descritos em §§ 5.2 a 5.8, e outros meios condicionados, as células foram la- 7 vadas com meio livre de soro contendo dexametasona .10 M. As células tratadas foram subsequentemente mantidas em meio livre de so-ro/dexametasona durante a duração do ensaio. As células foram incubadas em presença de tL-6 recombinante livre de císteína e outros meios condicionados durante cinco horas a 37°C num incubador de cultura de tecido. Após tratamento, os sobrenadantes das células foram removidos e armazenados a -20°C ou dírectamente analisados quanto ao fibrinogénío, como se segue. Foram preparadas diluições seriadas de duas vezes de sobrenadantes das células numa placa de microtitu 1 ação de 96 cavidades separada e manchadas sobre um filtro de nitroceiu1ose utilizando um aparelho de ponto-mancha (bio-Rad). Os níveis de fibrínogénio foram determinados por imuno ensaio ligado a enzima de fase solida. 0 fibrínogénio foi detecta-do utilizando uma diluição de 1:1000 de anti-soro policlonal de coelho antí~fibrinogénío de ratazana (obtido a partir de Dr. Ge-rald R. Crabtree, Stanford University). 0 anticorpo secundário era anti-soro anti-coelho de cabra conjugado com fosfatase alcalina purificado por afinidade (promega, Biotec). 0 anticorpo ligado foi visualizado pela adição de substractos de nitro-azul de tetrazólio (NBT) e sal de p-toluidina de fosfato de 5"bromo-4-c1 oro-indoί1 o.

Os controlos positivos consistiram em células tratadas com o sobre-nadante obtido a partir de fibroblastos MRC-5 estimulados com PMA. A quantificação do ensaio foi levada a cabo por densitometria laser de varrimento. 50 50 3 70336 5 Q 5-3-06.0-.11.8.

5.11.2 ENSAIO DA D tFERENC tΑζΤνΌ DAS' CÊLULAS-B O clone de células B murínas CH12.LX (N+, d+ LY-1+) foi cultivado e mantido em RPM f 1640 contendo 5¾ de soro de bovino fetal inactivado pelo calor, 300 ng/ml de glutamina, 2-mercapto-etanol 0,04 mM e antibióticos. As células CH12.LX apresentam IgM de superfície específica para a porção de fosfatidil colina de eritrócitos de carneiro (SRBC), 0 ensaio de diferenciação foi efectuado cultivando 2 x 10^ células B em presença ou na ausência de várias concentrações de IL-6 sintética livre de císteína, preparada de acordo com os processos descritos nos §§ 5.2 a 5.8, em 2 ml de meio de célula B em placas Costar de Zk cavidades. Os SRBC (ASA Biological Products, E i nston-Sa 1 em, NC) foram lavados três vezes com ÍRPMI 1640 antes da utilização; foram incluídos 1 x 10 eritrócitos em cada cultura de teste. Os controlos positivos consistiram em células B estimuladas por mitogénio, utilizando 50 ng/ml de 1ipopolissacãrido (difco). As culturas foram incubadas a 37°C numa atmosfera de CO2 a 5%· Foram determinadas as colónias formadoras de placa he-molítica directa (pfc) em culturas de CH12.LX.

5.11.3 ENSAIOS DE MEDULA OSSEA IN ViTRO A IL-6 sintética livre de císteína, preparada de acordo com os processos descritos nas secções 5*2 - 5·8, também apresentou utilidade terapêutica em análises i n v i t ro reconhecidas na especialidade. Os ensaios delta {j^) do efeito da IL-6, em células de medula óssea tratadas com f 1 uorouraci 1 oindicam que a IL-6 sintética livre de císteína tem boa actividade estimuladora sobre as células progenitoras. Encontra-se o protocolo para estes ensaios na Figura ]k. £ observada uma estimulação particularmente eficaz quando a IL-6 sintética livre de císteína é combinada com IL-1, e também quando estas duas citocinas são combinadas quer com M-CSF quer com IL-3. Encontra-se a apresentação tabular dos valores de ^ na Tabela 2; a representação gráfica dos ensaios de colónia de tempo 0 encontra-se na Figura 13· - 51 - - 51 -

70336 50.5.3-.06.0-] J.S.

5.11.4 ENSAIO DE 7TP1 DE MUTAÇÕES POR DELECÇÃO

Num ensaio de 7TD3 (Van Snick e colab, Proc. Natl. Acad. Scí. USA 8_3:9679“9683, 1986], 0 qual utílíza a proliferação de uma linha celular de hibrídona muríno dependente de IL-6 para quantificar a actívidade biológica, foram testadas virias delecções de resíduos de aminoicído da sequência de IL-6. A Tabela 3 apresenta estes resultados, expressos como actívidade em percentagem comparada com quantidades equímolares de IL-6 recombinante contendo cisteína (Amgen). As sequências de Γ L-6 testadas são todas contendo cistefna. 0 plasmídeo p478 ê uma construção de plasmídeo . idêntica ao plasmídeo p367, excepto que no p478» as cisteínas na sequência de IL-6 não foram substituídas. A fracção da proteína activa de IL-6 é o peptido.de IL-6 cortado da proteína de fusão (11 p478 cortado" na Tabela 2) com colagenase. Esta fracção peptí-dica é, portanto, para cada mutação por delecção testada, uma mistura de peptidos de IL-6 contendo cisteína tendo aminoácidos distintos adicionados a extremidade do terminal carboxi da sequência peptídica de IL-6·. Alem disso, as proteínas testadas são as próprias proteínas de fusão (11 p478 não cortado"). A proteína de fusão da sequência de IL-6 natural, contendo cisteína, do tipo selvagem, produzida pelo p478 ("478 não cortado"), conserva a actívidade biológica de IL-6 (3¾ de actívidade) quando comparada com o pépti-do de IL-6 contendo cisteína purificado ("478 cortado") que é produzido a partir dela. 0 péptido "478 cortado" é o padrão contra o qual as nove mutações por delecção são testadas e, como tal, é 100¾ activo neste teste. Assim, na Tabela 3, "478 cortado" refere--se ao plasmídeo do tipo selvagem expressando a proteína de fusão de IL-6 contendo cistefna que teve a IL-6 clivada a partir da proteína de fusão com colagenase, e "478 não cortado" refere-se, na Tabela 3, à proteína de fusão não cortada. 0 mutante 1AB é uma mutação por delecção produzida por delecção dos aminoácidos 4 até 23 no péptido de IL-6 contendo cisteína, onde met é o aminoicído número um da sequência do péptido para o péptido de IL-6 livre de cisteína análogo encontrado na Figura 8b. Os mutantes 2AB, 3AB, etc, referem-se todos ãs delecções de vinte aminoácidos correspondentes na posição apropriada na sequência, tal com estão identifi-

J 70336 5Q53“C[.6,Q-.11.8. - 52 - mar- cados na Tabela 3, na segunda coluna, os resíduos amínoãcido cados apagados. - 53 -

- 53 - J 70336 50 53-0 6.0-π.8. TA|ELAs2

Actlvidade de ActLvtdade SLnérgíca em Cultura Líquida

Estimulação de

Colónia em

Cultura Líquida

Meio IL-1 IL-6 IL-1 + IL-6 CSA de Léí tura Valor CSA de Lei tura Valor CSA de Lei tura Valor CSA de Leitura Valor G 0 G 5 G 7 G 149 Meio M 0 M 7 M 2 M 27 GM 0 GM 15 GM 4 GM 37 1L-3 0 IL-3 5 IL-3 1 IL-3 15 G 0 G 19 G 17 G 344 G-CSF M 0 M 7 M 3 M 65 (G) GM 0 GM 25 GM 7 GM 58 1L-3 0 tL-3 11 IL-3 4 IL-3 22 G 0 G 104 G 32 G 518 CS F-1 M 0 M 29 M , 2 M 97 (M) GM 0 GM 43 GM 9 GM 99 1L-3 0 tL-3 28 IL-3 3 IL-3 37 G 0 G 122 G 362 G 704 GM-CSF M 0 M 55 M 19 M 236 (GM) GM 0 GM 54 GM 53 GM 157 1L-3 0 IL-3 34 IL-3 37 IL-3 85 G 14 G 509 G 866 G 1.781 IL-3 M 15 M 208 M 136 M 675 GM 19 GM 129 GM 132 GM 415 1L-3 24 IL-3 102. IL-3 62 tL-3 313

J 70336 5Q5.3-a6.Q-118 - 54 -tabela_l

Nome do Mutante Resíduos de amínoac í do delecc íonados Actívidade em Ensaio de 7TD1 1AB 4-23 280¾ 2AB 24-43 0,001 3AB 44-63 0,0003 4ab 64-83 0,0003 5AB r^S o -=r oo 0,003 6AB 1 Q4-12 3 0 , Q06 7AB 124-143 (0,0000) 8AB 144-163 (0,0000) 9AB 164-183 (0,0000) 478 Cortado 100¾ 478 Não cortado 3¾ 55 70336

5Q53-Q6Q-118 6. ΕXEMP LOATE A_L S_E_M|TpD

6.1 CONDIÇÕES PARA DIGESTÃO COM ENZ[MA DE RESTRIÇÃO

Os enzimas foram obtidos a partir de fontes comerciais (new England Biolabs) e a digestão foi levada a cabo como recomendado pelo fabricante.

6.2 ESTIRPES BACTERI ANAS E PLASMfDEOS A E. Coli JM101 (P-L Pharmacia) foi transformada tal como descrito em Hanahan, 1983, J. Hol. Biol. 166:557· 0 plasmídeo pKK233-2 foi obtido a partir de P-L Pharmacia; o plasmídeo pBSt foi obtido a partir de Stratogene. Outras construções de plasmí-deo são tal como descritas neste pedido.

6.3 MONTAGEM DE 0LIGONUCLEÕTíDO

Os o 1igonuc1eõtidos foram sintetizados a partir de fos-foramiditos de CED e tetrazol de American Bionetics. Os oligonu-cleõtidos foram quinasados com po1inuc1eõtido quinase de TA, de acordo com as sugestões dos fabricantes (New England Biolabs). A quinase foi inactiva por aquecimento a 65°C. As misturas de oligo-nucleõtidos foram tratadas por aquecimento a 85°C durante 15 minutos, e lentamente- arrefecidas até ã temperatura ambiente. Os o1i — gonuc1eõtidos foram ligados com 10 U de ligase de TA; os produtos ligados foram separados sobre um gel de po1iacri1amida a 6%, e os fragmentos foram recuperados por electro-eluiçio.

6.A SEQUENC1AMENTO DO ADN A sequência do ADN dos fragmentos inseridos e os oligo-nucleõtidos foram determinados pelo mé.todo de terminação de cadeia de Sanger e colab, 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. 7A:5A63, incorporando as modificações de Biggen e colab, 1983? Proc. Natl. Acad. Sei. 8jQ:3963, Hattori e Sakakai, 1986, Anal. Biochem. 152:232, e Bankier e colab, 1988, Methods Enzymology, no prelo. - 56 - - 56 - i 70336 5tt53-.a6.a-J J.8.

6.5 ANÃLtSE DA MANCHA DE PROTEfNA

Amostras equivalentes a 50 /U de cultura de células foram passadas em geles de políacrί1amída -NaDodSO^ a 8¾ sob condições redutoras de acordo com Laeml11, 1970, Nature 227:680. As células foram quer coradas com azul de Coormasie ou electromancha-das sobre duas camadas de η 1 troceiu1ose a fim de ter manchas duplicadas do mesmo gel. Os marcadores de peso molecular pré-corados (BRL) foram utilizados para monitorizar a transferência. Após serem bloqueados com gelatina a 0,25%, as manchas foram incubadas com um anticorpo comercial para a β-ga1actosidase (Promega Bio-tech). As bandas de reacção cruzada foram visualizadas com anti--soro de cabra antí-igG de ratinho purificado por afinidade ligado a fosfatase (diluição de 1:7500, Promega Biotech), utilizando fosfato de bromo-c1 oro-íodoi1 o e nitro-azul de tetrazolio tal como recomendado pela Promega Biotech.

6.6 L1SE CELULAR E ENSAÍ0 DE TRI-HÍBRIDO A lise celular foi efectuada de acordo com Germino e colab, Proc. Natl. Acad. Sei. 1983 , 8^0:6848. As E. C o 1 i foram recolhidas por centrifugação, e as pelotas celulares foram suspensas em um quinto de volume de 0,05 mol/1 de Tris.HCl, pH8, 0,05 mo 1/1 de EDTA, 15% de sacarose.com lisozima dissolvida recentemente a 1 mg/ml . Após 15 minutos i temperatura .ambiente, os lisados foram congelados a -70°C, descongelados rapidamente a 37°C, e brevemente soniçado para cisalhar o ADN. A proteína de fusão tri-híbrida foi quantificada por ensaio co1 orimétrico para a actividade de β-ga1actosidase utilizando 0-n i t rof en i 1-β-D-ga 1 actop i ranos i do como substracto.

6.7 DIGESTÃO COM COLAGENASE DA PROTEÍNA DE FUSÃO

Antes da digestão da proteína de fusão, as actividades proteo1fticas não específicas na preparação de colagenase foram reduzidas por tratamento com benzoato de β-hidroximercúrio, de a-cordo com Lecroisey e colab, 1975, FEBS Lett. 5SU167· Uma unida- - 57 -

- 57 - J 70336 5053--0.6.0.-.11.8 de de colagenase de Acliromofcacter topEagus CEC 3t4 “ 24,8; Boeh-ringer Mannhejjn) foi dissolvida era 1QQ μ] de tampão contendo Tris--HC1 1Q0 mM, pH 7>4; NaCl 250 mH; CaC^ 1 mM e 40 yU.g/ml de benzo-ato de β-hídroxímercúrio. A colagenase dissolvida foi transferida para um tubo de polipropí1eno com silícone de 15 ml, e incubada ã temperatura ambiente durante 30 minutos. 0 extracto celular descongelado (4 ml ) foi sonicado brevemente para dispersar os agregados, adicionado i colagenase pré-tratada, e incubado durante 45 minutos ã temperatura ambiente. A maioria da β-ga1actosida-se clivada foi removida pela adição de 0,5 volumes de sulfato de amónio saturado, incubação em gelo durante 30 minutos e sedimentação do material insolúvel. A IL-6 recombínante sintética livre de cisteína clivada foi concentrada levando o volume total do so-brenadante até 13 ml com sulfato de amónio saturado, incubação em gelo durante 30 minutos e centrifugação para compactar a proteína insolúvel numa película flutuante. 0 líquido foi drenado por funcionamento do tubo, e a película remanescente foi ressus-pensa em 0,5 ml de solução salina tamponada com Tris.

7 * i^I^£k2i=IIIIMyLA£Ã0=DE=HEPATOC^TOS A IL-6 sintética livre de cisteína, preparada de acordo com os processos descritos nos §§ 5·2 a 5-8, estimula os hepatóci-tos tal como mostrado na Figura 11. A activídade de estimulação de hepatócitos foi detectada de acordo com o ensaio descrito no § 5*9*2, acima. A estimulação de hepatócitos exibida pela IL-6 sintética livre de cisteína ocorre em concentrações de 10 M, indicando uma activídade específica de IQ^U/mg de proteína. Esta acti-vidade é 100 vezes diferente da observada por May e colab, 1988, J. Biol. Chem. 263:7760. 0 nível da síntese de fibrinogénio observado nas nossas células FAZA é semelhante i resposta obtida utilizando meio condicionado em bruto obtido a partir de fibroblastos induzidos por PMA. Em concentrações superiores a 1 μΗ, o péptido causa uma diminuição do número de hepatõcitòs resultando numa diminuição do fibrinogénio detectivel. - 58 - 703.36 5053-.0.60-1 j.8 8 · I^I^yi=£l£IlM£iâ£i£=5I=c|Lylas=b O método maís sensível para avaliar a funcionalidade da proteína de IL-6 sintética livre de císteína, preparada de acordo com os processos descritos nos §§ 5*2 a 5.8, foi o ensaio da diferenciação de células B. Um ensaio de placa hemolítica avaliou a capacidade da IL-6 sintética para induzir a secreção de Ig em células B em repouso. 0 ensaio hemolítíco é superior para estudos de diferenciação e proliferação ao nível celular (Gronowicz e co-lab, 1976, Eur. J. Immunol. £:588). A nossa proteína teve uma concentração estimuladora máxima de cerca de 0,1 ng/ml (43 p) (ver Figura 12). Este valor e semelhante aos valores descritos noutros lugares para a lL-6 natural (Van Snick e colab, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. £3:9679; Brakenhoff e colab, 1987, J. Immunol. 139:4116; Poupart e colab, 1987, EMBO J. £:1219; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. £:133). Em concentrações acima de 43 pM, a 1L — 6 sintética livre de císteína pode causar uma diminuição no número de células B diferenciadas. a_açiivídade_biolOgiça

Três ensaio^ de actividades diferentes da proteína de IL-6 natural mostraram que a IL-6 livre de císteína conserva a ac-tividade biológica. 0 presente invento mostrou que é a sequência primária do péptido que i necessária para dobrar a cadeia peptídi-ca numa conformação activa.

As vacinas são muitas vezes formuladas e inoculadas em combinação com vários adjuvantes. Os adjuvantes auxiliam na obtenção de um nível de imunidade maís elevado e durável utilizando quantidades menores de antigénio ou menos doses do que se o imunogénio fosse administrado sozinho. 0 mecanismo de acção^Sdjuvante é complexo. Pode envolver a estimulação da produção de citocinas celulares (tais como a cítocina iL-6), fagocitose e outras actividades do sistema reticulo - endotelLai, assim como libertação e de- - 59 -

- 59 - J 70336 5a.53-Q6.a-l 18 gradação retardadas do antlgénlo. Exemplos de adjuvantes incluem o adjuvante de Freund (completo ou Incompleto], o Adjuvante 65 (contendo óleo de amendoim, mono-oleato de manítol e mono-estearato de alumínio], substâncias actlvas de superfície, como lisole-citína, pollois plurónicos, políaniões, péptidos, emulsões oleosas, e geles minerais comohidrõxido de alumínio ou fosfato de alumínio. 0 adjuvante de Freund já não é utilizado na formulação de vacinas para humanos porque contém um óleo mineral não metabolizã-vel e é um carclnogénio potencial.

Os péptidos semelhantes a IL-6 sintética purificados de acordo com o presente Invento podem ser adicionados is preparações das vacinas para modular uma resposta imune, isto é, para actuar como um adjuvante; isto incluí preparações das vacinas utilizadas para imunizar animais tais como ratinhos, cobaias, coelhos, galinhas, cavalos, cabras, ovelhas, vacas, chimpanzés, assim como outros primatas, e humanos. Os métodos de introdução da vacina com péptidos semelhantes a IL-6 como adjuvante, incluem a via oral, intradérmica, intramuscular, intraperítoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal ou qualquer outra via de âmunização. Os péptidos activos de IL-6 purificados podem ser utilizados como um anti-génio para imunização do hospedeiro e produção definitiva de anticorpos monoclonais específicos de IL-6. Tais anticorpos, por seu lado, podem ser utilizados como. inibídores da lL — 6 e, como tal, podem ser úteis no tratamento de certas condições nas quais foi implicada uma disfunção na produção de imunog1obu1inas. Isto inclui o tratamento de mieloma múltiplo, e doença auto-imune. Por exemplo, a injecção intra-articular destes anticorpos monoclonais poderia ser empregue no tratamento da artrite reumatóide. 0 péptido semelhante a IL-6 sintético purificado, quer da forma livre de cisteína quer da forma com cisteínas, está a-justado a uma concentração apropriada, formulada com quaisquer adições adequadas tais como outros péptidos de cítocina ou vacinas, e embalado para utilização. 0 péptido com actividade de lL — 6 também pode ser incorporado em .1 ísossomas para utilização como um adjuvante em formulações de vacinas ou como um produto farmacêuti-

J 70336 5053-06.0.-] 1.8 - 6α - co por ele próprio. 0 péptído sinté-tíco com actívidade de IL-6 também pode ser adicionado a anticorpos pri-formados que são fornecidos para imunoterapia passiva.

Numa concretização alternativa, os pêptidos purificados com actívidade de IL-6 podem ser utilizados como um produto farmacêutico ímuno-estímu 1ante; por exemplo, os pêptidos de IL-6 são úteis, na generalidade, para estimulação de células precursoras hematopoiéticas, e especia 1 mente para a estimulação da produção de anticorpos em imunodeficΓências causadas por doenças e induzidas por droga ou radiação. Como tal, os pêptidos são úteis no tratamento de doentes com StDA imunossup-r í mi dos. Também são úteis para a estimulação da produção de proteínas hepáticas na disfunção hepática. 0 péptído também pode ser utilizado como um reagente para a indução de anticorpos ín vitro, ou para modificar a expressão de outros factores de crescimento em cultura. Noutra concretização, os pêptidos purificados com actívidade de IL-6, preferivelmente em combinação com outros compostos anti-virais, podem ser utilizados para a prevenção e/ou o tratamento de doenças virais, incluindo HiV e HBV. Numa concretização alternativa, os pêptidos purificados com actívidade de tL-6 podem ser utilizados, sós ou em combinação com outras citocinas purificadas, para invocar a diferenciação terminal de células B em leucemias e outros estados de doença. Noutra concretização, o péptído semelhante a IL-6 sintético, quer da forma livre de císteína quer da forma contendo cisteínas, pode ser utilizado para induzir anticorpos que reconhecem qualquer porção do péptído.

1 0 . EXEMPL0;j:_|F|:l;T0=DA=iLI6_UyR^DI^Ç^STIÍNA=|=0UTR0S = FAÇT0RES MEDULA 0SSEA_lN_y,iyO_lENSAi_g_DELTAl É delineado um ensaio delta para determinar se existe ou não renovação de uma população altamente pro1íferatíva (HPP) em células precursoras de medula óssea (MO) que são estimuladas com vários factores de crescimento. Os ratinhos são tratados com -61-

-61- J 7 G 3-3 6 5a5.3-.Q.6.Q-l 18. 5-fluorouraci 1 o C5-FUl para remover as. células que são de baixo potencial proliferatlvo (LPP).

As células de HPP são incubadas numa primeira cultura de agarose semi-sólida durante 12 dias em presença de factores de crescimento. Os factores de crescimento u-tilizados incluem IL-1, IL-6 e uma mistura de 1:1 de IL-1 e IL-6. As células precursoras de HO são cultivadas em presença de cada um destes factores de crescimento na ausência de outros factores de crescimento, e em presença do factor de estimulação de colónias de granulõcitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factores de estimulação de colónias de macrófagos granulõcitos (GM-CSF), e t L-3. £ determinado o número de colónias estimuladas pelos factores de crescimento por um ensaio clonal em agarose de camada dupla e exibido na Figura 13, legendada "Ensaio de Colónia de Tempo 0". Esta figura mostra o total das unidades formadoras de colonias por 2,3 x 10 células de medula ossea de ratinho, 2k horas após os ratinhos serem tratados com 5~FU. As primeiras quatro barras mostram o efeito da IL-1, da IL-6 (livre de cisteína), e de uma mistura de 1:1 de IL-1 e IL-6 (livre de cisteína) sobre a actividade de estimulação de colónias na ausência de outros factores de crescimento. A série seguinte de quatro barras representa o efeito do G-CSF, só e em combinação com IL-1, IL-6 (livre de cisteína), e uma mistura de 1:1 de IL-1 e IL-6 (livre de cisteína), sobre a actividade de estimulação de colónias. As três séries seguintes de quatro barras cada representam a actividade de estimulação de colónias de M-CSF, GM-CSF, e IL-3, sós e com IL-1, IL-6 (livre de cisteína), e uma mistura de 1:1 de IL-1 e IL-6 (livre de cisteína). Os resultados mostram que IL-1, IL-6 (livre de cisteína), e uma combinação de IL-1 e IL-6 (livre de cisteína), estimulam a formação de colónias quando utilizadas em combinação com M-CSF, mais do que em combinação com IL-3, GM-CSF e G-CSF.

Num ensaio separado, as células de HPP são incubadas com os mesmos factores de crescimento e combinação, de factores de crescimento em cultura líquida. Após 7 dias é contado o número de células não aderentes, e os resultados estão ilustrados na Figura 14, legendada "Número de Células não-aderentes após 7 dias de Cultura - 62 - 703.36 5O5.3-CL6.0.-.11.8. Líquida". Esta figura mostra o número total de células não aderentes por ml. Cada uma das cinco séries de quatro barras tem o mes mo significado que a série correspondente na figura 1egendada"En-saio de Colónia de Tempo 0". 0 maior número de células não-aderentes é observado quando é utilizada uma mistura de IL-1 e IL-6 (livre de cisteína) em combinação com IL-3, GM-CSF e M-CSF.

As células da cultura líquida são lavadas e novamente cultivadas em presença dos factores de crescimento em agarose se-mi-sõlida, e submetidas a um segundo ensaio clonal em agarose de camada dupla. Este segundo ensaio clonal em agarose é denominado o ensaio de "leitura", E calculado um valor de Delta por divisão do número de colónias de medula Óssea no ensaio de leitura pelo número de colónias de medula óssea no Ensaio Clonal de Tempo 0. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Os dados do ensaio Delta descrevem quais dos factores de crescimento têm actívídade sinérgíca em cultura líquida quando vários factores são utilizados no ensaio de leitura. Quando é utilizado o meio sózínho em cultura líquida, a capacidade das citoci-nas adicionadas para facilitar a formação de colónias é IL-1 + IL-6 > IL-1 ou 1L-6. Esta preferencia de IL-1 + IL-6 sobre a capacidade de LL-1 ou IL-6 para actuar de forma sinêrgica com outros factores de crescimento é evidente quando são utilizados G-CSF, GM--CSF, M-CSF e IL-3 na cultura líquida. A sinergia é mais evidente quando é utilizado o G-CSF no ensaio de leitura. Quando são utilizados na cultura líquida 0 GM-CSF e a IL-3 em conjunto com IL-6 ou IL-1, a LL-6 causa um valor de Delta maior do que a IL-1. Contudo, quando é utilizado o CSF-1 em conjunto com IL-1 ou IL-6, a IL-1 causa um valor sinêrgico maior. Os melhores resultados no ensaio i n te i ro foram observados quando'. l.L-1 + IL-6 foram utilizados em conjunto com IL-3 no ensaio líquido e o G-CSF foi utilizado na leitura.

Estes dados sugerem que a IL-6 livre de cisteína, quando utilizada em conjunto com outros factores de crescimento, pode ser uma ferramenta importante no transplante de medula óssea e no tratamento do cancro. Um valor de Delta elevado indica que uma certa combinação de factores de crescimento produz crescimento e - 63 - - 63 -3 703365Q5.3-Q6.a-.n8 renovação de células, precursoras. Esta caracter fst 1 ca particular seria exigida num factor de crescimento que seria utilizado para estimular o crescimento e diferenciação de medula óssea in vivo. 1) Ratinhos BDF^ tratados com 150 mg/Kg de 5"f1uoroura-cilo (5-FU). 2) Matar os ratinhos, colher a medula óssea (MO) 2b horas após tratamento com 5-FU. 3) Lavar as células de MO com meio de IMDM com 20¾ de soro bovino fetal (FBS) e antibiótico (gentamicina) . 4) Cultivar as células num ensaio clonal em agarose de camada dupla:

Factores de crescimento em ÍMDM com 20¾ de FBS são colocados em placas de petri de 35 mm em agarose a 0,5¾. As células de MO são b adicionadas a uma cobertura numa concentração de 2,5 x 10 ate 2 x 10^ células de M0 em 0,5 ml por placa, isto e denominado um Ensaio Clonal de Tempo 0. Crescimento a 37°C sob 0^ a aproximada-mente 7¾ durante 12 dias. 5) As células de MO são cultivadas em 1 ml de cultura líquida (IMDM, 20¾ de FBS + antibiótico) em placas de cultura de 2b cavidades. As células são incubadas durante 7 dias partindo de 2,5 x 10"* célu1as/ml. 6) Após 7 dias de cultura líquida, as células de MO não aderentes são recolhidas. Os números de células são contados, são feitas preparações de citospína, e as células restantes são lavadas sobre 5 ml de FBS frio para remover todos os factores de cres c i mento. 7) As células são então diluídas 20 - 100 vezes e colocadas no ensaio clonal em agarose. Estas culturas são deixadas crescer a 37°C, em 0^ a 1% numa atmosfera completamente humidificada. Este ê denominado o Ensaio de Leitura. 8) 0 valor de Delta é calculado dividindo o número de colónias de M0 no Ensaio de Leitura pelo número de colónias de M0 no Ensaio Clonal de Tempo 0. 70336 5053-0-60.-] 18 - 6 k - 1 1 · i^|^Pk£l_00M^ARA£Ã0_Ç0M_0yTRA|_F0NTES ÇOM!RCJ_A^S_DE_J_L- 6_EM_ENSAIOS_DE_2tçL 2 A activídade híolõgica do péptido de IL-6 livre de cis-teína purificado a partir do produto de fusão induzido por células alojando o p3^7 foi comparada com a l L-6 contendo cistefna de fontes comerciais utilizando um ensaio de 71 d. 1 (Van Snick e co-lab, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8^:9679-9633, 1986). Estas fontes comerciais foram: Boehringer Mannheim (bm) a qual produziu uma lL-6 derivada de E Col i; Endogen que foi um produto não recombi-nante; e Genzyma que produziu uma IL-6 derivada de levedura. Quando o péptido sintético livre de cistefna em solução salina tam-ponada com fosfato purificado a partir de células contendo o p3β7 induzido foi comparado com a IL-6 de Boehringer Mannheim, a Boehringer apresentou actividade mais elevada a concentrações baixas e actividade menor a concentrações altas, tal como mostrado na Figura 17· A actividade máxima mais elevada foi alcançada utilizando a IL-6 sintética livre de cistefna. A comparação do péptido de IL-6 sintética livre de cistefna com a IL-6 de Endogen revelou que o péptido de iL-6 livre de cistefna tinha actividade superior sobre todas as concentrações analisadas (0,1 ng até 50 ng), como mostrado na Figura 16. A IL-6 si_ntética livre de cistefna também forneceu acti-vadade biológica mais elevada do que a IL-6 de Genzyme quando foram testadas concentrações entre 0,1 ng e 50 ng, tal como mostrado na Figura 18. 2|SÇRi£AO_DO_ENSMO_DE_ÇRESÇiMENXO_2l_Ztdi!.i

Este ensaio de 3>5 dias de duração foi realizado em placas de cultura de 96 cavidades. Os péptidos com actividade de IL--6 foram medidos em unidades de HGF onde 10Q unidades de HGF equivalem aproximadamente a 1 unidade de PCT-GF. Tipicamente, 2000 células da estirpe de 71d.1 são incubadas em câmaras altamente hu- - 65 -

- 65 - J 70336 50:5-3-0.6.0-11.8. mi dificadas de CO a 5% em 200 ul de meio contendo uma diluição do péptido exibindo actívidade de ÍL-6. Após 84 horas, as células são pulsadas durante 4 horas com o sal de tetrazolilo de brometo de 3-(4,5 dImeti1tIazol-2-M)-2,5"difen11formazano e os sobrena-dantes são então removidos após centrifugação a 1000 x g durante 5 minutos. Os cristais de formazano são dissolvidos com 100 ul de DMS0 e as placas são lidas a um comprimento de onda de 570 nm. A densidade õptica é proporcional ao numero de células vivas. A quantidade de IL-6 em unidades de HGF é definida como o recíproco da diluição necessária para originar 50% da densidade õptica máxima. BIA0 ENTES _D0_ENSAi0_D|=2tdil: 0 meio diluente ê RPM I 1640 com 10¾ de soro de vitelo fetal. 0 RPMi suplementado contém RPMI 1640 com 10¾ de soro de vitelo fetal, 2-mercaptoetanol 0,1 mM e 2x solução de antibiótico. 0 reagente de marcação é 5 mg/ml de MTT em PBS.

12. DEPOSITO DE MtCR00RGANISM0S

Os plasmídeos seguintes foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD em 29 de Novembro de 1988, e foram designados com os numeros de acesso indicados: P1asmídeo p 3 4 0 P367 pTrpE/EK/cfIL-6 pBgal/EK/cflL-6

Numero de Acesso ATCC 40516 ATCC 40517 ATCC..... ATCC..... 0 presente invento não está limitado em âmbito pelos plasmídeos depositados, dado que as concretizações depositadas se destinam a ser simples ilustrações de um aspecto do invento e quaisquer plasmídeos que sejam fune tona 1 mente equivalentes estão dentro do

J 70336 5Q5.3--.QAa-118. - 66 - âmbito deste invento. Na realidade, várias modificações do invento, além daquelas aqui apresentadas e descritas, se tornarão aparentes aos especialistas na matéria a partir da descrição anterior e dos desenhos acompanhantes. Taís modificações destinam-se a situarem-se dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Deverá também compreender-se que todos os números e tamanhos de pares de bases e resíduos de amínoácidos fornecidos para os nucleótidos e péptidos são aproximados e são utilizados para os fins da descrição.

Claims (113)

1. -67- 70 336 5053-060-118 REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de preparação de um gene recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína tri-híbrida sintética, tendo esta proteína tri-híbrida uma primeira porção peptídica, uma segunda porção peptídica e uma terceira porção proteica, a primeira porção peptídica tendo actividade de IL-6, a segunda porção peptídica compreendendo uma ligação peptídica clivável química ou enzimaticamente entre a primeira porção peptídica e a terceira porção proteica, a terceira porção proteica ou uma sua porção sendo capaz de ser expressa por uma célula hospedeira, caracterizado por se ligar uma sequência de ADN que codifica a primeira porção peptídica a uma sequência de ADN que codifica a segunda porção peptídica e por se ligar a primeira e segunda sequência de ADN a uma terceira sequência de ADN que codifica a terceira porção proteica.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica com actividade de IL-6 ser incapaz de formar ligações sulfidrilo.
3. 3 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender uma ligação peptídica que é reactiva em relação a uma enzima proteolítica.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender um sítio sensível à colagenase.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender um sítio sensível à enteroquinase.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender um sítio sensível ao Factor Xa.
7. 7 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a terceira porção proteica compreender uma sequência de 0-galactosidase ou uma sua porção. -68- 70 336 5053-060-118
8. 8 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a terceira porção proteica compreender um produto do gene TrpE.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à colagenase e por a terceira porção proteica compreender uma proteína com actividade enzimática de β-galactosidase.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à enteroquinase; e por a terceira porção proteica compreender uma proteína que é um produto do gene TrpE ou uma sua porção.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível ao Factor Xa> e por a terceira porção proteica compreender uma proteína que é um produto do gene TrpE ou uma sua porção.
12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à enteroquinase, e por a terceira porção proteica compreender uma sequência de β--galactosidase ou uma sua porção.
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível ao Factor Xaí e por a terceira porção proteica compreender uma sequência de β---galactosidase ou uma sua porção.
14. 14 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-13, caracterizado por a primeira porção peptídica, após -69- 70 336 5053-060-118 clivagem da segunda porção peptldica, não reter aminoácidos residuais da segunda porção peptldica.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido gene recombinante compreender uma sequência de ADN codificando a sequência de aminoácidos da IL-6 seguinte· 10 30 50 70 90 CCATGGGTGTACCACCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGCCGCTCACCTCTTCAGAACGAATCGATAAACAAA MiVPPSEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQI 110 130 ISO 170 TTCGGrACATCCTCGACGGGATATCAGCQCTGAGAAAAGAGACCAGCAACAAGAGTAACATGAGCGAAAGCAGTAAAGAAGCACTGGCAG RYILDGISALRKETiNKSNMAESSKEALAE 190 210 230 250 270 aaaacaacctgaaccttccsaagatgsctsaaaaagatggatcttttcaatctggattcaatigassaaacttctctqstgaaaatcatca NNLNLPKMAEKOGiFQSGFNEETALVKIIT 290 310 330 350 CAGGCCTTTTGGAATTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTCAGGAACAAGCGAGAQCTGTCCAGATGTCGA GLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMST 370 390 410 430 4S0 CCAAAGTCCTGATCCAGTTTCTGCAGAAAAAGSCAAAAAATCTAGATGCAATAACCACCXXSjATCCAACCACAAATGCGAGCCTGCTGA KVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLT 470 490 510 530 CGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTQGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGAGATCmTAAGGASTTOCTGCAGTCTAGCCTGA KLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLR 550 570 590 GAGCTCTTCGGCAAATGTCAGATCCTGGTCCTGTTGGTCCTGTTGSTCCTGCTGGTG ALRQMS DPGPVGPVG PAS * I-Ligante da calagéneo->
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido gene recombinante compreender uma sequência de ADN codificando a sequência de aminoácidos de IL-6 que se apresenta na reivindicação 15.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido gene recombinante compreender uma sequência de ADN codificando a sequência de aminoácidos de IL-6 que se apresenta na reivindicação 15.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado -70- 70 336 5053-060-118 por o referido gene recombinante compreender uma sequência de ADN codificando a sequência de aminoácidos de IL-6 que se apresenta na reivindicação 15.
19. 19 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 1, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura.
20. 20 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 2, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura.
21. 21 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 3, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura.
22. 22 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 4, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura.
23. 23 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 5, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura.
24. 24 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 6, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmideo, bacteriófago, vírus e levedura. 25 Processo de preparação de um vector recombinante, -71- 70 336 5053-060-118 caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 7, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
25. 26 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 8, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura. 27 ~ Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 9, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
26. 28 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 10, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
27. 29 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 11, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
28. 30 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 12, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
29. 31 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 13, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura. -72- 70 336 5053-060-118
30. 32 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizadò por compreender a inserção do gene, preparado de acordo com a reivindicação 14, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriofago, vírus e levedura.
31. 33 - Processo de preparação de um vector recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 32, caracterizadò por o vector recombinante preparado ser um plasmídeo.
32. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizadò por o plasmídeo ser seleccionado do grupo constituído por pTrpE/EKcfIL-6; p6Gal/EK/cfIL-6> pTrpE/Xa/cfIL--6; ou p6Gal/Xa/cfIL-6.
33. 35 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizadò por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 19.
34. 36 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizadò por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 20.
35. 37 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizadò por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 21.
36. 38 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizadò por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 22.
37. 39 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizadò por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 23.
38. 40 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular -73- 70 336 5053-060-118 transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 24.
39. 41 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 25.
40. 42 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 26.
41. 43 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 27.
42. 44 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 28.
43. 45 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 29.
44. 46 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 30.
45. 47 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 31.
46. 48 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo -74- 70 336 5053-060-118 com a reivindicação 32.
47. 49 - Processo de produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro unicelular adequado com o vector preparado de acordo com a reivindicação 33.
48. 50 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-49, caracterizado por o referido hospedeiro unicelular ser um procariota.
49. 51 - Processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por o referido hospedeiro unicelular ser uma bactéria.
50. 52 - Processo para a produção de um péptido com actividade de IL-6, caracterizado por compreender: (a) a cultura de um microrganismo hospedeiro unicelular contendo um gene recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando uma proteína tri-híbrida sintética, a qual tem uma primeira porção peptídica com actividade de IL-6, uma segunda porção peptídica que compreende uma ligação peptídica clivável quimicamente entre a primeira porção peptídica, e uma terceira porção proteica que é capaz de ser expressa pelo hospedeiro unicelular, sendo o referido gene capaz de ser replicado, transcrito e traduzido no hospedeiro; (b) a identificação de proteínas tripartidas produzidas pelo hospedeiro; (c) a clivagem química ou enzimática da segunda porção peptídica; e (d) a recuperação da primeira porção peptídica com actividade de IL-6.
51. 53 - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender uma ligação peptídica que é reactiva em relação a uma enzima proteolítica.
52. 54 - Processo de acordo com a reivindicação 53, 70 336 5053-060-118 -75- caracterizado por a segunda sensível à colagenase. porção peptídi ca compreender um sítio 55 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a segunda porção peptídica compreender um sítio sensível à enteroquinase. 56 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a segunda sensível ao Factor Xa. porção peptídi ca compreender um sítio 57 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a terceira porção proteica compreender uma sequência de JJ-galactosidase ou uma sua porção.
53. 58 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a terceira porção proteica compreender um produto do gene TrpE.
54. 59 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à colagenase, e por a terceira porção proteica compreender uma proteína com actividade enzimática de fl-galactosidase.
55. 60 - Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à enteroquinase, e por a terceira porção proteica compreender uma proteína que é um produto do gene TrpE ou uma sua porção.
56. 61 - Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível ao Factor Xa, e por a terceira porção proteica compreender uma proteína que é um produto do gene TrpE ou uma sua porção.
57. 62 - Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de -76- 70 336 5053-060-118 formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível à enteroquinase, e por a terceira porção proteica compreender uma sequência de fi--galactosidase ou uma sua porção.
58. 63 - Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a primeira porção peptídica ser incapaz de formar ligações sulfidrilo; por a segunda porção peptídica compreender um péptido que tem um sítio sensível ao Factor Xa» e por a terceira porção proteica compreender uma sequência de β--galactosidase ou uma sua porção.
59. 64 - Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a primeira porção peptídica, após clivagem da segunda porção peptídica, não reter aminoácidos residuais da segunda porção peptídica.
60. 65 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-64, caracterizado por a proteína tri-híbrida compreender, pelo menos, cerca de 20% da proteína total produzida pelo organismo hospedeiro.
61. 66 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-64, caracterizado por o organismo hospedeiro ser um procariota.
62. 67- Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado por o organismo hospedeiro ser uma bactéria.
63. 68 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por o hospedeiro ser uma bactéria.
64. 69 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-64, caracterizado por a primeira porção peptídica não ter ligações sulfidrilo.
65. 70 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-64, caracterizado por a primeira porção peptídica compreender a sequência de aminoácidos de IL-6 que se apresenta na reivindicação 15. 71 Processo de acordo com a reivindicação 70, -77- 70 336 5053-060-118 caracterizado por a proteína tri-híbrida compreender, pelo menos, cerca de 20% da proteína total produzida pelo organismo hospedeiro.
66. 72 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o plasmídeo recombinante ter o número de acesso ATCC 40516 (P340).
67. 73 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o plasmídeo recombinante ter o número de acesso ATCC 40517 (p367).
68. 74 - Processo de preparação de uma proteína recombinante substancialmente pura, compreendendo uma primeira porção peptídica com actividade de IL-6, uma segunda porção peptídica compreendendo um péptido clivável e uma terceira porção proteica capaz de ser expressa por um organismo hospedeiro escolhido, caracterizado por compreender a expressão de um gene codificando a referida proteína no organismo hospedeiro escolhido.
69. 75 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 1. num organismo hospedeiro escolhido. 76 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 2, num organismo hospedeiro escolhido. 77 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 3, num organismo hospedeiro escolhido. 78 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 4, num organismo hospedeiro escolhido.
70. 79 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado -78- 70 336 5053-060-118 de acordo com a reivindicação 5, num organismo hospedeiro escolhido.
71. 80 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 6, num organismo hospedeiro escolhido.
72. 81 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 7, num organismo hospedeiro escolhido.
73. 82 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 8, num organismo hospedeiro escolhido.
74. 83 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 9, num organismo hospedeiro escolhido.
75. 84 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 10, num organismo hospedeiro escolhido.
76. 85 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 11, num organismo hospedeiro escolhido.
77. 86 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 12, num organismo hospedeiro escolhido.
78. 87 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 13, num organismo hospedeiro escolhido. -79- -79- 1 61 121 181 241 301 361 421 481 540 70 336 5053-060-118
79. 88 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender a expressão de um gene, preparado de acordo com a reivindicação 14, num organismo hospedeiro escolhido.
80. 89 - Processo de preparação de uma proteína recombinante, de acordo com.' a reivindicação 74, caracterizado por a referida proteína ter a sequência de aminoácidos da IL-6 e do colagénio seguinte: ---------X---------+---------+---------+---------+---------+ 6Q GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ X20 GGCAGCCATCGGAAGCTGTGGATTGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 CGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATATAAACGGTTCTG ---------4.---------+---------+---------+---------+---------+ 240 GCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATAAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAAT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3 00 TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTATCGATTAAATAAGGAGGAA ----------+---------+---------+---------+---------+---------+ 36o TAACCATGGGTGTACCACCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGC MetGlyValProProGlyGluAspSerLysAspValAlaAlaProHisArgGlnP ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 CGCTCACCTCTTCAGAACGAATCGATAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGGATATCAG roLeuThrSerSerGluArglleAspLysGlnlleArgTyrlleLeuAspGlylleSerA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4 80 CGCTGAGAAAAGAGACCAGCAACAAGAGTAACATGAGCGAAAGCAGTAAAGAAGCACTGG laLeuArgLysGluThrSerAsnLysSerAsnMetSerGluSerSerLysGluAlaLeuA ------— —---———4.—— — — —-----—---- ---h CAGAAAACAACCTGAACCTTCCGAAGATGGCTGAAAAAGATGGATCTTTTCAATCTGGAT laGluAsnAsnLeuAsnLeuProLysMetAlaGluLysAspGlySerPheGlnSerGlyP -80-70 3365053-060-118 541. 601 661 721 781 841 901 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCAATGAGGAAACTTCTCTGGTGAAAATCATCACAGGCCTTTTGGAATTTGAGGTATACC heAsnGluGluThrSerLeuValLysIlelleThrGlyLeuLeuGluPheGluValTyrL ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCGAGAGCTGTCCAGATGT euGluTyrLeuGlnAsnArgPheGluSerSerGluGluGlnAlaArgAlaValGlnMetS ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CGACCAAAGTCCTGATCCAGTTTCTGCAGAAAAAGGCAAAAAATCTAGATGCAATAACCA erThrLysValLeuIleGlnPheLeuGlnLysLysAlaLysAsnLeuAspAlalleThrT ----------1----4----------+ CCCCGGATCCAACCACAAATGCGAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGC hrProAspProThrThrAsnAlaSerLeuLeuThrLysLeuGlnAlaGlnAsnGlnTrpL --——I — — — — — — — TGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGAGATCTTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCTAGCC euGlnAspMetThrThrHisLeuIleLeuArgSerPheLysGluPheLeuGlnSerSerL ---—--———+——————----1-——----'----Ϊ—---------h TGAGAGCTCTTCGGCAAATGTCAGATCCTGGTCCTGTTGGTCCTGTTGGTCCTGCTGGTG euArgAlaLeuArgGlnMetSerAspProGlyProValGlyProValGlyProAlaGlyA —-----—i----———+ CTTTTGGCCCAAGAGGTCTCGCTGGCCCACAAGGTCCACGTGGTGAGAAAGGTGAAGCTG laPheGlyProArgGlyLeuAlaGlyProGlnGlyProArgGlyGluLysGlyGluProG — — +---—— “ —— — — —“ \- GTGATÀAGGGACATAGAGGTCTGCCTGGCCTGAACGGACACAATGGATTGCAGGGTCTTC lyAspLysGlyHisArgGlyLeuProGlyLeuAsnGlyHisAsnGlyLeuGlnGlyLeuP ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTGGTCTTGCTGGCCAACATGGTGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACC roGlyLeuAlaGlyGlnHisGlyAspProValValLeuGlnArgArgAspTrpGluAsnP 600 660 720 780 840 900 960 1021 -81- 70 336 5053-060-118
81. 90 - Processo de preparação de uma proteína recombinante tendo actividade de IL-6, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 75-88.
82. 91 - Processo de preparação de uma proteína recombinante algumas tendo actividade de IL-6, contendo/cisteínas, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática das proteínas preparadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 75-88, não retendo, a referida proteína, aminoácidos residuais, derivados da segunda porção peptídica, após a clivagem.
83. 92 - Processo de preparação de um péptido sintético tendo actividade de IL-6 e sendo substancialmente solúvel em água, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 88.
84. 93 - Processo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado por o referido péptido ser incapaz de formar uma ligação sulfidrilo.
85. 94 - Processo de preparação de um péptido sintético tendo a sequência de aminoácidos de IL-6 apresentada na reivindicação 15, a referida sequência não contendo cisteínas ou qualquer sua porção homóloga, análoga ou activa, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 88.
86. 95 - Processo de preparação de um péptido sintético tendo a sequência de aminoácidos de IL-6 apresentada na reivindicação 15, a referida sequência não contendo cisteína, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 88, com delecção total ou parcial dos aminoácidos do ligante de colagénio.
87. 96 - Processo de preparação de um péptido sintético tendo a sequência de aminoácidos de IL-6 apresentada na reivindicação 15, a referida sequência não contendo cisteína, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína -82- 70 336 5053-060-118 preparada de acordo com qualquer das reivindicações 75 a 88, com delecção de todos os aminoácidos do ligante de colagénio e do resíduo serina ligando o colagénio à proteína IL-6.
88. 97 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 94 a 96, caracterizado por o referido péptido sintético conter prolina em vez de glicina como segundo aminoácido da sequência N--terminal.
89. 98 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 97, caracterizado por o referido péptido sintético estar desprovido da metionina inicial na sequência N-terminal.
90. 99 - Processo de preparação de um péptido sintético, caracterizado por compreender a delecção, substituição, inserção, inversão, adição ou recolocação de aminoácidos num péptido preparado de acordo com qualquer das reivindicações 94 a 98.
91. 100 - Processo de preparação de um péptido sintético, compreendendo a porção da sequência de aminoácidos da IL-6 nativa do aminoácido 29 ao aminoácido 212, a referida sequência contendo cisteína, caracterizado por compreender a clivagem química ou enzimática da proteína preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 88 e por o aminoácido 29 ser glicina em vez de prolina.
92. 101 - Processo de acordo com a reivindicação 100, caracterizado por o referido péptido sintético ter um resíduo inicial de metionina.
93. 102 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido gene recombinante compreender uma sequência de necleótidos que codifica o péptido sintético preparado de acordo com as reivindicações 92 a 101.
94. 103 - Processo de preparação de um vector caracterizado por compreender a inserção do gene recombinante preparado de acordo com a reivindicação 102, num vector seleccionado de entre os vectores de plasmídeo, bacteriofago, vírus e levedura.
95. 104 - Processo para a produção de um hospedeiro unicelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um -83- 70 336 5053-060-118 organismo hospedeiro com o gene recombinante preparado de acordo com a reivindicação 102.
96. 105 - Processo para a produção de um hospedeiro uniçelular transformado, caracterizado por compreender a transformação de um organismo hospedeiro com o vector preparado de acordo com a reivindicação 103.
97. 106 - Processo de preparação de uma formulação farmacêutica, caracterizado por compreender a associação de uma quantidade eficaz do péptido, preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 101, com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
98. 107 - Processo de acordo com a reivindicação 106, caracterizado por o péptido estar combinado com, pelo menos, um outro factor de crescimento de citoquina ou hematopoiético.
99. 108 - Processo de acordo com a reivindicação 107, caracterizado por o factor de crescimento de citoquina ou hemopoiético ser escolhido de entre sritropoietina, uma interleuquina e um factor de estimulação de colónias.
100. 109 - Processo de acordo com a reivindicação 107, caracterizado por a interleuquina ser IL-1, IL-2 ou IL-3 e por o factor de estimulação de colónias ser G-CSF, GM-CSF ou M-CSF.
101. 110 - Processo de acordo com a reivindicação 106, caracterizado por o péptido estar presente como um adjuvante, em combinação com uma quantidade eficaz de um antigénio protector.
102. 111 - Processo de preparação de um vector de ácido nucleico recombinante, caracterizado por compreender a ligação de uma primeira, segunda, terceira, quarta e quinta porções de uma sequência de ácido nucleico, a referida primeira porção da sequência de ácido nucleico codificando um promotor induzivel, segunda porção sendo uma sequência de minicistrão, a terceira porção sendo um sítio de clonação para inserção de um fragmento de ADN codificando uma proteína, desprovido de um codão de terminação, quarta porção sendo uma sequência de nucleótidos para um péptido clivável e a quinta porção sendo uma sequência de -84- 70 336 5053-060-118 nucleótidos para a β-galactosidase que está em cadeia com o péptido clivável codificado pela quarta porção; e na qual a sequência de ácido nucleico do sitio de clonação da terceira porção está fora de uma fase de leitura de tradução da quinta porção de /5-galactosidase.
103. 112 - Processo de acordo com a reivindicação 111, caracterizado por o referido vector de ácido nucleico recombinante compreender a sequência de ADN apresentada na reivindicação 89.
104. 113 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por o referido gene recombinante compreender uma sequência de ADN codificando um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 92 a 101.
105. 114 - Processo de preparação de um vector recombinante, caracterizado por compreender a inserção de um gene preparado de acordo com a reivindicação 113, num vector seleccionado de entre o grupo consistindo dos vectores de plasmídeo, bacteriófago, vírus e levedura.
106. 115 - Processo para a produção de um hospedeiro, caracterizado por compreender a transformação de um organismo hospedeiro com o vector preparado de acordo com a reivindicação 114.
107. 116 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido vector recombinante compreender o plasmídeo p340.
108. 117 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido vector recombinante compreender a sequência de ADN do mutante 1AB.
109. 118 - Processo de preparação de um péptido caracterizado por compreender a expressão da sequência de ADN do mutante 1AB.
110. 119 - Processo de preparação de uma sequência de ADN codificando um péptido tendo actividade de IL-6, caracterizado por compreender a delecção de nucleótidos da sequência de IL-6 nativa, de acordo com a sequência definida pelo mutante 1AB. -85- 70 336 5053-060-118
111. 120 - Processo de preparação de um péptido caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de ADN preparada de acordo com a reivindicação 119.
112. 121 - Processo de preparação de um péptido tendo actividade de IL-6, caracterizado por compreender a delecção dos aminoácidos 4-23, inclusivé, da sequência de IL-6 nativa.
113. 122 - Processo de preparação de uma sequência de ADN, caracterizado por compreender a delecção da sequência de ADN da IL-6 nativa, dos nucleótidos codificando os resíduos de aminoácidos 4 a 23, inclusivé. Lisboa, 30 t^'V.1989 Por THE TRUSTEES OF UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA e IMCLONE SYSTEMS, INC.