JPS62102157A - 抗体 - Google Patents
抗体Info
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- JPS62102157A JPS62102157A JP60241658A JP24165885A JPS62102157A JP S62102157 A JPS62102157 A JP S62102157A JP 60241658 A JP60241658 A JP 60241658A JP 24165885 A JP24165885 A JP 24165885A JP S62102157 A JPS62102157 A JP S62102157A
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- JP
- Japan
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- antibody
- peptide
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- antigen
- column
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は抗体に関し、更に詳しくは、ヒトＢリンパ球
を抗体産生細胞へ分化させる因子であると）Ｂ細胞分化
因子（以下ＢＣＤＦと称する）に対する抗体に関する。
を抗体産生細胞へ分化させる因子であると）Ｂ細胞分化
因子（以下ＢＣＤＦと称する）に対する抗体に関する。
このような抗体は、人の免疫機能の診断薬として使用で
きる。
きる。
従来の技術
化体内でＢ＄Ｉ胞が抗体産生を行なうに到る経路におい
て、Ｔ細胞から産生される蛋白性の因子によりＢ細胞が
活性化される必要がある。これら因子の中でＢ細胞の増
殖は促進せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化のみを誘
導する゛因子はＢＣＤＦと名付けられている（Ｔ、 Ｋ
ＩＳＨＩＭＯＴＯら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ
↓、１１７〜１２０．１９８３）。
て、Ｔ細胞から産生される蛋白性の因子によりＢ細胞が
活性化される必要がある。これら因子の中でＢ細胞の増
殖は促進せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化のみを誘
導する゛因子はＢＣＤＦと名付けられている（Ｔ、 Ｋ
ＩＳＨＩＭＯＴＯら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ
↓、１１７〜１２０．１９８３）。
人間が免疫機能を維持するためには、Ｔ細胞が適正な刺
激を受けてはじめて正常な形のＢＣＤＦを産生ずること
やＢ細胞がＢＣＤＦに正常に反応して抗体産生細胞へ分
化することが必要である。
激を受けてはじめて正常な形のＢＣＤＦを産生ずること
やＢ細胞がＢＣＤＦに正常に反応して抗体産生細胞へ分
化することが必要である。
たとえば自己免疫疾患のモデルであるＭＲＬ／ＡＰｒマ
ウスでは、Ｔ細胞が自発的にＢＣＤＦを−産生し続ける
ために自己免疫疾患が生ずることが病因の１つとされて
いる（Ｇ、Ｊ、ＰＲＵＤＨＯＭＭＥらＪ、 Ｂｘｐ、
Ｍｏｄ、 １５７． ７３０〜７４２．１９８３）。
ウスでは、Ｔ細胞が自発的にＢＣＤＦを−産生し続ける
ために自己免疫疾患が生ずることが病因の１つとされて
いる（Ｇ、Ｊ、ＰＲＵＤＨＯＭＭＥらＪ、 Ｂｘｐ、
Ｍｏｄ、 １５７． ７３０〜７４２．１９８３）。
人間の自己免疫疾患でも同様の病因が想定されている（
鈴木登ら、医学のあゆみ、１２５，５４９〜５５５．１
９８３）。このようにＢＣＤＦは人間の生命維持に重要
な働きをしており、ＢＣＤＦの産生や分子形体の異常は
重篤な疾病を引きおこす。
鈴木登ら、医学のあゆみ、１２５，５４９〜５５５．１
９８３）。このようにＢＣＤＦは人間の生命維持に重要
な働きをしており、ＢＣＤＦの産生や分子形体の異常は
重篤な疾病を引きおこす。
このようなりＣＤＦに対する抗体は、従って、ヒトの免
疫不全の診断に使用できる。
疫不全の診断に使用できる。
発明が解決しようとする問題点
この発明の目的は従って、ヒ）ＢＣＤＦに対する抗体を
得ることにある。ＢＣＤＦに対する抗体はヒトの免疫不
全の診断薬として使用できる。
得ることにある。ＢＣＤＦに対する抗体はヒトの免疫不
全の診断薬として使用できる。
問題を解決するための手段
このような状況下において、本発明者らは、ＢＣＤＦの
アミノ酸配列（以下「抗原ペプチド」と記す）を抗原と
してＢＣＤＦに対する抗体を得ることに成功した。
アミノ酸配列（以下「抗原ペプチド」と記す）を抗原と
してＢＣＤＦに対する抗体を得ることに成功した。
抗原ペプチド
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ 抗原ペプチドを用いて抗血清を得るには、抗原ペプチド
と適当なキャリヤー蛋白と結合せしめた後、抗原として
用いる。
ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ 抗原ペプチドを用いて抗血清を得るには、抗原ペプチド
と適当なキャリヤー蛋白と結合せしめた後、抗原として
用いる。
キャリヤー蛋白としては、キーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）、 ウシ血清アルブミン。
アニン（ＫＬＨ）、 ウシ血清アルブミン。
卵白アルブミン（ＯＶ Ａ）等従来知られているものの
いずれも使用できる。キャリヤー蛋白と抗原ペプチドと
を結合せしめる方法も、又、マレイミドを用いる方法（
Ｒ，ＪｕｌｉａｎらＡｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
いずれも使用できる。キャリヤー蛋白と抗原ペプチドと
を結合せしめる方法も、又、マレイミドを用いる方法（
Ｒ，ＪｕｌｉａｎらＡｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
１３２．６８ （１９８３）］及びグルタルアルデヒド
を用いる方法（Ｇ、 Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｐ
ｒｏｃ。
を用いる方法（Ｇ、 Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｐ
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ７７． ５１
９７ （１９８０）及び水溶性カルボジイミドを用いる
方法（Ｗ、 Ｇ：Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ８０゜２
８３４ （１９８３）） 、サクシンイミドを用いる方
法（Ｔ、 Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 ７９゜２３３ （１９７６）”）等
通常の方法を用いても特に支障はない。
９７ （１９８０）及び水溶性カルボジイミドを用いる
方法（Ｗ、 Ｇ：Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ８０゜２
８３４ （１９８３）） 、サクシンイミドを用いる方
法（Ｔ、 Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 ７９゜２３３ （１９７６）”）等
通常の方法を用いても特に支障はない。
キャリヤー蛋白と抗原ペプチドとの結合物を用いて、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も通常の方法でよい。
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も通常の方法でよい。
得られた抗血清より本発明の抗体を得る方法も従来知ら
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば採血後、抗血清を作成する。抗ペプチド活性の測定は
酵素免疫測定法（ＥＬ Ｉ ＳＡ）又はラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩ Ａ）にて行なう。
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば採血後、抗血清を作成する。抗ペプチド活性の測定は
酵素免疫測定法（ＥＬ Ｉ ＳＡ）又はラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩ Ａ）にて行なう。
抗血清゛の抗ヒ１−ＢＣＤＦ活性があるか否か判定する
には下記の方法を用いる。
には下記の方法を用いる。
まず抗原ペプチドを結合したカラムを用いて、抗ペプチ
ド抗体を特異的に吸着させて、精製抗ペプチド抗体を得
る。
ド抗体を特異的に吸着させて、精製抗ペプチド抗体を得
る。
さらに精製抗ペプチド抗体を結合したカラムに対するヒ
トＢＣＤＦの吸着を検出することにより抗ペプチド抗体
が抗ヒ１−ＢＣＤＦ活性を持つことを判定できる。（実
施例参照） あるいは上記のように免疫した動物のリンパ球とミエロ
ーマとを融合させ、本発明の抗体を特異的に産生ずるハ
イブリドーマを得、これによってモノクローナル抗体と
して、本発明の抗体を得ることもできる。
トＢＣＤＦの吸着を検出することにより抗ペプチド抗体
が抗ヒ１−ＢＣＤＦ活性を持つことを判定できる。（実
施例参照） あるいは上記のように免疫した動物のリンパ球とミエロ
ーマとを融合させ、本発明の抗体を特異的に産生ずるハ
イブリドーマを得、これによってモノクローナル抗体と
して、本発明の抗体を得ることもできる。
このようにして得られた免疫グロブリンは、以下のよう
な性質を有するものである。
な性質を有するものである。
１）免疫グロブリンの種類：１ｇＧ
２）分子量 ＝１５０×１０３ダルトン３）分子
吸光係数 ： Ｅｊ２． ２８０ｎｍ＝ １４．０４）
得られた抗体はヒ１−ＢＣＤＦ蛋白と結合する。
吸光係数 ： Ｅｊ２． ２８０ｎｍ＝ １４．０４）
得られた抗体はヒ１−ＢＣＤＦ蛋白と結合する。
作用
本発明の抗体は免疫不全症の診断薬として使用できるほ
か、免疫不全症の治療薬として使用できる可能性がある
。
か、免疫不全症の治療薬として使用できる可能性がある
。
実施例
実施例１
（１） Ｖ Ｔ −１１，、：よるＢＣＤＦの製造２
１容プラスチツクローラ培養器（ファルコン＃３０２７
）（以下ローラーと称する）中の１１の２０％ＦＣ３含
有ＲＰＭ１１６４０培地（，２ｍＭグルタミン、５ｘｌ
Ｏ−’、Ｍ ２ＭＢ、１００単位／ｍｌペニシリン、
１００μｇ／ｍβ ストレプトマイシン、２０μｇ ／
ｍ ｌ ゲンタマイシン、１６ ｍＭ Ｎ ａ
ＨＣＯｔを含有）に２Ｘ１０’／ｍｊ！細胞数にＶＴ−
１を接種し、８ ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃
で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集め
ＲＰＭ１１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２
ｊ２容ローラー中１１のＲＰＭ１１６４０培地にＩＸ１
’Ｏ’／ｍｊ！細胞濃度に懸濁した。ローラーを８ ｒ
ｐｍで回転させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後
培養物を遠心分離して、培養上清を得た。
１容プラスチツクローラ培養器（ファルコン＃３０２７
）（以下ローラーと称する）中の１１の２０％ＦＣ３含
有ＲＰＭ１１６４０培地（，２ｍＭグルタミン、５ｘｌ
Ｏ−’、Ｍ ２ＭＢ、１００単位／ｍｌペニシリン、
１００μｇ／ｍβ ストレプトマイシン、２０μｇ ／
ｍ ｌ ゲンタマイシン、１６ ｍＭ Ｎ ａ
ＨＣＯｔを含有）に２Ｘ１０’／ｍｊ！細胞数にＶＴ−
１を接種し、８ ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃
で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集め
ＲＰＭ１１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２
ｊ２容ローラー中１１のＲＰＭ１１６４０培地にＩＸ１
’Ｏ’／ｍｊ！細胞濃度に懸濁した。ローラーを８ ｒ
ｐｍで回転させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後
培養物を遠心分離して、培養上清を得た。
上述のように、ＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞
上清Ｉｏｎを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃｄの圧力
をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１ ００ｍｌの濃
縮液をさらに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着
した限外濾過装置（アミコン、スタンダードセル５２型
）を用い窒素ガスにより４ ｋｇ ／ ａＪの圧力をか
けて濾過した。濾過膜上部に残った５ｍｌの濃縮液を採
取した。
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞
上清Ｉｏｎを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃｄの圧力
をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１ ００ｍｌの濃
縮液をさらに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着
した限外濾過装置（アミコン、スタンダードセル５２型
）を用い窒素ガスにより４ ｋｇ ／ ａＪの圧力をか
けて濾過した。濾過膜上部に残った５ｍｌの濃縮液を採
取した。
上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、Ｓｗｅｄｅｎ、、 ２．６
Ｘ ９０ ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムを
あらかじめＰＢＳ （ホスフェート・バッファーセイラ
イン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェート・
パンファー、ｐ Ｈ７，０）で平衡化した。濃縮上清を
ＰＢＳで溶出し、溶出液を５ ｍ ｌずつ分取し、分取
液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する分
画は分子量（３，５±０．５Ｘ１０’ダルトンに相当す
るフラクションにＢＣＤＦが含まれていることがわかっ
た。ゲル濾過カラムは次の分子量マーカーで検定した。
ＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、Ｓｗｅｄｅｎ、、 ２．６
Ｘ ９０ ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムを
あらかじめＰＢＳ （ホスフェート・バッファーセイラ
イン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェート・
パンファー、ｐ Ｈ７，０）で平衡化した。濃縮上清を
ＰＢＳで溶出し、溶出液を５ ｍ ｌずつ分取し、分取
液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する分
画は分子量（３，５±０．５Ｘ１０’ダルトンに相当す
るフラクションにＢＣＤＦが含まれていることがわかっ
た。ゲル濾過カラムは次の分子量マーカーで検定した。
ブルーデキストラン２０００ （ファルマシア・ファ
インケミカルス、スウェーデン）２Ｘ１０ｂ％フェリチ
ン４．５×１０’、 フルＶラ−Ｍ１．５８ Ｘ １０
’、オブ７）Ｌｉブミン４．５ｘｌＯ’、キモトリプシ
ノーゲン２．５×１０４、チトクロームＣ１，１７ｘｌ
Ｏ’また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾
過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置を
用いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）
に置換した。
インケミカルス、スウェーデン）２Ｘ１０ｂ％フェリチ
ン４．５×１０’、 フルＶラ−Ｍ１．５８ Ｘ １０
’、オブ７）Ｌｉブミン４．５ｘｌＯ’、キモトリプシ
ノーゲン２．５×１０４、チトクロームＣ１，１７ｘｌ
Ｏ’また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾
過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置を
用いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）
に置換した。
クロマトフオーカシング
ＡＣＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎ。
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎ。
Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩衝液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４
０ ｍ ｉｔの１／１０希釈ポリバツフアー７４ （
ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）で
溶出した。カラム操作はファースト・プロティン・リキ
ッド・クロマトグラフィ＋、ＦＰＬＣ（ファルマシア・
ファインケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎
分０．５ ｍ ｌで行なった。溶出液を１ｍｌずつ分取
し、ＢＣＤＦ活性とｐ Ｈを測定した。ＢＣＤＦ活性は
ｐ Ｈ４，９〜５．１の位置に溶出された。
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩衝液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４
０ ｍ ｉｔの１／１０希釈ポリバツフアー７４ （
ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）で
溶出した。カラム操作はファースト・プロティン・リキ
ッド・クロマトグラフィ＋、ＦＰＬＣ（ファルマシア・
ファインケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎
分０．５ ｍ ｌで行なった。溶出液を１ｍｌずつ分取
し、ＢＣＤＦ活性とｐ Ｈを測定した。ＢＣＤＦ活性は
ｐ Ｈ４，９〜５．１の位置に溶出された。
Ｍｏｎｏ Ｐカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１
％ ＴＦＡ （１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラムＰｒ。
％ ＴＦＡ （１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラムＰｒ。
ＲＰＣＨＲ５／１０ （ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ）にかけ、溶出液、００１％ ＴＦＡ中のアセ
トニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢ
ＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出
される。Ｏ，Ｄ、 ２１１０のピークは他のＯ，Ｄ、、
、。のピークとは完全に分離しており、このピークに対
応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾
燥して精製ＢＣＤＦを得た。
ミカルズ）にかけ、溶出液、００１％ ＴＦＡ中のアセ
トニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢ
ＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出
される。Ｏ，Ｄ、 ２１１０のピークは他のＯ，Ｄ、、
、。のピークとは完全に分離しており、このピークに対
応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾
燥して精製ＢＣＤＦを得た。
ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために６μｇの
精製ＢＣＤＦをプロティン・セクエンサ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、、 Ｃａ１ｆ、 Ｍ
ｏｄｅｌ ４７０Ａ）に導入した。アミノ酸配列の決定
方法はＪ、 Ｂｉｏｌ。
精製ＢＣＤＦをプロティン・セクエンサ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、、 Ｃａ１ｆ、 Ｍ
ｏｄｅｌ ４７０Ａ）に導入した。アミノ酸配列の決定
方法はＪ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、１９３．２６５〜２７５ （１９５１）に
記載されている方法により行なった。
記載されている方法により行なった。
Ｎ−末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ ＶａｌＡｌａ Ａｌａ
・・ （２） 抗原蛋白の調製 ＢＣＤＦの部分構造決定より得たアミノ酸配列に従って
、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾
１ａなる抗原ペプチドを合成した。
ｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ ＶａｌＡｌａ Ａｌａ
・・ （２） 抗原蛋白の調製 ＢＣＤＦの部分構造決定より得たアミノ酸配列に従って
、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾
１ａなる抗原ペプチドを合成した。
本ペプチドの合成はベックマン社９９０Ｂ自動ペプチド
合成装置を用い固相法で行なった。
合成装置を用い固相法で行なった。
合成されたペプチドを、７５％フン化水素／２５％アニ
ソール中で３０分間Ｏ℃で加温することにより樹脂から
脱離した。合成されたペプチドは、ｓｐ−セファデック
スカラム（２，５ｃｏ＋Ｘ５０ｃｍ） （０，０５Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐ Ｈ７，０及び１ｍＭジチオスラ
イトールと平衡化）に吸着させた。５００ｍｌ！の同緩
衝液と、０，５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ｍＭジチオス
ライドールｐＨ７，０，５００ｍｇのグラジェントで目
的のペプチドを分画精製した。各両分をフルオロレスカ
ミンでペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃
縮した。３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１
０カラム（Ｉ ＱｃｍＸ ５０ｃｍ）に上記濃縮液を加
え蛋白画分を集めた。得られたペプチド画分を濃縮乾固
した。ペプチドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ
塩酸で１２０℃１晩の加水分解により調べた。加水分解
物はアミノ酸アナライザーを用いて測定した。
ソール中で３０分間Ｏ℃で加温することにより樹脂から
脱離した。合成されたペプチドは、ｓｐ−セファデック
スカラム（２，５ｃｏ＋Ｘ５０ｃｍ） （０，０５Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐ Ｈ７，０及び１ｍＭジチオスラ
イトールと平衡化）に吸着させた。５００ｍｌ！の同緩
衝液と、０，５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ｍＭジチオス
ライドールｐＨ７，０，５００ｍｇのグラジェントで目
的のペプチドを分画精製した。各両分をフルオロレスカ
ミンでペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃
縮した。３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１
０カラム（Ｉ ＱｃｍＸ ５０ｃｍ）に上記濃縮液を加
え蛋白画分を集めた。得られたペプチド画分を濃縮乾固
した。ペプチドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ
塩酸で１２０℃１晩の加水分解により調べた。加水分解
物はアミノ酸アナライザーを用いて測定した。
ペプチドのアミノ酸組成は以下の通りであった。
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａこのペプチドにキャリヤー
蛋白を以下のように付加させた。
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａこのペプチドにキャリヤー
蛋白を以下のように付加させた。
１）ＳＨ基導入ペプチドの作製ＣＲ，ＪｕｌｉａｎらＡ
ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３２． ６８ （１
９８３） ）ペプチド２■を０．５ ｍ ｌの１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４−ＮａｚＨＰＯ４
バッファーｐ Ｈ７，５に溶解し、ＬＯｔｔｌのｄｉｍ
ｅｔｙｌ ｆｏｒｍａｍｉｄｅに溶解した１、２■のＳ
Ａ Ｔ Ａ （Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｄｙｌＳ−ａｃｅ
ｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａＬｅ）を混合し、室温で１０
分攪拌した。１００．ｃｉ！の３６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１ｐＨ７，８を加えて反応を停止した。反応液を
０．１％ Ｔ Ｆ Ａ （Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ
ｉｃ Ａｃ１ｄ）水溶液で緩衝化したＣ１逆層カラーム
（バイオラド）に注入し、０．１％ＴＦＡアセトニトリ
ルの０〜１５％の直線的濃度自記により溶出した。流速
は１．５ｍｆｆ／分とした。ペプチド−３ＡＴＡ結合画
分を集め減圧乾固した。これをＱ、５ｍ４の０．０５
ＭＫ Ｈ２Ｐ Ｏ。
ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３２． ６８ （１
９８３） ）ペプチド２■を０．５ ｍ ｌの１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４−ＮａｚＨＰＯ４
バッファーｐ Ｈ７，５に溶解し、ＬＯｔｔｌのｄｉｍ
ｅｔｙｌ ｆｏｒｍａｍｉｄｅに溶解した１、２■のＳ
Ａ Ｔ Ａ （Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｄｙｌＳ−ａｃｅ
ｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａＬｅ）を混合し、室温で１０
分攪拌した。１００．ｃｉ！の３６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１ｐＨ７，８を加えて反応を停止した。反応液を
０．１％ Ｔ Ｆ Ａ （Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ
ｉｃ Ａｃ１ｄ）水溶液で緩衝化したＣ１逆層カラーム
（バイオラド）に注入し、０．１％ＴＦＡアセトニトリ
ルの０〜１５％の直線的濃度自記により溶出した。流速
は１．５ｍｆｆ／分とした。ペプチド−３ＡＴＡ結合画
分を集め減圧乾固した。これをＱ、５ｍ４の０．０５
ＭＫ Ｈ２Ｐ Ｏ。
Ｎ ａ ｚ ＨＰ Ｏ４バッファーｐＨ７，５に溶解し
、５０ｍ１のｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ溶液（５００ｍ
Ｍｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ、 ２５ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ ＡをＮ ａ
ｚ ＨＰ Ｏａでｐ Ｈ７，５に調整した）を加えて、
室温で１時間攪拌した。
、５０ｍ１のｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ溶液（５００ｍ
Ｍｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ、 ２５ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ ＡをＮ ａ
ｚ ＨＰ Ｏａでｐ Ｈ７，５に調整した）を加えて、
室温で１時間攪拌した。
ｉｉ）マレイミド基導入オブアルプミンの作製（Ｓ、
Ｈａｓ’ｈｉｄａら、Ｊ、 Ａｐｐｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ６． ５６３．４ｍｇのＯＶＡを含む３００μｌ
の０．１ Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，０と
０．８７ｍｇのＣＭ Ｂ Ｓ （Ｎ −Ｔ −Ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）
を含む３０μｌのＤＭＦ （ジメチルホルムアミド）を
混合し、３０℃で３０分攪拌した。反応液を０．１Ｍ
リン酸ナトリウムバッファーｐＨ６，０で緩衝化したＰ
Ｄ−１０カラムでゲル濾過しマレイミド基導入オブアル
ブミン分画を得た。
Ｈａｓ’ｈｉｄａら、Ｊ、 Ａｐｐｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ６． ５６３．４ｍｇのＯＶＡを含む３００μｌ
の０．１ Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，０と
０．８７ｍｇのＣＭ Ｂ Ｓ （Ｎ −Ｔ −Ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）
を含む３０μｌのＤＭＦ （ジメチルホルムアミド）を
混合し、３０℃で３０分攪拌した。反応液を０．１Ｍ
リン酸ナトリウムバッファーｐＨ６，０で緩衝化したＰ
Ｄ−１０カラムでゲル濾過しマレイミド基導入オブアル
ブミン分画を得た。
ｉｉｉ ）マレイミド−ＯＶＡ分画（約１ｍｊりとＳＨ
−ペプチド溶液（５５０μＩりを０．１ Ｍリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ６，８）中にて反応（４℃。
−ペプチド溶液（５５０μＩりを０．１ Ｍリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ６，８）中にて反応（４℃。
２０時間）後、反応液をセファデックスＧ−２５を用い
てカラムクロマトグラフィーを行って、ＯＶＡと抗原ペ
プチドとの結合物を得た。
てカラムクロマトグラフィーを行って、ＯＶＡと抗原ペ
プチドとの結合物を得た。
（３） 抗体の調製
得られたキャリアーとペプチド結合物７００μｇをフロ
イントの完全アジュバントと共にウサギの指軍部に注射
した。以後７日間隔で３回キャリアー・ペプチド結合物
７００μｇをフロイントの不完全アジュバントと共にウ
サギの背皮下に免疫した。
イントの完全アジュバントと共にウサギの指軍部に注射
した。以後７日間隔で３回キャリアー・ペプチド結合物
７００μｇをフロイントの不完全アジュバントと共にウ
サギの背皮下に免疫した。
最終免疫の後１０日ロー採血し血清を得た。血清を遠心
（１００００Ｘｇ、５分）した上清に飽和硫安溶液（ｐ
Ｈ７，４）を加えて５０％飽和とした。
（１００００Ｘｇ、５分）した上清に飽和硫安溶液（ｐ
Ｈ７，４）を加えて５０％飽和とした。
−晩水冷下で攪拌した後、ＩＱＯＯＯＸｇにて５分間遠
心し、沈澱物を得た。沈澱物を蒸留水に溶かし、２００
倍量の０．１５ＭＮａＣ１に対し、３６時間透析した。
心し、沈澱物を得た。沈澱物を蒸留水に溶かし、２００
倍量の０．１５ＭＮａＣ１に対し、３６時間透析した。
得られた抗血清’１ｍ１ｌを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２＞で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワット
マンＤＥ３２）カラム（１ｃｍ Ｘ ｌ ５ ｃｌＢ）
に添加した。免疫グロブリンＩｇＧ画分は素通りして溶
出されるので、この両分を回収した。’１ｍｌの抗血清
から２４■のＩｇＧが得られた。集めたＩｇＧを０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に透析した。
Ｈ７，２＞で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワット
マンＤＥ３２）カラム（１ｃｍ Ｘ ｌ ５ ｃｌＢ）
に添加した。免疫グロブリンＩｇＧ画分は素通りして溶
出されるので、この両分を回収した。’１ｍｌの抗血清
から２４■のＩｇＧが得られた。集めたＩｇＧを０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に透析した。
次にキャリヤー蛋白に用いたＯＶＡに対する抗体を除去
するため、キャリヤー蛋白−結合セファロース４Ｂカラ
ムを用いてキャリヤー蛋白抗体を結合させた。すなわち
、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア製
１７−０４３１−０１）０．５ｇを０．１ Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，０）５ｍｊ！に投入し、ただちに、０ＶＡ
２５■を加え、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セフ１０−ス４Ｂを
Ｑ、５ａａＸ２０ｃｍＯカラムにつめ、このカラムにＩ
ｇＧ画分画分２壱ｌせた。洗浄用緩衝液（０，１５ＭＮ
ａＣ１１０，０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０
）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をすべて集めた
。
するため、キャリヤー蛋白−結合セファロース４Ｂカラ
ムを用いてキャリヤー蛋白抗体を結合させた。すなわち
、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア製
１７−０４３１−０１）０．５ｇを０．１ Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，０）５ｍｊ！に投入し、ただちに、０ＶＡ
２５■を加え、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セフ１０−ス４Ｂを
Ｑ、５ａａＸ２０ｃｍＯカラムにつめ、このカラムにＩ
ｇＧ画分画分２壱ｌせた。洗浄用緩衝液（０，１５ＭＮ
ａＣ１１０，０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０
）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をすべて集めた
。
得られたＩｇＧはさらにペプチドを結合させたアフィー
ゲル力ラム（バイオラド）で精製した。このペプチド結
合アフィーゲルカラム（０，５ｃｍｘ２０ｃｍ）に上記
で得られたＩ’ｇＧ画分をのせ、洗浄用緩衝液（０，１
５ＭＮａ（１！１０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ８，０）で十分洗浄し、３Ｍでカラムに吸着した抗ペ
プチド抗体を溶出させた。
ゲル力ラム（バイオラド）で精製した。このペプチド結
合アフィーゲルカラム（０，５ｃｍｘ２０ｃｍ）に上記
で得られたＩ’ｇＧ画分をのせ、洗浄用緩衝液（０，１
５ＭＮａ（１！１０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ８，０）で十分洗浄し、３Ｍでカラムに吸着した抗ペ
プチド抗体を溶出させた。
集めた溶出液を０．１５ＭＮａＣ／に対して透析し、限
外濾過で濃縮した。このようにして１０■の精製抗体を
得た。
外濾過で濃縮した。このようにして１０■の精製抗体を
得た。
（４）抗ＢＣＤＦ抗体の性質
（４） −１ＩｇＧであることの証明
精製した抗ＢＣＤＦ抗体がＩｇＧクラスであることは、
抗体のクラス別に作成された抗１ｇ抗体で免疫沈降する
かどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩｇＧ抗体（
カンベル社製ｍ０２１２−０１２４）、抗つサギＩｇＭ
抗体（カッペル社製Ｎａ０２１２−０２１０）、抗ウサ
ギＩ ｇＡ＋ Ｉ ｇＭ十ｌ−ｇＧ抗体（カッペル社製
１１ｈ０２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。方
法はオフタロニー法を用いた。すなわち、１％の寒天中
にあけた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、まわ
りの穴には抗体に対して１／２０量から２倍づつ希釈し
た精製抗ペプチド抗体を入れる。０℃で１晩放置後形成
された沈降線を観察した所、精製抗ペプチド抗体は抗ゲ
サギＩｇＧ抗体及び抗ウサギＩ ｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ
抗体とのみ沈降したことがらＩｇＧであると確認できた
。
抗体のクラス別に作成された抗１ｇ抗体で免疫沈降する
かどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩｇＧ抗体（
カンベル社製ｍ０２１２−０１２４）、抗つサギＩｇＭ
抗体（カッペル社製Ｎａ０２１２−０２１０）、抗ウサ
ギＩ ｇＡ＋ Ｉ ｇＭ十ｌ−ｇＧ抗体（カッペル社製
１１ｈ０２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。方
法はオフタロニー法を用いた。すなわち、１％の寒天中
にあけた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、まわ
りの穴には抗体に対して１／２０量から２倍づつ希釈し
た精製抗ペプチド抗体を入れる。０℃で１晩放置後形成
された沈降線を観察した所、精製抗ペプチド抗体は抗ゲ
サギＩｇＧ抗体及び抗ウサギＩ ｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ
抗体とのみ沈降したことがらＩｇＧであると確認できた
。
←ツー２ 分子量
精製した抗ペプチド抗体の分子量はセファデックスＧ−
１００を用いるゲル濾過法により求めた。
１００を用いるゲル濾過法により求めた。
すなわち０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化させ
たセファデックスＧ−１″００（１ｃｍＸ１００ｃ＋＋
＋）カラムに１ｍｇの精製抗ペプチド体をのせ、同緩衝
液で展開した。２８０ ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検出
し、分子量測定スタンダード（バイオランド社製Ｎａ１
５１−１９０１．チログロブリン分子量６７００００．
γ−グロブリン１５８０００゜卵白アルブミン４４
０００． ミオグロビン１７０００、 ビタミンＢ−
１２１３５０）の溶出パターンと比較した所分子１１５
００００の所に抗ペプチド抗体が溶出した。
たセファデックスＧ−１″００（１ｃｍＸ１００ｃ＋＋
＋）カラムに１ｍｇの精製抗ペプチド体をのせ、同緩衝
液で展開した。２８０ ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検出
し、分子量測定スタンダード（バイオランド社製Ｎａ１
５１−１９０１．チログロブリン分子量６７００００．
γ−グロブリン１５８０００゜卵白アルブミン４４
０００． ミオグロビン１７０００、 ビタミンＢ−
１２１３５０）の溶出パターンと比較した所分子１１５
００００の所に抗ペプチド抗体が溶出した。
（４１−３分子吸光係数
１■の精製抗ペプチド抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）１ｍｌに溶解し、２８０ ｎｍの吸光度を測
定した所、１．４０を示したので、本蛋白の分子吸光係
数Ｅ１λ＝１４．０である。
Ｈ９，０）１ｍｌに溶解し、２８０ ｎｍの吸光度を測
定した所、１．４０を示したので、本蛋白の分子吸光係
数Ｅ１λ＝１４．０である。
Ｔ４１−４ 抗体の免疫特異性
ｉ）精製抗ペプチド抗体を０．１ Ｍ炭酸バッファー
（ｐＨ９，０）ｐＨ８，３，０，５Ｍ食塩を含む）中で
ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ （ファルマシ
ア）に結合（２■抗体／ｍｌ（セファ０−ス・ゲル）さ
せた。抗ペプチド抗体結合セファロースをカラム（０，
５ｃｓａｘ２０ｃｍ）につめ、０．１Ｍリン酸バッファ
ーｐ Ｈ７，４で洗浄後、同バッファーに溶解した４０
００単位のＢＣＤＦをカラムに添加した。カラム通過分
画（非結合分画）を回収した。次にカラムを０．１ Ｍ
リン酸バッファーｐＨ７，４で洗浄後、３Ｍ ＫＳＣ
Ｎで結合蛋白を溶出した。溶出液をＰＢＳ （ホスフェ
ートバッファーセイライン）に透析し溶出分画とした。
（ｐＨ９，０）ｐＨ８，３，０，５Ｍ食塩を含む）中で
ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ （ファルマシ
ア）に結合（２■抗体／ｍｌ（セファ０−ス・ゲル）さ
せた。抗ペプチド抗体結合セファロースをカラム（０，
５ｃｓａｘ２０ｃｍ）につめ、０．１Ｍリン酸バッファ
ーｐ Ｈ７，４で洗浄後、同バッファーに溶解した４０
００単位のＢＣＤＦをカラムに添加した。カラム通過分
画（非結合分画）を回収した。次にカラムを０．１ Ｍ
リン酸バッファーｐＨ７，４で洗浄後、３Ｍ ＫＳＣ
Ｎで結合蛋白を溶出した。溶出液をＰＢＳ （ホスフェ
ートバッファーセイライン）に透析し溶出分画とした。
非結合分画と溶出分画のＢＣＤＦ活性を測定した。表１
に示す通り、抗ペプチドカラムより６２７単位（１６％
）のＢＣＤＦ活性が回収されたが、対照として用いた抗
ＯＶＡカラム（抗ＯＶＡ抗体を抗ペプチド抗体と同様に
セファロースに結合させたもの）よりは１０単位（０，
３％）のＢＣＤＦ活性しか回収されなかった。この結果
は明らかに、抗ペプチド抗体がＢＣＤＦと結合している
を示すものである。
に示す通り、抗ペプチドカラムより６２７単位（１６％
）のＢＣＤＦ活性が回収されたが、対照として用いた抗
ＯＶＡカラム（抗ＯＶＡ抗体を抗ペプチド抗体と同様に
セファロースに結合させたもの）よりは１０単位（０，
３％）のＢＣＤＦ活性しか回収されなかった。この結果
は明らかに、抗ペプチド抗体がＢＣＤＦと結合している
を示すものである。
表 １
ｉｉ）精製ＢＣＤＦをペルオキシダーゼ法にて１１２５
を標識した。抗ペプチド抗体結合セファロースＣＬ−４
Ｂ４０（１１！ （抗ペプチド抗体４ｎｍｏｌ相当）と
Ｉ”’−ＢＣＤＦ４００ｕｌ（１２ｐｍｏｌ）を０．１
Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，４中４℃、１晩反応さ
せた後、セファロースゲルを０． Ｉ Ｍリン酸バッフ
ァー、ｐＨ７，４で洗浄し、さらに５ＤＳ−ＰＡＧＥサ
ンプルバッフｙ−（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５％２−
メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ。
を標識した。抗ペプチド抗体結合セファロースＣＬ−４
Ｂ４０（１１！ （抗ペプチド抗体４ｎｍｏｌ相当）と
Ｉ”’−ＢＣＤＦ４００ｕｌ（１２ｐｍｏｌ）を０．１
Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，４中４℃、１晩反応さ
せた後、セファロースゲルを０． Ｉ Ｍリン酸バッフ
ァー、ｐＨ７，４で洗浄し、さらに５ＤＳ−ＰＡＧＥサ
ンプルバッフｙ−（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５％２−
メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ。
０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ６，８） １
００μ！で溶出した。溶出液を２メルカプトエタノール
存在下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
００μ！で溶出した。溶出液を２メルカプトエタノール
存在下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
泳動したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ
ィーを行ない、分子１２０．０００の位置に単一の放射
活性バンドを認めた。対照実験として、抗ＯＶＡ抗体結
合セファロースを用いて同様の操作を行なうと分子量２
０．０００の位置に放射活性のバンドを認めなかった。
ィーを行ない、分子１２０．０００の位置に単一の放射
活性バンドを認めた。対照実験として、抗ＯＶＡ抗体結
合セファロースを用いて同様の操作を行なうと分子量２
０．０００の位置に放射活性のバンドを認めなかった。
ＢＣＤＦの分子量は２０．０００であるから、上述の結
果は明らかにＢＣＤＦが抗ペプチド抗体と結合したこと
を示している。
果は明らかにＢＣＤＦが抗ペプチド抗体と結合したこと
を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記のペプチドを抗原として得られる抗体 Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60241658A JPS62102157A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60241658A JPS62102157A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62102157A true JPS62102157A (ja) | 1987-05-12 |
| JPH0574600B2 JPH0574600B2 (ja) | 1993-10-18 |
Family
ID=17077594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60241658A Granted JPS62102157A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62102157A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR890100799A (el) * | 1988-12-01 | 1991-03-15 | Univ North Carolina | Μεθοδος παρασκευης συνθετικης ιντερλευκινης-6. |
-
1985
- 1985-10-30 JP JP60241658A patent/JPS62102157A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR890100799A (el) * | 1988-12-01 | 1991-03-15 | Univ North Carolina | Μεθοδος παρασκευης συνθετικης ιντερλευκινης-6. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0574600B2 (ja) | 1993-10-18 |
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