JPH02138982A - ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、原核細胞中でデラスミノーグンアクチペータ
を製造する方法に使われるベクターに関する。

従来の技術 プラスミノーグンアクチベータは人間及び動物の組織及
び体液中に広く分布している。これはフィブリツリシス
で中心的な役割を果たし、かつプラスミノ−ｒ　ｙ　１
ゾラスミンに変化させる。プラスミンは血栓溶解作用に
重要である。

それ故、プラスミノーグンアクチペータは血栓による血
管閉塞の臨床治療に非常に１要である。

例えば、公知のプラスミノ−ｒンアクチベータはプロウ
ロキナーゼ（ｕ−ＰＡ　）並ひに組織グラスミノーグン
アクチベータ（ｔ、−ｐｐ、　）である。

プロウロキナーゼは、プラスミンによシ活性化される一
本鎖型のセリ／プロテアーゼであるＣ　”　Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　　１５　［１巻、１８６〜
１８８頁（１９８５年）、ヨーロッパ公開特許第００９
２１８２号〕。

ｔ−ＦＡも、種々の変態形で産出するセリンプロテアー
ゼである〔６動脈硬化（Ａｒｔｅｒｉｏｓ−ｃｌｅｒｏ
ｓｉｓ　）”　４巻、５７９〜５８５頁（１９８４年）
〕。

組織又は細胞培養物から単離したｔ−ＰＡは低い活性（
酵素前駆体）の形で一本鎖ｔ−ＰＡとしてグリコジル化
されて存在する（分子量約７００００ダルトン）。プラ
スミン、トリプシン又はカリクレインによるこの酵素前
駆体に対する制限された作用にょシ、この前駆体は完全
活性状態（二本鎖ｔ−ｐＡ）に変換される。その際に、
Ａｒｇ　２７５とＩｌｅ　２７６との間の結合が切断さ
れる。重い鎖（Ａ、　−Ｍ　）と軽い鎖（Ｂ−鎖、プロ
テアーゼドメイン）が生じる。両方の鎖はジスルフィド
架橋によ＃）結合している［　”　、ｒ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　　　２５６巻（７０３５〜７０４１貢（
１９８１年）〕。

更に、ｔ−ＰＡとは備かに異なる天然誘導体が公知であ
る。分子の約５０％がＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇ’ｉｎ　（Ｌ−鎖）で開始し、ｔ−ＰＡの
他の約５０％ではＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇが欠けておシ
かつアミノ酸配列は（）ｌｙ／５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ
　（Ｓ−鎖）で開始する。Ｌ−４位もしくはｓ−１位で
（）ｌｙ／Ｓｅｒの交換が行なわれていることもあるじ
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ　　　１５６巻、４７〜５０頁
（１９８３年）〕。しかしこの僅かな変態はｔ−ＰＡの
生物学的作用に対して作用しない。

自然界の天然プラスミノ−ｒンアクチベータは極く備か
な蓋（例えは血しよう中でｔＰＡ約６ｎｇ　／　ａｇ　
）でしか酸量されないので、臨床的な通用及び科学的な
目的に必要とされる血のこのアクチペータを遺伝子工学
的に製造すると有利である。例えば、ｔ−ＰＡに関して
は原核細胞中でのクローニング及び発現の方法［Ｐｅｎ
ｎｊｃａ及びその他共著、１ネイチヤー（Ｎａｔｕｒｅ
　）”６０１巻、２１４〜２２１頁（１９８３年）〕及
び真核細胞中での発現法〔６バイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）”　１２月８４．１０５８
〜１０６２頁〕が記載されている。真核細胞中で発現さ
れるグラスミノーグンアクチベーりはグリコジル化され
ているが、原核細胞中で発現させる際にはグリコジル化
は行なわれない。

原核細胞中で発現されたシラスミノ−ｒンアクチペータ
は、グリコジル化された天然産生アクチペータと同様に
生物学的に作用すると考えられる。それというのも例え
ば炭水化物鎖の分離後〔６バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）’。

２３巻、６１９１〜６１９５頁（１９８４年）〕又はグ
リコジル化の阻害後〔６血栓症及び止血（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　ａｎｄ　ＨＨｅｍｏｓｔａＳｉｓ　）″　５
４巻、７８８〜７９１負（１９８５年）〕のｔ−ＦＡで
は、そのように製造されたグリコジル化されていないｔ
−ＰＡがグリコジル化された天然ｔ−ＦＡと同一の特性
を有するからである。

従って、原核生物による問題のない醗酵及び予測される
高い収率故に、プラスミノ−ｒンアクチペータを原核生
物中で発現させるための方法に対して大きな関心が寄せ
られている。しかし従来公知の方法〔例えばｔ−ＰＡ　
Ｋ関して６ネイチヤー（Ｎａｔｕｒｅ　）″　６０１巻
、２１４〜２２１負（１９８３年）及びヨーロッパ特許
第００９３６１９号参照〕は、主として所望の連鎖長を
有していない蛋白質が発現されるという欠点’に４＝１
−している。ベクターとしてのｐＢＲ６２２によシＥ、
コリ（ｃＱｌ：Ｌ　）中でｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡを発現さ
せる際に発現した蛋白質の８０％よシ多くのものが僅か
３２０００〜３６０００ｄの分子量に’Ｆ］Ｌ、それ故
ｔ−ＰＡの分解生成物よｐ成ることが認められた。２０
％より少ない発現蛋白質は一本鎖ｔ−ＰＡでるり、その
分子量は５７０００ａである〔前記の’　Ｎａｔｕｒｅ
　’中に記載の配列に相当〕。このよりに類似の化合物
の混合物の精製は不経済で経費がかかる。

観察されるｔ−ＰＡ誘導体の形成は、原核生物中で組換
え蛋白質を発現させる際に長い間公知である現象との類
似性を有する。つまシ、権々のこのような蛋白質に関し
て、蛋白質が完全に発現ちれるけれとも、蛋白質分所作
用を受けるので宿主細胞中でのその半減期が惨めて低い
ということが報告されている〔６バイオテクノロジ−の
方向（Ｔｒｅｎｄｓ　ｊｎ　Ｂｊｏｔ、ｐｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　）”　１巻、１０９〜１１６頁（１９８３年）Ｌ
この蛋白質の分７！＋を回避するために、様々な方法が
提案され１いる。１つの方法は、分解に関与する蛋白質
分解系を胸−していない債主細胞の使用である。例えは
、Ｅ、コリーのＩｏｎ−変異株全宿主細胞として便用す
ることができる。この種の変異株は欠失であるかもしく
は野生型で産生ずるプロテアーゼの１つである。Ｅ、コ
リには少７ｚくとも７稲の他のプロテアーゼが存在する
Ｃ　”　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｊ、ｏｌ、　　　１４９巻
、１０２７〜１０６６自（１９８２年）〕ので、この方
法は、発現される蛋白質がこれらの他のプロテアーゼに
よシ分屏δれない場合にたけ適している。更に、好適な
宿主細胞の選択は非常に限定されている。

蛋白質の分′ｌ＃は、蛋白質中でアミノ酸交換（ｃＤＮ
Ａレベル（Ｅｂｅｎｅ　）で）によりプロテアーゼ切断
位ｔＭ　’ｔｒ除去することにより回避することもでき
るほすである。しかしそのためにはこの切断位ｔｋｋ初
めにロスの多い方法によシ決定しなければならない。史
に、アミノ酸の交換は蛋白質の活性及び免役学的特性を
激しく変化させ得る。

史に、クローニングベクター中にＴ、ファージのアンチ
プロテアーゼ遺伝子盆地み込むことが公知である〔Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

８０巻、２０５９〜２０６２負（１９Ｅ１年）３゜この
方法も一定の組換え蛋白質にたけ好適であり、しかも蛋
白質分解ヲ不十分にしか抑制しないＯ 丈に、発現ベクターのコピー数盆尚めることにより、プ
ロテアーゼ會莫大な電の組換え蛋白質で満たしてそのプ
ロテアーゼの作用が比較的僅かなパーセントの組換え蛋
白質でたけ展開されるようにして発現全部めることが提
搬された。

しかしこの方法の欠点は、僅か１〜２世代で発現全美大
に尚りなければならすかつより長い時聞夫施することが
できないということである〔前記文献”バイオテクノロ
ジーの方向（Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　）　　″　〕。

蛋蛋白仕分を回避するための他の方法は、組換え蛋白質
を廓にＣＤＮＡレベルで他の蛋白質との融合によシ保護
することである。例えは、この方法はペプチドホルモン
のインシュリン及びンマトスタチンについて記載されて
おり、その際に融合成分としてβ−ガラクトシダーセ゛
が使われる〔”サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）”　１
９８巻、１０５６〜１０６６負（１９７７年）〕。

しかしこの方法は、保腹蛋白質が一緒に発現しかつ鞘゛
製する際に初めに分離して除去しなけれはなら７１いと
いう欠点（！−自し、これは付加的な高い経費７ｃ慧休
する。遺伝子工学的に製造した蛋白質の分解を回避する
ために従来提案された方法のいずれもが、蛋白質混合物
からこ９して製造きれるＰＡ（７″ラスミノ−ｒンアク
チベータ）の同順を解決するのに好適ではないように思
われる。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の諌趙は、原核生物中で完全でほぼ均一
なデラスミノーグンアクチベータの発現を可能にしかつ
生成物の分ｔ％を回避するだめの前記の方法の欠点を有
していない方法で使われるベクター全開示することであ
る。

問題点を解決するための手段 ところで、複製が両生細胞の染色体の仮装から脱共役（
ｅｎｔｋｏｐｐｅｌｎ　）　Ｌないか又は−時的にたけ
説共役し、それ故ｍＲＮＡの形成が著しく低減する発現
ベクターを使用する際に、あるいはｍＲＮＡ形成が同様
に低水準に低下する工９にデロモーメが眺節されるベク
ターを使用する際に、原核生物中での発現で一本＠ゾラ
スミノーグンアクチペータが關純度で生成するといつこ
とが判明し、かつ本発明はこれに基いている。

それ故、本発明の目的は、イｄ主＃１１Ｉ飽に好適であ
るベクター中に挿入さｎて存在している、プラスミノ−
ｒンアクチベータをコードするｃＤＮＡｒ原核細胞中で
発現憾せることによりこのアクチベータを製造するに好
適な、プラスミドｐＲ８Ｆ１０１０　、　ｐＫＮ　４０
２　、　ｐＡＣＹＣ１７７又はこｒらから誘導される、
ベースプラスミドのＯｒｉ及びｔＰＡのｃ−ＤＮＡ　ｋ
有するプラスミドの１つｔベースとするベクターである
。緊縮調節（ＳｔｒｉｋｔｅＫｏｎｔｒｏ’ｌｌｅ　）
されていて、それ散板製が宿主細胞の染色体の複製から
説共役しないか又は−時的に脱共役するに過ぎないこの
ベクター全便用し、かつ緩和調節（ｒｅ’１ａｘｉｅｒ
ｔｅ　Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ　）が起らないかもしくはベ
クターのプロモータが、脱共役したプラスミドのｍＲＮ
Ａ形成が緊縮調節−トの場合よりも大きくないように調
節される条件下で培養を実施することにより、原核細胞
中でプラスミノ−ｒンアクチベータ會有利に製造するこ
とができる。

この製法は、窒ましくない蛋白質混合物の形成は、種々
の組数のｍＢＮＡ鎖の混合が惹起されることに帰因して
おジかつ相応して低い転写速度に調節することにより回
避し得るという篤くべき認誠に泰いている。

′ｇ縮調節さｎるベクターは、宿主細胞の成長の早期に
そのコピー数音係数１０、殊に係数３よりも多くは尚め
ない。それは、一般に遺伝子工学で使用される、緩和調
節されたマルチコピープラスミドとは反対に、”ローコ
ピー（ｌｏｗｃｏｐｙ　）−プラスミドと表わされる。

そのようなベクターは、それが活性な蛋白質の生合成あ
るいはＤＮＡ−プロテアーゼｌ’にその増畑のために必
要とするがどうがｔ試験して見出すことができる。

”　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　　１１０巻、６６
７〜６７６貞（１９７２年）から、クロラムフェニコー
ル又Ｕスペクチノマイシンのような蛋白貴生会成の阻杏
物實を添加することにより、緩和調節されているベクタ
ー（例えはＣｏ１Ｅ　ｌ型のベクター　ｐＢＲ３２２）
ではプラスミド複＆Ｉが染色体の複製から説共役されか
つベクターのコピー数が１００〜１０００．ｃりも多く
増幅し得ることが知られている。主にこの特性か、合成
にこれらのベクターヲ優先的に１史用する理由でるる。

しかし前記方法で使用するのに好適な、緊縮内筒されて
いるベクターはこの方法にょ９係数１０倍、殊に係数６
倍よｐも多くなく最高約５０のコピー数に増幅すること
ができる。

成長の開始前に、ベクターは１細胞当シコピー１〜５０
、殊に２〜２０、特に２〜１０のコピー数で存在する。

ベクターの開始コピー数が下の範囲（１０又はそれ以下
ンである場合、増幅係数がその範囲の上限（１０近く）
にめるようなベクターが優れている。開始コピー数か既
に約２０〜５０である場合には、増幅係数を可能なＶｉ
り低くすると有利である。増幅係数が６又はそれ以下だ
と特に好適である。

ベクターとして？ｉ時に原核生物のプラスミドベクター
　ファージベクター及び両方の組付せが好適である。

緊縮される讃れたプラスミドベクターは＄ｐＲ８Ｆ　１
０１０、ｐＫＮ　４０２及びｐＡｃＹｃ　１７７並ひに
これらからｄｉされる、有利にその特徴的な配夕１」會
Ｏｒｉとして有するｆ′″ｊスミドでおる。

プラスミドｐＫＮ　４０２及びｐＡＣＹＣ１７７は特に
後れている。ｐＫＮ　４０２の複製は温度上昇により染
色体の複製から説共役することができる。

それ故、コピー数？Ｉ−ｗＪ年な方法で尚めることかで
きる。しかしこの際に一本鎖ではないＰＡの著しい上昇
が認められる。それ故、脱共役が起らない温度全培養に
選択しなければならない。

表１及び２は、緊縮調節又は緩和調節されている数種の
ベクターに関してコピー数及び−本鎖ＰＡの形成會これ
らのベクターにより発現される蛋白質の係で示している
。

場合によｐ、ｔ、−ＰＡ染色体のｍＲＮＡコピーの形成
を、筒いコピー数で存在するベクター（ハイコピーベク
ター：　ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ−Ｖｅｋｔｏｒｅｎ　）　
ｆ使用する際に所望通シ低くするには、ベクターのプロ
モータを、ｍＲＮＡ形成（転与）が前記の緊縮調節され
るベクターと同じ程度に低いｍＲＮＡ形成となるようｖ
ｃ　′Ａ節することである。それ故、強力なグロそ一タ
を有するこのようなハイコピーベクター全使用する場合
に、プロモータは弱く妨発されて、ｔ−ＦＡ遺伝子のｍ
ＢＮＡへの低い転写が行なわれるに過ぎない。例えは、
このためにハイコピーベクターのプロモータを相応して
ＶＳＭ害するリプレッサーを形成ブーる宿主細胞を使用
し、その際に、このｌ５１１杏は相応して低い童の誘導
物質の添加により抑えることかできる。例えはこのため
には、１ａＣ−ベルミアーゼを生成せすかつ１ａｃ−Ｉ
Ｊプレツサー葡過剰生産する工９に形質転換し得るＥ、
コリ変異株が好適である。それ故、強力な１ａｃ−プロ
モータ七Ｍするハイコピープラスミドと一緒に便用する
場合、プロモータは強く抑制されて、ｍＦｔＮＡの形成
は抑えられる。七牡故、誘導物質の冷加によジ所望の低
いｍＲＮＡ形底が達成さｔしる。このような変異株の代
表的な例はＥ、コ！Ｊ　Ｋ　１２株、ＤＳＭ２１０２又
はＤＳＭ　２０９３である。これ全プラスミドｐｅＰａ
　１１９　（ＤＳＭ　６６９１　Ｐ　）で形質転換する
場合には、１ａｃ−’）プレツサー過剰生服省が該当す
る。これは、ｔ−ＰＡ遺伝子が１ａ　ｃ−プロモータの
コントロール−）に置かれているハイコピープラスミド
で、所望のｍＲＮＡ　＃成のために、必要な誘導物質、
例えはＩＰＴ（）　（イソゾロピルーβ−Ｄ−チオガラ
クトシド）を相応する少い童で又は１８Ｃ−ベルミアー
ゼ栄養要求変異株ではラクトースを添加して使用するこ
とができる。後者の場合、誘導物質ラクトースの少い配
置はその極めて緩慢な細胞への浸透により行なわれる。

ｔａｃ↓りも低い効率のプロモータ全便Ｊ＋３−ｆる場
合、完全に誘導される際には相応して筒いベクターのコ
ピー数が許容される。プロモータ強度はコ′ビー数に反
比例して選択し侍るか又はプロモータの使用は相応して
低い誘導によυ制限しなけれはならない。

発現ベクターのコピー数を限定することによｐ達成され
る、ｔ−ＦＡ断片が産生しないという効果は次のよりに
して達成することもできる二強力なプロモータ（ｔａｃ
　）　ｆ有するハイコピー発現ベクターを１８（−ＩＪ
プレツサー過剰生産の菌株（ｌａｃ　ＩＱ　）中で１史
用する場合、ｄｊ専物質（ＩＰＴ（）、ラクトース等）
の添加によシｔ−ＰＡ−ｆ成が？Ｉ４される。これは用
地中でＩＰＴＧ　０．５〜５ミリモルの電で完全に行な
われる。これに対し、ローコピーベクターを同じ系（ｔ
ａｃ−プロモータ、１ａｃ工ｑ）でイ史用する場合、同
じＩＰＴＧ　Ｈの添加で屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｊｌｅ
　ｂｏｄｉｅｓ　）の形成が認めしれるか、屈折体中へ
のｔ−ＰＡの断片のとジ込みは誌められない、、／ＳＳ
ココーベクターでＩＰＴＧ添加ｋｋ　Ｏ，０１ミリモル
に低下させる際に、完全なＩＰＴＧ誘導ではローコピー
系と同じ純粋な屈折体が得られる。この効果は、ｔａｃ
より不良のプロモータでも同様に達成される。ベクター
のコピー数は、そのプロモータがｔａｃ−プロモータよ
りも低い効率である分たけ上昇し得る。即ちプロモータ
の効率↓４ｏでは可能なプラスミドコピー数の上昇は、
使用されるローコピープラスミドに対して係数１０であ
る。

前記の両方の方法ではローコピー糸の使用が優れている
。本発明による強力なプロモータを有するローコピー系
の利点は、Ｉ！！ｌＩ＃における糸の易取扱い性である
。この際に誘導は低い経費で実施することができる。そ
れというのも誘導物質の童は調節により強く制御する必
要はなく、記載したように、単槽系（Ｅｉｎｔｏｐｆ−
８ｙｓｔｅｍ　）が機能するからである。また、：Ｌａ
ｃ糸金介するこの誘導はｔｒｐ系金介する制御よりも優
先する。

それというのもラクトースの１史用によりＭ　ＩｒｃＱ
の成長が一緒に制御され得るからでりシ、これはｔｒｐ
−欠乏技術（ｔｒｐ−Ｖｅｒａｒｍｕｎｇｓｔｅｃｈｎ
ｊｋ　：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　）ではあまシ簡単に１ｌ
−ｊ、可能ではない。

一般に、ベクターの分子量は１０６〜１０８タルトンで
ある。ペタターはデラスミノーケゞンアクチペーターＱ
ＤＮＡ、例えはｔＰＡ−ＣＤＮＡ以外に有利には調節−
及び末端配列並ひに選択マーカを含有してよい。特に、
プロモータとしてはｔａｃ−及びｔｒｐ−プロモータが
好適であることが明らかになった。このベクター中への
ｃ　ＤＮＡの押入は任意の配向で行なうことができる。

宿主細胞としては原核細胞が好適である。Ｅ。

コリ、クレープジュラ・プノイモニエ（Ｋｌｅｂ−ｓｊ
ｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｌａｅ　）、シンイドモナス
・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ
ｊｎｏｓａ　）、シンイドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）及びバチルス・スブチ
リス（Ｂａｃｊｌ−１ｕｓ　５ｕｂｔｉ−１１ｓ）が有
利であることが明らかになった。Ｅ。

コリの例えば菌株ＤＳＭ　３６８９並ひにプソイドモナ
ス・プチダの菌株ＤＳＭ　２１０６が特に優れている。

宿主細胞は、使用されるベクターに相応して、ベクター
が宿主中で良好に複写されるように選択すると有利であ
る。好適なベクター／宿主の組合せは当業者に公知であ
る。その都度使用するプロモータに好適な調節体（リプ
レッサー）、例えば１ａｃ−又はｔａｃ−プロモータに
対して１６ｃ　−＋）プレツサー會宮刹゛する宿主′に
便用すると有利でるる。

本発明の範囲でプラスミノーグンアクチペータとしては
、プラスミノーゲン奮活性化する作用を前記の意味で有
するすべての蛋白質、殊にｔ−ＰＡ及びグロウロキナー
ゼ並ひにそれらの誘導体である。

誘導体では、例えば１個又はそれ以上のドメインが部分
的にもしくは全部欠損している大然訪導体並びに人工的
に製造された誘導体が挙けられる。この方法は、１個又
は数個のアミノ酸が父換されている誘導体にも好適であ
る。

この方法は、天然ｔ−ＰＡの発現、並ひに公知の天然ｔ
−ＰＡ分子から誘導されている（第１図参照）が、アミ
ノ酸４６〜７２の１つで開始しかつアミノ酸１７９〜１
１３の１つで終結している、完全ｔ−ＰＡ分子の連鎖片
が欠損しているｔ−ＦＡ誘導体を発現するのに特に好適
である。

例えはそれは西ドイツ国特許出願Ｐ３６４３１５８．６
号に記載されている。この命名法はｐｅｎｎｉｃａ　（
前記文献）により記載された命名法と同じである。

プ２スミノーグンアクチペータ會コードするｃ　ＤＮＡ
のベクター中への１申入はここで詳説する必要のない当
業者に常用の方法にょシ行なう。

例えｉｊ　ｔＰＡ　ｕ　４体全製造する際に、完全ｉｐ
八へ子に比べて該誘導体に欠けているアミノ酸配列をコ
ードする断片’ｉ　ｔ−ＰＡ−ＤＮＡから、相応する制
限エンドヌクレアーゼにょ多切断し、所望のｔＰＡ誘導
体全コードする断片を結合させ、このようにして得られ
たｔｐＡｒ＄；導体−ｃＤＮＡ　ｆ本発明により好適な
ベクターを介して原核生物中に導入しかつそこで発現さ
せて行なう。この場合、制限エンドヌクレアーゼとして
は特にＣＤＮＡ配列の範囲ｂｐ　３１５〜ｂｐ　７２６
　ＣＰｅｎｎ１ｃａ著、’　Ｎａｔｕｒｅ”　６０１巻
、２１４〜２２１貞（１９８３年）診照〕において切断
するような酵素が好適である。

制限エンドヌクレアーゼの組合せＤｒａ　ｌとＭａｅｌ
はアミノ酸４５〜１７９の除去に、又はＤｄｅ　ＩとＭ
ｎｌ　ｌはアミノ１Ｒ４５〜１７１の除去に並ひにＤｄ
ｅ　Ｉはアミノ酸４５〜１７４及びＦｎｕ　４　Ｈはア
ミノ酸５２〜１６８の除去に及びＲｓａ　Ｉはアミノ酸
６７〜１６２の除去に特に好適である。

ベクター中での再結合に当って、殊にリンカ−の使用下
に公知方法’を適用する。

引続いて、このベクターに！植生物中に公知方法によシ
導入しかつ例えはｔＰＡ誘導体のような−ｊ″２スミノ
ーｒンアクチベータを発現させる。

調製ベクターの製造に当っても、イントロン金言有する
完全ＤＮＡから出発することかできる。

このためにＤＮＡ　、例えはｔＰＡ−ＤＮＡ　全マニア
チスーｒンバンク（Ｍａｎｊａｔｉｓ−Ｇｅｎｂａｎｌ
ｃ　）から単離し、選択したベクター中に挿入する。

丈に、ｐＡｉ生絹胞系（Ｐｅｎｎｊｃａ著、前記文献）
からｎｎＲＮＡを単離しかつ多電分別（Ｇｒ６ｇｅｎ−
ｆｒａｋｔ、ｊｏｎｉｅｒｕｎｇ）により分離すること
ができる。それからｃＤＮｐ、　製造しかつ生成りロー
ン會試峡することによｐ、ＦＡのコード領域全官有する
クローンを見出すことかでさる。そのために、相応して
構成されているオリゴヌクレオチドで雑種形成するクロ
ーン全選択する。

前記発明によｐ１アミノ酸４５〜１７９が欠損している
ｔＰＡ　ｇ　４体全製造すると籍に優れている。例えは
、これはｃＤＮＡレベルで、制限エンドヌクレアーゼＤ
ｒａ　ｌ及びＭａ、ｅ　ｌで切断しかつ突出している一
本鎖木端をヌクレアーゼＳ１で消化することにより製造
することができる。

引続いて、リガーゼで連結する。その後、本発明による
ベクター系で原核生物中で発現させる。

真核生物中で発現させる際にこのように生成したｔ、Ｐ
Ａ誘導体は分子蓋約４３０００Ｄｋ有する。

本発明に６ベクターを使うことによシ、実質的に純粋な
プラスミノーグンアクチベータが主として不溶性不活性
形（屈折体）で得られ、これは分離後に可溶性の活性形
に変換することができる。

実施例 例　　１ ｔＰＡ用発現プラスミドの調製： ａ）　　ｐＢＲ３２２０ｒｉ勿自するプラスミドの使用
下に発現プラスミドの調製： 出発シラスミドとしてプラスミドｐＢＴ　９５（ＤＳＭ
３６１１Ｐ、西ドイツ国特許第６５４５１２６号）を使
い、このプラスミドからプラスミドｐｅＰａ　９８−１
　ｋ次のように製造した：このプラスミド全酵素Ｂｇｌ
　ｌｌで切断しがっヌクレアーゼＳ１で後処理する。丈
に酵素Ｓｅａ　Ｉで切断することによシ、フラグメント
ａが調製的に得られ、これは約７６０個の塩基対【有し
がっｔＰＡ　ｋコードするヌクレオチド配列１９２〜９
５２　（Ｐｅｎｎｊｃａ著、前記ＫＭ　）　’ｒ：含自
ｉル。

フラグメン）ｂも同様にｐＢＴ　９５がらＳｃａ　ｌ及
ヒＨｊｎｄｌで切断することにょｐ得られる；これによ
り　ｔ、ＰＡヌクレオチド配列９５６〜２１６５を含有
する約１２００の塩基対のフラグメントが得られる。パ
ートナ−Ｃはリンカ−として合成されかつ次の配列を含
有する： ５’　ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣ）ＴＣ３’３’　　　Ｇ
ＡＡＴＡＣＡＧ５’ 構成中のパートナ−ｄとしてはプラスミドｐＫＫ　２２
３−３　（ＤＳＭ　３６９４　Ｐ　）　ｋ酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨ１ｎｃｉ量によりポリリンカーで切断する。

パートナ−ａ＝ｄｔ連結する。連結反応バッチ全常法に
より　Ｔ　４−　ＩＪガーゼで処理し、引続いてＥ、コ
リ＃Ｉ肥（ＤＡＭ　３６８９　）中で形質転換させる。

形質転換細胞を培地上で５０μｙ／酩−アンビシリンの
添加下に培養する。得られたクローンから、シラスミド
ｐｅＰａ　９８−１を担持するクローンを選択する。こ
のｐｅＰａ　９８．１は出発プラスミドｐＢＴ　９５及
びｐＫＫ　２２３−３とは、プラスミドｐＫＫ　２２３
−３のポリリンカーにおいてＥｃｏＲＩとＨ１ｎｄ’　
ｌ−切断部位との間にｔＰＡヌクレオチド配列１９２〜
２１６５′に正しい配列で含有することによジ異なって
いる。

ｂ）温度感受性複製調節性を有するｔＰＡ用発現プラス
ミドの調＃： １ａ）で製造したプラスミドｐｅＰａ　９８．１から、
Ｘｈｏ■で切断することによシ約１．８５ｋｂのフラグ
メントが得られ、これはｔＰＡ　をコードしかつｔａｃ
プロモータ會含有する。このフラグメント中にはｔＰＡ
　’（ｉ−コードするヌクレオチド配列１９２〜１８０
９が変化せずに含有されている。デソキシヌクレオシド
トリホスフェート４個全部の存在においてフレノウ酵素
で処理することによシ、Ｘｈｏ　Ｉｆ切断部位の５′−
突出（ｕｂｅｒｈ６ｎｇｅｎｄ）末端が満たされる。複
製と、それ故コピー数が温度調節により作用される受答
プラスミドｐＲＬ’Ｍ２３３４　（ＤＡＭ　３６９０　
Ｍ　）　’！Ｉ−酵素Ｃ１ａ　Ｉによシ線状にしかつ５
′−突出（ｕｂｅｒｓｔｅｈｅｎｄ　）末端はテンキシ
ヌクレオシドトリホスフェート４個全部の存在において
フレノウ酵素によ、！２＃た芒れる。どのように準備し
たパートナ−分子を連結反応バッチ中で合する。Ｅ、コ
リ細胞（ＤＳＭ６６８９）中での形質転換後、細胞をク
ロラムフェニコール２５μｙ／計會官有する培地上で＠
養する。温度は僅か６０℃である。このようにして得ら
れたクローンのうち、プラスミドｐｅＰａ　ｌ　００−
１を含有するものを選択する。このプラスミドは出発プ
ラスミドｐＲＦａ４２３３４とは、ｔＰＡ’ｉｊコード
するＸｈｏ　ｌフラグメントを含有°する点で異なって
いる。このことは、このクローンのプラスミドを単離し
かつＢａｍ　ＨＩで切断することにより検査する。その
際にｐｅＰＡｌ　００．１分子は約６．８５及び２．１
５１ｃｂである２つのフラグメントに切断される。

ｃ）　　Ｂ、コリ中でもシンイドモナス・プチダ中でも
使用することのできるｔＰＡ用発現ベクターの調製： フレノウ酵素で処理した例１　ｔ））に記載のＸｈｏ　
ｌフラグメント’４再度使用する。受答シラスミドとし
ては、Ｈｐａ　Ｉで線状になるプラスミドｐＲＥＭ　３
０６１　（ＤｓＭ　３６９２　Ｆ　）會使う。

両方のパートナ−分子會−緒に連結反応バッチ中でＴ４
−！Ｊガーゼで処理する。Ｅ、コリ細胞（ＤＳＭ　３６
８９　）中で形質転換しかつ良好に形質転換された＃Ｉ
胞をカナマイシン２５μｇ／鮎を官有する培地で培養す
ることによりクローンが得られた。こγしらのクローン
からプラスミドｐｅＰａ　１０７−８　’？ｌ−官有す
る細胞を選択する。このプラスミドは出発ベクターｐＲ
ＥＭ　３０６１　トは、記載のＸｈｏ■フラグメントを
含有するので異なっている。プラスミドを細胞から散得
しかつ酵素Ｂｓｔ　Ｆ、　ｎによシ分析的に切断する。

その際に１０．８及び１．３ｋｂのおおよその大きさの
２つのフラグメントが得られる。このプラスミドは菌株
プソイドモナス・プチダの細胞中で形質転換することに
より導入することができる。

そのために、菌株シンイドモナス・プチダ（ＤＡＭ　２
１０６　）の細胞を初めにプラスミドｐｅＰａ　１１９
　（ＤＡＭ　３６９１　Ｐ　）で形Ｊｋ換しかつカナマ
イシン２５μ、？　／ＩＵ’ｔ−含有する培地上で選択
する。いまやこのグツイドモナス・プチダ細胞はｌａｃ
　−ＩＪデレツサー會多輩に産生ずる状態のプラスミド
を含有する。

ｐｅＰａ　１１９に含有するグツイドモナス・プチダ細
胞全プラスミドｐｅＰａ　１０７．８で形質転換する。

この形質転換細胞ストレプトマイシン５０μｍ１７ｍ１
ｋ官有する培地上で選択し、その後シラスミドｐｅＰａ
　１１９並ひにｐｅＰａ　１０７−８會甘有する。プラ
スミドｐｅＰａ　１１９の存在はｌａｃ　−！Ｊプレツ
サー蛋白質の生成によシＭＵＩ胞中でのｔＰＡの住地會
抑電１」する。この蛋白質はｔａｃ−プロモータからの
転写全シンイドモナス・プチダ中でも抑飼し得る。

ｄ）　　ｐＡＣＹＣ１７７０ｒｉ　ｆ含有するｔＰＡ用
発現プラスミドの調製 フレノウ酵素で処理した約１．８５　ｋｋ）のＸｈ。

■フラグメント音便ハ」する（例１　’ｂ）から）。

これ全７ラグメントａと表わす。フラグメントｂはｐＫ
Ｋ　２２３−３からａｒｋし、つｉ　９　Ｂａｍ　ＨＩ
で切断しかつＳ１ヌクレアーゼで処理する。

引続いて酵素Ｐｖｕ　Ｉで後切鵬し、このよりにして約
１．０５　ｋｂのフラグメントが伶られ、これは私写読
み終９暗号（’Ｉｒａｎｓｋｒｊ、ｐｔｉｏｎｓｔｅｒ
ｍｊ−ｎｅｔｏｒ　）及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の５
′−ボーショ：ｙ　（Ｐｏｒｔ：ｉｏｎ　）　ｋ含有す
る。フラグメントＣはプラスミドｐＡｃＹｃ’　１７７
　（ＤＳＭ　３６９３Ｐ）ｋ　Ｂａｍ　ＨＩで切障１し
かつ引続いてＳ１ヌクレアーゼ消化によシ得られる。こ
のバッチを部分的にＰｖｕ　Ｉで後切断する。、ｉＭＩ
Ｍｉｑに約２．９　ｋｂの７ラグメントが得られる。フ
ラグメントａ、　　ｂ及びＣｒ連結反応バッチ中で台す
る。Ｔ　４−！Ｊガーゼで処理した後で、この連結反応
パッチ會Ｅ、コリ（ＤＳＭ　３６８９　）の細胞中で形
質転換する。引続いてこの細胞？カナマイシン２５μｙ
／祷及びアンピシリン５０μ＆／ｍｊ−に含有する培地
上に塗布する。生成りローンから、プラスミドｐｅＰａ
　ｋ担持するもの全選択する。これは出発プラスミドｐ
ＡＣＹＣ１７７とは、ｔＰＡ會コードする１９２〜１８
０９の配列′？ｒ：変らずに含有しかつ付加的にプラス
ミドｐＫＫ　２２３−３からの転与式み終り暗号を含有
する点で異なっている。プラスミド全単離しかつ酵素Ｂ
ｓｔ　Ｅ　ＩＩで分析市に切断する。大きさ約６．９及
び１．９ｋｔ＋の２つの７ラグメントが得られる。

例　　２ 原核細胞中でのｔＰＡ蛋白質の発現 ａ）１ａ）、ｂ）、Ｃ）及びｄ）で製造したプラスミド
全１δｃＩｑ−プラスミド全宮自するＥ、コ！Ｊ（ＤＳ
Ｍ３６８９）中で形質転換する。形質転換体ｋ、１　ａ
）、ｃ）及びｄ）からのプラスミドに関してはアンピシ
リン５０μｊＪ　／　ｕｔｂ　ｆ含慣しく６２） あるいは１　ｂ）からのプラスミドに関してはクロラム
フェニコール２５μ＆　／　成金含有する培地で選択す
る。プラスミドｐｅＰａ　９８．１、ｐｅＰａｌ　００
．１、ｐｅＰａ　１０７．８又はｐｅＰａ　１３３　ｋ
金材う−る細胞全培誉ブイヨン中で○Ｄ５ｏｏｎｍ　−
０，４まで通気下に培養し、かつその後ＩＰＴＧ　１０
０ミリモルの添加下に誘導する。恒縣保狩はプラスミド
ｐｅＰａ　？　８．１、ｐｅＰａ　１０７．８及びｐｅ
Ｐａ１６６では６７°Ｃで及びプラスミド全単離ａ　１
００．１では６０°Ｃで行なう。Ｉ　ＰＤＧの存在にお
いて通気−トに４時間恒温保持した後で、細胞を採取し
かつ砕屏する。そのために１５分曲氷上でリゾチーム０
．５μＭ／Ｉｎｂで処理する（細胞濃度ＯＤｉ　Ｑ／ｍ
ｂ）。トリス緩衝液ｐｉ”ｉａ、６’ｔｉ＝用す、６　
（ＥＤＴＡ１００ミリモル／を及びＮａＣ１１００ミリ
モル／を全含有するトリス−ＨＣｌ　Ｑ、１モル／１）
。

その後、＃Ｉ胞全全超音波処理より砕解する。このよう
にして得しれｆＣ慾濁液を１０分間２００００、！９で
遠心しかつ上ン覚与會廃棄する、沈積物はｔＰＡ　ｉ不
活性形で官有する。これは西ドイツ国特許６５３７７０
８号に記載の方法によｐ俗解しかつ回復きせることかで
きる。しかし逢たベレットｉ　Ｓｎ２１％及びメルカプ
トエタノール１００ミリモル／ｌｋ添加することによｐ
＃触しかつ５ＤＳ−ポリアクリルアミドグル中で′電気
泳動によシ分離することもできる、この′電気泳動の後
で蛋白質をクマシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｊ、ｅ−ｂ
ｌｕｅ　）によｐ着色することにより蛋白質バンド紮司
視化することができる、主に、プラスミドｐｅＰａ　１
００．１、ｐｅＰａ　１０７．８又はｐｐＰａ１６６會
有する＃胞からの抽出数はグリコジル化されていないｔ
、ＰＡ−蛋白質の大きさに相遇する約５７０００ダルト
ンの分子基゛の蛋白質１程？含有する。プラスミドｐｅ
Ｐａ　９８．１を有する細胞からの抽出液は主に太ささ
３２０００〜３４０００ダルトンの物買と僅少崖の５７
０００ダルトンｔち有する。１０」定した蛋白質バンド
は、ウェスタン・ブロード法（ｗｅｓｔ＋ｅｒｎ−ｂｌ
ｏｔ、−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ　）によｐヤギからの仇ｔ
Ｐｐ、−ＰＡＫ　−接合体で等動的に免役学的に検出す
ることができる。

ｂ）例１　ｃ）によりプラスミドｐｅＰａ　１ｉ　９及
びｐｅＰａ　１０７．８で形７Ｊｔ転換したデンイドモ
ナス・プチダ細胞（Ｉ）ＳＭ　２１０９　）を６０℃で
培養ブイヨン中でＯＤ５００ｎｍ−０，４まで通気下に
培養し、その後工ＰＴ０１０ミリモルの添加下に６導す
る。ＩＰＴｅ　ｌ／）存在において６０℃で通気下に４
時間恒縣保何した後で細胞全採取しかつ伜屏する。史に
例２ａ）に記載したように行なう。

細胞抽出液のグル電気泳動及びクマシープルーによる蛋
白質の染色後に、主に抽出液中に分子ｊ＝：ＩＦＩ５７
０００ダルトンの蛋白質が認められる。

この蛋白質はウェスタン・ブロード法によシャギからの
抗−ｔＰＡ　−ＰＡＫ−接合体でｔＰＡ−蛋白質として
免疫学的に検出ム」能である。５７０００ダルトンより
小さい蛋白質は一般に免疫学的に記載の方法でｔＰＡと
して検出することはできないＯ 例　　６ 高いコピー数及び低いコピー数を有するベクタープラス
ミドのｔＰＡ発現の比較 プラスミドｐｅＰａ　１００．１　′？！：含有するＥ
、コリ菌株（ＤＳＭ　３６８９　）音便用する。この細
胞全培養ブイヨン中ＯＤａｏｏｎｍ　−０，４まで通気
下に６０℃で培養する。ＩＰＴｏ１０ミリモルの除却に
よりｄ導する。このバッチを６個の同−谷量部に分ける
。それぞれ’／３ずつ’（１１−３０℃、６７′Ｃ又は
４２°Ｃで４時間Ｉ　ＰＴＧの存在において丈に恒温保
持する。引続いて、細１１ｉｌ！１’に採取しかつ例２
に記載したように砕解する。抽出液のＳＤ８−グル電気
泳動後、ｔＰＡ−蛋白質バンド全クツシー・ブルーでｇ
Ｊ視化することができる。６０℃バッチからの抽出液は
王に分子量５７０００ダルトンの蛋白Ｘ葡含有する。６
７℃及び４２℃のバッチからの抽出液は大きさ５７００
０ダルトンの蛋白質を僅少割合で含有するたけであり、
大部分は３２０００〜３４０００ダルトンである。これ
らの蛋白質バンドはウェスタン・ブロード法によりヤギ
からの抗−１ＰＡ　−ＰＡＫ−接合体で等価であること
を免疫学的に址明することがｔ＠る。

プラスミドｐｅＰａ　１００−１は高い視度で強く複製
され、これは細胞中でのプラスミドのよシ高いコピー数
に東門する。この高いコピー数は、大きさ５７０００ダ
ルトンの不活性ｔＰＡ−蛋白買蛋白得する際に不利に作
用する。

例　　４ 原核生物からｔＰＡ−蛋白質の復元 例２及び６により得られ７′ｃｔＰＡ−蛋白質を含有す
る細胞フラクション會西ドイツ国特許第６５３７７０８
号に記載の方法によシ溶解しかつ回復させることかでき
る。その際に、６「Ｃで培養させたｐｅＰａ　１０７．
８、ｐｅＰａ　１３３又はｐｅＰａ　１００．１を含有
する＃１胞の抽出液から、６７°Ｃ又は４２℃で培養さ
せたｐｅＰａ　９８．１　；ｈるいはｐｅＰａ　１００
．１　’ｔ”　言上する細胞よυも約１０倍活性のｔＰ
Ａが得られる。得られた活性ｔＰＡはそれぞれフィブリ
ンによシ刺激性である。

一般に、その刺激性は１０倍よシ太きい。

例　　５ ｔｐＡの半減期上決定するドメインの欠失（Ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎ　） ａ）　　ｔＰＡ−突然変異蛋白質−遺伝子の調製出発物
置としてプラスミドｐｅＰａ　９８．１　’に使用する
。このプラスミドから、ＸｈＯＩｌ切ｗｒｋ介してｔａ
ｃ−プロモータ含有するｔＰＡ−コードの７ラグメント
が得られる。このフラグメントは約１．８５ｋｌ）の大
きさであシかつ突出末端で、テンキシヌクレオシドトリ
ホスフェート４個すべての存在においてフレノウ酵素で
処理することにより完全に満たされる。工程Ａでは、こ
のフラグメン）ｋ酵素Ｄｒａ　ｌで切断しかつ突出末端
上ヌクレアーゼＳ１で消化させる。グル電気泳動によシ
塩基対約６７０の大きさの７ラグメントが得られる。工
程Ｂでは同じＸｈｏ　１１出発フラグメント會酵素Ｍａ
ｅｌで切断しかつ同じように８１で後消化させる。引続
いて付加的にこのバッチｔ＃素Ｓａｃ　Ｉで処理する。

グル電気泳動によりこのバッチから塩基対約７００の大
きさの７ラグメントが単離する。バッチＣではペクター
シラスミドｐｅＰａ　９８．１　ｋ酵素Ｂａｍ　Ｈｌで
切断しかつ突出末端をデツキジヌクレオシドトリホスフ
ェート４個全部の存在においてフレノウ酵素により満た
しかつ酵素Ｓａｃ　ｌで後切断する。引続いて、ケゞル
電気泳動によシ最大フラグメントがこのバッチから得ら
れる。連結反応バッチ中でバッチＡ、Ｂ及びＣから得ら
れたフラグメント會−緒にしかつＤＮＡ　−リガーゼの
添加下に連結させる。

連結混合物’ｚｌａｃｌｑ−プラスミド全含有するＥ、
コ！Ｊ　ＤＳＭ　３６８９中で形質転換させかつ生成し
た形質転換体全アンピシリン５０μ９／ｍｊ３ｆ召有す
る培地上で選択する。このようにして得られたクローン
から、所望のプラスミドｐｅＰａ　１２９全宮刹するも
のを選択し、このプラスミドはｔＰＡ　ｃＤＮＡ−目己
夕ＩＪ　３０１〜７２６の間のＤＮＡ配列をもはや含有
していない点で出発プラスミドｐｅＰａ　９８．１と異
なっている。第１図はこの↓つにして得られた突然変異
蛋白質遺伝子のヌクレオナト配列奮示す。

ｂ）　　Ｅ、コリ中で発現させるための突然変異蛋白質
用の発現ベクターの調製 ａ）により製造したシラスミドｐｅＰａ　１２９から、
制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ及びＰｖｕ　Ｉによる消化で１ｐ
Ａｋコードするフラグメントが得られる。プラスミドｐ
ＡＣＹＣ１７７（ＤＳＭ　３６９３　Ｐ　）も同様にＢ
ａｍＨＩ及びＰｖｕで切断する。両方の７ラグメンｌ−
に連結させかつｌ［ｌｌｃ　ｌｑ−プラスミドを含有す
るＥ、コ＋）　−ＤＳＭ　３６８９中で形質転換する。

カナマイシン及びアンピシリンｔそれぞれ２５μｇ／廐
もしくは５０μど／廐含有する培地で選択することによ
ジ＃實転侠体が得られ、そのうちのプラスミドｐｅＰａ
　１３７　ｋ含有するもの全選択する。これは、ｐｅＰ
ａ１２９からの突然変異蛋白質遺伝子フラグメントと７
ラスミドｐＡＣ’ＹＣ１７７の配列と會それぞれ完全に
含有するという点で出発ベクターとは異なっている。

第２図はプラスミド１６７の制限切断部位地図會示す。

Ｃ）プソイドモナス・プチダ中で発現させるだめの突然
変異蛋白質用の発現ベクターの調製プソイドモナス・プ
チダのベクターとしては、付加的にｐＡＣＹＣ１７７か
らのカナマイシン耐性遺伝子を官有するシラスミドｐＲ
８Ｆ　１０１０の妨導体全便用する。このベクターはｐ
ＲＥＭ　３０６１（ＤＳＭ　３６９２　ｐ　）と表わさ
れる。このプラスミドは制限酵素Ｈｐａ１７１ｉｌ−使
うことにより線状化されている。

ａ）によジ製造したベクターｐｅＰａ　１２９からＸｈ
ｏ　Ｕ切断によジ約１．４５　ｋｂの７ラグメントが得
られ、これはｔ＋ａｃ−プロモータ及び完全な突然装具
蛋白質遺伝子配列全含有−する。テンキシヌクレオシド
トリホスフェート４個全部の存在においてフレノウ・フ
ラグメントで処理することにより　Ｘｈｏ　ｎ−切断部
位は完全に満たされる。このように処理したフラグメン
ト會線状ベクター］）ＲＥＭ　６０６１と連結しかつＥ
、コリ細胞（ＤＳＭ　６６８９　）中で形質転換させる
。この形買転換体全カナマイシン２５μｙ／継を含有す
る培地上で選択する。シラスミドｐｅＰａ　１４３全含
有する形質転換体を選択する。このシラスミド１４６は
、ｔａＣ−プロモータ含有する完全突然変異蛋白質遺伝
子配夕１は含有゛する点で出発ベクターｐＲＥＭ　３　
ＵＪ　６１とは異なっている。このプラスミドを単離し
かつ形質転換により菌株プソイドモナス・プチダＤＳＭ
　２１０６の細胞中に挿入する。形質転換体ｒカナマイ
シン２５μ９／勘全含有する培地上で選択踵引続いて分
析する。これはプラスミド１４６を含有する。付加的に
、この形質転換体細胞中に同様に形質転換によシ、ｐｅ
Ｐａ１４３と適合性でありかつｌａｃ　ｌｑ−遺伝子を
宮自するプラスミドｐｅＰａ１１９　（Ｄ８Ｍ３６９１
　ｐ）會導入する。このプラスミドはプラスミドＲＰ４
の誘導体である。

このプラスミドの存在は、１ａＣ−リグレッサー蛋白質
の成牛により該細胞中での突然変異蛋白質の産生を抑制
する。これは、ｔａｃ−プロモータからの転写全抑制す
ることができる。

例　　６ 無傷のｔＰＡ　ｉ太腸凶中で強力なプロモータｔ有する
ハイコピーベクターにょシ発現 突然変異ｋ　１ａｃ−遺伝子中に有しがっｌａｃ　−ベ
ルミアーゼ會産生することのできないＥ、コＩＪ　Ｋ　
−１２の誘導体を使用する。菌株はＥＤ８６５４　（Ｄ
ＳＭ　２１０２　）又はＣ６００（ＤＡＭ２０９３）で
ある。この閑株から変異株を製造することができ、この
変異株はそれｋ　ｐｅＰａ１１９（ＤＳＭ　３６９１　
Ｐ　）で形質転換することにょシ１ａｃ−リプレッサー
を過５１！ＩＩ年産する（１ａ＃照）。

このようにして得られたａｍ中でシラスミドｐｅＰａ　
９８．１　ｋ形質転換すると（１ａ参照）、ｌａｃ　−
リプレッサーを過剰生産しがっｔＰＡ　ｋ合成する細菌
が得られる。

とのａｍｋ２ａに記載されているように培養ブイヨン中
、６７℃で通気下に培養する。

ａ）　　０Ｄ５５０−０．４でラクトース０．２％會培
地に添加しかつ恒幌保持を４時間継続する。１ａＣ−ベ
ルミアーゼが欠損することにょ９ラクトースは＃１１１
Ｉｔｉｌ！１中に緩慢に吸収されるに過ぎない。引続い
て、例２ａに記載されているよりに、細胞全採取し、砕
解し、ｔＰＡ−フラクションを取得しかつ５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドグル中で分析する。

定性的かつ定量的に、例２の完全誘導されたロウコピー
ベクターからの抽出液と同じ結果がｔＰＡ生産に関して
得られる。

ｂ）同じように、この時点で僅少菫のＩ　ＰＴＧの冷加
によｐ　ｔｐＡ発現に関して相応して低い誘導速度が達
成されるい　ＩＰＴ（）　［Ｊ、０５〜５ミリモル及び
それ以上の童で完全な誘導が達成され、０．００２〜０
．０１ミリモルの童で相応して低い誘導が達成される。

この低い誘導は、例２がらのロウコピーベクターの完全
誘導と定性的かつ定量的に同じ結果金もたらす。ｔａｃ
としてよシ低い効率のプロモータを使用する際に、完全
誘導ではベクターの相応して高いコピー数かｂ」能であ
る。プロモータの強さはコピー数に反比例して辿択する
か又はプロモータの使用音相応して低い誘導により制限
すべきである。

ｔＰＡ切片が産生されないという発現ベクターのコピー
数の制限による作用効果は、次のようにして達成するこ
ともできる： 強力なプロモータ（ｔａｃ　）　ｋ有するハイコピー発
現ベクターｋ　１ａｃ−リプレッサー過剰生産（ｌａｃ
　ｌｑ）する菌株中で使用する際に、誘導物質（ＩＰＴ
Ｇ、ラクトース等）の添加によシｔＰＡ合成’ｋｆ８ｉ
＄Ｌなければならない。これは培地中のＩＰＴ（）　０
．５〜５ミリモルの倉で完全に達成される。これに対し
てロウコピーベクターを同じ系（ｔａｃ−プロモータ、
１ａｃ　１ｑ）中で使用する場合、屈折体の形紙が認め
られるが、同じ工ｐ’ｒＧｉ加菫でｔＰＡ切片の屈折体
中へのとシ込みは認められない。工ＰＴＧ　’ｆＡ　ｊ
ＪＤ　’ｊｌｔ　ｔ”ハイコピーベクターで０．０１　
ミリモルに低める場合、完全Ｉ　ＰＴＧ誘尋でロウコピ
ー系と同じ純粋な屈折体が得られる。この効果は、ｔａ
ｃよシも不良なプロモータを用いても達成される。ベク
ターのコピー数は、プロモータがｔａｃ−プロモータよ
シも低い効率の分たけ高めることができる。即ち”／１
０のプロモータ効率で可能なプラスミドコピー数の上昇
は使用したロウコピープラスミドに対して係数１０であ
る。

本発明による強力なプロモータ上方するロウコピー系の
利点は醗酵における系の取扱いの容易さにある。この際
に、酵導會実施するのに経費が少ない。七ｎというのも
誘導物質の蓋ｔ？調節により厳しく制御する必要はなく
、記載したように単槽系が機能するからである。、ｌａ
Ｃ系を介するこの誘導はｔｙｐ系を介する制御よりも好
ましい。それというのもラクトースの使用によシ細胞の
成長を一緒に制御することができるからである、これは
ｔｙｐ−欠乏技術（Ｖｅｒａｒｍｕｎｇｓ−ｔｅｃｈｎ
ｉｋ　：　Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　）ではあまシ簡単では
ない。

【図面の簡単な説明】

第１図はｔＰＡ−突然変異蛋白質遺伝子のヌクレオチド
配列、第２図はプラスミドｐｅＰａ１３７の制限切断部
位地図でるる。 欠 図面の浄書（内容に変更なし） ｌｎＭｅｔＩｌｅＴｙｒＧｌｎＧｌｎＨｉｓＣｌｎＡ（
１；ＡＴＧＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣ；ｘ
　　　　　　　　　　　　　ｘ　　　　　　　　　　　
　　ｘｌｕＴｙｒＣｙｓＴｒｐＣｙｓＡｓｎＳｅｒＣ；
１ｙＡＡＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣ
蚤　　　　　　　　　　　　脣　　　　　　　　　　　
　Ｘ１ａＴｙｒＡｒｑＣ；１ｙＴｈｒＨｉｓｓｅｒＬｅ
ｕＣＣＴＡＣＣＧＴＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣ×
×ｘ ｅｔｌｌｅＬｅｕＩｌｅＣｌｙＬｙｓｌＪａｌＴｙｒＴ
ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＸ　　
　　　　　　　　　（ｘ ＭｅｔＬｅｕＣｖｓＡｌａＧ１ｙＡｓｐＴｈｒＡｒｑＳ
１？ｒＣ；ＩＡＴＧＣＴＣ；ＴＣＴにＣＴＣ；Ｃ；ＡＧ
ＡＣＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＣ；賛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラスミドｐＲＳＦ１０１０、ｐＫＮ４０２、ｐＡ
   ＣＹＣ１７７又はこれらから誘導される、ベースプラス
   ミドのＯｒｉ及びｔＰＡのｃ−ＤＮＡを有するプラスミ
   ドの１つをベースとするベクター。 ２、プラスミドｐｅＰａ１００．１である特許請求の範
   囲第１項記載のベクター。 ３、プラスミドｐｅＰａ１０７．８である特許請求の範
   囲第１項記載のベクター。 ４、プラスミドｐｅＰａ１３３である特許請求の範囲第
   １項記載のベクター。 ５、プラスミドｐｅＰａ１３７である特許請求の範囲第
   １項記載のベクター。 ６、プラスミドｐｅＰａ１４７である特許請求の範囲第
   １項記載のベクター。