DE4015922A1

DE4015922A1 - Verfahren zur enzymatischen prozessierung von proteinen unter verwendung von iga-proteasen (igase)

Info

Publication number: DE4015922A1
Application number: DE4015922A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Meyer; Johannes Dr Pohlner
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1990-05-17
Filing date: 1990-05-17
Publication date: 1991-11-21

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Spaltung von biotechnologisch gewonnenen Proteinen unter Verwendung von IgA-Proteasen von Neisserien und Haemophilus spp. (hier bezeichnet als Igasen).

Die biotechnologische Darstellung von Proteinen wird vorzugsweise unter Verwendung von Mikroorganismen durchgeführt, die sich leicht züchten lassen und die die Gewinnung des erzeugten Proteins auf einfache Weise gestatten. Geeignete Mikroorganismen hierfür sind z. B. das gramnegative Bakterium Escherichia coli, das grampositive Bakterium Streptococcus carnosus sowie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Die Expression authentischer fremder Gene in solchen Mikroorganismen hat jedoch häufig Nachteile. In E. coli z. B. wird der translationsbedingte aminoterminale Methioninrest natürlicher Proteine von Proteasen meist effizient abgespalten. Bei fremden Proteinen geschieht diese Abspaltung des ersten Methioninrestes jedoch meist nur partiell. Ein geeigneter Weg, solche Proteine mit einem definierten Aminoende herzustellen, ist es daher, diese zunächst in Form von Proteinfusionen zu bilden und im Anschluß mit einer sequenzspezifischen Protease definiert zu spalten.

Gegenüber authentischen Proteinen können solche Proteinfusionen darüber hinaus den Vorzug besitzen, in der Zelle des Mikroorganismus zu aggregieren und dichte Präzipitationskörper ("Inclusion Bodies") zu bilden, die mit geringem Aufwand von anderen Zellteilen abtrennbar sind und somit die Isolierung und Reinigung des gewünschten Proteins erleichtern. Andererseits verleihen Trägerproteine, die mittels gentechnischer Verfahren zunächst an ein eigentlich erwünschtes Protein fusioniert werden, dem Fusionspartner besondere Stabilität gegen unspezifischen proteolytischen Abbau; das Problem des Abbaus von Polypeptiden, die als fremd erkannt werden, betrifft insbesondere die biotechnologische Darstellung kleiner Peptide. Wiederum andere Trägerproteine erlauben, die gewünschten Proteine in bestimmte Zellkompartimente zu steuern, aus welchen sie besonders leicht aufgereinigt werden können, wo sie besonders stabil sind und/oder wo sie für Testzwecke zugänglich sind. Schließlich können Trägerproteine auch spezielle Eigenschaften besitzen, die eine effiziente Aufreinigung, z. B. durch Affinitätschromatographie, erlauben. Für die meisten Anwendungszwecke eignen sich Proteinfusionen, die das Trägerprotein am Aminoende und das erwünschte Protein am Karboxylende tragen. Aber auch die umgekehrte Version oder die Verknüpfung des erwünschten Proteins mit zwei Fusionspartnern kann in bestimmten Fällen erwünscht sein. Weiterhin kann die Reiteration des erwünschten Proteins innerhalb einer Fusion vorteilhaft sein.

Für die Darstellung des erwünschten Proteins in freier Form aus einer derartigen Fusion ist die Spaltung der kovalent verbundenen Fusionspartner voneinander notwendig. Prinzipiell kann dies mit chemischen oder biochemischen (enzymatischen) Verfahren erreicht werden. Einschränkend wirkt sich jedoch dabei meist die begrenzte Spezifität der zur Verfügung stehenden Verfahren aus; denn es ist wichtig, um das erwünschte Protein zu erhalten, daß eine derartige Spaltung in einer Spaltsequenz zwischen den Fusionspartnern, also der Übergangsregion, aber keinesfalls zusätzlich innerhalb des erwünschten Proteins selbst, erfolgt. Die Spaltung der Fusionspartner muß daher hochspezifisch erfolgen.

Bisher verwendete chemische Verfahren für die sequenzspezifische Trennung von Protein-Fusionen sind beispielweise die Spaltung mit Bromcyan an der Aminosäure Met innerhalb eines Proteins und die Spaltung zwischen den Aminosäuren Asp^-1-Pro im sauren Milieu unter Verwendung von Ameisensäure. Diese Verfahren eignen sich, sofern die spezifische Aminosäure in dem erwünschten Protein, abgesehen von der Übergangsregion zum Fusionspartner, kein weiteres Mal vorhanden ist. Allgemein sind jedoch biochemische Spaltverfahren chemischen Verfahren vorzuziehen, weil erstere meist unter physiologischen oder zumindest chemisch milden Reaktionsbedingungen durchgeführt werden können, die das erwünschte Protein nicht schädigen.

Biochemische Verfahren zur Spaltung von Proteinfusionen basieren auf der Verwendung möglichst spezifischer Proteasen. Beispielweise spaltet Trypsin die auf die Aminosäuren Arg oder Lys folgenden Peptidbindungen innerhalb von Proteinen. Eine Erhöhung der Spezifität kann durch vorangehende chemische Modifikation der Aminosäure Lys erzielt werden, wodurch sich die spezifische Erkennung auf die Aminosäure Arg reduzieren läßt. Eine weitere Protease, die biotechnologisch verwendet wird, ist Clostripain; dieses Enzym spaltet Peptidbindungen zwischen der Aminosäure Arg und einer beliebigen darauffolgenden Aminosäure. Eine Übersicht über bisher eingesetzte enzymatische Verfahren zur Spaltung von Proteinfusionen wurde von F.A.O. Marston (In (D. M. Glover, Ed.): DNA cloning III, IRL PRESS Oxford und Washington DC, 1987) verfaßt. Auch enzymatische Spaltverfahren werden dadurch eingeschränkt, daß die für die Spaltstelle spezifische(n) Aminosäure(n) zugleich auch in dem erwünschten Protein selbst vorkommen können. Zur biochemischen Spaltung von Proteinfusionen eignen sich daher besonders Enzyme, die zur Spaltung nicht nur eine Aminosäure, sondern eine Abfolge von Aminosäuren erkennen; denn die Wahrscheinlichkeit, daß eine bestimmte Aminosäureabfolge außer in der Spaltstelle zwischen den Fusionspartnern in dem erwünschten Protein selbst noch einmal vorkommt, ist um so geringer je größer die Anzahl der für die Erkennung und Spaltung einer Spaltsequenz notwendigen Aminosäuren ist.

Proteasen, die ein bestimmtes Protein sehr spezifisch schneiden, sind bekannt. Die Mehrzahl solcher selektiver Proteasen (die z. B. im Komplement- und Blutgerinnungsystem des Menschen vorkommen) spaltet zwar an einer definierten Stelle des Substrats; bei Übertragung der entsprechenden Spaltregion in ein anderes Protein (z. B. eine Protein-Fusion) sind derartige Proteasen im Regelfall jedoch nicht mehr in der Lage zu spalten. Die Gründe hierfür sind vielfältig und liegen bespielsweise in der Erkennung einer bestimmten Sekundär- oder Tertiär-Struktur im Substrat durch die Protease oder in der Unzugänglichkeit der Spaltstelle in Proteinfusionen.

Die Liste sequenzspezifischer Proteasen, die für die Spaltung von Proteinfusionen bisher bedingt eingesetzt werden, wird zur Zeit von dem Faktor Xa angeführt. Diese Protease schneidet spezifisch die Spaltsequenz

Ile-Glu-Gly-Arg^-1-X,

wobei ^-1- die Spaltstelle und X eine beliebige Aminosäure angibt. Es zeigt sich jedoch, daß auch diese Protease nicht generell zur Spaltung von Proteinfusionen, die eine entsprechende Spaltsequenz in ihrer Übergangsregion tragen, einsetzbar ist; häufig werden solche Substrate (d. h. Proteinfusionen, die ein erwünschtes Protein kovalent gebunden an ein Trägerprotein enthalten) überhaupt nicht, nur zu einem geringen Ausmaß oder nur in löslicher Form gespalten.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur biochemischen (enzymatischen) Spaltung von Proteinfusionen so zu verbessern, daß gentechnologisch hergestellte Proteinfusionen, bestehend aus beliebigen Fusionspartnern und einer spezifischen Spaltsequenz in der Übergangsregion, als Substrat für die Gewinnung erwünschter Proteine mit hoher Ausbeute und reproduzierbar eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe wurde gentechnologisch gelöst durch den Einbau der Spaltsequenz, Pro^-1-X-Pro, in die Übergangsregion von Proteinfusionen und durch die spezifische Spaltung dieser Spaltsequenz durch Igase an der mit ^-1- bezeichneten Spaltstelle, wobei X vorzugsweise für die Aminosäuren Ser, Thr und Ala steht, aber auch für andere Aminosäuren stehen kann.

Verschiedene pathogene Bakterienarten der Gattung Neisseria, wie Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis und der Gattung Haemophilus wie Haemophilus influenzae und Haemophilus aegypticus geben extrazellulär Proteasen ab (die in ihrer Sequenz untereinander nahe verwandt sind und deshalb hier zusammenfassend als Igase bezeichnet werden), die menschliches IgAl an spezifischer Stelle spalten. Die Bildung dieses Enzyms des Bakteriums Neisseria gonorrhoeae MS11 im authentischen Bakterienstamm sowie in gramnegativen Wirtszellen wurde zuvor ausführlich beschrieben (DE-36 22 221.6) und konnte inzwischen durch weitere Befunde belegt und für die Familie der oben genannten Igasen generalisiert werden.

Diese Arbeiten erbrachten erstmals den Nachweis, daß Igase nicht nur - wie zuvor angenommen - menschliches IgAl spalten kann, sondern daneben auch ihr eigenes Vorläuferprotein, aus dem das Enzym durch Autoproteolyse reift. Die im Vorläuferprotein von Igase des Stammes Neisseria gonorrhoeae MS11 gefundenen Spaltsequenzen sind

(a) Pro-Ala-Pro^-1-Ser-Pro,
(b) Pro-Pro^-1-Ser-Pro und
(c) Pro-Arg-Pro-Pro^-1-Ala-Pro,

wobei ^-1- die Spaltstelle angibt. Weiterhin ist auch noch eine Spaltsequenz

(d) Pro-Pro^-1-Thr-Pro

bekannt. Diese Spaltsequenzen sind bei einem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt. Aus diesen Spaltsequenzen ergibt sich die Konsensus-Spaltsequenz

ProX-Pro

für die Igase.

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet, daß eine Igase- Erkennungsstelle mit mindestens der Konsensus-Spaltsequenz nun in die Übergangsregion einer beliebigen Proteinfusion zwischen Trägerprotein und erwünschtem Protein eingebracht und zur Abspaltung und Gewinnung des erwünschten Proteins durch Igase benutzt werden kann. Dabei werden in der Spaltsequenz

Pro^-1-X-Pro

vorzugsweise die Aminosäuren Ser oder Thr in der Position X eingesetzt. Zur weiteren Optimierung der Spaltung an der bezeichneten Stelle können der Spaltsequenz weitere spezielle Aminosäuren vorgeschaltet werden, insbesondere die Aminosäure Pro.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Spaltung von Proteinfusionen, in denen das erwünschte Protein einem Trägerprotein nachgeschaltet ist, entsteht nach Spaltung durch Igase ein Protein, dessen Aminoterminus durch die Sequenz X-Pro charakterisiert ist. Diese Sequenz kann als Teil des erwünschten Proteins von Vorteil, nachteilig ober aber belanglos sein. Von Vorteil ist diese Sequenz im allgemeinen dann, wenn das gentechnologisch dargestellte erwünschte Protein auch in seiner natürlichen Form die entsprechenden beiden Aminosäuren X-Pro an seinem Aminoterminus enthält. Durch ein aminoterminales X-Pro charakterisierte Proteine, die biotechnologisch wichtig sind, kommen in der Natur vor.

Für den Fall, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren ein Protein entsteht, welches an seinem Aminoterminus das unerwünschte Dipeptid X-Pro trägt, dann kann dieses unerwünschte Dipeptid als Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die weitere Behandlung mit Dipeptidylaminopeptidasen (DPAP) abgetrennt werden. Dipeptidylaminopeptidasen wurden bisher bei einer Reihe von Mikroorganismen, Insekten, Amphibien und in verschiedenen menschlichen Geweben gefunden. Sie dienen z. B. zur schrittweisen Prozessierung von Vorläuferproteinen und besitzen zum Teil ausgeprägte Spezifität für den aminoterminalen Abbau des Dipeptids X-Pro (X-Pro-DPAPase; G. Kreil, Trends in Biochemical Sciences 15, 23-26, 1990). Durch die erfindungsgemäße Kombination von Igase und X-Pro-DPAP können daher erwünschte Proteine mit beliebigen aminoterminalen Aminosäuren hergestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber allen anderen bekannten Verfahren zur Spaltung von Proteinfusionen die Vorzüge, daß es universell auf Proteinfusionen, die in ihrer Übergangsregion die angegebene Spaltsequenz tragen, anwendbar ist und daß es sowohl auf unlösliche, lösliche, membranassoziierte und zellgebundene Proteinfusionen angewendet werden kann. Als besonderen Vorteil bietet das Verfahren darüber hinaus die Möglichkeit, Proteinfusionen in Form von Präzipitationskörpern zu spalten, derart wie sie in Mikroorganismen anfallen und von wo sie als solche leicht angereichert werden können. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß das verwendete Spaltenzym, Igase, mit geringem Aufwand aus Kulturmedien von nichtpathogenen Bakterien gewonnen werden kann.

Der Einbau der Spaltsequenz für Igase in die Übergangsregion einer Proteinfusion erfolgt durch gentechnische Mittel. So kann beispielsweise eine Abfolge von Nukleotiden, die für eine Spaltsequenz kodiert, chemisch synthetisiert und zwischen die Gene für ein Trägerprotein und ein erwünschtes Protein mittels bekannter gentechnischer Mittel eingebaut werden. Entsprechend kann eine natürliche Abfolge von Nukleotiden, die für eine geeignete Spaltsequenz kodiert, eingebaut werden. Das für eine Proteinfusion kodierende Gen wird vorzugsweise unter die Kontrolle von geeigneten (beispielsweise induzierbaren) Expressionssignalen gestellt, so daß eine den Anforderungen entsprechende Produktion von Proteinfusionen ermöglicht wird. Als Wirtszellen für die Produktion von Proteinfusionen können geeignete prokaryontische oder eukaryontische (pflanzliche wie tierische) Zellen verwendet werden; aber auch zellfreie Systeme sind möglich. Die dabei verwendeten Trägerproteine können beliebige Funktionen beinhalten, jenachdem welche Eigenschaften sie einer Proteinfusion verleihen sollen wie bestimmte Transportfunktionen, Funktionen, die die Aufreinigung der Proteinfusion oder deren Stabilität verbessern und vieles mehr.

Die dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechende Spaltung von Proteinfusionen erfolgt bevorzugt mit Igase, die von einem überproduzierenden nicht-pathogenen Stamm gebildet und durch Reinigung aus Kulturüberständen gewonnen wird (DE-36 22 221.6).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für präparative wie auch für analytische Zwecke eingesetzt werden. Bei präparativem Einsatz dient das Verfahren der biotechnologischen Gewinnung wichtiger Proteine, die z. B. in der Medizin, in der Forschung, im Umweltschutz oder bei industriellen Prozessen bzw. Produkten Verwendung finden können. Bei analytischem Einsatz kann das Verfahren beispielsweise in Verbindung mit geeigneten Expressionssystemen zur Routineuntersuchnung von Genfusionen dienen.

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Proteinfusion, die mehrere Polypeptidanteile enthält und die in mindestens einer Übergangsregion zwischen verschiedenen Polypeptidanteilen eine oder mehrere Igase-Erkennungsstellen mit der Aminosäuresequenz Pro^-1-X-Pro aufweist, wobei X eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise jedoch Ser, Thr oder Ala bedeutet. Besonders bevorzugt besitzt die Erkennungsstelle die Aminosäure sequenz

(a) Pro-Ala-Pro^-1-Ser-Pro,
(b) Pro-Pro^-1-Ser-Pro,
(c) Pro-Arg-Pro-Pro^-1-Ala-Pro oder
(d) Pro-Pro^-1-Thr-Pro,

wobei ^-1- die Spaltstelle angibt.

Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombinante DNA, die für eine erfindungsgemäße Proteinfusion kodiert und worin in mindestens einer Übergangsregion der Proteinfusion eine oder mehrere Igase-Erkennungsstellen bzw. Spaltsequenzen eingebaut sind.

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein rekombinanter Vektor, der eine oder mehrere Kopien einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA enthält. Dieser Vektor ist günstigerweise ein solcher, der eine hohe Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA erlaubt. Solche Vektoren, die sich jeweils für die Genexpression in einem bestimmten Wirtsorganismus eignen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig. Es kann sich dabei um einen eukaryontischen oder einen prokaryontischen Vektor handeln. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein Vektor, der zur Expression der erfindungsgemäßen DNA in Prokaryonten geeignet ist.

Weiterhin beinhaltet die vorliegende Erfindung auch eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen DNA oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist.

Schließlich beinhaltet die Erfindung auch eine rekombinante DNA, die einen für eine (oben definierte) Igase-Erkennungsstelle kodierenden Bereich enthält und zum Einbau in eine Übergangsstelle von Proteinfusionen geeignet ist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um ein chemisch synthetisiertes DNA-Fragment, an dessen Enden sich günstigerweise eine oder mehrere geeignete Restriktionsschnittstellen befinden.

Definitionen

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die biotechnologische Gewinnung erwünschter Proteine. Unter biotechnologisch versteht sich in diesem Zusammenhang, daß ein erwünschtes Protein oder ein Zwischenprodukt desselben unter Verwendung gentechnologischer Mittel und anderer biotechnologischer Verfahren (z. B. der Fermentation von Mikroorganismen) hervorgeht.

Ein erwünschtes Protein ist ein Zwischenprodukt oder ein Endprodukt, das z. B. im Bereich der Medizin, der Forschung, im Umweltschutz oder bei industriellen Prozessen bzw. Produkten Verwendung finden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet, daß ein erwünschtes Protein aus einer Proteinfusion gebildet wird, die sich ihrerseits aus mehreren kovalent miteinander verbundenen Fusionspartnern zusammensetzt. Dabei stellt wenigstens einer der Fusionspartner ein erwünschtes Protein dar. Die Reihenfolge der Fusionspartner und deren Wiederholungsgrad in einer Proteinfusion ist beliebig; im Normalfall besteht sie jedoch aus einem aminoterminalen Trägerprotein und einem karboxyterminalen erwünschten Protein.

Ein Trägerprotein dient dazu, dem erwünschten Protein in Form einer Proteinfusion besondere Eigenschaften zu verleihen. Derartige Eigenschaften können sich beispielsweise in einer erhöhten Stabilität der Proteinfusionen äußern, die auf strukturellen Besonderheiten und damit einhergehend höherer Resistenz gegenüber zellulären Proteasen oder aber auf dem Transport der Proteinfusionen in eine Umgebung mit geringer proteolytischer Aktivität beruhen. Darüber hinaus können im Trägerprotein Eigenschaften enthalten sein, die eine effiziente Reinigung der Proteinfusion erlauben. Dazu gehört z. B. die Bindung von bestimmten Liganden in Zusammenhang mit affinitätschromatographischen Methoden, die Ablagerung der Proteinfusionen in mit geringem Aufwand abtrennbaren Präzipitationskörpern und der Transport der Fusionen an leicht zugängliche Orte.

Die Bereiche innerhalb einer Proteinfusion, in denen die Komponenten (Trägerproteine und erwünschte Proteine) einer Proteinfusion miteinander in Verbindung treten, werden als Übergangsregionen bezeichnet.

Eine jede Übergangsregion kann durch eine oder mehrere Aminosäureabfolgen definiert sein. Die Aminosäureabfolgen (wie auch alle übrigen Folgen von Aminosäuren und Proteinen) werden von aminoterminal (links) in Richtung karboxyterminal (rechts) verstanden und dargestellt.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten all diejenigen Aminosäureabfolgen in Übergangsregionen, die durch Igase spaltbar sein sollen, die erfindungsgemäße Spaltsequenz.

Diejenige Stelle zwischen zwei Aminosäuren einer Aminosäureabfolge, an der die Spaltung von Proteinfusionen erfolgt wird als Spaltstelle bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die enzymatische Spaltung von Proteinfusionen in den Übergangsregionen durch Igase. Unter Igase werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die IgA-Protease des Stammes Neisseria gonorrhoeae MS11 und alle anderen mit dieser Protease auf Nukleotidebene und in ihrem Bildungsprozeß verwandten Enzyme verstanden. Hierunter zählen insbesondere auch die IgA-Proteasen der Genera Neisseria und Haemophilus.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit der Zeichnung erläutert.

In der Zeichnung stellen dar:

Fig. 1 zeigt schematisch die Proteinfusion zwischen dem Trägerprotein MS2-Polymerase (99 Aminosäuren) und der β-Domäne (Aminosäureposition 1195-1505) des IgA-Protease-Vorläufers aus N.gonorrhoeae MS11. Die Übergangsregion zwischen diesen beiden Anteilen besteht aus 12 Aminosäuren und enthält die Spaltsequenz

-Pro-Pro^-1-Thr-Pro-

für Igase. Für die Konstruktion der Spaltstelle wurden die vier Oligonukleotide (1) bis (4) zwischen die Restriktionsschnittstellen EcoRI und HindIII eingebaut. Die Herstellung des Polypeptids und die Spaltung mit gereinigter Igase sind unter Beispiel 1 näher erläutert.

Fig. 2 zeigt eine Proteinfusion bestehend aus dem Trägerprotein (99 Aminosäuren der MS2-Polymerase und 6 Plasmid-kodierte Aminosäuren) und 206 Aminosäuren vom CD8-Protein menschlicher T-Lymphozyten. In der Aminosäureabfolge des CD8-Proteins befindet sich eine natürliche Spaltsequenz die durch Igase gespalten wird (siehe Beispiel 2).

Fig. 3 zeigt die Proteinfusion B63*, die mittels eines Expressions-Sekretionssystems von E. coli Zellen produziert wurde. Sie besteht am Aminoende aus der Choleratoxin B Untereinheit (103 Aminosäuren), gefolgt von einer Verbindungsregion (11 Aminosäuren) mit der Igase Spaltstelle und am Karboxylende einem Teil (Aminosäureposition 1097-1160) der β-Domäne des IgA-Protease- Vorläufers. Die Igase Schnittstelle wurde mittels der beiden Oligonukleotide Tk006 und Tk007 zwischen die beiden Proteindomänen eingebaut.

Fig. 4 zeigt schematisch die Proteinfusionen B49 und B59. Sie bestehen aus der Choleratoxin B Untereinheit und der β-Domäne des IgA-Protease-Vorläufers. Zwischen diesen Anteilen enthalten sie zwei unterschiedliche Übergangsregionen mit zwei verschiedenen Igase Spaltsequenzen (-Pro-Pro-Ala-Pro- und -Pro-Pro-Thr-Pro-). Die Spaltsequenz wurde mit synthetischen Oligonukleotiden konstruiert (siehe Fig. 3).

Beispiele Beispiel 1 Herstellung einer Proteinfusion und Spaltung unlöslicher Protein- Aggregate aus "Inclusion Bodies" an einer Igase spezifischen Schnittstelle

Der prokaryontische Expressionsvektor pEX31C (K. Strebel, Journal of Virology 57, 983-991, 1986) wurde in solcher Weise modifiziert, daß eine mit diesem System in E. coli Zellen überproduzierte Proteinfusion durch Igase in das Trägerprotein und das gewünschte Protein aufgespalten werden konnte. Hierfür wurde aus synthetisch hergestellten Oligonukleotiden ein doppelsträngiges DNA-Fragment zusammengesetzt, welches für die Aminosäuresequenz

Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro^-1-Thr-Pro

kodiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit gentechnologischen Methoden in die EcoRI-Schnittstelle des Expressionsvektors pEX31C eingesetzt. Darüber hinaus wurden direkt angrenzend in die HindIII Schnittstelle zwei weitere synthetische DNA-Fragmente eingefügt, welche eine Reihe geeigneter Schnittstellen für Restriktions-Endonukleasen und Terminations- Signale für die an der Genexpression beteiligten bakteriellen Enzyme enthielten. In das so entstandene Expressionsplasmid pEV37 wurde unter Benutzung der Schnittstellen für SmaI und HindIII ein DNA Fragment eingesetzt, das für die β-Domäne des IgA-Protease Vorläuferproteins aus Neisseria gonorrhoeae MS11 kodiert. Dadurch entstand ein hybrides Gen, bei dessen Ausprägung in E. coli ein Fusionsprotein gebildet wurde. Dieses enthielt am Aminoende als Trägerprotein 99 Aminosäuren der MS2-Polymerase, gefolgt von einer zentralen Übergangsregion von 12 Aminosäuren mit der Igase Spaltsequenz und der gewünschten β-Domäne am Karboxylende (siehe Fig. 1). Mit gereinigter Igase lies sich die β-Domäne vom Karboxylende der Proteinfusion an der Spaltstelle Pro^-1-Thr innerhalb der Übergangsregion abspalten.

Das Plasmid mit dem hybriden Gen wurde durch Transformation in E. coli Zellen eingebracht, die für die regulierbare Überproduktion der Proteinfusion den Regulationsfaktor CI⁸⁵⁷ aus dem Bakteriophagen Lambda enthielten (E. Remaut, Gene 22, 103-113, 1983). Durch Temperaturerhöhung von 28°C auf 42°C wurde der CI⁸⁵⁷- Repressor inaktiviert und infolgedessen die Proteinproduktion in den rekombinanten E. coli Zellen aktiviert. Hierzu wurden 50 ml einer 12 h bei 28°C gewachsenen E. coli Kultur in 200 ml, zuvor auf 45°C vorgewärmtes Medium überführt und 2 Stunden bei 42°C weiter kultiviert. In diesem Schritt wurde die Proteinfusion im Zytoplasma der Bakterien in großen Mengen in Form von "Inclusion Bodies" angereichert. Die Bakterien wurden danach durch Zentrifugation geerntet, in 20 ml Lysepuffer (10% Saccharose, 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) suspendiert und nach Zugabe von 400 µl Lysozymlösung (5 mg/ml) 30 min bei 22°C inkubiert. Das Detergenz TritonX-100 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben und die Lösung erneut 30 min inkubiert. Die bei der Lyse der Zellen freigesetzte DNA wurde durch Ultraschall-Behandlung zerkleinert, die unlöslichen Bestandteile, u. a. die in Präzipitationskörpern vorliegende Proteinfusion, wurden abzentrifugiert und anschließend in 5 ml HlNTE-Puffer (1 M Harnstoff, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren wurde das Sediment durch Beschallen in 5 ml PBS-Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7.5, 140 mM NaCl) suspendiert und gewaschen. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt um Harnstoff-Rückstände vollständig zu entfernen. Schließlich wurde die unlösliche Fraktion, die das Fusionsprotein enthielt durch Beschallen in 5 ml PBS-Puffer suspendiert.

Die Qualität und die Menge der suspendierten Proteinfusion wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12,5%) und anschließender Färbung mit Coomassie-Blau bestimmt. Zur Spaltung wurde die Proteinsuspension in einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/100 (W/W) 3 h bei 37°C inkubiert. Die erfolgte Spaltung der ungereinigten und unlöslichen Proteinfusion wurde durch analytische SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht, wobei sich ergab, daß ein Polypeptid in der für das b-Protein erwarteten Größe entstanden war. Dieses Protein wurde auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und einer automatisierten Sequenzanalyse unterworfen. Die Abfolge der endständigen Aminosäuren bestätigte seine Entstehung aus der Proteinfusion durch korrekte Spaltung an der vorhandenen Igase-Spaltstelle.

Bei der Spaltung wurden jedoch nur bis zu etwa 50% der Gesamtmenge des eingesetzten Substrats umgesetzt. Durch Zugabe größerer Mengen Igase und durch längere Reaktionszeiten keine Steigerung erzielt werden. Dies deutet darauf hin, daß im ungeschnittenen Anteil des Fusionsproteins die Schnittstelle für Igase nicht zugänglich ist. Hybridprotein und Spaltprodukte lagen auch nach der Inkubation mit Igase weiterhin in Form unlöslicher Aggregate vor und ließen sich demzufolge aus der Suspension durch Zentrifugation sedimentieren.

Spaltungs-Ausbeuten bis zu 90% wurden erzielt wenn anstatt der unsauberen "Inclusion Body"-Fraktion eine Proteinfusion eingesetzt wurde, die zuvor einem zusätzlichen Aufreinigungsschritt unterworfen worden war. Dazu wurde das unlösliche Sediment nach dem Waschen in HlNTE-Puffer (s. o.) in 5 ml H7NTE-Puffer (7 M Harnstoff, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) aufgenommen. Unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt und die lösliche Fraktion gegen 5 l PBS- Puffer bei 4°C dialysiert. Bei der Entfernung des Harnstoffes durch Dialyse präzipitierte das Fusionsprotein aus der Lösung in Form von unlöslichen Aggregaten. Die ausgefallenen Aggregate wurden durch Ultraschall-Behandlung in eine feine Suspension überführt und wie oben beschrieben mit Igase gespalten und analysiert.

Beispiel 2 Spezifische Spaltung einer renaturierten, löslichen Proteinfusion mit Igase

Unter Verwendung des pEX-Expressionssystems wurde ein Hybridprotein hergestellt (siehe Beispiel 1), welches aus der MS2- Polymerase und einem Teil des CD8-Proteins menschlicher cytotoxischer T-Lymphozyten besteht (siehe Fig. 2). Nach der Vorreinigung und dem Lösen des Proteins aus "Inclusion Bodies" in H7NTE-Puffer wurde als weiterer Reinigungsschritt ein präparatives 12,5% SDS-Polyacrylamidgel eingesetzt. Die Proteinfusion wurde als einzelne Bande nach dem Färben mit Coomassie-Blau aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend nach der Methode von Hunkapiller (Methods in Enzymology 91, 227-235, 1983) vom Gelmaterial getrennt. Die Elektroelution erfolgte dabei in TAE-Puffer (40 mM Tris/Acetat, pH 7.8) dem 0,1% SDS (Natriumlaurylsulfat) zugesetzt war. Das SDS wurde später durch Dialyse gegen 5 1 TAE-Puffer bei 22°C entfernt. In einer weiteren Dialyse wurde das Protein in Aufbewahrungspuffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7.5, 140 mM NaCl, 50% Glycerin) überführt. Das somit erhaltene lösliche Fusionsprotein wurde mit gereinigter Igase inkubiert (siehe Beispiel 1) und dabei vollständig an einer im CD8 Molekül enthaltenen Spaltstelle

(-Pro-Pro^-1-Thr-Pro-Ala-, siehe Fig. 2)

in zwei Polypeptid-Fragmente gespalten. Die Spezifität der Spaltung wurde durch Analyse der Aminosäureabfolge am Aminoende des kleineren Spaltproduktes überprüft. Dabei ergab sich wie erwartet die Sequenz Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile.

Beispiel 3 Spezifische Spaltung einer löslichen, aus Kulturüberständen gewonnener Proteinfusion mit Igase

Eine Proteinfusion bestehend aus der Choleratoxin B Untereinheit und einem Teil der b-Domäne (Pos. 1097-1160; J. Pohlner, Nature 325, 458-462, 1987) des IgA-Protease-Vorläufers aus N.gonorrhoeae MS11 wurde in löslicher Form aus Kulturüberständen rekombinanter E. coli Zellen gewonnen. Um die beiden Proteinanteile voneinander trennen zu können, war in die Übergangsregion zwischen der Choleratoxin B Untereinheit und der β-Domäne mit gentechnologischen Methoden eine künstliche Spaltsequenz für Igase (-Pro-Pro.!.Thr-Pro-) eingesetzt worden. Hierfür waren die Oligonukleotide Tk006 und Tk007 zwischen die Restriktions schnittstellen EcoRI und SacII in der Übergangsregion eingesetzt worden (siehe Fig. 3). Das Fusionsprotein wurde aus 2 l Überstand einer 12 h bei 37°C gewachsenen Bakterienkultur durch Fällung mit Ammoniumsulfat angereichert und anschließend gegen 5 l PBS-Puffer dialysiert. Zur Spaltung wurde es in einer Konzentration von 50 µg/ml in PBS-Puffer in einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/50 (W/W) mit gereinigter Igase für 2 h bei 37°C inkubiert. Eine Immunblot-Analyse zeigte, daß das bei der vollständigen Spaltung auftretende größere Spaltfragment in seinem Molekulargewicht und in seiner Reaktion mit Antiserum der natürlichen Choleratoxin B Untereinheit entsprach.

Beispiel 4 Spezifische Spaltung von Proteinfusionen auf der Oberfläche Gram negativer Bakterien mittels Igase

Ein Expressions-Sekretionssystem wurde benutzt, um die Proteinfusionen TKB49 und TKB59 bestehend aus der Choleratoxin B Untereinheit und der IgA-Protease β-Domäne auf der Oberfläche von rekombinanten Salmonellen nach außen zu exponieren. Das für TkB49 kodierende hybride Gen enthielt in der Übergangsregion zwischen der Toxin- und der β-Domäne die Original-Spaltsequenz (c)

(-Pro- Pro^.!.Ala-Pro-)

für die Igase. Dagegen wurde in das Gen für TkB59 ein künstliches DNA-Fragment, bestehend aus den Oligonukleotiden Tk006 und Tk007 zwischen die Restriktionsschnittstellen EcoRI und SacII eingesetzt, das für die Spaltsequenz

(-Pro-Pro^.!.Thr-Pro-)

kodierte (siehe Fig. 3). Wurden intakte Bakterien, die solche an ihrer Oberfläche verankerten Proteinfusionen trugen, mit gereinigter Igase inkubiert, dann konnte die spezifische Spaltung an den Igase Schnittstellen beobachtet werden. In Immunblot- Analysen wurde gezeigt, daß die bei der Spaltung auftretenden kleinen Spaltfragmente in ihrer Größe und Reaktion mit Antiserum der natürlichen Choleratoxin B Untereinheit entsprachen.

Beispiel 5 Aufreinigung aktiver Igase aus Kulturüberständen rekombinanter E. coli Zellen

Rekombinante E. coli C600 Zellen, die das Plasmid pEX1070 (DE 36 22 221.6) mit einem modifizierten IgA-Proteasegen enthalten, sekretieren die aktive Igase in den Kulturüberstand. Durch Membranfiltration konnte das Enzym im Kulturüberstand angereichert und anschließend mit Ammoniumsulfat (0,42 g/ml) aus der Lösung ausgefällt werden. Nach Zentrifugation wurde das Sediment in Biorex-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.0, 8,6% Glyzerin) gelöst (1 ml Puffer pro 1 l Kulturüberstand), durch Dialyse gegen 2 l Puffer äquilibriert und anschließend einer Kationenaustausch- Chromatographie (Biorex70) unterworfen. Die gebundene IgA-Protease wurde in einem Schritt mit Elutions-Puffer (500 mM Kaliumphosphat, pH 7.0, 8,6% Glyzerin) von der Säule eluiert und fraktioniert.

IgA-Protease enthaltende Fraktionen wurden anschließend durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12,5%) analysiert. An diesem Punkt der Aufreinigung ergab sich ein durchschnittlicher Reinheitsgrad von <90%. Für die Darstellung der Igase in reiner Form wurden eine Gelfiltration mit Sephacryl HR300 in Biorex- Puffer, gefolgt von einer weiteren Kationenaustausch- Chromatographie (s. o.), durchgeführt. Die Aktivität der Igase wurde durch Inkubation mit IgAl Antikörpern und Auftrennung der entstandenen Spaltprodukte im SDS-Polyacrylamidgel getestet.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Protein fusionen, dadurch gekennzeichnet, daß man mit gentechnischen Mitteln eine oder mehrere Igase- Erkennungsstellen mit der Aminosäuresequenz Pro^.!.X-Pro in eine Übergangsregion einer Proteinfusion einbaut, wobei X eine beliebige Aminosäure bedeuten kann, die resultierende Proteinfusion durch Behandlung mit Igase an der mit ^.!. bezeichneten Position der Erkennungsstelle spaltet und einen oder mehrere erwünschte Anteile der Proteinfusion gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein für eine Igase-Erkennungsstelle kodierendes DNA-Frag ment vor oder/und hinter einen für einen erwünsch ten Anteil der Proteinfusion kodierenden DNA- Abschnitt einbaut.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein chemisch synthetisiertes DNA-Fragment verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere Igase-Erkennungsstellen in eine Übergangsregion einer Proteinfusion ein baut, die neben einem erwünschten Anteil noch einen oder mehrere, die Gewinnung der Proteinfusion er leichternde Trägeranteile enthält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der erwünschte Anteil der Proteinfusion mit der Aminosäuresequenz X-Pro beginnt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Spaltung mit der Igase den erwünschten Anteil der Proteinfusion in einem weiteren Schritt mit einer Dipeptidyl-Aminopeptidase behandelt und die N-ter minale Sequenz X-Pro abspaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Abspaltung der N-terminalen Sequenz X-Pro eine X- Pro-Dipeptidylaminopeptidase verwendet.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß X Ser, Thr oder Ala bedeutet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß X Ser oder Thr bedeutet.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Igase-Erkennungsstelle die Aminosäuresequenz

(a) Pro-Ala-Pro^.!.Ser-Pro,
(b) Pro-Pro^.!.Ser-Pro,
(c) Pro-Arg-Pro-Pro^.!.Ala-Pro oder
(d) Pro-Pro^.!.Thr-Pro

besitzt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Igase verwendet, die aus pathogenen Bakterienarten der Gattung Neisseria, insbesondere Neisseria gonorrhoe und Neisseria meningitidis oder der Gattung Haemophilus, insbesondere Haemophilus influenzae und Haemophilus aegypticus oder von einer derartigen Igase durch Modifikationen abge leitetem Protein stammt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Igase verwendet, die aus einem überproduzierenden nicht-pathogenen Bakterienstamm gewonnen wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteinfusion aus einem Mikroorganismus gewinnt, der mit einer für die Proteinfusion ko dierenden DNA oder einem für die Proteinfusion kodierenden Vektor transformiert ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine lösliche, unlösliche, membranasso ziierte oder zellgebundene Proteinfusion spaltet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine als unlöslicher Präzipitationskörper vorliegende Pro teinfusion spaltet.

16. Proteinfusion, die mehrere Polypeptid-Anteile ent hält, dadurch gekennzeichnet, daß sie in min destens einer Übergangsregion zwischen den jewei ligen Polypeptid-Anteilen eine oder mehrere Igase- Erkennungsstellen mit der Aminosäuresequenz Pro^.!. X-Pro aufweist, wobei X eine beliebige Aminosäure bedeuten kann.

17. Proteinfusion nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X Ser, Thr oder Ala bedeutet.

18. Proteinfusion nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle die Aminosäuresequenz

besitzt.

19. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine Proteinfusion nach einem der Ansprüche 16 bis 18 kodiert, worin in mindestens einer Übergangsregion eine oder mehrere Igase-Erkennungsstellen eingebaut sind.

20. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA nach An spruch 19 enthält.

21. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sich die rekombinante DNA unter Kontrolle eines induzierbaren Expressionssignals befindet.

22. Zelle, dadurch gekennzeich net, daß sie mit einer DNA nach Anspruch 19 oder einem Vektor nach Anspruch 20 oder 21 trans formiert ist.

23. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine Igase-Erkennungsstelle kodierenden Bereich enthält, der für eine Aminosäuresequenz Pro^.!.X-Pro ko diert, worin X eine beliebige Aminosäure, insbe sondere Ser, Ala oder Thr bedeutet und zum Einbau in eine Übergangsstelle von Proteinfusionen ge eignet ist.

24. Rekombinante DNA nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein chemisch synthetisiertes Fragment ist, an dessen Enden sich eine oder mehrere Restriktionsschnitt stellen befinden.