DE3320339C2

DE3320339C2 -

Info

Publication number: DE3320339C2
Application number: DE3320339A
Authority: DE
Inventors: Atsuo Toyonaka Osaka Jp Nakata; Hideo Minoo Osaka Jp Shinagawa
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1982-06-04
Filing date: 1983-06-04
Publication date: 1990-08-23
Also published as: GB2124232A; DE3320339A1; JPS592689A; SE8303068L; SE8303068D0; SE459816B; FR2528070B1; GB8315278D0; JPH0116159B2; US4703005A; FR2528070A1; NL189208C; CA1202258A; NL8301986A; BE896957A; GB2124232B; NL189208B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Expressionsvektor mit einem DNS-Fragment (DNA), der eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen enthält, sowie auf ein Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung (vgl. die Ansprüche 1, 3 und 7). Die Ansprüche 2 und 4 bis 6 beinhalten Ausgestaltungen der Erfindung.

Unter dem Begriff der "Genexpression" wird hier die Translation aus einer Genkodierung für eine Polypeptidsequenz in das Polypeptid verstanden. In der Genexpression wird die Kodierung in einer DNS-Kette für die Polypeptidsequenz zuerst in eine komplementäre Ribonucleinsäure transkribiert, in eine sogenannte Boten-RNS, und anschließend findet die Translation der so transkribierten Boten-RNS in das vorgenannte Polypeptid statt.

1970 wurde die Technik der Umwandlung von Escherichia coli entdeckt (M. Mandel und A. Higa, Journal of Molecular Biology, 53 (159-162 (1970)), und man fand ein Restriktionsenzym (H. O. Smith, und K. W. Wilcox, Journal of Molecular Biology, 51, 379-391 (1970)). Diese Erkenntnisse führten zu einem raschen Fortschritt in der Gentechnik und in der Zelltechnologie. Beispielsweise wurde auf der Basis dieser Erkenntnisse die grundlegende Technik der Genrekombination entwickelt, wie sie in der US-PS 42 37 224 beschrieben ist. Des weiteren wurden neue Vektoren entwickelt, sowie Verfahren zur Herstellung nutzbringender Substanzen mit Hilfe der Gentechnik. Die genannten neuen Vektoren sind beispielsweise in der DT-OS 27 12 615, in der FR-PS 24 41 659, der US-PS 42 73 875, in der PCT-Anmeldung WO 79/01 169, der GB-PS 20 52 516 und in der EPC-PS 32 238 beschrieben. Die vorgenannten Verfahren zur Herstellung nutzbringender Substanzen sind beispielsweise in der US-PS 43 75 514 beschrieben.

Aus all den vorgenannten Veröffentlichungen geht jedoch nur hervor, daß die gewünschten nützlichen Substanzen mit Hilfe der Genexpression hergestellt werden können. Die Techniken, die in den genannten Veröffentlichungen zum Stand der Technik beschrieben sind, haben jedoch den Nachteil, daß die Ausbeute an den gewünschten Nutzsubstanzen nicht hoch genug ist. Aus diesem Grund besteht auf diesem Gebiet der ernstgemeinte Wunsch nach Entwicklung eines Expressionsvektors, der zur Herstellung von nutzbringenden Substanzen mit hoher Ausbeute geeignet ist.

Unter dem Gesichtspunkt des industriellen Einsatzes der Gentechnik und im Hinblick auf eine Senkung der Kosten zur Herstellung von nutzbringenden Substanzen bestand hier der Wunsch, einen Expressionsvektor zu entwickeln, der sich durch eine große Genexpressionskraft auszeichnet. Die grundlegenden Techniken zur Genrekombination sind in den Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A., 70, 3240-3244 (1973) und 71, 1743-1747 (1974) beschrieben, doch wurde in diesen Veröffentlichungen kein allgemeines Verfahren zur Isolierung eines Gens vorgeschlagen, das sich durch eine hohe Genexpressionskraft auszeichnet und aus einer großen Anzahl natürlich vorkom mender Gene isoliert wird, woraus sich bei der Lösung der genannten Aufgabenstellung Schwierigkeiten ergeben.

Zur vorliegenden Erfindung wurden umfangreiche intensive Untersuchungen und Studien zur Lösung dieses Problems durchgeführt, mit dem Ergebnis, daß eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein gefunden wurde, die einen Expressionsvektor mit äußerst starker Genexpression - verglichen mit den bis dahin bekannten Vektoren - ergibt. Dann wurde mit Erfolg ein solcher Expressionsvektor hergestellt, der eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führt, wobei man die Kloniertechnik mit großem Erfolg einsetzte. Diese neuen Erkenntnisse und Erfolge bilden die Grundlage der vorliegenden Erfindung.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Expressionsvektor zu entwickeln, der sich durch seine hohe Genexpressionskraft auszeichnet, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Genexpressionsvektors zu ent wickeln, und die Verwendung zur Erzeugung von physiologisch aktiven Substanzen mit hoher Ausbeute unter Einsatz eines Expressionsvektors der vorgenannten Art mittels Genexpression zu schaffen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.

Der erfindungsgemäße Expressionsvektor wird durch ein Verfahren mit folgenden Verfahrensschritten hergestellt:

1) Gewinnung einer chromosomalen DNS (DNA) mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein aus Bakterien der Familie Enterobacteriaceae;
2) Aufspaltung der chromosomalen DNS mit Hilfe eines Re striktionsenzyms in DNS-Fragmente;
3) Ligieren der DNS-Fragmente an ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide;
4) Transformierung der Zellen eines Bakteriums aus der Familie Enterobacteriaceae mit Hilfe des Replikons, an welches das DNS-Fragment ligiert ist, in Transformationsprodukte, darunter Transformationsprodukte, welche einen Rekombinationsvektor mti dem DNS-Fragment enthalten, das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein mit sich führt;
5) Auslesen von Transformationsprodukten, welche den Re kombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein enthaltenden DNS-Fragment beinhalten, aus den Transformationsprodukten, und
6) Isolieren des Rekombinationsvektors mit dem die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment aus den ausgelesenen bzw. selektierten Transformationsprodukten.

Diese und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung. Es zeigen:

Fig. 1 die Restriktionsabbildungen der Plasmide pSN401, pSN507, pSN508 und pSN518, und

Fig. 2 das Ablaufschema für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Plasmids pSN2507, mit den Restriktionsabbildungen der Plasmide pKN402A, pSH101 und pSN2507.

In Fig. 1 und 2 ist mit der symbolischen Bezeichnung "phoS" eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein der Enterobacteriaceae angegeben, worüber eine ausführliche Erläuterung an anderer Stelle gegeben wird. Die symbolischen Bezeichnungen "phoT", "pstA" und "phoU" stehen jeweils für Gene, die zusammen mit phoS an der Chromosomen-DNS von E. coli angelagert sind; auch hierüber folgt eine genaue Erläuterung später. Zur Kennzeichnung der Erkennungssequenzen bei den Restriktionsenzymen werden die folgenden Symbole ver wendet:
EcoRI, HpaI, PstI, BglII, MluI HindIII, AvaI, HincII und SmaI (wobei die angehängten Zahlen bei diesen Symbolen gemäß der Zeichnung zur Kennzeichnung der jeweiligen Erkennungsorte für ein Restriktionsenzym eingesetzt sind.)

Weitere Abkürzungen:
Tn3(Ap^R) (angegeben mit ): Transposon
welches eine Genkodierung für die Ampicillinresistenz enthält;
Rep: Replikationsgen
ori: Replikationsausgangspunkt
Kb: 1000 Nukleotidenpaare
: ausgelöschter Teil

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ein Expressionsvektor geschaffen wird, der ein DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide enthält, wobei das DNS-Fragment an das Replikon ligiert ist.

Der Begriff "Replikon" bezeichnet in diesem Zusammenhang einen Vektor, der replikationsfähig ist und ein Gen für ein phänotypisches Merkmal sowie eine Restriktionsstelle aufweist, die zur Anbindung eines Spender-DNS-Fragments geeignet ist.

Unter einem Replikon versteht man einen Träger der genetischen Information, der als Replikationseinheit einer Nukleotidenkette bekannt ist, so daß bei Beginn eines Replikationsvorgangs die Replikation nacheinander bis zum Ende der Nukleotidenfolge schrittweise stattfindet. Als Beispiele für ein solches Replikon lassen sich Plasmide, Bakteriophagen, Viren und dergleichen nennen. Zu den Replikonen gehören DNS-Replikone und RNS-Replikone, doch werden aus praktischen Erwägungen heraus bei der vorliegenden Erfindung die RNS-Replikone nicht bevorzugt eingesetzt. Als DNS-Replikone lassen sich Plasmide und replikationsfähige DNS-Fragmente nennen, die von DNS-Viren abgeleitet sind, ferner procaryotische und eucaryotische Zellen. Von diesen werden für den Einsatz bei der vorliegenden Erfindung die Plasmide und Bakteriophagen bevorzugt. Herkömmlicherweise werden zum Klonieren verschiedener Gene DNS-Replikone mit weiter Verbreitung eingesetzt, welche ein Gen mit sich führen, das Resistenz gegenüber Antibiotika verleiht. Das weitverbreitete Verfahren zum Klonieren eines Gens umfaßt die Auflösung einer Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym zur Herstellung eines DNS-Fragments, welches das gewünschte Gen führt, die Ligierung des DNS-Fragments an das DNS-Replikon, die Transformierung eines Einzeller-Organismus mit dem DNS-Replikon, welches das DNS-Fragment umfaßt, in Transformationsprodukte, die Isolierung der Transformationsprodukte aus den einzelligen Stammorganismen unter Einsatz der Antibiotikaresistenz, die durch das DNS-Replikon verliehen wird, und Inkubieren der isolierten Transformationsstoffe, wobei das DNS-Replikon mit dem DNS-Fragment kloniert wird.

Die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ist für den Phosphattransport und den Phosphatstoffwechsel verantwortlich und ist von der Entwicklung her in procaryotischen Zellen und einzelligen eucaryotischen Zellen vorhanden. Unter anderem wurde die Genkodierung für ein Protein zur Phosphatbindung bei Escherichia coli relativ eingehend untersucht, und insbesondere wird das Gen bei Escherichia coli als phoS-Gen bezeichnet.

Das phoS-Gen ist nicht nur bei Escherichia coli, sondern auch bei Bakterien aus der Familie Enterobacteriaceae vorhanden. Dementsprechend läßt sich das phoS-Gen jedes Bakteriums der Familie Enterobacteriaceae bei der vorliegenden Erfindung verwenden. Das phoS-Gen bei Escherichia coli ist zusammen mit phoT, pstA und phoU bei 83 Minuten auf der genormten Genabbildung für E. coli (Backman, B. J. und K. B. Low, Microbiol. Rev., 44, 1-56 (1980)) angelagert. Die Gene phoT, pstA und phoU sind Gene, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphattransport und dem Phosphatstoffwechsel steht. Wie schon erwähnt, sind die Gene phoS, phoT, pstA und phoU in Haufen auf einem Chromosom von E. coli angelagert, und wenn nun aus der Chromosomen-DNS von E. coli mit Hilfe eines Restriktionsenzyms das das phoS-Gen führende DNS-Fragment gewonnen wird, so enthält das DNS-Fragment auch die Gene phoT, pstA und phoU.

Außerdem lassen sich Gene, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphattransport und dem Phosphatstoffwechsel steht, bei Hefe und einem anderen Bakterium als einem der Familie Enterobacteriaceae verwenden. In diesem Fall muß man ein Replikon und einen Wirt suchen, die für Gene geeignet sind, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphat transport und dem Phosphatstoffwechsel bei Hefe und einem anderen Bakterium als einem aus der Familie Enter obacteriaceae steht.

Entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines Expressionsvektors geschaffen, bei welchem

1) eine Chromosomen-DNS hergestellt wird, die eine Genkodierung für ein Protein zur Phosphatbindung enthält, und zwar aus einem Bakterium der Familie der Enterobac teriaceen;
2) die Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym zur Erzeugung von DNS-Fragmenten gespalten wird;
3) die DNS-Fragmente an ein aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen gewähltes Replikon ligiert werden;
4) Zellen eines Bakteriums aus der Familie der Enterobacteriaceen mit dem Replikon, an welches die DNS-Fragmente ligiert sind, zur Bildung von Transformationsprodukten transformiert werden, darunter solchen, die einen Rekombinationsvektor enthalten, unter anderem die DNS-Fragmente, welche eine Genkodierung für ein Phosphat bindungsprotein führen;
5) Transformationsprodukte, welche den Rekombinationsvektor, darunter die eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragmente, aus den gesamten Transformationsprodukten ausgewählt werden, und
6) der Rekombinationsvektor, einschließlich der die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragmente, aus den ausgewählten Transformationsprodukten isoliert wird.

Im Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man aus Bakterien aus der Familie Enterobacteriaceae unter Einsatz einer üblichen Isoliertechnik wie beispielsweise Lyse, Zentrifugieren oder dergleichen eine chromosomale DNS her, welche eine Genkodierung für ein Phosphat bindungsprotein (nachstehend einfach "phoS-Gen" genannt) enthält.

Im zweiten Schritt wird die im ersten Schritt hergestellten Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym gespalten, wobei man DNS-Fragmente erhält, welche ein phoS-Gen führendes DNS-Fragment (DNA-Fragment) umfassen.

Im dritten Schritt des Verfahrens läßt sich, wie schon oben erwähnt, jedes Plasmid und jeder Bakteriophage als Replikon verwenden. Die Anbindung der DNS-Fragmente an das Replikon läßt sich unter Verwendung einer Ligase nach dem herkömmlichen Verfahren durchführen (vgl. beispielsweise US-PS 42 37 224). Mindestens eines der ein phoS-Gen und ein Replikon führenden DNS-Fragmente hat ein Gen für ein phänotypisches Merkmal.

Im vorgenannten vierten Schritt werden Zellen eines Bakteriums aus der Familie Enterobacteriaceae mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon, welches vorher in Schritt 3 hergestellt wurde, transformiert. Als Bakterium aus der Familie Enterobacteriaceae lassen sich Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia und Shigella nennen. Neben den genannten Bakterien lassen sich auch Mutantenzellen all dieser Bakterien verwenden. Selbstverständlich muß das entsprechende Bakterium unter Berücksichtigung der Replikationsfähigkeit des Replikons in den Zellen eines Bakteriums gewählt werden. Beispielsweise lassen sich in geeigneter Form die Spezies Escherichia coli, Serratia oder Salmonella als Wirt verwenden, wenn als Replikon ein allgemein bekanntes Plasmid vom Entspannungstyp wie pBR322, pBR325, pACYA177 oder pKN410 verwendet wird.

Im vorgenannten fünften Schritt werden die Transformationsprodukte zunächst von den Stammzellen eines Bakteriums aus der Familie Enterobacteriaceae mit Hilfe des phänotypischen Merkmals isoliert, beispielsweise unter Ausnutzung einer Medikamentenresistenz, die durch das Replikon vermittelt wird, welches die entsprechenden Merkmalsgene führt. Anschließend werden die Transformationsprodukte, welche den Rekombinationsvektor enthalten - darunter das DNS-Fragment, welches das phoS-Gen führt - aus den wie vorstehend isolierten Transformationsprodukten selektiert, wobei als Kriterium die Menge des Phosphatbindungsproteins in den Transformationsprodukten eingesetzt wird. Die Menge des Phosphatbindungsproteins in jedem der Transformationsprodukte wird folgendermaßen bestimmt. Zunächst wird das Phosphatbindungsprotein aus dem Transformationsprodukt isoliert und mit Hilfe einer üblichen Technik, z. B. Lyse, Zentrifugieren oder Aussalzen, gereinigt. Dann wird mittels einer üblichen Technik wie beispielsweise der SDS-Agarose- Gelelektrophorese die Menge des gereinigten Phosphatbindungsproteins bestimmt. Die Menge an Phosphatbindungsprotein in jedem der Transformationsprodukte wird mit der Menge an Phosphatbindungsprotein verglichen, die von einer Stammzelle eines Bakteriums aus der Familie Enterobacteriaceae erzeugt wird, welche nicht mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon transformiert wurde. Die Transformationsprodukte mit einer größeren Menge an Phosphatbindungsprotein als in der Stammzelle des Bakteriums der Familie Enterobacteriaceae werden dann ausgelesen.

Wenn als Zelle eines Bakteriums der Familie Enterobacteriaceae im vorstehend beschriebenen Schritt 4 eine Mutantenzelle eingesetzt wird, welche nicht nur unter phosphatarmen, sondern auch unter phosphatreichen Bedingungen alkalische Phosphatase erzeugt, so läßt sich die Auslese der Transformationsprodukte, die das Replikon mit dem das phoS-Gen führenden DNS-Fragment enthalten, im vorstehend beschriebenen fünften Schritt sehr leicht ausführen, ohne Bestimmung der Menge des Phosphatbindungsproteins in jedem der Transformationsprodukte. Der Grund hierfür ist folgender. Wird eine solche Mutantenzelle mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon, wie im vorstehend beschriebenen dritten Schritt hergestellt, transformiert, so erzeugt die Mutantenzelle alkalische Phosphatase unter phosphatarmen Bedingungen, jedoch unter phosphatreichen Bedingungen aufgrund der Funktion des im DNS-Fragment, das an das Replikon ligiert ist, enthaltenen phoS-Gens keine alkalische Phosphatase. Wenn somit die Transformation unter phosphatreichen Bedingungen ausgeführt wird, so werden hinsichtlich der alkalischen Phosphatase negative Transformationsprodukte ausselektiert.

Im vorstehend erläuterten sechsten Schritt wird der Re kombinationsvektor mit dem das phoS-Gen führenden DNS-Fragment aus den im fünften Schritt ausgelesenen Trans formationsprodukten mittels einer üblichen Technik wie beispielsweise Lyse, Zentrifugieren oder dergleichen isoliert.

Der nach dem vorstehend erläuterten Verfahren hergestellte Rekombinationsvektor läßt sich hinsichtlich des DNS- Fragmentanteils und/oder des Replikonanteils mit Hilfe eines Restriktionsenzyms teilweise auslöschen, während das phoS-Gen beibehalten wird, worauf der dann entstandene, ausgelöschte Rekombinationsvektor mit Hilfe einer Ligase erneut so angebunden wird, daß sich ein rekonstruierter Rekombinationsvektor mit geringerer Größe bildet. Der rekonstruierte Rekombinationsvektor läßt sich leichter manipulieren, da die Anzahl der Restriktionsstellen im rekonstruierten Rekombinationsvektor gegenüber derselben Anzahl im ursprünglichen Rekombinationsvektor verringert wurde. Wenn außerdem eine Genkodierung für ein bestimmtes Polypeptid an den rekonstruierten Rekombinationsvektor angebunden wird, so wird das Verhältnis der Länge der Polypeptid-Genkodierung zur Gesamtlänge des Rekombinationsvektors größer als bei Anbindung der Poly peptid-Genkodierung an den ursprünglichen Rekombinationsvektor, der nicht rekonstruiert wurde. Es ist gut vorstellbar, daß mit zunehmendem Verhältnis zwischen der Länge der Polypeptid-Genkodierung und der Gesamtlänge des Rekombinationsvektors die pro Zelle gewonnene Proteinmenge ansteigt und die pro Zelle entstehende Menge an Nebenprodukten kleiner wird. Wenn somit der vorstehend rekonstruierte Rekombinationsvektor zur Gewinnung eines bestimmten gewünschten Polypeptids eingesetzt wird, so läßt sich nicht nur die hohe Produktivität für das Polypeptid erzielen, sondern auch mühelos eine höhere Reinheit des gewonnenen Polypeptids.

Ein das phoS-Gen führendes DNS-Fragment läßt sich aus dem Rekombinationsvektor herauslösen, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und an eine andere Art von Replikon als der ursprüngliche Rekombinationsvektor angebunden wurde, um einen anderen Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors herzustellen. Ein solcher anderer Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors läßt sich vorteilhaft einsetzen, wenn eine mühelose Auslese der Transformationsprodukte durch Veränderung eines phänotypischen Merkmals des Replikons und/oder eine Erhöhung der Vervielfältigungszahl eines Rekombinationsvektors beabsichtigt sind. Der Einsatz eines solchen anderen Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors ist wünschenswert, wenn die mit Hilfe des ursprünglichen Rekombinationsvektors hergestellten Transformationsprodukte diejenigen sind, aus denen sich die erwünschten Transformationsprodukte nur mit Mühe auslesen lassen und/oder bei denen die Replikationsfähigkeit des ursprünglichen Replikationsvektors in den Transformationsprodukten niedrig ist.

Die Rekonstruktion des Rekombinationsvektors wird, wie bereits erwähnt, mit einer der üblichen Techniken ausgeführt (vgl. beispielsweise die US-PS 43 40 674, 43 49 629 und 43 56 270).

Der nach dem obigen Verfahren gewonnene Expressionsvektor läßt sich durch Aufbau des Restriktionsbildes wie folgt kenntlich machen. Der Expressionsvektor wird zur Gewinnung von DNS-Fragmenten mit verschiedenen Restriktionsenzymen teilweise oder völlig aufgelöst. Die gewonnenen Fragmente werden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, wobei Größe und Restriktionsmuster des Expressionsvektors bestimmt werden. Die Lage der pho S-Gene auf dem genannten Expressionsvektor wird durch Aufbau einer Vielzahl verschiedener erfindungsgemäß ausgelöschter Expressionsvektoren mittels teilweise oder vollständiger Auflösung mit einem entsprechenden Restriktionsenzym und mit anschließender Selbstbindung und durch Untersuchung der gelöschten Expressionsvektoren durch Komplementbildungstests bestimmt, bei denen als Wirt die phoS-Gen-negativen Mutanten verwendet werden.

Der das phoS-Gen führende erfindungsgemäße Expressionsvektor hat die folgenden Vorteile, wenn die Genkodierung für ein gewünschtes Polypeptid an den Expressionsvektor an dessen unterhalb der DNS-Sequenz für den Promotor eines phoS-Gens angebunden wird und durch Gentechniken die Gewinnung des erwünschten Polypeptides durchgeführt wird:

1) Die Ausbeute des vorgenannten erwünschten Polypeptides beträgt 1×10⁵-10⁶ Moleküle/Zelle, also mehrere bis 100Male höher als bei Verwendung des üblicherweise verwendeten Vektors.
2) Die Genexpression des Expressionsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich einschränkungslos durch Einstellung der Phosphatkonzentration im Kulturmedium steuern. Damit läßt sich auch die Produktion des gewünschten Polypeptides durch Einstellen der Phosphatkonzentration im Kulturmedium steuern.
3) Das gewünschte Polypeptid kann zusammen mit dem Anteil an Phosphatbindungsprotein in das Periplasma des Wirts ausscheiden. Damit läßt sich das gewünschte Polypeptid ohne Schwierigkeiten vom Wirt isolieren.

Aus diesem Grunde läßt sich der erfindungsgemäße Expressionsvektor in großem Umfang industriell einsetzen. Nachstehend wird nun ein Beispiel für das Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptides mit Hilfe des erfindungsgemäßen Expressionsvektors beschrieben. Die Genkodierung für das gewünschte Polypeptid wird aus den Genen eucaryotischer Zellen, procaryotischer Zellen oder Viren gewonnen, und das so gewonnene Gen wird an den erfindungsgemäßen Expressionsvektor gebunden. Anschließend wird der Wirt mit dem zuvor gewonnenen Expressionsvektor unter Bildung von Transformationsprodukten umgewandelt. Anschließend werden die so erhaltenen Transformationsprodukte im großen inkubiert, um damit die gewünschten Polypeptide mit extrem hoher Ausbeute zu gewinnen.

Der erfindungsgemäße Expressionsvektor läßt sich zur Erzeugung physiologisch aktiver Substanzen, von Enzymen, Antigenen, Toxinen, Aminosäuren, Stoffwechselnebenprodukten und dergleichen einsetzen. Als Beispiele für physiologisch aktive Peptide lassen sich Hormone wie Somatostatin, Insulin, Corticotropin, das Wachstumshormon und dergleichen, Kalmodulin, die Zellwachstumsfaktoren, Interferone und dergleichen nennen. Als Enzyme kann man Urokinase, Amylase, Glukose-Isomerase, Hyaluronidase, Umkehr-Transkriptase, Enzyme zur Stickstoffixierung und dergleichen nennen. Unter den Antigenen sind das Antigen für das Grippevirus HA, das Oberflächenantigen für Hepatitis B und dergleichen zu nennen. Als Beispiele für Toxine lassen sich das Toxin für Bordetella pertussis, Schlangengift und dergleichen nennen, und als Beispiele für Aminosäuren seien L-Glutaminsäure, L-Lysin, L-Methionin und dergleichen hier genannt. Antibiotika, Mycotoxine und ähnliches sind Beispiele für Stoffwechselnebenprodukte, und als Beispiele für andere Proteine als die vorstehend aufgeführten Substanzen seien opioide Peptide, Ovalbumin und ähnliches genannt. Daraus ergibt sich, daß die Erfindung bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, Medikamenten, Futtermitteln, fermentierten Erzeugnissen, Energiequellen und dergleichen von großem Nutzen ist.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht.

Die in den Beispielen benutzten Kulturmedien, Pufferlösungen, Verfahren zur DNS-Extraktion und Verfahren zur DNS-Reinigung werden jeweils nachstehend zusammengefaßt.

A: Zusammensetzung des T-Mediums
Bacto-Trypton\|10 g
NaCl	5 g

beides in 100 ml Wasser aufgelöst.

B: Schnelle Alkali-Extraktion der Plasmid-DNS

0,1 ml einer Lysozym-Lösung (2 mg Lysozym/ml, 50 mM Glukose, 100 mM CDTA (Cyclohexandiamin-Tetraazetat), 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) wurden dem Bakterienzellgranulat zugesetzt, das durch Zentrifugieren von 1,5 ml Kultur nach Inkubation über Nacht hergestellt wurde. Die entstandene Suspension wurde 30 Minuten bei 0°C inkubiert. Anschließend wurden der Suspension 200 µl einer alkalischen SDS-Lösung (0,2 N NaOH, 1 G/G% SDS (Natrium-Dodecylsulfat) zugesetzt und gerührt. Nach fünfminütigem Inkubieren bei 0°C wurden der Suspension 150 µl 3 M Natriumacetat (pH 4,8) zugesetzt und vorsichtig damit vermischt. Die entstandene Suspension ließ man 60 Minuten bei 0°C stehen und zentrifugierte dann die Niederschläge fünf Minuten lang bei 5000 UpM ab. Aus der oberen Schicht des Überstands wurden 0,4 ml Teilmenge mit der Pipette abgezogen. Die Teilmenge wurde mit 1 ml kalten wasserfreien Äthanols zur Ausfällung der DNS vermischt. Das entstehende Gemisch wurde 2 Minuten zentrifugiert und der sich bildende Überstand wurde entfernt; dem entstandenen Granulat wurden 100 µl einer Natriumacetatlösung (0,1 M Natriumacetat, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0)) zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde mit der doppelten Menge eines kalten wasserfreien Äthanols zur erneuten Ausfällung der DNS versetzt. Die ausgefällte DNS wurde in einem entsprechenden Puffer aufgelöst. Die Einzelheiten der vorstehenden Arbeitsgänge sind in Nucleic Acid Research, Band 7, Nr. 6, S. 1513-1523 (1979) beschrieben. Die nach dem vorstehenden Arbeitsablauf gewonnene Rohplasmid- DNS läßt sich für physikalische Abbildungsanalysen und zu Transformationszwecken verwenden.

C: Entfernen des Ethidiumbromids aus der DNS

Die DNS-Fraktion wurde nach der CsCl-Dichtegradient- Zentrifugation mit der gleichen Volumenmenge einer Isopropanollösung vermischt, die mit wäßriger 5 M NaCl - 10 mM Tris-Hcl-1 mM Na₃EDTA (pH 8,3) gesättigt war. Dieser wiederholt, welche die DNS enthält. Zwei Volumenanteile Wasser und anschließend 6 Volumenteile wasserfreies Äthanol wurden der entstandenen wäßrigen Phase zugesetzt. Man ließ das Gemisch bei -20°C eine Stunde bis mehrere Tage zur Ausfällung der DNS stehen. Die ausgefällte DNS wurde durch Zentrifugieren aufgefangen und zur Herstellung einer DNS-Probe getrocknet. Die DNS-Probe wurde in 100 µl einer Tris- EDTA-Lösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₃EDTA (pH 7,5)) aufgelöst und der Verwendung zugeführt. Einzelheiten über dieses Verfahren finden sich in Advanced Bacterial Genetics, S. 126, Cold Spring Harbor Laboratory (1980).

D: Zusammensetzung des Puffers für das EcoRI-Restriktionsenzym (fünffach konzentriert)
NaCl\|500 mM
Tris-HCl	250 mM (pH 7,4)
MgSO₄	50 mM

E: Zusammensetzung des Ligasepuffers
Tris-HCl
66 mM (pH 7,6)
MgCl₂	6,6 mM
Dithiothreitol	10 mM
ATP	0,5 mM

F: CsCl-Block-Dichtegradient-Zentrifugation

Unten in ein Zellulosenitrat-Zentrifugenglas mit einem Durchmesser von 12,7 mm und einer Länge von 50,8 mm brachte man 1 ml einer 5,0 M- CsCl-Lösung (5,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Na₂EDTA (Schwebdichte=1,60)) ein. Über die Lösung im Glas brachte man 3 ml einer 3,0 M-CsCl-Lösung (3,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Na₂EDTA (Schwebdichte=1,40) ein. Dann wurde über die CsCl-Lösungsschicht 1 ml einer Phagensuspension eingebracht, und das Ganze mit 30 000 UpM in einem Rotor vom Typ SW 50.1 bei 20°C eine Stunde lang zentrifugiert. Anschließend wurden mit Hilfe einer 1 ml-Spritze und einer 15,8 mm-Nadel (Kaliber 25) weniger als 0,5 ml der Phagenfraktion von den Seitenwandungen des Glases abgenommen. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Advanced Bacterial Genetics, S. 80-81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980) beschrieben.

G: CsCl-Gleichgewichts-Dichtegradient-Zentrifugation

Die nach dem obigen Arbeitsschritt F hergestellte Phagenfraktion wurde mit einer 4,0 M CsCl-Lösung (4,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA) versetzt und mit 30 000 UpM in einem Rotor vom Typ SW 50.1 20 Stunden lang zentrifugiert. Mit einer 1 ml-Spritze und einer 15,8 mm-Nadel (Kaliber 25) wurden von den Seitenwandungen des Zentrifugenglases ganze 0,5 ml Phagenfraktion abgenommen. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Advanced Bacterial Genetics, S. 81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980) beschrieben.

H: Zusammensetzung des LB-Mediums*)

Diese drei Bestandteile wurden in 1000 ml Wasser aufgelöst und durch Zusatz von NaOH wurde der pH-Wert auf 7,2 ein gestellt.

*) Nach Sterilisierung des Mediums im Autoklav setzte man 1/1000 Volumen einer wäßrigen Tetrazyklinlösung von 10 mg/ml oder einer wäßrigen Ampicillinlösung von 40 mg/ml zu. Die die Antibiotika enthaltenden Medien wurden zur Auslese der gegenüber Antibiotika resistenten Transformationsprodukte verwendet und sollten die Aufrechterhaltung des antibiotika- restistenten Rekombinationsvektors in den Bakterienzellen sicherstellen.

I: Zusammensetzung des T-Agarmediums*)

Diese drei Bestandteile wurden in Wasser aufgelöst, und dann wurde soviel Wasser zugesetzt, daß insgesamt ein Lösungsvolumen von 1000 ml erreicht wurde.

Beispiel 1 Erster Schritt: Gewinnung der DNS für Plasmid pBR322 und Spaltung der DNS für Plasmid pBR322 mit dem Restriktionsenzym EcoRI

1 l des T-Mediums wurde mit 10 ml Keimen von Escherichia coli K-12-Stamm C600 geimpft (B. J. Bachmann, Bacterial. Rev., 36, 525-557 (1972)) (Träger des Plasmids pBR322) und unter Schütteln bei 37°C kultiviert, bis die Trübung der Kulturbouillon bei 600 nm 0,6 A erreichte. Der Bouillon wurde Chloramphenicol bis zur Endkonzentration von 250 µg/ml zugesetzt. Anschließend wurde die Kultur 15 Stunden lang bei 37°C inkubiert und zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die so gewonnenen Zellen wurden einmal mit 100 ml Tris- EDTA-Lösung (die 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthielt) gewaschen und schnell alkalisch extrahiert; dies ergab eine Rohplasmid-DNS. In die so hergestellte Rohplasmid-DNS wurde die obige Tris-EDTA-Lösung in solcher Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 15 ml betrug. 16 g kristallines CsCl und 2 ml Ethidiumbromid in einer Konzentration von 5 mg/ml wurden der Lösung zugesetzt, worauf das spezifische Gewicht d²⁵ des Gemisches durch Zusatz von Wasser oder kristallinem CsCl auf 1,39 eingestellt wurde. Das so hergestellte Gemisch wurde dann 40 Stunden lang bei 20°C mit 33 000 UpM zentrifugiert. Die Lage des Plasmid-DNS-Bandes wurde mit Hilfe langwelligen UV-Lichtes ermittelt, und die Plasmid-DNS wurde durch Fraktionierung gewonnen. Aus der Plasmid-DNS-Fraktion wurde das Ethidiumbromid nach dem in Punkt C beschriebenen Verfahren herausgelöst. Der auf diese Weise hergestellten pBR322-DNS-Lösung (100 µg/ml) von 0,2 ml wurden 0,05 ml des Restriktionsenzympuffers für EcoRI zugesetzt, und anschließend wurde das Restriktionsenzym EcoRI in solch einer Menge zugesetzt, daß die Aktivität des Restriktionsenzyms EcoRI eine Einheit pro µg der Plasmid-DNS erreichte. Die Enzymreaktion lief bei 37°C 60 Minuten lang ab. Danach wurde das Gemisch 5 Minuten lang auf 65°C erwärmt, um das Restriktionsenzym zu inaktivieren. Das Gemisch wurde dann gegen eine Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthielt) dialysiert. Nach Beendigung der Dialyse wurden dem Gemisch 4 Einheiten alkalischer Phosphatase von Escherichia coli zugesetzt, worauf 30 Minuten lang bei 65°C inkubiert wurde. Eine gleiche Menge Phenollösung (durch Sättigung der obigen Tris-EDTA-Lösung mit Phenol hergestellt) wurde dem Gemisch zugesetzt und anschließend wurde geschüttelt. Das geschüttelte Gemisch wurde dann mit niedriger Drehzahl zentrifugiert und in die wäßrige Phase und die Phenolphase getrennt. Die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Diese Zentrifugierung mit Auffangen der wäßrigen Phase wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurde der aufgefangenen wäßrigen Phase ein gleiches Volumen der Lösung I (24 : 1 volumetrisch, Gemisch aus Chloroform und Isoamylalkohol) zugesetzt. Dann wurde gründlich gemischt und die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt, worauf die aufgefangene wäßrige Phase gegen einen Ligasepuffer für die nachfolgende Einbindungsreaktion dialysiert wurde, wobei man eine gespaltene DNS-Lösung für pBR322 erhielt.

Zweiter Schritt: Herstellung der DNS-Fragmente mit einem das phoS-Gen von Escherichia coli K-12- Stamm führenden DNS-Fragment

1 l des T-Mediums wurde mit 10 ml Keimen von Escherichia coli K-12-Stamm KLF48/KL159 (CGSC Nr. 4302) (Journal of Bacteriology, June 1975, Vol. 122, No. 3, Seiten 1153 und 1154) geimpft und unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Die Kulturbouillon in der Phase eines logarithmisch ansteigenden Wachstums (Trübung: 0,6A bei 600 nm) wurde zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die auf diese Weise gewonnenen Zellen wurden in 10 ml einer Lysozymlösung (die 2 mg Lysozym/ml, 100 mM EDTA und 0,15 M NaCl enthielt) suspendiert und die Suspension wurde 15 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Anschließend wurde die Suspension rasch über einem Trocken eis-/Azetonbad bei -20°C gefroren. In die auf diese Weise gefrorene Suspension wurden 50 ml eines Tris-SDS- Puffers (der 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0), 1G/V% SDS (Natrium dodecylsulfat) und 0,1 M NaCl enthielt) gegeben, und das Gemisch wurde bei 60°C geschmolzen. Dieses Frieren über einem Trockeneis-/Azetonbad und Schmelzen bei 60°C wurde fünfmal wiederholt, wobei die Zellen vollständig lysiert wurden. In die so erhaltene Lösung, in der die Zellen lysiert vorlagen, wurde eine gleiche Menge einer Phenollösung (hergestellt durch Sättigung des vorgenannten Tris-SDS-Puffers mit umdestilliertem Phenol) gegeben und anschließend wurde gerührt. Diese Lösung wurde langsam zentrifugiert, wobei sie in eine wäßrige Phase und in die Phenolphase getrennt wurde. Die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Die auf diese Weise aufgefangene wäßrige Phase wurde mit dem doppelten Volumen wasserfreien Äthanols versetzt. Dieses Gemisch wurde dann 20 Minuten lang mit 12 000 UpM zentrifugiert, worauf man das Granulat erhielt. Dieses Granulat wurde in 20 ml eines Gemisches aus NaCl und Zitronensäure (welches 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumzitrat bei pH 7,0 enthielt) aufgelöst, wodurch sich eine die DNS enthaltende Lösung ergab. In 10 ml der so hergestellten, die DNS enthaltenden Lösung wurde eine gleiche Menge der Lösung I (vgl. Erster Schritt) zugesetzt und anschließend wurde gerührt. Daraus wurde die wäßrige Phase gewonnen. Die so gewonnene wäßrige Phase wurde mit dem doppelten Volumen von Äthanol vermischt und die ausgefällte DNS wurde in 5 ml Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM Na₂EDTA enthielt) aufgelöst. Die vorbeschriebene Ausfällung mit wasserfreiem Äthanol wurde wiederholt und 5 ml der DNS-Lösung wurden angesetzt. 0,05 ml des Restriktionsenzympuffers wurden 0,2 ml der auf diese Weise hergestellten DNS-Lösung (200 µg/ml) zugesetzt, und danach wurde das Restriktionsenzym EcoRI in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Aktivität des Restriktionsenzyms EcoRI eine Einheit pro µg der DNS erreichte. Anschließend wurde das Gemisch bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert, mit nachfolgender 5minütiger Wärmebehandlung bei 65°C zur Inaktivierung des Restriktionsenzyms. Das Gemisch wurde dann gegen den Ligasepuffer dialysiert, wobei man eine E. coli-DNS-Lösung erhielt.

Dritter Schritt: Ligieren der pBR322-DNS und der DNS-Fragmente von E. coli mit einem phoS-Gen

Die pBR322-DNS-Lösung, die im ersten Schritt hergestellt wurde, wurde auf 30 µg/ml DNS-Konzentration mit einem Einbaupuffer verdünnt. Die E. coli-DNS-Lösung, die im zweiten Schritt angesetzt wurde, wurde auf 100 µg/ml DNS-Konzentration mit dem gleichen Einbaupuffer verdünnt. 50 µl der pBR322-DNS-Lösung wurden mit 100 µl der E. coli-DNS-Lösung vermischt. Diesem Gemisch wurde T4-Ligase in einer Menge entsprechend einer T4-Ligase-Einheit pro µg zu ligierender DNS zugesetzt. Die Enzymreaktion für die Ligierung der DNSen wurde 8 Stunden lang bei 8°C durchgeführt. Nach Beendigung der Ligierung wurde die erhaltene Lösung gegen eine Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthielt) dialysiert.

Vierter Schritt: Auslese der das phoS-Gen führenden Plasmide A: E.-coli-Stamm C75

Der Stamm C75 von E. coli (Garen, A., und N. Otsuji, J. Mol. Biol., 8, 841-852 (1964) wurde in einem LB-Medium unter Schütteln kultiviert, bis die Trübung der Kulturbouillon bei 600 nm den Wert 0,6 A erreichte. Anschließend wurden zur Zellengewinnung 2,5 ml der Bouillon langsam zentrifugiert. Die gewonnenen Zellen wurden in 2,5 ml einer wäßrigen MgCl₂-Lösung von 0,1 M suspendiert, und diese Suspension dann langsam zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die gewonnenen Zellen wurden in 1,2 ml einer wäßrigen CaCl₂-Lösung von 0,1 M suspendiert und diese Zellsuspension ließ man 30 Minuten lang bei 0°C stehen, worauf dann zur Zellgewinnung langsam zentrifugiert wurde. Die gewonnenen Zellen wurden erneut in einer wäßrigen CaCl₂-Lösung von 0,1 M in einer Menge von 0,1 ml suspendiert. Dieser Zellsuspension wurden 10 µl der im dritten Schritt angesetzten Lösung eingebundener DNS zugesetzt. Dieses Gemisch ließ man 30 Minuten lang auf eisgekühltem Wasser stehen und erwärmte sie dann 5 Minuten lang in einem Wasserbad von 40°C. 1,0 ml des auf 37°C vorgewärmten LB-Mediums wurden dem erwärmten Gemisch zugesetzt und dann wurde 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 0,1 ml der so hergestellten Kulturbouillon und 0,1 ml der 10mal mit LB-Medium verdünnten Kulturbouillon jeweils auf T-Nährbodenplatten aufgetragen, welche Tetracyclin oder Ampicillin enthielten, worauf man über Nacht bei 37°C bzw. 30°C inkubierte, um Kolonien von Transformationsprodukten zu bilden, die gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin resistent waren. Die so entstandenen Kolonien der Transformationsprodukte wurden mit einer alkalisachen Phosphatase-Einfärbelösung besprüht (welche 2 mg α-Naphthylphosphat/ml, und 20 mg Fast Blue B Salt (blauer Farbstoff, tetrazotbehandeltes o-Dianisidin)/ml enthielt, die in 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) aufgelöst war. Die weißen Kolonien von Transformationsprodukten, die sich durch Aufsprühen der Farbstofflösung nicht braun verfärbt hatten, wurden als die Zellen herausgelöst, welche die Plasmide enthielten, in denen das E. coli-phoS-Gen in die pBR322-DNS ligiert war.

B: E. coli-Stamm C 2

Zur Auslese der weißen Kolonien von Transformationsprodukten, die Plasmide enthielten, in denen ein E. coli-phoS-Gen in die pBR322-DNS einligiert war - allerdings mit dem Unterschied, daß die Transformierung des C 2-Stammes von E. coli (Morris, H., M. J. Schlesinger, M. Bracha, und E. Yagil, J. Bacteriol., 119, 583-592 (1974)) als Indikator bei der Auslese der Plasmide verwendet wurde - wurde im wesentlichen der gleiche Verfahrensablauf wie der soeben beschriebene wiederholt.

Fünfter Schritt: Aufau der Restriktionsabbildungen für die ein phoS-Gen führenden Plasmide (pSN401 und pSN402)

Die im vorhergehenden vierten Schritt ausgewählten Transformationsprodukte wurden im LB-Medium kultiviert. Anschließend wurden aus der erhaltenen Zellkultur Plasmid-DNSen wie folgt extrahiert und gereinigt. Zur Extraktion der Plasmid-DNSen aus den zuvor angesetzten Zellkulturen wurde das Verfahren zur raschen alkalischen Extraktion herangezogen. Anschließend wurden die Rohplasmid-DNS-Lösungen durch Gleichgewichts-Dichtegradient-Zentrifugierung in gleicher Weise wie im ersten Schritt gereinigt. Aus den so gereinigten Plasmid-DNS-Lösungen wurde das Ethidiumbromid herausgelöst, und die DNS wurde ausgefällt (vgl. Erster Schritt).

Die auf diese Weise gewonnenen Plasmid-DNSen wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen aufgeschlossen und dann wurde die Länge der DNS-Fragmente durch Elektrophorese auf Agarosegel bestimmt. Die Restriktionsabbildungen der Plasmide wurden dann aufgebaut. Dabei zeigte sich, daß zwei Arten von phoS-Gen-führenden Plasmiden gewonnen worden waren.

Nachstehend wird eines der Plasmide als "pSN401" bezeichnet, und das andere als "pSN402". Die Restriktionsabbildung des Plasmids pSN401 ist in Fig. 1 dargestellt. Das Plasmid pSN402, das EcoRI₁-EcoRI₂-Fragment von pSN402 wurde mit entgegengesetzter Orientierung zum Plasmid pSN401 einligiert.

Beispiel 2 Erster Schritt: Herstellung der DNS-Fragmente mit phoS-Gen für die Bakteriophagen-gglmS-DNS

150 ml des T-Mediums wurden mit 1,5 ml Keimen von Escherichia coli KY7388-Stamm (T. Miki, Annu. Rep. Inst. Virus Res., 21, 1-26 (1978)) geimpft, also einem Lysogen des Bakteriophagen λglmS, und unter Schütteln bei 37°C kultiviert. In der Mitte der Phase logarithmischen Wachstums wurde der Kultur Mitomycin C bis zu Endkonzentration von 0,5 µg/ml zugesetzt. Bis zur Lyse wurde noch etwa zwei weitere Stunden kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis gekühlt und tropfenweise setzte man (in mehreren Tropfen) Chloroform zu. Danach wurde Luft mit der Pipette in die Kulturbouillon zur Blasenbildung gegeben, wodurch die Zellen in der Kulturbouillon völlig lysiert wurden. Das angesetzte Phagenlysat wurde dann langsam zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgefangen, während das Ausgefällte, das aus Zellenresten bestand, weggeworfen wurde. Der ge wonnene Überstand wurde mit 25 000 UpM 90 Minuten lang zur Gewinnung der λglmS-Phagenpartikel zentrifugiert, die unten im Zentrifugierglas abgelagert wurden. Die gewonnenen Phagenpartikel wurden in 4,0 ml λ-Verdünner (der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO₄ und 0,1 mM Na₂EDTA enthielt) suspendiert. Die angesetzte Phagenpartikelsuspension wurde einer CsCl-Block-Dichtegradient-Zentrifugierung unterzogen, mit anschließender CsCl-Gleichgewichts-Dichtegradient-Zentrifugierung, worauf man eine Fraktion gewann, die nur λglmS-Phagenpartikel enthielt. Aus diesen Phagenpartikeln wurde mit Formamid in nachstehend erläuterter Weise die λglmS-DNS extrahiert. Der aus den gglmS-Phagenpartikeln bestehenden Fraktion setzte man dann 0,05 ml einer Tris- EDTA-Lösung (die 2 M Tris-HCl (pH 8,5) und 0,2 M Na₂EDTA enthielt) und dann 0,5 ml Formamid zu. Das angesetzte Gemisch ließ man etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Anschließend setzte man nacheinander 0,5 ml destilliertes Wasser und 3 ml wasserfreies Äthanol dem Gemisch zu und vermischte dies zur Ausfällung der λglmS-Phagen-DNS. Die ausgefällte gglmS-Phagen-DNS wurde durch Zentrifugieren abgenommen, mit 70 V/V% Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, worauf man eine trockene λglmS-DNS erhielt. Die getrocknete λglmS-DNS wurde in 5 ml einer Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM Na₂EDTA enthielt) und dann mittels eines Restriktionsenzyms EcoRI gespalten, und in gleicher Weise wie im zweiten Schritt bei Beispiel 1 dialysiert. Auf diese Weise wurde eine Lösung mit das phoS-Gen führenden DNS-Fragmenten angesetzt.

Zweiter Schritt: Ligierung der pBR322-DNS und der λglmS-Phagen- DNS-Fragmente mit dem phoS-Gen

Dies geschah im wesentlichen genauso wie im dritten Schritt bei Beispiel 1, wobei man eine Lösung mit ligierter DNS erhielt, allerdings mit dem Unterschied, daß die λglmS-Phagen-DNS-Lösung, wie sie im vorstehenden ersten Schritt angesetzt wurde, anstelle der E. coli-DNS-Lösung eingesetzt wurde.

Dritter Schritt: Auslese der das phoS-Gen führenden Plasmide

A. D. coli Stamm C75

Im wesentlichen wurden die gleichen Abläufe wie in Arbeitsschritt 4A bei Beispiel 1 wiederholt, um weiße Kolonien von Transformationsprodukten mit den das phoS-Gen enthaltenden Plasmiden aus den λglmS-Phagen zu selektieren, allerdings mit dem Unterschied, daß die im obigen zweiten Schritt angesetzte Lösung mit ligierter DNS eingesetzt wurde anstelle der Lösung mit ligierter DNS, die nach dem dritten Schritt von Beispiel 1 angesetzt worden war.

B: E. coli Stamm C2

Im wesentlichen wurde genauso gearbeitet wie in Arbeitsschritt 4B bei Beispiel 1, um die weißen Kolonien mit Transformationsprodukten mit Plasmiden auszulesen, in denen das aus λglmS-Phagen gewonnene phoS-Gen in die pBR322-DNS einligiert war, mit dem Unterschied allerdings, daß die Lösung mit einligierter DNS, wie sie im vorhergehenden zweiten Schritt angesetzt worden war, verwendet wurde anstelle der im dritten Arbeitsschritt bei Beispiel 1 angesetzten einligierten Lösung.

Vierter Schritt: Aufbau der Restriktionsabbildungen der das phoS-Gen führenden Plasmide (pSN401 und pSN402)

Es wurden im wesentlichen die gleichen Arbeitsgänge wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 wiederholt, um die Restrik tionsabbildungen der Plasmide zu erstellen, allerdings mit dem Unterschied, daß die in den vorangegangenen Arbeitsschritten 3A und 3B gewonnenen Plasmide eingesetzt wurden, und nicht die nach Schritt 4A und 4B bei Beispiel 1 hergestellten Plasmide. Dabei wurde festgestellt, daß es sich bei den hier gewonnenen Plasmiden um pSN401 und pSN402 handelte.

Beispiel 3 Erster Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN507 aus pSN401

Die pSN401-DNS, wie sie im fünften Schritt bei Beispiel 1 gewonnen wurde, wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym HindIII aufgeschlossen und anschließend mit Hilfe von T4-Ligase im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 1 erläutert erneut einligiert. Mit Hilfe der so gewonnenen Lösung mit umligiertem Plasmid wurden die E. coli-Stämme C75 und C90 (Garen, A., und N. Otsuji, J. Mol. Biol., 8, 841-852 (1964) als Rezipienten im wesentlichen in gleicher Weise wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 beschrieben transformiert, worauf man Stämme erhielt, die die phoS⁺-Plasmide führten. Anschließend wurden die Plasmid-DNSen aus den Kulturen der verschiedenen unabhängigen Transformationsprodukte extrahiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie beim fünften Schritt in Beispiel 1 gereinigt, worauf eine Restriktionsabbildung der Plasmide aufgebaut wurde. Das gereinigte umligierte Plasmid wird im folgenden mit "pSN507" bezeichnet, sein physikalischer Aufbau ist Fig. 1 zu entnehmen.

Zweiter Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN508 aus pSN507

Die pSN507-DNS, die im vorangegangenen ersten Schritt gewonnen worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym MIuI aufgeschlossen und anschließend erfolgte die erneute Einligierung des Plasmids und die Transformierung jedes der E. coli-Stämme C75 und C90 mit dem umligierten Plasmid, und zwar im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 2, wobei man Stämme erhielt, die das umligierte Plasmid (das nachstehend als "pSN508" bezeichnet wird) mit sich führten. Die pSN508-DNS wurde aus den Zellkulturen dieser Stämme extrahiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie beim Schritt 5 in Beispiel 1 gereinigt. Es wurde eine Restriktionsabbildung des Plasmids pSN508 aufgebaut. Das Ergebnis ist Fig. 1 zu entneh men.

Dritter Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN518 aus pSN508

Die im vorhergehenden zweiten Schritt gewonnene pSN508-DNS wurde mit dem Restriktionsenzym pstI aufgeschlossen und anschließend fand die erneute Ligierung des Plasmids und die Transformierung jeder der E. coli-Stämme C75 und C90 mit dem umligierten Plasmid im wesentlichen in gleicher Weise wie im obigen zweiten Schritt statt, wobei man Stämme mit dem umligierten Plasmid erhielt (das nachstehend als "pSN518" bezeichnet wird). Anschließend wurde aus der Zellkultur der so gewonnenen Stämme die pSN518-DNS extrahiert und im wesentlichen genauso wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 gereinigt. Beim Aufbau der Restriktionsabbildung des Plasmids pSN518 erhielt man das aus Fig. 1 zu entnehmende Ergebnis.

Beispiel 4 Aufbau der das phoS-Gen führenden Plasmide pSN407 und pSN408 aus pSN402

Die pSN402-DNS, die nach Schritt 5 des Beispiels 1 gewonnen wurde, wurde im wesentlichen in gleicher Weise wie im ersten Schritt bei Beispiel 3 umligiert. Das gewonnene Plasmid wird nachstehend als "pSN407" bezeichnet. Anschließend wurde eine Restriktionsabbildung des Plasmids pSN407 aufgebaut. Die Restriktionsabbildung von pSN407 entspricht im wesentlichen der von pSN507, mit dem Unterschied, daß die Orientierung des EcoRI₁-EcoRI₂-Fragments von pSN407 bei pSN507 genau entgegengesetzt ist.

Das so gewonnene pSN407 wurde in gleicher Weise wie im zweiten Schritt von Beispiel 3 umligiert. Das gewonnene Plasmid wird nachstehend als "pSN408" bezeichnet. Die Restriktionsabbildung von pSN408 wurde erstellt; sie entspricht im wesentlichen der von pSn508, mit dem Unterschied, daß die Orientierung des EcoRI₁-EcoRI₂-Fragmentes bei pSN408 genau entgegengesetzt ist zu der bei pSN508.

Beispiel 5 Aufbau der das phoS-Gen führenden Plasmide pSN1507 und pSN1508 aus pSN507

Im wesentlichen in gleicher Weise wie bei Beispiel 1 wurden die Plasmide pBR325 (Bolivar, F. u. a., Gene, 4, 121 (1978)) und pSN507 jeweils mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten. Anschließend wurde das gespaltene Plasmid pBR 325 in das gespaltene Plasmid pSN507 im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 1 ein ligiert. Anschließend wurde - im wesentlichen wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 - die Auslese der gewonnenen angebundenen DNS unter Verwendung des E. coli-Stammes ANCC75 (ein Transduktionsprodukt vom Typ P1: E. coli-Stamm C75 X E. coli-Stamm CSH57 (Miller, J. H., Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., S. 13-23 (1972)) als Rezipienten durchgeführt.

Im wesentlichen in gleicher Weise wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 wurde nun die Extraktion und Reinigung der so gewonnenen Plasmide ausgeführt. Anschließend erstellte man die Restriktionsabbildungen der Plasmide, und stellte fest, daß man zwei Arten von Plasmiden erhalten hatte, die das phoS-Gen enthielten. Eines der Plasmide wird nachfolgend als "pSN1507" und das andere als "pSN1508" bezeichnet. Man stellte außerdem fest, daß das EcoRI₁-EcoRI₂-Fragment von pSN507 an die EcoRI-Einbaustelle bei pBR325 einligiert worden war, wodurch sich pSN1507 bil dete.

Beispiel 6 Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN2507 und Erstellung einer Restriktionsabbildung des Plasmids pSN2507

Das Plasmid pKN402A (B. E. Uhlin u. a., Gene, 6, 91-106 (1979), dessen DNS in der Restriktionsabbildung in Fig. 2 dargestellt ist, wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym HincII aufgeschlossen und mit Hilfe von T4-Ligase umligiert. Stämme mit umligierten Plasmiden (nachstehend mit "pSH101" bezeichnet) wurden im wesentlichen in gleicher Weise wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 und im fünften Schritt bei Beispiel 1 gewonnen, worauf eine Restriktionsabbildung von pSH101 aufgebaut wurde. Fig. 2 zeigt diese Restriktionsabbildung. Nun wurden pSH101 und pSN507 jeweils mit EcoRI aufgeschlossen. Die gewonnenen Fragmente von pSH101 und pSN507 wurden mit Hilfe von T4-Ligase eingebunden. Das gewonnene ligierte Plasmid wurde nun einer Selektierung unterzogen, um die weißen Kolonien der Transformationsprodukte herauszulösen, die das phoS-Gen führende Plasmide enthielten und durch Ligieren des pSN507-Fragmentes in pSH101 gebildet wurden. Das entstandene Transformationsprodukt wurde in einer Kultur angesetzt, und es wurden aus den kultivierten Transformationsprodukten die Plasmid-DNSen extrahiert und im wesentlichen genauso wie beim fünften Schritt in Beispiel 1 gereinigt. Nun wurde im wesentlichen genauso wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 eine Restriktionsabbildung des Plasmids pSN2507, eines der dabei gewonnenen Plasmide, aufgebaut, und die Lage des phoS-Gens in pSN2507 bestimmt. Fig. 2 zeigt die Restriktionsabbildung von pSN2507. Man stellte fest, daß ein Plasmid, in welchem die Orientierung des das phoS-Gen führenden EcoRI₁-EcoRI₂-Fragmentes entgegengesetzt zur Orientierung bei pSN2507 war, auch bei der vorstehend beschriebenen Einbindung des pSN507-Fragmentes in pSH101 hergestellt worden war.

Versuch 1

Durch rechnerische Ermittlung der Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins, die pro Wirtszelle produziert wurden, wurde die Genexpressionskraft des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ermittelt. Der Mechanismus der Produktion eines Phosphatbindungsproteins mit Hilfe der phoS-Genexpression wird nachstehend kurz erläutert. Der Vorläufer des Phosphatbindungsproteins wird zuerst durch Expression des phoS-Gens produziert. Der Vorläufer hat ein Signalpeptid N-terminal am reifen Phosphatbindungsprotein. Das Signalpeptid ist für die Interaktion mit der innenliegenden Zellmembran und für die Sekretion durch diese hindurch erforderlich. Deshalb wird der Vorläufer des Phosphatbindungsproteins zunächst zur Innenmembran transportiert, wobei das Signalpeptid in Funktion tritt. Anschließend wird der Signalpeptidteil des Proteins abgespalten, während es durch die Innenmembran hindurchtritt, und damit wird in das Periplasma der Zelle das reife Phosphat bindungsprotein im gespaltenen Zustand sekretiert.

Die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins, die pro Zelle produziert wurden, wurde wie folgt ermittelt.

Der E. coli-Stamm ANCC 75 wurde mit dem Plasmid pSN507 transformiert und über Nacht in einem Tris/Glucose-Medium inkubiert, also einer mit Tris/HCl (pH 7,2) gepufferten Minimalsalzlösung, die 0,2% (G/V) Glukose enthielt und mit 0,64 mM KH₂PO₄ (nachstehend als "Hochphosphatmedium" bezeichnet) aufgefüllt wurde. Nach der Inkubierung wurden die Wirtszellen geerntet und in zweierlei Arten von Kulturmedien suspendiert, nämlich dem vorgenannten Hochphosphatmedium und dem gleichen Tris/Glukose-Medium, wie es oben beschrieben ist, allerdings mit dem Unterschied, daß die Konzentration von KH₂PO₄ 0,064 mM betrug (nachstehend als "Niedrigphosphatmedium" bezeichnet), mit anschließender sechsstündiger Inkubation unter Schütteln bei 37°C. Die Zelldichte jeder Kultur wurde aus der Absorptionsleistung bei 600 nm durch Schätzung ermittelt. Dabei wurde festgestellt, daß die Anzahl der Zellen in jeder Kultur 1,3×10⁹ betrug. Anschließend wurden die Zellen jeder Kultur durch Zentrifugieren bei 2000×g fünf Minuten lang gewonnen.

Die gewonnnenen Zellen wurden einmal mit 1 ml Pufferlösung gewaschen, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und 30 mM NaCl enthielt, und in einem Zentrifugierglas erneut in 0,1 ml 33 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert. 0,1 ml der 33 mM Tris-HCl (pH 7,5) 40% (G/V) Saccharose und 0,1 mM EDTA enthaltenden Pufferlösung wurden der vorgenannten Zellsuspension zugesetzt, rasch vermischt und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch dreiminütiges Zentrifugieren bei 8000×g gewonnen und sofort erneut in 0,1 ml 0,5 mM wäßriger MgCl-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde kräftig im Eiswasserbad 10 Minuten lang geschüttelt und anschließend fünf Minuten lang bei 8000×g abzentrifugiert. Dem so gewonnenen Überstand (nachstehend als "Periplasmafraktion" bezeichnet) wurden 20 µl einer Probenpufferlösung für die Polyacrylamid-Elektrophorese zugesetzt (die 1 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 1 ml 10 G/V%iges Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1 ml β-Mercaptoäthanol, 1 ml Glyzerin, 2,5 ml 0,1 G/G%iger wäßriger Bromphenolblaulösung und 4,4 ml Wasser enthielt) mit anschließender fünfminütiger Wärmebehandlung bei 100°C. Das Granulat (nachstehend als "Interzellularfraktion" bezeichnet), das bei der vorstehend erläuterten Zentrifugierung entstand, wurde zweimal mit 1 ml 0,5 mM wäßriger MgCl₂-Lösung gewaschen und erneut in 20 µl der Lysozymlösung (die 2 mg Lysozym in 1 ml Wasser, 50 mM Glukose, 10 mM EDTA und 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) enthielt suspendiert, mit anschließender 30minütiger Inkubation bei 37°C. Die auf diese Weise hergestellte Suspension wurde mit 180 µl 0,5 M wäßriger MgCl₂- Lösung verdünnt, und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Diesem Gemisch wurden 120 µl der vorgenannten Probenpufferlösung für die Polyacrylamid-Elektrophorese zugesetzt und anschließend eine Wärmebehandlung 5 Minuten lang bei 100°C durchgeführt.

Die wie vorstehend hergestellten Fraktionen wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Verfahren unterzogen, wie es von Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-685 (1970) beschrieben wurde, wobei die Ausbeute an Phosphatbindungsprotein in den Zellen bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammen gefaßt.

Tabelle

Wie sich aus der obigen Tabelle ergibt, wird die Produktion des Phosphatbindungsproteins und von dessen Vorläufer - mit anderen Worten, die Expression der Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein des erfindungsgemäßen Expressionsvektors - durch Einstellen der Phosphatkonzentration im Kulturmedium gezielt beeinflußt.

Anschließend wurde die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins pro Zelle rechnerisch nach folgender Gleichung ermittelt:

Anzahl der Moleküle pro Zelle = ×C

wobei
A = Ausbeute an Phosphatbindungsprotein (g/Zelle)
B = Molekulargewicht des Phosphatbindungs proteins (35 000)
C = Avogadro′sche Zahl (6×10²³).

Bei Kultivierung im Niedrigphosphatmedium betrug die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins pro Zelle 1,3×10⁶.

Beispiel 7 Produktion von β-Galaktosidase unter Verwendung des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN508

Das wie in Schritt 2 bei Beispiel 3 hergestellte Plasmid pSN508 wurde mit Hilfe von EcoRI gespalten, wobei ein EcoRI- EcoRI-DNS-Fragment mit einem phoS-Gen hergestellt wird. In dieses so gewonnene DNS-Fragment mit dem phoS-Gen wurde das DNS-Fragment ligiert, das durch Spaltung des Plasmids pMC1403 mit der Genkodierung für die β-Balaktosidase (im Zusammenhang mit dem Plasmid pSN1403 wird auf das Journal of Bacteriology, 143, 971-980 (1980) verwiesen) mit Hilfe von EcoRI zur Bildung eines Rekombinationsvektors hergestellt wurde.

Anschließend wurde der Rekombinationsvektor (der nachstehend als "pSN5081" bezeichnet wird) selektiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie bei den Schritten 4 und 5 in Beispiel 1 isoliert.

Dann wurde mit Hilfe von HpaI das Plasmid pSN5081 teilweise ausgelöscht, worauf die beiden Terminale des dabei entstehenden DNS-Fragments des Plasmids pSN5081 teilweise mit Hilfe der Nuklease BAL31 (Handelsbezeichnung für die von Bethesda Research Laboratories Inc., U. S. A. hergestellte und vertriebene Desoxyribonuklease) aufgeschlossen und mit Hilfe von SmaI gespalten wurden. Das abgespaltene DNS-Fragment des Plasmids wurde mit T4-Ligase erneut ligiert.

Nun wurde der E. coli-Stamm CSH26 (hier kann auf J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 17 (1972) verwiesen werden), der eine Lac^--Mutation darstellt, die Laktose in einem Kulturmedium nicht verarbeiten kann, in einem mit Laktose versetzten Tetrazolbett als Kulturmedium mit dem vorgenannten Rekom binationsvektor transformiert, der eine Genkodierung für β-Galaktosidase mit sich führt, wobei Transformationsprodukte entstanden. Durch Transformation mit diesem Rekombinationsvektor wurde aus dem phänotypischen Merkmal Lac^- beim E. coli-Stamm CSH26 der Phänotyp Lac⁺, und damit wurden die zuvor gewonnenen Transformationsprodukte so verändert, daß sie nun Laktose in dem mit Laktose versetzten Tetrazolbett verarbeiten konnten. Dementsprechend ließen sich die Transformationsprodukte ohne Schwierigkeit aus den Stammzellen des E. coli-Stammes CSH26 herausfinden, wobei Größe und Farbe der auf dem mit Laktose angereicherten Tetrazolbett als Selektionskriterien dienten und man im wesentlichen in gleicher Weise wie bei den Experimenten vorging, die in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 49 und S. 52-54 (1972) beschrieben sind. Das erneut eingebundene Plasmid wird nachstehend als "pSN5084" be zeichnet.

Beim Plasmid pSN5084 wurde das die Genkodierung für b-Galaktosidase führende DNS-Fragment in das DNS-Fragment einligiert, welches an seinem unterhalb der DNS-Sequenz eines Promotors für das phoS-Gen das phoS-Gen führte, so daß in Form eines Fusionsproteins β-Galaktosidase gebildet werden konnte.

Anschließend wurde der E. coli-Stamm CSH26 mit dem Plasmid pSN5084 zur Bildung von Transformationsprodukten transformiert. Die Selektierung der Transformationsprodukte aus den Stammzellen vom E. coli-Stamm CSH26 erfolgte in gleicher Weise wie zuvor beschrieben. Die selektierten Transformationsprodukte wurden in Niedrigphosphatmedium inkubiert, wobei in Form des Fusionsproteins β-Galaktosidase entstand. Anschließend wurde das spezifische Gewicht der β-Galaktosidase in den Trans formationsprodukten nach dem Verfahren ermittelt, das in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 352-355 (1972) beschrieben ist. Die Anzahl der Moleküle der β-Galaktosidase, die in Form des Fusionsproteins entstanden, wurde rechnerisch pro Zelle ermittelt, indem die spezifische Aktivität der in Form des Fusionsproteins erzeugten β-Galaktosidase mit der spezifischen Aktivität einer Standard-β-Galaktosidase mit einem Molekulargewicht von 145 000 verglichen wurde. Dabei wurde festgestellt, daß die Anzahl der Moleküle von β-Galaktosidase, die in Form des Fusionsproteins gebildet wurden, pro Zelle 1×10⁵ betrug.

Claims

1. Expressionsvektor mit einem DNS-Fragment, welcher eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen enthält, wobei das DNS-Fragment an das Replikon ligiert ist.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ein DNS-Fragment mit einem von Bakterien der Familie Enterobacteraceae abstammenden phoS-Gen ist.

3. Verfahren zur Herstellung des Expressionsvektors nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

1) Gewinnung einer chromosomalen DNS mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein aus Bakterien der Familie Enterobacteriaceae gehören;
2) Aufspaltung der Chromosomen-DNS mit Hilfe eines Restriktionsenzyms in DNS-Fragmente;
3) Ligieren der DNS-Fragmente an ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen;
4) Transformierung der Zellen eines Bakteriums aus der Familie Enterobacteriaceae mit Hilfe des Replikons, an welches das DNS-Fragment ligiert ist, in Transformationsprodukte, darunter Transformationsprodukte, welche einen Rekombinationsvektor mit dem DNS-Fragment enthalten, das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein mit sich führt;
5) Auslesen von Transformationsprodukten, welche den Rekombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein enthaltenden DNS-Fragment beinhalten, aus den Transformationsprodukten, und
6) Isolieren des Rekombinationsvektors mit dem die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment aus den ausgelesenen Transformationspro dukten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ein von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae abgeleitetes phoS-Gen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der isolierte Rekombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment teilweise ausgelöscht wird, während die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein beibehalten wird, und daß der dabei entstehende, teilweise ausgelöschte Rekombinationsvektor mit Hilfe einer Ligase zum Aufbau eines rekonstruierten Expressionsvektors erneut ligiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führende DNS-Fragment aus dem isolierten Rekombinationsvektor herausgetrennt wird, und daß das herausgetrennte DNS-Fragment an ein andersgeartetes Replikon als das im isolierten Rekombinationsvektor enthaltene ligiert wird.

7. Verwendung des Expressionsvektors nach Anspruch 1 oder 2 zur Erzeugung physiologisch aktiver Substanzen.