DE3433156A1 - Die faehigkeit zur fermentation von saccharose verleihende dna-sequenz, diese dna-sequenz enthaltender vektor, transformierter wirtsorganismus und ihre verwendung - Google Patents
Die faehigkeit zur fermentation von saccharose verleihende dna-sequenz, diese dna-sequenz enthaltender vektor, transformierter wirtsorganismus und ihre verwendungInfo
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Description
. ' " ' 343315$
-A-
Escherichia coli K12-Stämme sind bekanntlich bevorzugte
Mikroorganismen für die Durchführung von Experimenten der Genmanupulation. Die Technologie der rekombinanten DNA wurde
im industriellen Bereich für die Herstellung kommerziell interessanter Substanzen entwickelt, wobei das Wirts-Vektor-System
Escherichia coli Ki2 benutzt wird. Dies geschah hauptsächlich
aus zwei Gründen:
Einerseits ist die Genetik dieser Mikroorganismen derzeit am besten bekannt, und andrerseits schreiben die Richtlinien für
den Umgang mit rekombinanter DNA in verschiedenen Ländern die Benützung dieses Organismus für die Durchführung von Experimenten
mit rekombinanter DNA vor. Doch diese Stämme besitzen nicht die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, wie sie andere
industriell nützliche Mikroorganismen aufweisen wie z.B. Bacillus, Corynebacterium, Actinomyceten und Hefen. Daher
können Escherichia coli Ki2-Stämme nicht gut wachsen, wenn man
Rohmaterialien wie melasse verwendet, die Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Somit wäre es wünschenswert,
einen Plasmidvektor zu erhalten, der sich nicht nur dafür eignet, industriell nützliche genetische Information zu tragen,
sondern der gleichzeitig Bakterien, beispielsweise Escherichia coli K12, die Fähigkeit der Saccharosevergärung verleihen
könnte.
Dieser Plasmidvektor würde einen weiteren Vorteil gegenüber anderen konventionellen Vektoren bieten, der dadurch bedingt
ist, daß der Phänotyp zur Saccharosegärung dazu beiträgt, die Stabilität einer diesen Vektor enthaltenden Kultur von Mikroorganismen
sicherzustellen, wenn man ein Kulturmedium benutzt, das Saccharose als Kohlenstoffquelle enthält. In einem
solchen Medium können nur Zellen mit diesem Plasmid wachsen,
da sie allein in der Lage sind, Saccharose zu vergären. Wenn Zellen ihr Plasmid mit kommerziell verwertbaren Genen
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verlieren, verlieren sie gleichzeitig die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, und sie sind nicht mehr in der Lage zu
wachsen- Dies erübrigt den Zusatz großer Antibiotikamengen zum Kulturmedium, um auf die Anwesenheit des Plasmids zu
g selektionieren, ein Verfahren, das wirtschaftlich sehr
kostenaufwendig ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Sequenz bereitzustellen, die die Fähigkeit der Saccharosevergärung
.verleihen kann- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Hybridvektors plasmidischen
oder viralen Ursprungs für Klonierung und/oder Expression der die genannte DNA-Sequenz enthält und damit transformierten
Organismen die Fähigkeit der Saccharosevergärung verleihen kann. Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, transformierte
Wirtsorganismen zu schaffen, die die Fähigkeit der Saccharosevergärung aufweisen.
Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine DNA-Sequenz, enthaltend
das Saccharose-Operon von Plasmid scr 5 3 (53 Mdal) aus
E. coli AB 1281 (scr 53) mit der Hinterlegungsnumrer NCIB 11993.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Hybridvektor plasmidischen oder viralen (Bakteriophage) Ursprungs zur
Klonierung oder Expression, dadurch gekennzeichnet, daß er die vorstehend genannte DNA-Sequenz enthält.
Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein transformierter Wirtsorganismus bakteriellen Ursprungs, der dadurch gekennzeichnet
ist, daß er mit einem Hybridvector transformiert ist, der eine die Fähigkeit der Saccharpsevergärung verleihende
DNA-Sequenz enthält.
' -6- 343315B
Durch Einführung eines Hybridvektors der Erfindung mittels Transformation in einen Mikroorganismus, beispielsweise
einen Stamm von E. coli K12 mit genetischen Methoden wird
ein DNA-Fragment übertragen, welches den Zellen die Fähigkeit zur Saccharosevergärung verleiht. Die neu hergestellten
Mikroorganismen sind in der Lage, in einem Kulturmedium zu wachsen, welches Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle
enthält. Wenn der Plasmidvektor den Zellen verlorengeht, können die Mikroorganismen die Saccharose nicht mehr verwerten
und sind nicht mehr in der Lage, in einem solchen Medium zu wachsen. Daher können Stämme, welche diesen Plasmidvektor
tragen, gut in Rohmaterialien wie Melasse wachsen, welche Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthalten.
Dieser neue Hybridvektor kann dazu benutzt werden, andere
Gene von industriellem Interesse einzubauen. In diesem Fall ist die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, welche durch den
Plasmidvektor verliehen wird, nicht nur insofern nützlich, als sie dem Mikroorganismus das Wachstum in saccharosehaltigem
2^ Medium erlaubt, sondern auch dadurch, daß sie die Stabilität
des Plasmids auch ohne Zusatz von Antibiotika zur Kultur erhöht, wenn in diesen Medien die Gärung erfolgt. Darüber hinaus
kann man, falls die Anwesenheit anderer Mikroorganismen vermieden werden soll, dem Medium ein Antibiotikum zufügen,
für welches der Hybridvektor Resistenz verleiht. Durch diese zusätzliche Möglichkeit kann die Plasmidstabilität
erhöht werden. Folglich sind der Mikroorganismus und das Verfahren zu seiner Herstellung von großem Nutzen in kommerziellen
Gärungsprozessen.
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Die Erfindung wird nachstehend an Hand einer bevorzugten Ausführungsform
naher erläutert, bei der der verwendete Mikroorganismus der bekannte Stamm Escherichia coli K12 DH1
(beschrieben in: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)) ist, der wegen seiner guten Transformationseigenschaften
einer der bevorzugten E. coli K12-Stämme für Klo-
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nierungsexperimente ist. Jedoch können auch andere E. coli
Stämme sowie andere, insbesondere gramnegative Bakterien mit guten Ergebnissen verwendet werden.
Zur Gewinnung der Saccharosevergärungsgene (Saccharose-
Operon) wird die DNA des Stammes E.coli AB12B1 (scr53) /kCTB 119927
benutzt. Dieser Stamm trägt das konjugative Plasmid scr53 (53 Md), von dem man feststellte, daß es in der Lage ist,
einem klinisch isolierten Salmonella-Stamm die ungewöhnliche
Eigenschaft der Saccharosevergärung zu verleihen (J.
Bacteriol. 122, 401 (1975)). Das Plasmid scr53, welches das
Saccharose-Operon enthält, kann dazu benutzt werden, die Eigenschaft der Saccharosevergärung durch Konjugation oder
Transduktion auf andere Salmonella - oder Escherichia coli Stämme
zu übertragen (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)); es kann jedoch nicht als Plasmidvektor für genetische Klonierungsexperimente
eingesetzt werden. Mit vorliegender Erfin-" dung ist es erstmals gelungen, das im Plasmid scr53 enthaltene
Saccharose-Operon zu isolieren und in geeignete Hybridvektoren umzuklonieren, so daß neue genetische Manipulationen
mit diesem Operon ermöglicht werden.
Nach Isolierung der scr53-Plasmid-DNA durch ein gebräuchliches Verfahren wird die DNA mit einer Restriktionsendonuklease
behandelt. Als Vektor-DNA kann jedes Plasmid oder jede Phage benutzt werden, welche sich in Mikroorganismen,
beispielsweise in Escherichia Zellen vermehren können. Nach Verdauung der Vektor-DNA mit einer Restriktionsendonuklease
braucht man keine spezielle Methode, um das scr53-DNA-Fragment in den Vektor einzufügen; es kann jede
gebräuchliche Technik zur Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden. Das Hybridplasmid, welches man auf diese
Weise erhält, kann in einem geeigneten Mikroorganismus, beispielsweise der Art Escherichia mittels gebräuchlicher
Transformationstechniken eingeführt werden, obwohl die Ausbeute
bei diesen Techniken schwanken kann.
3433151
Transformanten können leicht selektioniert werden, da diese
Kolonien auf einem Nährboden mit Saccharose als einziger Kohlenstoff quelle wachsen können, und da auf dem Vektor vorzugsweise
zusätzlich mindestens-eine Antibiotikaresistenz kodiert ist, die als weiteres Markierungsgen dient.
Wenn das Plasmid einer auf diese Weise erhaltenen Transformante genetische Information zur Saccharosevergärung trägt,
können die Transformanten einwandfrei in saccharosehaltigem
Medium wie Melasse wachsen, wodurch das Saccharose-Operon zum Erhalt der Plasmidpräsenz beiträgt.
Das auf diese Weise geklonte Saccharose-Operon kann auch in andere F]asmidvektoren mit breitem Wirtsbereich umgeklont
werden, wie zum Beispiel in das Plasmid RSF1010, welches
durch Transformation die Fähigkeit zur Saccharosevergärung in andere gramnegative Bakterien übertragen kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt das
Vektcrplasmid pSP1 dar, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
a) er ein Hybridplasmid ist, das die gesamte Nucleotidsequenz
des Plasmids pBR 3 25 und ein Fremd-DNA-Insert an der Fstl-Schnittstelle von pBR 325 enthält, wobei das
Fremd-DNA-Insert eine das Saccharose-Operon von Plasmid ser 53 enthaltende DNA-Sequenz ist.
b) er ein Molekulargewicht von etwa 10,8 kb und die folgenden
Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen aufweist:
Restruktionsenzvm Zahl der Schnittstellen
BgTII 0
Xbal 0
5 Xhol
Smal ι
Hindll I χ
CUI 2
BamHl 2
EcoRI 2
Sail 2
Pstl 2
Sphl 2
Hindi 5
PvuII 5
on Das Beispiel erläutert die Erfindung.
A. - Gewinnung der scrSS-Plasmid-DNA mit der genetischer
Information für die Fähigkeit zur Saccharosevergärung.
/NCIB 119937
Der Stamm Escherichia coli AB1281 (scr53)/mit dem konjugativen
Plasmid scr53 ist eine Exkonjugante des E. coli-Stamms
AB1281 (CGSC1281) (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)). Dieser
Stamm wird bei 37°C 16 Stunden lang unter Schütteln in ml L-Mediuir. gezüchtet, das 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt,
0,5 % NaCl und 0,1 % Saccharose enthält und auf pH 7,2 eingestellt
ist. Die Bakterienzellen werden konzentriert und die Plasmid-DNA nach der Methode von Hansen und eisen
(J. Bacteriol. 135, 227 (1978)9 extrahiert. Das Plasmid
scr53 wird weiter durch Zentrifugation in ei rein isopykni-
r _ 10 _ 343315Β
< sehen CsCl-Gradienten mit Ethidiumbromid gereinigt. Es werden
10 μς gereingte DNA erhalten.
B. - Gewinnung der Vektor-DNA
DNA des Plasmids pBR325, einem Vektor mit Genen für Ampicillin-, Tetracyclin- und Chloramphenicolresistenz als
Marker (Gene 4, 121 (1978)), wird auf folgende Weise gewonnen:
Zellen des Stammes Escherichia coli K12DH1, welcher das
Plasmid pBR325 trägt, werden in 500 ml L-Broth (1% Pepton,
0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, eingestellt auf pH 7,2),
die 100 μg/ml Ampicillin enthält, bei 37°C bebrütet. Die
Plasmide werden durch Zugabe von 300 μg/ml Spectinomycin
zu den Zellen ir der exconentiellen Phase amplifiziert.
«5 Nach 16 Stunden Bebrütung werden die Zellen geerntet und
durch Behandlung mit Lysozym und SDS lysiert (Biochim, Biophys. Acta 299, 516 (1973)). Nach Reinigung durch Zentrifugation
im CsCl-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsgradienten werden
500 μg Plasmid-DNA erhalten.
C. - Einführung des scrSS-Plasmid-DNA-Fragments in die
Vektor-DNA.
1 ng der scr53-Plasmid-DNA und 2 ug der Vektor-DNA werden
jeweils mit der Restriktionsendonuklease Pst I bei 37°C für eine Stunde behandelt, um die DNA-Moleküle zu spalten;
anschließend wird für 10 min auf 650C erhitzt. Die Lösuncer
den verdauten DNAs des Plasmids scr53 und des Vektors werden gemischt und die DNA-Fragmente mit T4-DNA-Ligase in
Gegenwart von ATP, MgCl2 und Dithiothreit bei 14°C 24 Stunden
lang ligiert. Die rekombinante DNA wird durch Äthanolfällung gewonnen.
D. - Genetische Transformation mit dem Hybridplasmid, welches die genetische Information für die Eigenschaft der
Saccharosevergärung enthält.
Γ - η - 343315S
Kompetente Zellen des Stammes Escherichia coli DH1 werden
mit der RbCl-Methode gewonnen, die von Hanahan beschrieben
wurde (J. Mol. Biol. 166, 557 (1983)). Die im Schritt (C) erhaltene DNA mit den Hybridplasmiden wird der Suspension
kompetenter Zellen zugefügt. Die Suspension wird für 20 min im Eis gehalten, dann 2 min auf 370C erwärmt und schließlich
wieder für 60 see in Eis gestellt.
Mit den Zellen, die nun DNA enthalten, wird L-Broth beimpft und das Medium 1 Stunde bei 370C geschüttelt, wobei die
Transformationsreaktion abgeschlossen wird. Die Zellen werden konzentriert, mit Saline (8,5 g/l NaCl) gewaschen und auf
Agarmedium ausplattiert (9 g K3HPO4, 4,5 g KH2PO4, 2 g
(NH4J2SO4, 0,1 g MgSO4 x 7 H2O, 0,01 g FeSO4 x 7 H2O,
1 mg Thiamin-HCl, 5 g Saccharose, 15g Agar pro Liter und
12,5 μg/ml Tetracyclin).
Die Platten werden bei 370C bebrütet. Nach 2 Tagen können
8 000 Kolonien auf den Platten gezählt werden. 100 Kolonien werden abgenommen, gereinigt und isoliert. Jede auf diese
Weise erhaltene Transformante wird auf einem Medium aus
10g Pepton, 5 g NaCl, 10g Saccharose, 0,02 g Bromcresolpurpur
und 15g Agar pro Liter auf ihre Fähigkeit, Saccharose zu vergaren (scr -Phänotyp), geprüft. In diesem Medium
erscheinen saccharoseverwertende Transformanten als gelbe
Kolonien. Die Transformanten werden auch auf Tetracyclin-
und Chloramphenicolresistenz sowie auf Ampicillinsensitivität geprüft.
Die Plasmide der Zellen, welche den richtigen Phänotyp
+ RRS
(scr , Cm , Tc , Ap ) zeigen, werden mit einer Minipräparationsmethode analysiert (Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Die Hybridplasmide werden mit Pst I gespalten und ein Klon mit einem Plasmid ausgewählt, welches ein Pst I-Insert von 4,85 kb aufweist. Das pBR325-Hybridplasmid mit besagtem Insert wird als pSP1 bezeichnet und hat eine Größe von 10,8 kb.
(scr , Cm , Tc , Ap ) zeigen, werden mit einer Minipräparationsmethode analysiert (Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Die Hybridplasmide werden mit Pst I gespalten und ein Klon mit einem Plasmid ausgewählt, welches ein Pst I-Insert von 4,85 kb aufweist. Das pBR325-Hybridplasmid mit besagtem Insert wird als pSP1 bezeichnet und hat eine Größe von 10,8 kb.
L . .J
E. - Präparation des Plasmids pSPl.
343315
Aus saccharosevergärenden Zellen des Stammes Escherichia coli DH1 (pSP1) (AM512), welche das Plasmid PSP1 besitzen,
wird die pSP1-Plasmid-DNA durch das in Schritt (B) beschriebene
Verfahren extrahiert.
F. - Spaltstellen für verschiedene Restriktionsendonucleasen
im Plasmid pSP1.
In diesem Schritt werden 0,5 μg der pSP1 -Plasmid-DNA aus dem
vorangehenden Abschnitt mit folgenden Restriktionsendonukleasen verdaut:
EcoRI Escherichia coli
Hindlll Haemophillus influenzae
Pstl Providencia sttfartii
Sail Streptomyces albus
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
Xbai Xanthomonas badrii
PvuII Proteus vulgaris
CIaI Caryophanum latum
Xhol Xanthomonas holicola
HincII Haemophilus influenzae
Sphl Streptomyces phaechromogenes
Smal Xanthomonas malvacearum
BgIII Bacillus globigii
Die Restriktionsendonukleasen werden von Biolab New England Inc. und von Boehringer Mannheim GmbH bezogen und unter den
für jedes Enzym geeigneten Bedingungen eingesetzt. Die daraus hervorgehenden DNA-Fragmente werden durch horizontale
Elektrophorese in 0,5 % Agarose-Gelen analysiert. Das Molekulargewicht
eines jeden Fragments wird aus seiner elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit errechnet. Die Berechnung
erfolgt mittels einer Standardkurve, bei der die elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeiten gegen die
Γ - 13 - 3Α33158
bekannten Molekulargewichte von DNA-Fragmenten aufgetragen werden, welche durch Hind HI-Verdauung von DNAs der
Phagen^-und 0 29 erhalten werden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
Restriktionsendonuklease Anzahl der Spaltstellen auf
dem Plasmid pSP1
BgIII 0
Xbal 0
Xhol 0
Smal 1
Hindlll 1
CIaI 2
BamHI 2
EcoRI 2
Sail 2
Pstl 2
Sphl 2
Hindi 5
PvulI 5
Die Restriktionskarte des Plasmids pSP1 wird durch Einzel-
und Doppelverdauungen der Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
und Analyse der DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese
erstellt. Die bekannte Restriktionskarte des Plasmids pBR325 (Gene 14, 289 (1981)) wird ebenfalls für
die Erstellung der pSP1-Restriktionskarte herangezogen. Diese ist in Figur 1 dargestellt.
G. Analyse des saccharosespaltenden Enzyms
Die Saccharaseaktxvitat wird durch folgende Methode bestimmt,
die auf dem Auftreten von reduzierenden Zuckern nach Saccharosespaltung beruht: Zellen des Stammes E. coli DH1 mit
Γ - 14 - 343315?
dem Plasmid pBR325 oder dem neuen Hybridvektorplasmid pSP1 werden in L-Broth und in L-Broth mit 10 mM Saccharose kultiviert.
Die Zellen werden geerntet und die bakteriellen Pellets mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 gewaschen,
der 200 mM KCl und 1 mM 2-Mercaptoäthanol enthielt. Nach dem Waschen werden die Zellen im gleichen Puffer resuspendiert
und mit Ultraschall behandelt. Nach dieser Behandlung wird die Suspension bei 40 000 χ g 20 min lang bei 40C zentrigugiert.
Der überstand wird extrahiert und ohne weitere Behandlung verwendet. Eine Mischung von 0,5 ml dieser
Enzympräparation und 0,5 ml von 1 M Saccharose wird 30 min bei 370C inkubiert. Durch Zugabe von 1 ml Dinitrosalicyl-Reagens
(Methods in Enzymol. 1, 149 (1955))wird die Reaktion gestoppt. Die Proben werden für 5 min in ein kochendes
Wasserbad gestellt, in Eis gekühlt und mit 20 ml destl. Wasser verdünnt. Die optische Dichte der Proben wird bei
540 nm gemessen. Standardlösungen von Glucose werden zur Eichung verwendet. Die Proteinkonzentration wird mit
einer gebräuchlichen Methode bestimmt.
Wie in Tabelle II gezeigt, wurde in den pSPi enthaltenden
Zellen von E. coli DH1 die Saccharaseaktivität konstitutiv exprimiert.
Stamm Plasmid Wachstum in Saccharose- Saccharoseaktivität
Minimal-Salz- Vergärungs- mg reduzierende Zucker
Medium M63+ phänotyp /30 mg Protein
Thiamin +0,5% T ,
, , „ .. L broth
Saccharose 1 Broth . n „ _ ,
10 mM Saccharose
-
E.coli DHI pBR325 - scr 0,0 0,0
E.coli DHI pSPI + scr+ 1,4 1,4
1 Literatur
- Maniatis T. et al., Molecular cloning, a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor New Yorl.
5 (1982).
- Wohlhieter, J.A. et al., J. Bacteriol. 122, 401-406
(1975)
- Bolivar F., Gene 4, 121-136 (1978).
- Godson, G.N. and Vapnek, D., Biochim. Biophys. Acta 299,
10 516-520 (1973)
- Hanahan D., J MoI. Biol. 166, 557-567 (1983).
- Bernfeld P., Methods in Enzymol. 1, 149-159 (1955).
- Hansen, J.B. and Olsen,'R.H., J. Bacteriol. 135, 227-238
(1978)
15 - Prentki, P. et al., Gene 14, 289-299 (1981).
-IL.
- Leerseite -
Claims (8)
1. DNA-Sequenz, enthaltend das Saccharose-Operon von
Plasmid scr 53 (53 Mdal) aus E. coli AB 1281 (scr 53)
mit der Hinterlegungsnummer NCIB 11993.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Größe von 4,85 Kb aufweist.
3. Hybridvektor plasmidischen oder viralen (Bakteriophage)
Ursprungs zur Klonierung oder Expression, dadurch Gekennzeichnet, daß er die DNA-Sequenz von Anspruch 1 oder
2 enthält.
4. Hybridvektor (pSP 1) gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
a) er ein Hybridplasmid ist, das die gesamte Nucleotidsequenz
des Plasmids pBR 325 und ein Fremd-DNA-Insert an der Pstl-Schnittstelle von pBR 325 enthält, wobei
das Fremd-DNA-Insert eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1
35 oder 2 ist,
b) er ein Molekulargewicht von etwa 10,8 kb und die fol-
343315%
genden Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen aufweist:
Restriktionsenzym Zahl der Schnittstellen
5. Hybridvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Hybridplasmid darstellt, das aus einem Plasmidvektor
mit breitem Wirtsbereich und einem Fremd-DNA-Insert besteht, wobei das Fremd-DNA-Insert eine DNA-Sequenz
gemäß Anspruch 1 oder 2 ist.
6. Hybridvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid mit breitem Wirtsbereich das Plasmid
RSF 1010 ist.
7. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem mindestens eine DNA-Sequenz
enthält, die für eine Resistenz gegen ein Antibiotikum kodiert.
Γ - 3 -
j
8. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß er außerdem eine DNA-Sequenz enthält, die für ein wertvolles Genprodukt kodiert.
9. Transformierter Wirtsorganismus bakteriellen Ursprungs,
dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus mit einem Hybridvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 8 transformiert
ist.
10- Wirt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ein
gram-negatives Bakterium ist.
11. Wirt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Species der Art Escherichia ist.
12. Escherichia coli DH 1 (psp1) mit der Hinterlegungs-Nummer
NCIB 11940.
13. Verfahren zur Selektion eines Mikroorganismus unter Ausnutzung
einer metabolischen Eigenschaft, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus mit einem
Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7 transformiert,
und ihn dabei die Fähigkeit verleiht, in einem Medium zu wachsen, das Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle
25 enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
der zur Transformation verwendete Vektor dem Mikroorganismus Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum
30 verleiht.
15. Verwendung eines Expressions-Hybridvektor nach einem
der Ansprüche 3 bis 7 zur Herstellung von Organismen mit Sucrase-Aktivität.
16. Verwendung eines Expressions-Hybridvektors nach Anspruch
8 zur Herstellung nützlicher Genprodukte.
L i
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-
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