DE2933000A1

DE2933000A1 - Verfahren zur darstellung einer gencodierung fuer ein ein hohes molekulargewicht aufweisendes protein

Info

Publication number: DE2933000A1
Application number: DE19792933000
Authority: DE
Inventors: Barbara Jean Bruce; Thomas Hunter Fraser
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1978-08-21
Filing date: 1979-08-14
Publication date: 1980-04-17
Also published as: GB2033905B; FR2450874A1; FR2450874B1; GB2033905A

Description

Henkel, Kern, Feiler & Hänzel Patentanwälte

Registered Representatives

before the

European Patent Office

■Y-

Möhlstraße 37 D-8000 München 80

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme- ellipsoid

TUC 3542A - Dr.F/rm 1 k. AUG. 1979

THE UPJOHIi COMPAIIY
Kalamazoo, Mich., V.St.A.

Verfahren zur Darstellung einer Gencodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes Protein

03001Θ/0623

Beschreibung

Zahlreiche aus der Anwendung der DNS-Rekombinationstechnologie auf medizinische Probleme herrührende mögliche und verstellbare Nutzungsmöglichkeiten erfordern die Einfügung von zur Biosynthese der erforderlichen Proteine fähigen Gene in Bakterien. In den meisten Fällen wird ein interessierendes Protein normalerweise in tierischen Zellen synthetisiert und nicht als in E. coli oder sonstigen Prokaryoten natürlich vorkommend gefunden. Obwohl es möglich geworden ist, eine Reihe unterschiedlicher tierischer Gene mit der zur Codierung, Übertragung bzw. Chiffrierung (code) für Proteine erforderlichen Information zu klonen, gibt es Berichte über die Darstellung bzw. den "Ausdruck" (expression) dieser Proteine in Bakterien oder sonstigen einzelligen Organismen nur für das menschliche Polypeptidhormon "Somatostatin" (vgl. K. Itakura, T. Hirose, R. Crea, A.D. Riggs, H.L. Heyneker, F. Bolivar und H.W. Boyer in "Science", Band I98, Seiten 1056 bis 1063 (1977)) und Rattenproinsulin.

Das Somatostatingen wird chemisch synthetisiert, während die Codesequenz für seine 14 Aminosäuren mit dem ß-Galactosidasebaugen auf einem Plasmid verschmolzen wird. Die Ausbeute an Somatostatin schwankt von 0,001 bis 0,03% des gesamten Zellproteins. Das Rattenproinsulingen wird in ein Plasmid-erzeugtes Penicillinasegen eingeführt, wobei das Bakterium etwa 100 Moleküle Proinsulin pro Zelle produziert.

Unter Anwendung der später noch beschriebenen DNS-Rekombinationsmethodologie wurde das Hühnerovalbuminbaugen mit den einen Kopiervorgang und eine Übertragung steuernden Stellen bei E. coli verschmolzen. Wenn ein das Hybridgen

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enthaltendes Plasmid in E. coli eingebaut wird, erfolgt eine Synthese eines durch Immunoreaktionsfähigkeit und SDS-föLyacrylamidgelelektrophorese als Ovalbumin identifizierten Proteins. Das in Bakterien gebildete Hühnerovalbumin ist von voller Länge (MG: 43000) und macht 1,5?6 des Zellproteins (etwa 20000 Moleküle pro Zelle) aus. Dies ist das erste in E. coli dargestellte tierische Protein hohen Molekulargewichts. Ein weiterer vorteilhafter Gesichtspunkt dieses Verfahrens besteht darin, daß das Eierovalbumin durch die Bakterienzellmembran abgesondert wird.

Gegenstand der Erfindung ist ganz allgemein ein Verfahren zur Darstellung bzw. zum Ausdruck (expression) einer Gencodierung oder -codifizierung (gene coding) für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes Protein in einem geeigneten Träger, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das betreffende Gen nimmt und es nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen (transcriptional and translational initiation regions) unter Erhaltung des Übertragungsleserasters (translational reading frame) anschmilzt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einsetzt.

Beispiele für andere erfindungsgemäß darstellbare Proteine mit hohem Molekulargewicht sind liumanserumalbumin, Humaninterferone, Eumanantikörper, Blutgerinnungsfaktoren, Enzyme, virale Antigene und Proteine aus Pflanzen (ausschließlich von Pilzen). Auf zahlenmäßiger Molekulargewichtsbasis ist unter einem ein hohes Molekulargewicht aufweisenden Protein ein solches mit einem Molekulargewicht über etwa 10000 Dalton zu verstehen.

Aus der Zeichnung ergeben sich die bei der Herstellung des mit lac-Ovalbumin verschmolzenen Plasmids pUC 1001 durch-

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zuführenden Verfahrensstufen. Obwohl die verschiedenen Abkürzungen üblich und dem Fachmann bekannt sind, werden sie im folgenden zum besseren Verständnis der Erfindung nochmals definiert:

Restriktionsendonukleasen: Taq I, EcoRI (in den Beispielen), Hind III, Taq I und EcoRI - Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen (in der Zeichnung). Tc^r - Tetracyclinresistenzgen dA:dT - Desoxyadenosin:Desoxythymidin. ρ - Phosphat C - Cytosin G - Guanosin A - Adenosin T - Thymidin ΐ4 DNS Ligase - Enzym, codifiziert durch Dakteriophage T4. T4 DNS Polymerase - Enzym, codiert durch Bakteriophage T4. Iac - Lactose-operon-Steuerbereich. OH - Hydroxyl

pUC - offizielle Bezeichnung für ein der Anmelderin gehörendes Plasmid

pOP - Plasmidoperatorpromotor. pOV - Plasmidovalbumin. Ovalbumin - HUhnerovalbuminbaugen bzw. -strukturgen.

Die im vorliegenden Falle beschriebenen Plasmide sind in E.-coli- Wirten bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH München, Griset

sind:

Grisebachstr. β,"¹' hinterlegt. Ihre Hinterlegungsnummern

IiU 101 - DSM 1611

HB 101 (pOV 230) - DSM l6l2

+) D-3400 Göttingen

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HB 101 (pOP 203) - DSM l6l3 HB 101 (pUC 1001)- DSM I6l4

Der Aufbau des alt lac-Ovalbumin verschmolzenen Plasmlds pUC 1001 verläuft, vie aus der Zeichnung ersichtlich. Das pOP-203-Plasmid wird mit EcoRI aufgeschnitten, worauf das erhaltene lineare Molekül zweckmäßigerweise mit alkalischer Phosphatase behandelt wird, um die 5'-Phosphatgruppen an den Molekülenden zu entfernen.

Das pOV-230-Plasmid enthält nahezu die gesamte OvalbuminmRNA-Sequenz einschließlich der gesamten Information, die zur Codlfizierung der Aminosäuresequenz von HUhnerovalbumin erforderlich ist (vgl. L.A. McReynolds, J.F. Catterall und B.W. O'Malley in "Gene", Band 2, Seiten 217 bis 231 (1977)). pOV 230 stellt Jedoch keine nachweisbaren Mengen HUhnerovalbumin her. Dies 1st darauf zurückzuführen, daß. es einen Promotor plus eine die Proteinsynthese einleitende Stelle, die in das Ovalbuminbaugen gerichtet ist, benötigt. Die Sequenz der OvalbumlngeneinfUgung in pOV 230 (vgl. L. McReynolds, B.W. O'Malley, A.D. Nisbet, J.E. Fothergill, D. Givol, S. Fields, M. Robertson und G.G. Brownlee in "Nature¹¹, Band 273, Seiten 723 bis 728 (1973)) hat eine einzigartige Taq-I-Restrlktlonsendonukleasestelle 25 Basepaare zu der 5»-Seite des die Ovalbuminproteinsynthese einleitenden Codons sichtbar werden lassen. Vie aus der Zeichnung hervorgeht, befindet sich eine zusätzliche Taq-I-Steile etwa 230 Basepaare außerhalb der OvalbumlneinfUgung, so daß eine

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Taq-I-Verdauung ein DNS-Fragment von etwa 2200 Basepaaren mit dem gesamten Ovalbuminbaugen liefert. In dem pOV-230-Plasmid sind mindestens 11 weitere Taq-I-Stellen vorhanden, so daß die Verdauung 12 Fragmente liefert.

Da die Sequenz der in pOP 203 eingefügten lac-Steuerstelle (vgl. H.M. Maizels in "Proc. Nat. Acad. Sei.", Band 70, Seiten 3585 bis 3589 (1973) und R.C. Dickson, J. Abelson, W.H. Barnes und W.S. Reznikoff in "Science", Band 187, Seiten 27 bis 35 (1975)) und des in pOV 230 eingefügten Ovalbumingens bekannt ist, besteht die Aufgabe darin, die lac- und Ovalbumin-DNS'n zu verschmelzen, um den Übertragungsleseraster zu erhalten. Dies erfolgt durch Auffüllen der versetzt endenden (stagger-ended) Taq-I-Fragmente mit DNS-Polymerase und anschließendes Anbinden synthetischer EcoRI-octameren Verbindungsglieder an die stumpfen Enden (vgl. die Zeichnung). Bei der Reaktion wird ein großer Überschuß an Verbindungsmolekülen eingesetzt, um eine Verbindung der aufgefüllten Taq-I-Fragmente miteinander zu verhindern.

Die verbundenen Fragmente werden mit EcoRI verdaut, um die 5'-versetzten Enden (staggered ends) zu erzeugen. Vor der EcoRI-Verdauung werden die DNS-Fragmente mit Hilfe der Hha-I-Restriktionsendonuklease verdaut. Dies erfolgt zweckmäßigerweise zur Erleichterung der anschließenden Gelreinigung des Ovalbumin-DNS-Fragments, da dieses im Gegensatz zu zahlreichen anderen Taq-I-Fragmenten überhaupt keine Hha-I-Stellen aufweist.

Nach dem Eluieren aus dem Gel wird das gereinigte pOV-230-DNS-Fragment an den mit der alkalischen Phosphatase behandelten pOP-203-Plasmidvektor gebunden (vgl. die Zeichnung) . Diese gebundene DNS wird dann zur Umwandlung von

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E. coil ΗΒ1Ο1 DSM 1611 verwendet. Es werden tetracydinreslstente Kolonien auegewählt.

Die tetracyclinresiatenten Itawandlungsprodukte (transformants) werden Im Rahmen eines in-situ~Immunotests bezüglich der Ovalbuminproduktion getestet. Die umgewandelten ("transformant) Kolonien werden, nachdem sie auf einem Ovalbuminantiserum, handelsübliches Isopropyl-ß-D-thiogalactosid und Tetracyclin enthaltenden Agar wachsen gelassen worden waren, mit Lysozym und Sarkosyl lysiert. Rund um die Kolonien mit denjenigen Plasmiden, die die Ovalbumlnsynthese steuern, bilden sich leicht sichtbare Präzipitinringe.

Aus den Ovalbumln produzierenden Utawandlungsprodukten (trans» formants) werden Zellextrakte gewonnen. Nachdem belegt wurde, daß diese Extrakte immunoreaktionsfähiges Ovalbumin aufweisen, werden Antikörperfällungen durchgeführt und die Niederschläge auf einem SOS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Die Gelanalyse zeigt, daß das immunoreaktlonsfähige Ovalbumin die volle Länge aufweist (MG: 43000) und keine ein niedrigeres Molekulargewicht aufweisende Fraktionen vorhanden sind.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren und die Produkte gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche '•Prozentangaben" - "Gewichtsprozente" und sämtliche Mengenangaben bei Lösungen!ttelgemischen "Volumenverhältnisse".

Beispiel 1 - DNS-Herstellung

Die pOP-203-Plasmid-DNS aus DSM 1613 wird nach dem von Guerry und Mitarbeitern (vgl. P. Guerry, D.J» LeBlanc und

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S. Falkow in »J. Bact.", Band 116, Seiten 1064 bis 1066 (1973)) beschriebenen Salzfällverfahren isoliert. Ferner wird L-Brühe (vgl. E.S. Lennox in "Virology", Band 1, Seiten 190 bis (1955)) mit 10 ug/ml Tetracyclin mit einer über Nacht gezüchteten Brühenkultur von HRRL B-11355 beimpft. Die Kulturen werden bei 37⁰C kräftig geschüttelt, bis die optische Dichte bei 600 nm einen Wert von 0,8 erreicht. Danach wird die Plasmidkopiezahl 18 h lang mit Chloramphenicol (250 η g/ml) erhöht. Nachdem die Zellen einmal mit 50 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 20 mW Athylendiamintetraessigsäure gewaschen worden waren, werden sie pro 1 Kultur in 33 ml TE (10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 mit 0,1 mM Athylendiamintetraessigsäure) mit 25% Saccharose resuspendiert. Wach Zugabe von 1 mg/ml Lysozym wird die Suspension 5 min lang auf Eis inkubiert, dann mit ein Drittel Volumen 0,25m-Äthylendiamintetraessigsäure eines pH-Werts von 8,0 versetzt und erneut 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch Zusatz von 10% Natriumdodecylsulfat in 37 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 mit 67 mM Athylendiamintetraessigsäure auf eine Endkonzentration von 1,3% lysiert, worauf das Ganze 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird.

Die Chromosomen-DNS wird ausgesalzen, indem die NaCl-Konzentration auf 1m gebracht wird. Danach wird über Nacht auf eine Temperatur von 4°C gekühlt. Das Natriumdodecylsulfat und die Chromosomen-DNS werden durch 30-minütiges Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4⁰C mit 17000 g entfernt. Bei der hierbei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wird eine Äthanolfällung durchgeführt, danach werden Kugelchen gebildet und diese in TE wieder aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird zweimal mit Phenol und dann mit Äther extrahiert, mit Äthanol gefällt, in Kugelchen überführt und in TE resuspendiert.

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Eine weitere Reinigung erreicht man durch Cäsiumchlorid/ Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugieren in der später beschriebenen Weise.

nach dem Die pOV-23O-Plasraid-DNS wird / im einzelnen von T.C. Currier und E.W. Nestor in "Anal. Biochem.", Band 76, Seiten 431 bis 441 (1976) beschriebenen "Rückschnapp-Verfahren" (snap back procedure) isoliert. Es wird Lennox-Brühe mit 1?6 Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl und 0,1% Glucose plus 15 Wg Tetracyclin pro ml mit 18 h alter BrUhekultur von E. coli HB 101 (pOV 230), DSM 1612 beimpft. Wenn die optische Dichte bei 600 mn einen Wert von 0,8 erreicht, wird die Plasmidkopiezahl 20 h lang durch Zusatz von Chloramphenicol (Endkonzentration: 250 ug/ml) vergrößert.

Die Zellen werden zweimal mit 50 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 20 mM Äthylendiamintetraessigsäure gewaschen und dann in demselben Puffer im Verhältnis 11,25 : 1 (ml : g Naßgewicht) resuspendiert. Die Bakterien werden in 1% Natriumdodecylsulfat und 500 u g/ml vorverdauter Pronase B (50 mg/ml in auf 37°C erwärmtem H₂O während 90 min) lysiert.

Nach 80 min bei 37°C wird mit dem Lysieren eingehalten, nicht-lysierte Zellen werden durch Zentrifugieren entfernt.

Die Chromosomen-DNS wird durch Hindurchleiten des Lysats durch eine 18-guage-Nadel einer Scherwirkung ausgesetzt. Durch kurzzeitiges Erhöhen des pH-Werts auf 12,2 wird sie denaturiert. Nach dem Wiedereinstellen des pH-Werts auf 6,5 wird die NaCl-Konzentration des Lysats auf 3% gebracht. Die denaturierte Chromosomen-DNS und die Proteine werden mit redestilliertem Phenol, das mit 3% NaCl gesättigt ist, extrahiert. Schließlich wird die wäßrige Phase mit Chloro-

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form/lsoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Danach wird die Plasmid-DNS mit 2 Volumina kalten Äthanols gefällt. Nach 18-stündiger Lagerung bei einer Temperatur von -20°C wird die DNS in Kügelchen überführt, im Vakuum getrocknet und erneut in 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 0,1 mM Äthylendiamintetraessigsäure gelöst.

Die Plasmid-DNS wird durch Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugieren weiter gereinigt. Zu diesem Zweck wird das Cäsiumchlorid in der DNS-Lösung im Verhältnis 1 : 1 (Gewicht : Volumen) gelöst, worauf 550 η g/ml Äthidiumbromid zugegeben werden. Die Gradienten v/erden etwa 40 h bei etwa 10OOO0 g zentrifugiert. Die Plasmid-DNS wird aus dem Gradienten durch Nadelpunktieren entfernt. Das Äthidiumbromid wird mit HpO-gesättigtem 1-Butanol extrahiert. Danach wird die DNS in 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 0,1 mM Äthylendiamintetraessigsäure dialysiert, worauf eine endgültige Äthanolfällung durchgeführt wird. Die gereinigte Plasmid-DNS wird in 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 0,1 mM Äthylendiamintetraessigsäure gelöst.

Das für die Herstellung von pOP-203-DNS beschriebene Verfahren kann auch zur Herstellung von pOV-230-DNS oder einer sonstigen Plasmid-DNS durchgeführt werden. Für den Fachmann bereitet es auch keine Schwierigkeiten, die angegebenen Bedingungen für die Herstellung von Plasmid-DNS zu variieren.

Beispiel 2 - Restriktionsendonukleaseverdauungen

(a) Die EcoRI-Verdauung der gemäß Beispiel 1 hergestellten pOP-203-DNS erfolgt in einem Reaktionsgemisch mit 100 mM

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Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4, 50 mil NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 u g/ml einer im Autoklaven behandelten Gelatine, 70 u g/ml DIIS und 100 Einheiten/ml EcoRI-Restriktionsendonuklease. Nach 60-minütiger Inkubation bei einer Temperatur von 37°C wird das Reaktionsgemisch mit Phenol und dann mit Äther extrahiert und schließlich mit Äthanol gefällt. Es sei darauf hingevd.esen, daß die Verwendung eines anderen Trägers wahrscheinlich die Verwendung einer anderen Restriktionsendonuklease erfordert.

(b) Die Taq-I-Verdauung der gemäß Beispiel 1 hergestellten pOV-230-DNS erfolgt in einem Reaktionsgemisch mit 6 nl-I Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4, 6 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 6 mM 2-Mercaptoäthanol, 100 ug/ml einer im Autoklaven behandelten Gelatine, 40 u g/ml DNS und 40 Einheiten/ml Taq-I-Restriktionsendonuklease. Nach 60-minütiger Inkubation bei einer Temperatur von 65⁰C wird das Reaktionsgemisch in der unter (a) für die EcoRI-Verdauung beschriebenen V/eise aufgearbeitet. Es können auch andere Restriktionsendonukleasen verwendet werden, solange der Schnitt an der 5'-Stelle des Ovalbuminbeginncodons (ovalbumin initiation codon) erfolgt. Die Verwendung eines anderen Trägers oder Gens dürfte wahrscheinlich die Verwendung einer anderen Restriktionsendonuklease er-fordern.

(c) Die Hha-I-Verdauung der pOV-230-DNS, die mit Taq I verdaut, unter Verwendung einer DNS-Polymerase aufgefüllt und unter Verwendung einer gemäß dem später folgenden Beispiel 6 (a) hergestellten DNS-Ligase mit EcoRI-Verbindungsgliedern verbunden wurde, erfolgt zweckmäßigerweise in einem Reaktionsgemisch mit 6 mM Tris.HCl eines pH-Vierts von 7,4, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 6 mM 2-Mercaptoäthanol,

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ii g/ral einer im Autoklaven behandelten Gelatine, 60 u g/ml DlJS und 200 Einheiten/ml Hha-I-Restriktionsendonuklease. Nach 60-minütiger Inkubation bei einer Temperatur von 37°C werden dem Reaktionsgemisch die folgenden Bestandteile zugesetzt: Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4 auf eine Endkonzentration von 100 mM, im Autoklaven behandelte Gelatine zur Aufrechterhaltung einer Konzentration von 100 ν. g/ml und 130 Einheiten/ml EcoRI. Danach wird das Reaktionsgemisch 60 min lang bei einer Temperatur von 37⁰C inkubiert und entsprechend Beispiel 2 (a) aufgearbeitet. Bei Verwendung anderer Verbindungsglieder als solcher mit einer EcoRI-Spaltungsstelle benötigt man eine andere Restriktionsendonuklease.

Für den Fachmann dürfte es keine Schwierigkeiten bereiten, die Konzentrationen der Reagentien, Substrate und Enzyme sowie die zur Herbeiführung der gewünschten Spaltungen eingehaltenen Reaktionsbedingungen zu variieren.

Beispiel 3 - Alkalische Ehosphatasebehandlung

Diese Maßnahme erfolgt im wesentlichen nach dem von A. Ullrich, J. Shine, J. Chirgwin, R. Pictet, E. Tischer, W.J. Rutter und H.M. Goodman in "Science", Band 196, Seiten 1313 bis 1319 (1977) beschriebenen Verfahren mit geringfügigen Modifikationen. 12 Einheiten/ml einer handelsüblichen bakteriellen alkalischen Phosphatase in 20 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 werden 10 min lang bei einer Temperatur von 70⁰C vorinkubiert. Danach werden 100 ug/ml einer gemäß Beispiel 2 (a) hergestellten EcoRI-Schnitt-pOP-203-DNS zugegeben, worauf 15 min lang bei einer Temperatur von 70⁰C weiter inkubiert wird. Schließlich wird das Reaktionsgemisch dreimal mit Phenol und dann mit Äther extra-

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hiert und mit Äthanol gefällt. Dieses Verfahren stellt bei der Herstellung von pUC 1001 eine gegebenenfalls-Maßnahme dar. Die Durchführung dieses Verfahrens liefert jedoch ein höheres Verhältnis pUC 1001 zu parenteralem pOP-203-Plasmid unter tetracyclinresistenten Umwandlungsprodukten (transformants), so daß die Gewinnung von pUC 1001 erleichtert wird.

Beispiel 4 - T4-DNS-Polymerase

Das durch T4-DriS-Polymerase katalysierte Auffüllen versetzter oder zickzackförmiger Enden erfolgt in einem Reaktionsgemisch mit 67 mM Tris*HCl eines pH-Werts von 8,8, 6,7 #1 KgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 16,6 mM (KH^J₂SO^, 6,7 JiM Athylendiamintetraessigsäure, 167 η g/ml einer im Autoklaven behandelten Gelatine, jeweils 0,2 mM dCTP, dATP, DGTP, und dTTP, 25 ug/ml einer gemäß Beispiel 2 (b) Taq I geschnittenen oder gespaltenen pOV-230-DNS und 30 Einheiten/ml einer handelsüblichen T4-DNS-Polymerase. Nach 15-minütiger Inkubation bei einer Temperatur von 15°C und anschließender Zugabe von 75 iig/ml tRNS erfolgen eine Phenolextraktion, eine Ätherextraktion und eine Dialyse gegen 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0, 0,1 mM Athylendiamintetraessigsäure und 500 mM NaCl. Die DNS wird dann durch Äthanol gefällt. Zum Auffüllen der bzw. Einfüllen in die versetzten oder zickzackförmigen Enden eignen sich auch noch andere Enzyme, z.B. E.-coli-DNS-Polymerase und Vogelmyeloblastosevirus-Umkehrtranskriptase. Für den Fachmann dürfte es keine Schwierigkeiten bereiten, die Konzentrationen an Reagentien, Substraten und Enzymen sowie die zur Sicherstellung der gewünschten Auffüllung der versetzten oder zickzackförmigen Enden einzuhaltenden Reaktionsbedingungen zu variieren.

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Beispiel 5 - Herstellung von EcoRI-Verbindungsgliedern

Das DNS-Verbindungsglied erhält man als einstrangiges Octameres ohne 5'-Phosphatgruppen. Die 5'-Phosphatgruppen werden unter Verwendung einer Polynukleotidkinase in einem Reaktionsgemisch mit 70 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,8, 15 mM 2-Mercaptoäthanol, 10 mM MgCl₂, 0,25 mM ATP, 40 η g/ml einer im Autoklaven behandelten Gelatine, 30 ug/ml RI-Octamerer (handelsübliche molekulare Rekombinationsverbindungsglieder Nr. 18027) und 90 Einheiten/ml einer handelsüblichen Polynukleotidkinase addiert. Das Reaktionsgemisch wird 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, worauf weitere 90 Einheiten/ml Enzym zugesetzt und mit der Inkubation weitere 30 min lang fortgefahren wird. Danach wird das Gemisch 10 min auf eine Temperatur von 70⁰C erwärmt und schließlich langsam auf 4° C abgekühlt, um doppeis trangige Verbindungsglieder zu tempern bzw. zu altern (anneal).

Beispiel 6 - T4-DNS-Ligase

(a) Etwa zwei Drittel des Ligationsreaktionsgemischs von zum Ausfüllen von Taq I geschnittenem pOV 230 dienenden synthetischen EcoRI-Verbindungsgliedern (vgl. Beispiel 4) bestehen aus im Reaktionsgemisch von Beispiel 5 enthaltenen phosphorylierten doppelstrangigen Verbindungsgliedern. Die Endkonzentration der Materialien beträgt 45 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,8, 10 mM 2-Mer-< captoäthanol, 10 mM MgCl₂, 15 mM Dithiothreit, 1 mM ATP, 20 η g/ml Taq I geschnittene pOV-230-DNS und 14 Einheiten/ml handelsübliche T4-DNS-Ligase. Das Reaktionsgemisch wird etwa 16 h lang bei einer Temperatur von 12,5°C inkubiert und dann mit Phenol und schließlich mit Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt.

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(b) Um das gemäß dem folgenden Beispiel 7 gereinigte Ovalbumingenfragment an die mit alkalischer Phosphatase behandelte pOP-203-DNS (vgl. Beispiel 3) zu binden, werden in dem Reaktionsgemisch 50 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,B, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit, 1 mM ATP, 30 ug/ml pOP-203-DNS, 6 ug/ml gereinigtes pOV-230-Fragment und 15 Einheiten/ml T4-DNS-Ligase verwendet. Nach 16-stündiger Inkubation bei einer Temperatur von 12,5°C wird das Reaktionsgemisch einer Äthanolfällung unterworfen. Die gebildete Kugel wird in TCM (10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 6,0, 10 mM CaCl₂ und 10 mM HgCl₂) gelöst. Selbstverständlich kann der Fachmann die Konzentrationen der Reagentien, Substrate und Enzyme sowie die Reaktionsbedingungen ändern, um die Jeweils gewünschten Ligationen oder Verbindungen herzustellen.

Beispiel 7 - Präparative Agarosegelelektrophorese

Agarose wird zu 1% in einem 2xE-Puffer (0,00 M Tris.HCl eines pH-Werts von 7,8, 0,01 M NaC₂H₃O₂, O,OO2m-Äthylendiamintetraessigsäure) gelöst, und in eine handelsübliche Plattengelvorrichtung gegossen. Verschiedene Proben werden in 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 3,0 und 0,1 mM Athylendiamintetraessigsäure gelöst, worauf die Proben bei konstanter Leistung mit 2x E fließendem Puffer getestet v/erden.

IJach der Elektrophorese der Hha-I- und EcoRI-verdauten DNS (vgl. Beispiel 2 (c)) wird aus dem Gel ein Streifen herausgeschnitten und&it Äthidiumbromid (0,5 u g/ml) "angefärbt". Darauf werden die DNS-Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die interessierende Bande wird aus dem Rest des Gels herausgeschnitten und vor dem Hindurchleiten durch

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eine 20-gauge-Nadel mazeriert. Danach wird eine gleiche Gewichtsmenge Extraktionspuffer (10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0, 2 mM Athylendiamintetraessigsäure, 1 M NaCl) zugesetzt und mit dem Gel gemischt. Das Gemisch wird 16 h lang bei einer Temperatur von 47⁰C inkubiert, worauf die Agarose 1 h lang bei 100000 g pelletisiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird auf 30 ug/ml in tRNS eingestellt und mit Phenol extrahiert, bis an der Grenzfläche keine Agarose mehr sichtbar ist. Schließlich v/ird die DNS mit Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt. Die Gelpuffer und Extraktionsmaßnahmen können zur Gewinnung der gewünschten DNS-Fragmente in dem Fachmann bekannter V/eise variiert werden.

Beispiel 8 - Umwandlung (transformation) von E. coli

120 ml L-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) werden mit einer 18 h alten Kultur von HB101 IiRRL B-11371 beimpft und dann bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,6 wachsen gelassen. Die Zellen werden in kalter 10 mM MgSO^-Lösung gewaschen und 15 min in 20 ml gekühlter 50 mM CaClp-Lösung resuspendiert. Danach werden die Bakterien auf ein Zehntel dieses Volumens in CaCl₂ konzentriert und im Verhältnis 2 : 1 (Volumenverhältnis) mit gemäß Beispiel 6 (b) hergestellter gebundener DNS gemischt. Nach 15-minütigern Kühlen des Zellen/DNS-Gemischs wird es für 2 min bei einer Temperatur von 42°C einem Wärmeschock unterworfen. Danach wird 10 min lang sich bei Raumtemperatur ein Gleichgewicht einstellen gelassen, bevor L-Brühe im Volumenverhältnis von 2 1/3 des Ausgangsvolumens der Zellen/DNS-Suspension zugegeben v/ird. Die umgewandelten Zellen werden 1 h lang in Brühe bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, bevor selektive Medien (L-Agar plus 10 ug/ml

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Tetracyclin) mit 200 ul/Platte beimpft werden. Um die Umwandlungsprodukte wachsen zu lassen, werden die Platten 48 h lang bei einer Temperatur von 37⁰C inkubiert. Obwohl das Umwandlungsverfahren für die Vergrößerung biochemisch aufgebauter Rekombinations-DNS-Moleküle von wesentlicher Bedeutung ist, lassen sich die zur Durchführung dieser Maßnahmen jeweils gewählten Bedingungen zur Erreichung des gewünschten Ergebnisses in dem Fachmann bekannter Weise variieren.

Beispiel ff - Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zur Proteintrennung erfolgt entsprechend dem von U.K. Laemmli in "Nature", Band 227, Seiten 680 bis 685 (1970) beschriebenen Verfahren unter Verwendung der handelsüblichen Plattengelvorrichtung. Proben werden in einem gleichen Volumen Probenpuffer (0,0625 M Tris.HCl eines pH-Werts von 7,8, 3 Gew.-^ SDS, 5 Vol.-Ji 2-Mercaptoäthanol und 20 Vol.-% Glycerin) gelöst und 5 min lang auf eine Temperatur von 100⁰C erhitzt (vgl. A. Moir und W.J. Brammar in "Mol. Gen. Genet.", Band 149, Seiten 87 bis 99 (1976)).

Beispiel 10 - Immunotests

Der in-situ-Immunotest wurde von A. Shalka und L. Shapiro entwickelt und ist in "Gene", Band 1, Seiten 65 bis 79 (1976) beschrieben. Zu diesem Zweck werden Bakterien auf einem mit Zusatzstoffen versehenen (supplemented) N-Z-Bodenagar (1% N-Z-Amin A, 0,5% NaCl, 0,4% Casaminosäuren, 10 p. g/ml Thymin, 1,5% Agarose) mit 25 ul/ml handelsüblicher Ovalbuminantisera, 10 ug/ml Tetracyclin und 1 mM IPTG wachsen gelassen. Nachdem die Bakterien über Nacht

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bei einer Temperatür von 37°C wachsen gelassen worden waren, werden die Kolonien in situ lysiert, indem-ede in 0,6% Agarose enthaltendem 0,5 mg/ml Lysozym, 0,1 M Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 und 10 mM Äthylendiamintetraessigsäure eingebettet werden. Nach 60-minütigem Erwärmen auf eine Temperatur von 37°C wird die Agarose mit 2% Sarkosyl (1 ml/Platte) überlagert, worauf über Nacht bei einer Temperatur von 37⁰C weiter inkubiert wird.

Das ovalbuminimmunoreaktionsfähige Material in den Zellextrakten wird durch Diffundieren des Extrakts aus einer Bohrung in die Ovalbuminantisera enthaltende Agarose bestimmt. Die Platten enthalten 1,3?6 Agarose in 10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4, 100 mM NaCl und 1 ul/ml Ovalbuminantiserum. Die Bohrungen werden mit einer stumpfen 13-gauge-Nadel gestochen, worauf in jede Bohrung 3 η 1 des gemäß dem folgenden Beispiel 11 hergestellten Extrakts eingebracht werden. Schließlich werden die Platten über Nacht bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, damit sie Fällungshalos bilden können.

Das immunoreaktionsfähige Material wird durch Zusatz von Antiserum zu den Extrakten zur Gelanalyse gefällt. Danach werden die Mischungen 60 min lang bei Raumtemperatur und schließlich etwa 16 h lang bei einer Temperatur von 4°C stehen gelassen. Der Niederschlag wird in der Kälte 5 min lang bei 2000 g zentrifugiert und zweimal mit 25 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4, 137 mM NaCl und 5 mM KCl gewaschen.

Beispiel 11 - Zubereitung des Zellenextrakts

Entsprechend Beispiel 8 umgewandelte Zellen werden in L-Brühe mit 10 ug/ml Tetracyclin und mit oder ohne 1 mM

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IPTG wachsen gelassen. Wenn infolge des Wachsturas die gewünschte optische Dichte bei 600 nm erreicht ist, werden die Zellen in Kügelchen überführt, mit 0,1 M Tris.HCl eines pH-Werts von 8,0 gewaschen und bei einer Temperatur von -70⁰C gefroren.

Die Zellen werden in noch gefrorenem Zustand in einen gekühlten Mörser gefüllt und bei einer Temperatur von 4°C mit dem 2,5-fachen Gewicht ihres Eigengewichts Aluminiumoxid vermählen. Danach wird Extraktionspuffer (10 mM Tris.HCl eines pH-Werts von 7,4, 10 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl) im Verhältnis von 2 : 1 Volumina (in ml) : Zellengewicht (in g) zugesetzt. Ferner wird pro g Zellen 1 μg DNase zugesetzt, worauf das Ganze mindestens 10 min lang bei einer Temperatur von 4°C inkubiert wird. Schließlich werden das Aluminiumoxid und unlösliches Zellenmaterial abzentrifugiert.

Die Proteinkonzentrationen werden nach dem von 0-H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr und R.J. Randal in "J. Biol. Chem.», Band 193, Seiten 265 bis 275 (1951) beschriebenen Verfahren bestimmt. Als Standard wird hierbei Rinderserumalbumin verwendet.

Beispiel 12 - Reinigung von Ovalbumin

Die Tatsache, daß das in E. coli synthetisierte Ovalbumin in den Peiplasmaraum (peiplasmic space) abgesondert wird, ermöglicht eine relativ einfache Reinigung des Ovalbumins. Die gemäß Beispiel 8 umgewandelten Zellen werden in L-Brühe mit 10 ug/ml Tetracyclin und 1 mM IPTG wachsen gelassen und in der späten log-Phase geerntet. Das zu reinigende Ausgangsmaterial besteht aus der überstehenden Fraktion, die erhalten wird, wenn das E. coli mit Lysozym

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und Athylendiamintetraessigsäure in einem osmotisch geschützten Medium in Protoplasten umgewandelt wird (vgl. M.H. Malamy und B.L. Horecker in "Biochemistry", Band 3, Seiten 1893 bis I897 (1964)). Diese Einzelstufe entfernt den Hauptteil des Proteins und der Nukleinsäure aus dem Reaktionsprodukt und ermöglicht die Darstellung von Ovalbumin, das als Nahrungsmittelergänzung oder -ersatz verwendet werden kann. Eine weitere Reinigung zur Gewinnung von kristallinem Ovalbumin, wie es in Bäckereien und zu Forschungszwecken benötigt wird, läßt sich nach dem von V. Shepherd und R. Montgomery in "Methods in Carbohydrate Research", Band VII, Herausgeber R.L. Whistler und J.W. BeMiller, Verlag Academic Press, New York, Seiten 172 bis 174 (1976) beschriebenen Verfahren bewerkstelligen. Kristallines Ovalbumin findet sich in den Verkaufskatalogen der verschiedensten Hersteller und Anbieter für Feinchemikalien.

Beispiel 13 - Genherstellung und Klonung

Baugene mit Codierung oder Codifizierung für eukoryotische Proteine erhält man in der Regel unter Verwendung ihrer gereinigten Messenger-RNS'n als Ausgangsmaterial. Eine komplementäre DNS-(cDNS)-Kopie der Messenger-RNS (mRNS) wird auf enzymatischem Wege synthetisiert und dann auf enzymatischem Wege doppeistrangig gemacht. Dieses Gen wird dann an einen geeigneten Klonungsträger gebunden. Dies geschieht in der Regel, obwohl nicht zwingend, nach dem Poly-dA:Poly-dT-Schwanzverfahren (tailing procedure) gemäß D.A. Jackson, R.H. Symons und P. Berg in "Proc. Nat. Acad. Sei.», Band 69, Seiten 2904 bis 2909 (1972). Der das Baugen enthaltende Träger wird dann in Bakterien vergrößert. Dieses Verfahren wurde zur Herstellung des pOV-

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230-Plasmids sowie zur Herstellung von Plasmiden mit Globingenen und Insulingenen durchgeführt.

Beispiel 14 - Herstellung von Vektoren mit Steuerelementen

Die Isolierung und Klonung von Steuerelementen zum Anlaufenlassen bzw. Auslösen der mikrobiellen Synthese tierischer Proteine in Rekombinations-DIIS-Molekülen ist relativ unkompliziert, nachdem einmal ein Test entwickelt wurde. Die die gewünschten Steuerelemente enthaltende Chromosomen-DIJS kann entweder mit Restriktionsendonukleasen geschnitten und direkt in einen Vektor geklont oder vor dem Schneiden mit Endonuklease auf eine übertragende Phage gesetzt werden. Der zum Nachweis geklönter lac-Steuerelemente verwendete Test beruht auf der grundlegenden Synthese von ß-Galactosidase in Zellen, die den auf einem Mehrfachkopieplasmid (multicopy plasmid) geklonten lac-Operator beherbergen. Kolonien dieser Zellen werden auf Agarplatten mit 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-ß-D-galactosid blau (vgl. K. Backman, K. Ptashne und W. Gilbert in "Proc. Hat. Acad. Sei.", Band 73, Seiten 4174 bis 4178 (1976)).

Beispiel 15 - Andere Träger, Wirte und Genlieferanten

Beispiele für andere erfindungsgemäß verwendbare Träger sind pBR 322 und pBR 313, mit einer Codierung für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, pSC 101 mit einer Codierung für Tetracyclinresistenz, pCR 11 mit einer Codierung für Kanamycinresistenz, λ-Bakteriophagenvektoren, z.B. Charonphagen, und Hef e-2-u. -Plasmid-DNS.

Beispiele für andere Wirte für den Träger sind sämtliche E.-coli-K12-Derivate (vgl. "Bacteriological Reviews",

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Dezember 197'-', reiten [>'<:['■ bis ^£:-';V) und l.efen, andere Pilze oder sonstige bakterien, oäntiiche im vorliegenden Falle verwendeten Hestriktionnenc.onukJ easen sind im Handel erhü.'.tlicn.

Unter die ür.Vindun/; fallen tiorinclio t^roteint; eiriscliliei3-licli solclior ^iron i/irboltieren, v.'ie warmblütigen I/irbelti eren, z.u. Vögeln, in 3 be sondere Uilinorr.. wie bereits erv.'ähnt, if"t die Erfindun^; mit ein hohes Molekulargewicht aufweisenden Proteinen eines ijolekularf;f"..^riciitn vor. nindestenn 10000 l>alton befaßt. Zu solchen aus einer GencodiiiziervinG hervorgehenrlen hociiiiolekiuoren Proteinen gehören auch fiolche aus Pflanzen und pflanzlichen und tierischen Viren.

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ORIGINAL INSPECTED

Nummer:
Int. Cl.2:
Anmeldetag:
Offenlegungstag:

29 33 000 C 12 K 1/00

14. August 1979 17. April 1980

Taq I

^dAdT

Taq I Verdauung Oval bumLn

pCGA

T 5'

AGCp 3'

♦ 11 andere BruchsLücke

T4 UNS Polymerase

Oval bumin _r

pCGA

GCT

TCG AGCp

Hind IH

1. Eco RJ-Verdauung

*■ alkalische Phosph&tase

Iac.

G CTTAAOH

Ovalbumin

pGGAATTCCCGA

CCTTAAGGGCT

T4 DNS Ligase

* . Ec:o Rf Verbindungsgl iedei /pGGAATTCC \ \ CCTTAAGGp /

TCGGGAATTCC AGCCCTTAAGGp

Oval.bura

1- niia J-Verdauiing

2. !.vco RI-Verdauuny

3. Gel-Iteinigung

pAATTCCCGA GGGCT

TCGGG AGCCCTTAAp

T4 DNS Liga;«

üvalbiiiii.in

Eco Rl

030016/0B23 ORIGINAI

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Darstellung einer Gencodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes tierisches Protein von mindestens 10000 Dalton in einem geeigneten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verschmelzung des betreffenden Gens (nach seiner Entnahme) nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen unter Erhaltung des Übertragungsleserasters herbeiführt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einfügt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gen für das ein hohes Molekulargewicht aufweisende tierische Protein aus einem Wirbeltier isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem warmblütigen Wirbeltier ausgeht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als warmblütiges Wirbeltier einen Vogel verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vogel ein Huhn verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Plasmid verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Plasmid pOP 203 verwendet.

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ORIGINAL INSPECTED

8. Verfahren zur Darstellung des Hiihnerovalbuminbaugens in einem geeigneten Träger, dadurch gekennzeichnet, daB man eine Verschmelzung des betreffenden Gens (nach seiner Entnahme) nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen unter Erhaltung des Übertragungsleserasters herbeiführt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einfügt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Plasmid verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Plasmid pOP 203 verwendet.

11. Verfahren zum Aufbau eines Plasmids, bei welchem eine einen Kopiervorgang einleitende Stelle und eine eine Übertragung einleitende Stelle mit der Baugencodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes Protein verschmolzen sind, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen geeigneten Klonungsträger mit den gewünschten Stellen zur Einleitung eines Kopiervorgangs und einer Übertragung mit einer Restriktionsendonuklease zu einem ersten linearen Molekül mit den Stellen zur Einleitung des Kopiervorgangs und der Übertragung "zerschneidet¹¹,

b) ein geklöntes DNS-Molekül mit der DNS-Sequenzcodierung für das gewünschte Protein zu einem zweiten linearen Molekül mit der DNS-Sequenzcodierung für das gewünschte Protein "zerschneidet¹¹ und

0 3 Q U 1 a / 0 6 2 3

- 3 - 293300Q

c) das erste und/oder zweite lineare DHS-Molekül durch Maßnahmen modifiziert, daß der in dem ersten linearen DNS-Molekül initiierte Übertragungsleseraster mit dem natürlichen Einleitungscode in dem zweiten linearen DIB-Molekül in Phase ist, wenn das erste und zweite lineare DNS-Molekül miteinander vereinigt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das ein hohes Molekulargewicht aufweisende Protein aus Hühnerovalbumin besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeigneten Klonungsträger das pOP-203-Plasmid verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das ein hohes Molekulargewicht aufweisende Protein aus Hühnerovalbumin besteht und als geeigneter Klonungsträger das pOP-203-Plasmid verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das ein hohes Molekulargewicht aufweisende Protein aus Hühnerovalbumin besteht und das zweite lineare DNS-Molekül aus dem pOV-230-Plasmid erhalten wurde.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das ein hohes Molekulargewicht aufweisende Protein aus Hühnerovalbumin besteht, als erster geeigneter Klonungsträger das pOP-203-Plasmid verwendet wird und das zweite lineare DNS-Molekül aus dem pOV-230-Plasmid erhalten wurde.

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-A-

17. E. coil IIB101 (pUC 1001) DSM 1614

18. Plasmid pUC 1001.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirt einen Einzeller verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man als Einzeller einen Pilz verwendet.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Einzeller ein Bakterium verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium E. coil verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als E. coli das E.-coli-K-12-Derivat HB1O1 verwendet.

24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen in einem einzelligen Organismus von Hause
aus eine mRNS-Synthese und eine Proteinsynthese einleiten.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als einzelligen Organismus oder Einzeller einen
Pilz verwendet.

26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als Einzeller oder einzelligen Organismus ein Bakterium verwendet.

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27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium £. coil verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die einen Übertragungsvorgang einleitende Stelle der lac-Promotor und die eine Übertragung einleitende Stelle die E.-coli-ß-galactosidaseinitiierungsstelle sind.

29. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid einen E.-coli-lac-Promotor und eine Et-coliß-galactosidaseinitiierungs3telle enthält.

30. Verfahren zur Herstellung von Hühnerοvalbumin, dadurch gekennzeichnet, daß man E. coli HB101 (püC 1001) DSM

l6l4 in einem wäßrigen Nährmedium unter gesteuerten Bedingungen züchtet.

31. Verfahren zur Darstellung einer Gencodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes pflanzliches Protein von mindestens 10000 Dalton in einem geeigneten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verschmelzung des betreffenden Gens (nach seiner Entnahme) nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen unter Erhaltung des Übertragungsleserasters herbeiführt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einfügt.

32. Verfahren zur Darstellung eines Gens aus einer Pflanzenviruscodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes Protein von mindestens 10000 Dalton in einem geeigneten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verschmelzung des betreffenden Gens (nach seiner Ent-

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nähme) nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang iind eine Übertragung einleitenden Stellen unter Erhaltung des Übertragungsleserasters herbeiführt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einfügt.

33. Verfahren zur Darstellung eines Gens aus einer Tierviruscodierung für ein ein hohes Molekulargewicht aufweisendes Protein von mindestens 10000 Dalton in einem geeigneten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verschmelzung des betreffenden Gens (nach seiner Entnahme) nahe den in dem Träger vorhandenen, einen Kopiervorgang und eine Übertragung einleitenden Stellen unter Erhaltung des Übertragungsleserasters herbeiführt und daß man den Träger in einen geeigneten Wirt einfügt.

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