DE2940525A1 - Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase - Google Patents

Description

Henkel, Kern, Feiler 8- Hänzel Patentanwälte European Patent Office

THE UPJOHN COMPANY Kalamazoo, Mich., V.St.A.

Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase

Möhlstraße 37 D-8000 München 80

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid

05. UKt. 1979

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Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase«

Glucose-isomerase ist ein wertvolles Enzym für die Herstellung von Fructose.Früher wurde die alkalische Isomerisierung von Glucose versucht, aber dies war in einem kommerziellen Masstab nicht möglich aufgrund der mangelnden Selektivität.Dieser Nachteil bezüglich der Selektivität bewirkte auch die Herstellung von nicht-biologisch abbaubaren Materialien wie zum Beispiel Psikose und ebenso von unerwünscht gefärbten Materialien, welche nur unter Kostenaufwand zu entfernen waren.

In der Folge wurde die mikrobiologische Produktion von Glucose-isomerase entwickelt,und diese erreichte bereits wirtschaftliche Bedeutung. Mikroorganismen welche dafür verwendet wurden sind diejenigen der Stämme Lactobacillus, Pseudomonas, Pasteurella, Leuconostoc, Streptomyces, Aerobacter und Arthrobacter. Siehe dazu die U.S. Patentschrift Nr. 3,645,848. Diese mikrobiologischen Prozesse zur Herstellung von Glucose-isomerase erreichen ihr Ziel durch Anwendung von Mikroben, welche ein Glucose-isomerase-gen als ein in den Chromosomen anwesendes Gen aufweisen.

Die DNA-Rekombinationsmethode, die weiter unten näher beschrieben wird, wurde angewandt um ein genetisches Element zu konstruieren, welches die Codierung für ein GIucose-isomerase-enzym aufweist. Dieses genetische Element wurde sodann in ein Wirtsbakterium eingebracht, und bei der Kultivierung wurden wesentlich grössere Mengen an Glucoseisomerase produziert als das bisher beim Donorstamm möglich war. So weit es uns bekannt ist, ist dies das erste Mal das3 ein derartiges unzweideutiges Resultat erzielt worden ist.

Dr.KM./Dr.IM.-eb

5.10.1979 - 1 - 40*582

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Rekombinierte Plasmiden, welche das Gen für das Enzym Xylose (Glucose) -isomerase tragen, wurden aufgebaut, indem man lineare DNA-Fragmente der Ligaturbildung unterwarf, welche durch Hind-III teilweisen Abbau von pMB9 DNA (die Replika) herstellte und eine vollständige Escherichia coli K12 DNA (die Quelle des Isomerase-genes) anwandte. Das Wirtsbakterium war ebenso ein E. coli K12 Stamm (Stamm JC1553), welcher einen Defekt bezüglich des Enzymes Xylose (Glucose)-isomerase aufwies, und welcher durch die Rekombinations-

— S + r

plasmiden vom Phenotyp XyI Tc in den Phenotyp XyI Tc übergeführt wurde. Die Auswahl bezüglich des geclonten Bakteriums, welches das erwünschte Rekombinationsplasmid trägt, wurde aufgrund folgender Tatsachen vorgenommen:

(1) Das Plasmid pMB9 trägt eine Codierung für eine Resistenz gegenüber dem Medikament Tetracyclin (Tc), und

(2) der Empfänger, nämlich der E. coli Stamm JC1553 weist eine Mutation im Xylose-isomerase-gen auf, und kann dementsprechend auf diesem Substrat nicht wachsen. Dieser Stamm kann ebenso auch nicht Glucose isomerisieren, weil das gleiche System beide Reaktionen ausführt. Jedoch kann der Stamm JC1553 normal auf Glucose wachsen, weil im Unterschied zur Xylose der Hauptanteil des Stoffwechselcyclus für die Verwendung von Glucose dieses Enzym nicht benötigt. Xylose-induzierte Zellen, welche das Rekombinationsplasmid pUC1002 aufweisen, zeigen eine Verstärkung der Glucose-isomerase-Aktivität von mehr als 500 % relativ zu dem Wert der vom Donorstamm gezeigt wird.

Es sei festgehalten, dass das Glucose-isomerasegen, welches in der Natur vorkommt, ein Chromosomengen ist wobei dieses Gen nur einmal pro Chromosom vorkommt. Andererseits wird das erfindungsgemässe Glucose-isomerase-gen in einen Plasmid eingebracht welcher im Wirtsorganismus vielfach vorkommt. Diese Einführung des Gens in ein Plasmid oder in einen anderen geeigneten Träger wie er hier definiert ist

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bewirkt eine Verstärkung der Genaktivität und des erwünschten Genproduktes, d.h. der Glucose-isomerase.

Die beiliegende Zeichnung veranschaulicht die Prozess-schritte zur Herstellung des rekombinierten Plasmides welches die E. coli Gene trägt, welche die Codierung für die Produktion des Enzymes Glucose-isomerase tragen. Obwohl die Abkürzungen, die verwendet werden, üblich sind und dem Fachmann gut bekannt sind werden sie hier nochmals definiert, -,__ um ein klares Verständnis der Erfindung zu gewahrleisten.

Hindlll, EcoRI, BamHI, Sail, Hpal bedeuten die Einschränkung von Endonuclease Spaltpositionen.

Tc - bedeutet die Gencodierung für die Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Antibiotikum Tetracyclin.

AGCT - ist ein einkettiges DNA-Fragment, welches die Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin enthält.

T4 DNA Ligase -

bedeutet ein Enzym, welches bezüglich des bakteriophagen T4 codiert ist, und welches die kovalente Verbindung von Polydeoxynucleotiden katalysiert.

XyI - bedeutet Xylose.

pMB9 - bedeutet einen nicht übertragbaren autonom replizierenden E. coli Plasmid.

Die E. coli Stämme, die hier beschrieben werden, einschließlich derjenigen, welche derartige Plasmide enthalten, wurden in der DauerSammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, D-34OO Göttingen unter folgenden DSM-Aufnahmenummern hinterlegt.

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• '"'-·^:· j naohqereicht|

JC1553 DSM 1647

Κ37 DSM 1648

HB 129 (pMB9 DSM 1646

JC1553 (pUC*1002) DSM 1649

* pUC ist die offizielle Bezeichnung für ein Plasmid, das der Upjohn Company gehört.

Die Erfindung sei nun anhand der Beispiele näher erläutert, welche bevorzugte Ausfülarungsformen dieser Erfindung beschreiben und durchaus nicht den gesamten Erfindungsgedanken umfassen. Alle Prozentsätze sind Gewichtsprozentsätze und alle Lb'sungsmittel-mischungsanteile sind Volumenanteile wenn dies nicht anders angegeben ist·

Beispiel 1: Herstellung von DNA

E. coli K37 Chromosomen DNA wird isoliert, wie dies von Marmur [j. Mol. Biol. 3_: 208-218 (1961)J beschrieben wird. Die Kultur wird in einer L-Nährlösung (Lennox, E.S. (1955) Virology U 190-206) unter heftigem Rühren bei 37⁰C wachsen gelassen, bis die optische Dichte bei 590 nm 0,8 erreicht. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10,000 g während 10 Minuten geerntet, und man wäscht 1-mal mit kalter, 50 milliinolarer Tris-HCl, pH 8,0, 20 mMol EDTA und suspendiert anschliessend wieder in einem Fünftel des Volumens des gleichen Puffers. Die Zellauflösung wird bewirkt

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durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer endgültigen Konzentration von 1,5 % und anschliessendem Erwärmen auf 6O⁰C während 10 Minuten. Die so erhaltene viskose Lösung wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und sodann wird Natriumperchlorat bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 Mol zugegeben. Die gesamte Mischung wird sodann mit einem gleichen Volumen Chloroform-isoamyl-alkohol (24 : 1, Volumen/ Volumen) während 20 Minuten geschüttelt. Die so erhaltene Emulsion wird in drei Schichten aufgetrennt, indem man 5 Minuten bei 10,000 g zentrifugiert. Die obere Schicht, welche die DNA enthält, wird in einen schmalen Kolben übergeführt und mit 2 Volumina kaltem, 95-prozentigem Aethanol überschichtet. Die DNA wird sodann auf einen Glasstab aufgewickelt, indem man leicht rührt. Die abgeschiedene DNA wird in 15 mMol Natriumchlorid, 1,5 mMol Trinatriumcitrat gelöst, und die Deproteinisierung wird wie oben wiederholt bis wenig oder kein Protein an der Grenzfläche nach der Zentrifugation erscheint. Schliesslich wird die gereinigte DNA in 15 mMol Natriumchlorid, 1,5 mMol Trinatriumcitrat und 0,5 mMol EDTA gelöst.

pMB9 Plasmid DNA wird aus E. coli HB129 isoliert, welche wie oben in einer L-Nährlösung gezüchtet wurden, welche mit Tetracyclin mit einem Gehalt von 25 yug/ml angereichert war. Die rohen Lysate wurden hergestellt, indem man die Zellen resuspendierte, und zwar in 1/10 des Volumens an 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA und 500 /ig predigestierte (90 Minuten bei 37⁰C) Pronase (Calbiochem, La Jolla, Calif.) und 1 % Natriumdodecylsulfat und sie bei 37⁰C inkubierte bis die Suspension sich geklärt hatte. Chromosomen DNA wird sodann abgezogen, indem man die Lysate durch eine Nadel von 13 Gauge hindurchzog und die Plasmid DNA wird isoliert, indem man Gleichgewichtszentrifugation (Spinco 50 Ti Rotor, 15°, 40,000 rpm, 48 - 60 Std.) der abgezogenen Lysate in Cäsiumchlorid-ethidium-bromid Dichtegradienten ausführte. Die Plasmid DNA wird entfernt, indem man Fraktio-

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nen sammelte und zwar mittels Anstechen mit einer Nadel vom Boden des Gradienten. Fraktionen, welche die Plasmid DNA enthielten wurden vereinigt und man extrahierte dreimal mit gleichen Volumina Isoamylalkohol um das Ethidiumbromid zu extrahieren. Die DNA-Lösung wurde sodann gegen 15 millimolares Natriumchlorid, 1,5 millimolares Trinatriumcitrat und 0,5 millimolares EDTA dialysiert, mit Aethanol abgeschieden und schliesslich in einem kleinen Volumen des obigen Puffers gelöst.

Beispiel 2; Restriktions-endonuclease-Abbau.

Die Hindlll-Spaltung einer Mischung aus E. coli K37 und pMB9 DNA (3:1), wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, wird ausgeführt indem man eine Reaktionsmischung anwandte, welche 7 mMol Tris«HCl, pH 7,9» 7 mMol Magnesiumchlorid, 60 mMol Natriumchlorid, 100/ig/ml autoklaviertes Gelatine und eine Einheit Hindlll Endonuclease/ug DIiA enthielt. Nach Inkubation bei 37°C während 60 Minuten wird die Reaktion abgestoppt, indem man während 5 Minuten auf 65⁰C erwärmt.

Beispiel 3: T4 DNA Ligase Reaktion.

Die abgestoppte Reaktionsmischung aus dem obigen Beispiel 2 wird mit Material ergänzt, das eine endgültige Konzentration von 5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithioerythrit, 50 pH ATP und eine Einheit T4 DNA Ligase/yug von DNA vorhanden war. Die Reaktionsmischung wird bei O⁰C während etwa 16 Stunden inkubiert.

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NACHQEREICHT ["- ο

Beispiel 4; Umwandlung von E. coli.

Die Umwandlung von E. coil JC1553 mittels Plasmid DNA wird ausgeführt, wie dies von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 6£: 2110-2114 (1972)] beschrieben wurde. 100 ml L-Nährlösung wurden mit dsm 164 7 angeimpi't, und man züchtete bis zu einer optischen Dichte von 0,85 bei 590 mn. Die Zellen wurden sodann eingefroren, sedimentiert und mit dem halben Volumen an kalter, 10 millimolarer Natriumchloridlösung gewaschen. Nach der Zentrifugation werden die Zellen im halben Volumen kalter 0,03 molarer Calciumchloridlösung resuspendiert und bei O⁰C während 20 Minuten belassen, sodann sedimentiert und in 1/10 des anfänglichen Volumens an 0,03 molarer Calciumchloridlösung resuspendiert. Sodann wurden 0,2 ml dieser Zellen mit 0,1 ml Ligations-DNA-Reaktionsmischung vermischt, welche vorhergehend mit Calciumchlorid angereichert wurde, sodann eine Konzentration von 0,03 molar bestand. Die so erhaltene Suspension wird während 60 Minuten bei O⁰C gehalten und sodann einer schockartigen Erhitzung während kurzer Zeit auf 42⁰C unterworfen. Schliesollch werden die Zellen 10-fach in L-NUhrlösung verdünnt und bei 37°C unter heftigem Rühren während 2-4 Stunden inkubiert um die Drogenresistenz ausbilden zu lassen, und sodann wurden sie in Petrischalen auf ein Medium, welches minimale Salzmengen enthielt, aufgebracht welche Xylose als einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie enthielt und darüber hinaus Tetracyclin in einer^Ienge von 5 ug/ml. Die Züchtung auf diesem Medium erlaubt die Unterscheidung der Transformate (bzw. umgewandelten, bzw. geklönten Zellen), welche die erwünschten genetischen Eleraentrekombinationen aus JC1553 (welche nicht in Gegenwart von Tetracyclin oder unter Anwendung von Xylose als einzige Konlenstoff- und Energiequelle gezüchtet werden können) und von JCI553 welche intakte pMB9 tragen (welche in Gegenwart von Tetracyclin wachsen, jedoch ebenfalls nicht Xylose als

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NACHQERi.-.!

einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie nutzen können).

Beispiel 5? Glucose-isomerase-Aktivität in rohen

Extrakten von JC1553 (pUC1002)

100 ml Portionen von Fräsers Medium (Fräser, D. und E.A. Jerrel, 1953, J. Biol. Chem. 205.: 291-295) dem 0,2 % Xylose (Gewicht/Volumen) zugesetzt wurden, werden mit 5 ml Portionen dsm 164 9 angeimpft,

welche über Nacht in einem Fraser-Medium gezüchtet worden waren, welches mit Tetracyclin in einer Menge von 5 ug/ml angereichert war. Die Reaktionsbehälter werden bei 37⁰C unter heftigem Rühren während 6 Stunden inkubiert und anschliessend werden die Kulturen sedimentiert und mit kalter 30 mlllimolarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,2) gewaschen. Die Zellen werden in 1/20 des Volumens des gleichen Puffers resuspendiert, und die rohren Extrakte werden hergestellt, indem man Ultraschallzerstörung anwendet. Die Zellinhaltsstoffe werden durch Zentrifugation bei 10,000 g während 10 Minuten entfernt und die überstehenden Anteile werden bezüglich der Glucose-isomerase-Aktivität getestet. Ein Standardtest besteht darin, dass 20 /iMol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2), 2,5yuMol Kobalt(II)-Chlorid, 5 A»Mol Magnesiumchlorid, 1 mMol D-Glucose und roher Extrakt in einem Gesamtvolumen von 1 ml angewandt werden. Die optimale Temperatur für die biologische Konversion unter diesen Bedingungen ist etwa 60⁰C. Der Ueberschuss an Glucosekonversion in Fructose v/ird bestimmt, indem man Proben von 0,02 ml zu verschiedenen Zeiten nimmt und diese Proberöhrchen zusetzt, welche 0,98 ml Wasser plus 3,5 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure enthalten. 1 ml einer 0,05-prozentigen Lösung von Resorcin in Aethanol wird dem Teströhrchen zugegeben, welches sodann auf 77⁰C während 8 Minuten erwärmt wird. Die Teströhrchen werden sodann in Eiswasserbad gekühlt

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und die optische Dichte bei 420 nm gemessen.

Obwohl das obige Verfahren das Enzym in einer zellfreien Form (Rohextrakt) anwendet, um Glucose in Fructose überzuführen kann die Konversion ebenso angewandt werden, wenn das Enzym in einer immobilisierten Form vorliegt, indem man Verfahrensweisen anwendet die dem Fachmann gut bekannt sind.

Es bleibt der Geschicklichkeit des Fachmanns überlassen die Konzentrationen an Reagenzien, Substraten und Enzymen, wie auch die Reaktionsbedingungen in den obigen Beispielen zu verändern und er wird trotzdem zu den erwünschten Resultaten gelangen.

Beispiel 6: Andere Trägermaterialien, Wirte- und

Gen-Quellen.

Beispiele für andere Trägermaterialien, welche bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, sind Plasmide wie zum Beispiel pBR322 und pBR313, welche eine Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz codieren, pSCOI, welcher eine Tetracyclin-Resistenz codiert, pCR11, welcher eine Kanamycin-Resistenz codiert, und Hefe 2μ Plasmid DNA und Bakteriophagen-vektoren wie zum Beispiel Charon λ Phage,

Beispiele für andere Wirte für das Ueberträgermaterial sind irgendwelche E. coli K-12-Derivate (Bacteriological Reviews, Dec. 1972, Seiten 525-557) (diese sind akzeptiert gemäss den NIH-Richtlinien) und Hefen, andere Pilze oder Bakterie. Es sei festgehalten, dass auch die letzt genannteren Wirte ebenso gemäss den NIH-Richtlinien approbiert sein müssen. Alle diese Enzyme die hier angewandt werden

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können von New England Biolabs, Beverly, Mass., USA, erhalten werden.

Beispiele für andere Gen-Quellen, welche zur Ausführung der vorliegenden Erfindung dienen können sind irgendwelche Glucose-isomerase-Gene, entweder mikrobiellen oder anderen Ursprungs.

Bei Anwendung der oben angegebenen Verfahrensweisen können irgendwelche anderen genetische Elemente, welche andere Enzyme codieren, wie beispielsweise alkalische Protease, Amyläse, Cholesterin-oxidase und anderes, aufgebaut werden.

Das Plasmid pUC1002 kann vom Wirtsbakterium isoliert werden, indem man nach der Verfahrensweise vorgeht, wie dies für das Plasmid pMB9 in Beispiel 1 weiter oben erläutert ist.

Die in der vorliegenden Beschreibung erläuterten Arbeiten wurden alle gemäss den physikalischen und biologischen Isolations- und Abschluss-anforderungen ausgeführt wie sie in den NIH-Richtlinien angegeben sind.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Wirtsorganismus züchtet welcher ein geeignetes Uebertragungsmaterial enthält, welches ein Gen für Glucose-isomerase aufweist.

   2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Wirtsorganismus ein Bakteriuni ist.

   3. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Bakterium ein E. coli K-12 Abkömmling ist.

   4. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte E. coli K-12 Abkömmling der Stamm DSM 1649 ist.

   5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte geeignete Uebertragungsmaterial ein Plasmid ist.

   6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Plasmid pUC1002 ist.

   7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Wirts Organismus ein BaItterium ist, und dass das genannte geeignete Ueberträgermaterial ein Plasmid ist.

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   8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Plasmid pUC1002 ist.

   9. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Wirtsorganismus ein

   E. coil K-12 Abkömmling ist, und dass das genannte Ueherträgermaterial ein Plasmid ist.

   10. Verfahren nach Patentanspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmid pUC1002 ist.

   11. Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase, dadurch gekennzeichnet, dass man einen E. coil Stamm dsm 1649 züchtet.

   12. Verfahren zum Aufbau eines genetischen Elementes, welches die Codierung für Glucose-isomerase trägt, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) ein geeignetes klonendes Ueberträgermaterial aus dem Erbmaterial herausschneidet, wodurch man eine erste lineare DNA-Sequenz erhält,

   (b) eine Chromosomen-DNA, welche ein Glucoseisomerase-Gen trägt, zerschneidet, wodurch man eine zweite lineare DIIA-Sequenz erhält, welche ein Glucose-isomerase-Gen enthält, und man

   (c) die genannten ersten und zweiten linearen DNA-Sequenzen verbindet.

   13. Verfahren gemäss Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das geeignetekloning-Ueberträgermaterial ein Plasmid ist.

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   14. Verfahren gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Plasmid ein pMB9 Plasmid ist.

   15. Verfahren gemäss Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Chromosomen-DNA aus E. coli K37 stammt.

   16. Verfahren zum Aufbau des Plasmides pUC1002, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) den Plasmid pMB9 ausschneidet, wodurch man eine erste lineare DNA-Sequenz erhält,

   (b) E. coli K37 zerschneidet, wodurch man eine zweite lineare DNA-Sequenz erhält, welche ein Glucose-isomerase-Gen enthält, und man

   (c) die genannte erste lineare Sequenz mit der genannten zweiten linearen DNA-Sequenz verbindet.

   17. Verfahren zur Herstellung eines genetischen Elementes, welches die Codierung für ein Enzym trägt, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) ein geeignetes Kloning-Ueberträgermaterial ausschneidet, wodurch man eine erste lineare DNA-Sequenz erhält,

   (b) eine Chromosomen-DNA ausschneidet, welche das erwünschte Enzym-Gen trägt, um eine zweite lineare DNA-Sequenz zu erhalten, welche das erwünschte Enzym-Gen trägt, und man

   (c) die genannte erste lineare DNA-Sequenz mit der genannten zweiten linearen DNA-Sequenz verbindet.

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   NACHQERtJC

   10. Das Plasmid pUC1002.

   19. E. coil JC1553 (pUC1002), welches die Hinterlegungsnuinraer dsm 1649 trägt.

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