DE2930922A1

DE2930922A1 - Verfahren zur herstellung von desoxyribonucleasen

Info

Publication number: DE2930922A1
Application number: DE19792930922
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Ando; Eiji Hayase; Shukuko Ikawa; Takehiko Shibata
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1978-07-28
Filing date: 1979-07-30
Publication date: 1980-02-07
Also published as: JPS5519058A; JPS5749195B2; DK157562C; DK318779A; DE2930922C2; DK157562B; US4259446A

Description

Enzyme (DNasen), die Desoxyribonucleinsäuren (DNS) spalten, Kommen in verschiedenen Lebewesen vor und beteiligen sich an wichtigen Vorgängen des Lebens, wie Stoffwechsel, Abbau, Synthese und Rekombination. Dementsprechend haben die Eigenschaften von Enzymen, insbesondere auf dem Gebiet der Protein-Chemie und der biologischen Funktionen, seit kurzem besonderes Interesse erregt.

Beim Studium der Struktur und der Funktionen von Genen ist es von Bedeutung,Enzyme mit spezifischen Wirkungen herzustellen und zu isolieren. Dabei sind Desoxyribonucleinsäuren spaltende Enzyme als biochemische Reaktionspartner zum Klonieren von Genen im molekularen Bereich und zur Verbesserung von Züchtungen besonders wertvoll.

DNasen werden entsprechend ihrer Wirkung grob in zwei Arten, nämlich Exonucleasen und Endonucleasen, eingeteilt. Die Exonucleasen \ wirken auf ein Polynucleotid von dessen Ende her und setzen der Reihe nach Nucleotide oder Oligonucleotide frei. Die Endonucleasen spalten Phosphorsäurediester-

25 bindungen im DNS-Molekül.

Auf dem Gebiet der Endonucleasen ergaben sich kürzlich große Erfolge bei Untersuchungen an Enzymen, die spezifische Eigenschaften bezüglich der DNS-Struktur, insbesondere bezüglich der Konfiguration von Nucleotiden oder bezüglich natürlicher oder künstlicher Strukturänderungen, aufweisen. Enzymen, die eine Molekülstruktur erkennen können und darauf einwirken , und Enzymen mit biologisch wichtigen Funktionen (vgl. T. Ando, Chemistry and Life, Bd. 13 (1975), 6, S. 342).

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! Auf dem einschlägigen Gebiet wurden bereits folgende Verfahren gefunden:

Ein von einer Kulturbrühe von Aspergillus oryzae ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das nicht auf doppelg strängige DNS einwirkt, sondern spezifisch einsträngige DNS abbaut (vgl. JP-PS 593 3 68);

ein von Zellen von Aspergillus oryzae ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das vorzugsweise eine Purin-Purin-Bindung im DNS-Molekül spaltet (vgl. JP-PS 621 205) ; 10 ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms aus Bacteriophageninfizierten Zellen von Escherichia coli, das in DNS Einzelstrangbrüche bewirkt (vgl. JP-PS 764 919);

ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, aus Escherichia coli-Zellen, in denen Bakteriophagen durch Infektion oder Induktion zur Vermehrung gebracht wurden. Das Enzym wirkt auf RNS ein und bildet cyclische Nucleosidphosphate (vgl. JP-PS 829 334); . .

ein von einer Kulturbrühe von alkalophilen Bakterien ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das vorzugsweise eine Guanin-Guanin-Bindung im DNS-Molekül spaltet (vgl. JP-PS 831 171);

ein von Bacillus subtilis ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das spezifisch iden ENSjÄnteileines DNS-RNS-Hybrids abbaut (vgl. JP-PS 877 668) ;

ein von Bacillus subtilis oder verwandten Stämmen der Gattung Bacillus ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit derartigen substratspezifischen Eigenschaften gegenüber DNS, daß' das Enzym eine spezielle Nucleotidsequenz erkennt und spaltet (vgl. JP-OSen 47 980/77 und 15 491/78).

Mikroorganismen sind in der Lage, fremde DNS in der Zelle spezifisch zu erkennen und abzubauen (Restriktionssystern) und sie haben die Fähigkeit, eine solche DNS zu modifizieren, so daß diese eine Resistenz gegenüber ihrem eigenen Restriktionssystem aufweist (Modifikationssystem).

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Γ _ ~1

■j Das Restriktionsenzym ist eine Endonuclease, die Bestandteil dieses Restriktions-Modifikations-Systens ist. Sie ist beispiels- weise ein Enzym, das eine spezifische Sequenz von 4 bis 6 Nucleotiden im Molekül einer doppe1strängigen DNS erkenn-

c nen kann und die Sequenz oder deren benachbarten Bereich spaltet.

Durch derartige substratspezifische Eigenschaften können diese Restriktionsenzyme vorteilhaft zu Untersuchungen der IQ Primärstruktur von DNS (Nucleotidsequenz) und ihrer Funktion sowie bei der in vitro Rekombinationen heterogener DNS eingesetzt werden. ..... . -

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch durch-•15 führbares Verfahren zur Herstellung solcher Restriktionsenzyme zu entwickeln, die wertvolle biochemische Reaktionspartner darstellen. Die Enzyme haben die Eigenschaft, eine spezifische Nucleotidsequenz von Desoxyribonucleinsäuren zu erkennen und ihre Bindungen unter Bildung einheitlicher Bruchstücke der Desoxyribonucleinsäure zu spalten. Eine weitere Aufgabe ist es, neue Transformanten von Bacillus subtilis zu schaffen, die die genetische Information für mindestens zwei Restriktionsenzyme enthalten.

Es wurden nun spezielle Untersuchungen bezüglich Herstellung, Trennung und substratspezifischen Eigenschaften von Restriktionsenzymen unter Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Bacillus durchgeführt. Dabei wurde ein Verfahren gefunden, bei dem Bacillus subtilis Marburg 168 (GSY 1026) als

bei
Empfänger einer Transformation mit DNS von Bacillus subtilis R verwendet wird, _um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes R in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISMR 4 wird selektioniert und dann als Empfänger e^iner Transformation mit DNS von Bacillus subtilis IAM 1247 verwendet, . um das Restriktions-Modifikations-System des letztgenannten Stammes in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISMRB 9 wird selektioniert und in ähnli-

bei
eher Weise als Empfänger einer Transformation mit DNS von

Bacillus subtilis IAM 1231 verwendet, um das Restriktions-L

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Γ "1

Modifikations-System des letztgenannten Stammes einzuführen. Die erhaltenen Transformanten ISMRBE 17 und ISMBP 21 werden selektioniert.

Die vorgenannte Transformante ISMRB 9 weist eine Kombination der Restriktions-Modifikations-Systeme der Stämme GSY 1026, R und IAM 1247 auf.

Weiterhin wurde ein Verfahren gefunden, bei dem die Transfor-IQ mante ISMRB 9 vermehrt und aus den erhaltenen Zellen ein im Stamm R vorliegendes Restriktionsenzym Bsu R und ein im Stamm IAM 1247 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 12 47 I gleichzeitig gewonnen werden.

Auf ähnliche Weise wurde bestätigt, daß die Transformante ISMRBE 17 eine Kombination der Restriktions-Modifikations-Systeme der Stämme GSY 1026, R und IAM 1247 sowie ein zweites Restriktions-Modifikations-System des Stamms IAM 1231, und die Transformante ISMRB die Restriktions-Modifikationssysteme der Stämme GSY 1026 und IAM 1247 sowie ein zweites Restriktions-Modif ikations-System des Stamms IAM 1247 aufweisen.

Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse ist es gelungen, gleichzeitig drei Enzyme, nämlich die Restriktionsenzyme Bsu R, Bsu 1247 I und Bsu 1231 I, die in den Stämmen R, 1247 und 1231 vorliegen, herzustellen, was durch Vermehrung der vorgenannten Transformante ISMRBE 17 geschieht.

Es ist auch gelungen, gleichzeitig die Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 II, die in den Stämmen IAM 1247 und IAM 1231 vorliegen, herzustellen; dies erfolgt durch Vermehren der vorgenannten Transformante ISMBF 21.

In ähnlicher Weise konnte ein Verfahren gefunden werden, bei dem der vom vorgenannten Stamm GSY 1026 abgeleitete Stamm GSY 1012 als Empfänger eingesetzt und

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mit DNS des Stammes IAM 1231 transformiert wird, um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes IAM 1231 einzuführen, und anschließend die erhaltenen Transformanten ISE und ISF 18 selektioniert werden.

Die Transformante ISE 15 weist ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes erstes Restriktions-Modifikations-System auf. Aus der Transformante ISE 15 konnte ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1231 I isoliert werden.

Die Transformante ISF 18 weist ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes zweites Restriktions-Modifikations-System auf. Aus der Transformante ISF 18 konnte ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes-Restriktionsenzym Bsu 1231 II isoliert werden.

Auf ähnliche Weise war es möglich, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem der vom Stamm GSY 1026 abgeleitete Stamm GSY 1012 als Empfänger eingesetzt und mit DNS des Stammes IAM 1247 transformiert wird, um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes IAM 1247 in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISB 8 wird selektioniert. Sie weist ein Restriktions-Modifikations-System des Stammes IAM 1247 auf.

Es ist gelungen, aus Zellen, die durch Züchten der vorgenannten Transformante ISB 8 erhalten worden sind, ein im Stamm IAM 1247 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1247 I herzustellen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können aus den neuen Transformanten zwei oder mehr DNasen hergestellt werden, die sich in den substratspezifischen Eigenschaften unterscheiden.

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Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ist eine neue Transformante der Gattung Bacillus, der durch Transformation die Fähigkeit zur Bildung mindestens einer weiteren Restriktionsendohuclease erhalten hat.

Der Ausdruck "Transformation" bedeutet eine Methode, bei der ein genetisch definierter Mikroorganismus als Empfänger eingesetzt und mit DNS in Berührung gebracht wird, die aus einem Mikroorganismus mit einem Restriktions-Modifikations-System stammt, das von dem des Empfängers verschieden ist. Dadurch wird ein neues Restriktions-Modifikations-System in den Empfänger eingeführt.

Erfindungsgemäß können als Transformanten beispielsweise Bacillus subtilis ISMRB 9, Bacillus subtilis ISMRBE 17, Bacillus subtilis ISMBF 21, Bacillus subtilis ISE 15, Bacillus subtilis ISF 18 und Bacillus subtilis ISB 8 eingesetzt werden.

Diese Transformanten sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (nachfolgend "FERM") und der American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA ("nachfolgend "ATCC", unter den nachfolgenden Nummern der Hinterlegungsstelle hinterlegt:

Nr. Mikroorganismus

(i) Bacillus subtilis ISMRB 9

(ii) Bacillus subtilis ISMRBE 17

(iii) Bacillus subtilis ISMBF 21

(iv) Bacillus subtilis ISE 15

(v) Bacillus subtilis ISF 18

(vi) Bacillus subtilis ISB 8

FERM-P Nr.	ATCC-Nr.
4543	31526
4381	31522
4384	31525
4380	31527
4382	31523
4383	31524

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Die Hinterlegung bei ATCC ist unbeschränkt. Der Öffentlichkeit sind die vorgenannten dort hinterlegten Mikroorganismen frei zugänglich.

Ein Beispiel für die Herstellung der vorgenannten Transformanten aus Mikroorganismen der Gattung Bacillus wird nachfolgend beschrieben.

Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026 (ATCC Nr. 31339, FERM-P Nr. 4216) als Empfänger wird bei 37°C unter Schütteln in Bott's Nährmedium gezüchtet, bis die Zelldichte auf 4 x IO /ml angestiegen ist. Das genannte Nährmedium besteht aus jeweils 50 μg/ml Histidin, Tryptophan, Arginin, Valin, Lysin, Glycin, Asparagin, Methionin und Threonin sowie O,6 % Kaliumdihydrogenphosphat, 1,4 % Dikaliumhydrogenphosphat, O,1 % Natriumeitrat, O,2 % Ammoniumsulfat, O,5 % Glucose und 6,5 mMol Magnesiumsulfat; das Nährmedium wird zusätzlich mit jeweils 2O μg/ml Adenin, Leucin und Methionin ergänzt. Die Kulturbrühe wird dann mit 0,1 ml DNS (45 μg/ml) von Bacillus subtilis R (Molec. Gen. Genet., Bd. 143 (1975), S. 13 bis 23), erhalten nach der Phenolextraktionsmethode bei einem pH-Wert von 9, versetzt. Das Gemisch wird 3O Minuten bei 37⁰C unter Schütteln inkubiert. Sodann wird die Kul— turbrühe mit dem gleichen Nährmedium auf das 1O-fache verdünnt und weitere 16 bis 18 Stunden bei 3O°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wird die Kulturbrühe bis zum 100-fachen mit dem gleichen Nährmedium verdünnt und auf eine TYP-Nähragarplatte aufgetragen. Die Platte enthält TYP-Nähragar (1 % Bactotrypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Natriumchlorid und 1,5 % Agar), in welchem vorher in der Phage #105C 168 sus pendiert worden war, welcher seinerseits in Bacillus subtilis Marburg 168 GSY 1026 vermehrt worden war. Die Züchtung erfolgt dann 16 bis 18 Stunden bei 37⁰C. Eine lölonie der erhal tenen Transformante mit einer Resistenz gegenüber dem Phagen 01O5C 168 wird isoliert. Auf diese Weise wird eine Transfor— mante ISMR4 mit einem Restriktions-Modifikations-System des Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026 und des Bacillus subtilis R erhalten.

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- 10 Gemäß vorstehender Methode, jedoch unter Einsatz afr ^oy<^ nannten Transformante ISMR4 als Empfänger und DNS von Baciiiub subtilis IAM 1247, wird eine Transformante ISMRB9 mit den Restriktions-Modifikations-Systemen von Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026 und Bacillus subtilis R und einem Restrik-

5 tions-Modifikations-System von Bacillus subtilis IAM 1247

erhalten- Der zur Selektion verwendete Phage mußte in diesem Fall in der Transformante ISMR 4 vermehrt werden.

In entsprechender Weise können unter Einsatz der vorgenannten Transformante ISMRB 9 als Empfänger und DNS von Bacillus subtilis IAM 1231 eine Transformante ISMRBE 17 mit den Restriktions-Modifikationssystemen von Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026, Bacillus subtilis R, Bacillus subtilis IAM 1247 und Bacillus subtilis IAM 1231 sowie eine Transformante ISMBF 21 mit den Restriktions-Modifikations-Systemen von Bacillus subtilis 168GSY 1Ο26, Bacillus subtilis IAM 1231 und Bacillus subtilis IAM 1247 erhalten werden.

Weiterhin können gemäß vorstehender Methode unter Einsatz von Bacillus subtilis 168GSY 1012, abgeleitet von Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026, als Empfänger und DNS von Bacillus subtilis IAM 1231 eine Transformante ISE 15 mit dem ersten Restriktions-Modifikationssystem von Bacillus subtilis IAM 1231 sowie eine Transformante ISF 18 mit dem zweiten Restriktions-Modifikations-System von Bacillus subtilis IAM 1231 erhalten werden.

Nach dieser Methode ist unter Einsatz des Stamms 168GSY 1012 als Empfänger und DNS von Bacillus subtilis IAM 1247 eine Transformante ISB 8 mit dem Restriktions-Modifikations-System von Bacillus subtilis IAM 1247 erhältlich.

Jede der vorgenannten Transformanten (i) bis (vi) wird durch Einführen eines Restriktions-Modifikations-Systems eines be-

35 kannten Stamms der Gattung Bacillus in Bacillus subtilis

Marburg 168GSY 1Ο26 oder Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1012, abgeleitet vom Stamm 168GSY 1026, unter Einsatz von DNS des bekannten Stamms erhalten. Die wesentlichen mikrobiologischen

L _J

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Eigenschaften dieser Transformanten sind die gleichen wie diejenigen des Basisempfängers, d.h. von Bacillus subtilis Marburg 168GSY 1026.

5 Charakteristische mikrobiologische Eigenschaften dieses letztgenannten Stamms wurden nach den von R.E. Gordon, W.C. Haymes und C. H-N. Pang in "The Genus Bacillus", U.S. Dept. Agr., 1974 und in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 1974 beschriebenen Methoden bestimmt und sind nachfolgend angegeben:

(A) Morphologie:

Der Stamm liegt in Form von vegetativen Stäbchen vor, die peritrich begeißelt und motil sind. Die Größe beträgt

(0,7 bis 0,9 μ) χ (1,8 - 3,0 μ). Die Gramfärbung ist positiv.

(B) Wachstum auf Nährmedien:

(1) Bouillon-Agar-Platten-Kultur:

(2) Bouillon-Agar-Strich-Kultur: (3) Bouillon-Flüssigkultur:

(4) Glucose-Bouillon-KuItür:

(5) Glucose-Bouillon-Agar-Kultur:

gutes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum

stärkeres Ausbreiten und gutes Wachstum im Vergleich zur Bouillon-Agar-Kultur

(C) Physiologische Eigenschaften:

(1) Wachstumsbedingungen: Temperatur:
Optimale Temperatur: pH:

Optimaler pH-Wert:

(2) Nitratreduktion:

18 - 50⁰C 30 - 45°C.

5-8
7,O- 7,5
positiv

(3) Hydrolyse von Gelatine und Casein: positiv

(4) Hydrolyse von Stärke: positiv

(5) Salzresistenz: gutes Wachstum in 5 %

NaCl-Lösung

(6) Sauerstoffbedarf: aerob

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1 Wenn die bakteriologischen Eigenschaften auf der Grundlage der vorgenannten Literatur und "Transformation and Transduction in Defective Mutants of Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology/ Band 93 (1967), S. 1925 - 1937,

5 überprüft werden, ergibt sich, daß der Mikroorganismus ein bekannter Marburg-Stamm von Bacillus subtilis ist.

Ergebnisse von Untersuchungen bezüglich der Restriktions-Modifikations-Systerne der vorgenannten Transformanten (i) ₁₀ bis (vi) unter Einsatz von Phagen 01O5C sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.

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ω ei

οι

Tabelle

Trans for mante

ISB 8

Restriktions-

Modifikations-

Svstem

	ISMR 4	Restriktion Modifikatlon
	ISMRB 9	Il
09886	ISMRBE 17	Il
/0937	ISMBF 21	Il
	ISE 15	Il
	ISF 18	Il

Eingeführte Restriktions-Modifikations-Systeme
änderer Hacillus-Stämme

R 1247 I 1247 II 1231 I T23I II

CD GO O CD K) N)

Die Vermehrung der Transformanten (i) bis (vi) kann nach den üblichen Methoden erfolgen. Eine typische Züchtungsmethode wird nachfolgend beispielhaft beschrieben.

Ein Nährmedium, das beispielsweise eine Aminosäure, ein Casein-HydroIysat, Glucose, ein Phosphat, ein Sulfat und Hefeextrakt enthält, wird mit der Transformanten beimpft. Die Züchtung erfolgt bei 30 bis 37⁰C unter Belüftung und Rühren. Während der logarithmischen Phase bis zum Beginn der

jQ stationären Phase gebildete Zellen werden gesammelt. Diese werden entweder durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und die Zelltrümmer durch Zentrifugieren abgetrennt, oder sie werden zunächst mit Lysozym behandelt und die erhaltenen Protoplasten werden mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Es wird ein zellfreier Extrakt erhalten. Dieser Extrakt wird fraktioniert und einer Streptomycinsulfat-Behandlung unterworfen. Nach entsprechender Reinigung, z.B. durch Gelfiltration unter Einsatz von Ultragel ACA 44 oder Sephadex G-100, Ionenaustauscherchromatographie unter Einsatz von DEAE-Cellulose oder Phosphocellulose oder durch eine Kombination dieser Reinigungs-Methoden, werden gleichzeitig mindestens zwei DNS abbauende Enzyme aus der Reihe Bsu R, Bsu 1247 I, Bsu 1231 I und Bsu 1231 II mit verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften erhalten.

Jedes der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Enzyme ist eine bekannte, DNS abbauende Endonuclease.

Physikochemische Eigenschaften dieser Enzyme werden nachfolgend angegeben.

(1) Bestimmung der Aktivität der Endonuclease: Der Phage 01O5C wird in einem Wirtsstamm vermehrt und die Phagen 01O5C DNS, welche dabei wirtsabhängig modifiziert wurde, wird isoliert. Die Phagen-DNS

wird als Substrat zur Messung der enzymatischen Aktivität eingesetzt. Im speziellen Fall werden die Phagen 01O5C DNS,

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_J

j gebildet unter Einsatz von Bacillus subtilis Marburg

168GSY 1026 als Wirtsstamm, und die Phagen 01O5C DNS, gebildet unter Einsatz der Transformante ISMRB 9 als Wirtsstamm, als Substrate verwendet.

Ein ,Reaktionsansatz, enthaltend 0,1 μg der Substrat-DNS, 5O mMol tris-HCl-Pufferlösung (pH = 7,5), 10 mMol Magnesiumchlorid, 1 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1 % Gelatine und eine Enzymprobe, wird 50 Minuten auf 37⁰C erwärmt. 30 μΐ des erhaltenen flüssigen Reaktionsgemisches wird 1 1/2 bis 2 Stunden einer Elektrophorese bei 110 V unterworfen, wobei eine Iprozentige Agarose-Gelplatte verwendet wird. Sodann wirddie Platte in eine Lösung getaucht worden ist, die 0,5pg/ml Ethidiumbromid enthält. Die Fluoreszenz im UV-Licht wird photographiert.

Die enzymatische Restriktionsaktivität wird auf der Basis der Stellung und der Anzahl der DNS-Fragmente bestimmt, die in dem erhaltenen Photo gefunden werden.

(2) Merkmale der Enzyme (Substratspezifische Eigenschaften): (^a) Restriktionsenzym Bsu R:

Es erkennt die folgende Nucleotidsequenz im Molekül der DNS:

5¹ - GGCC - 3· 25

3' - CCGG - 5'

und spaltet die Sequenz an den mit Pfeilen gekennzeichneten Stellen. Dieses Enzym spaltet außerdem SV4O DNS

[Simian Virus 40] an 18 Stellen, JVPhagen DNS an mehr als 30

200 Stellen, ^dv DNS an 14 Stellen und Phagen SPP1 DNS an

mehr als 80 Stellen (vgl. Mol. Gen. Genet., Band 143 . (1975), S. 13; Mol. Gen. Genet., Band 143 (1975), S. 25; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1Ο12).

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- 16 (b) Restriktionsenzym Bsu 1247 I:

Es erkennt die folgende Nucleotidseuqenz im Molekül der DNS

5¹ - CTGCAG - 3'

3' - GACGTC - 5¹
T

und spaltet die Sequenz an den mit Pfeilen gekennzeichneten Stellen.

Dieses Enzym spaltet auch ^ Phagen DNS an 18 Stellen, SV4O DNS

an 3 Stellen und Phagen φ 1O5C DNS (vgl. J. Bacteriol., Bd. 128 (1976), S 473; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1012; JP-OS 15 491/78).

(c) Restriktionsenzym Bsu 1231 I:

Die durch dieses Enzym im DNS-Molekül spaltbare Nucleotidsequenz ist noch unbekannt. Jedoch wurde festgestellt, daß dieses Enzym λ Phagen DNS, Phagen φ 105C DNS und Phagen SPP1 DNS spaltet (vgl. J. Bacteriol., Bd. 128 (1976), S. 473; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1012; JP-OS 15 491/78).

(d) Restriktionsenzym Bsu 1231 II:

Die durch dieses Enzym im DNS-Molekül spaltbare Nucleotidsequenz ist noch unbekannt.Jedoch wurde gezeigt, daß dieses Enzym Phagen φ 105c DNS an etwa 15 Stellen, ^ Phagen DNS an etwa 30 15 Stellen, Phagen φ X174 DNS an etwa 5 Stellen und ColEI (Plasmid [zelleigener Faktor von Escherichia coli]) an etwa 9 Stellen spaltet.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Enzyme stellen sehr /wertvolle biochemische Reaktionspartner zur Aufklärung von Strukturen

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^Γ -17-

und Funktionen der DNS von Genen dar und sind sehr nützlich zur molekularen Gen-Klonierung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Die Transformante ISMRB 9 (ATCC 31526) wird in 1 Liter Bact-Penassay -Nährmedium (enthaltend 1,5 % Rindfleischextrakt/ 1,5 % Hefeextrakt, 5 % Pepton, 1 % Glucose, 3,5 % Natriumchlorid, 3,68 % Dikaliumhydrogenphosphat und 1,32 % Kaliumdihydrogenphosphat) 16 bis 18 Stunden bei 37°C vorgezüchtet. Die Kulturbrühe wird dann in 10 Liter eines Trypton-Nährmediums (enthaltend 1 % Trypton, 5 % Hefeextrakt und 10 % Natriumchlorid) überführt. Die Züchtung wird 4 bis 5 Stunden bei 37⁰C unter Belüften und Rühren fortgesetzt. Durch Zentrifugieren werden Zellen im Anfangsstadium der stationären Wachstumsphase gesammelt. 30 g der Zellen werden in 50 ml einer Pufferlösung A (enthaltend 1O mMol tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5, sowie 0,1 mMol MEDTA und 5 mMol Mercaptoäthanol) suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wird mit Glasperlen (Durchmesser 0,1 mm) gemischt und 15 Minuten bei 0°C zertrümmert. Der erhaltene Zellbrei wird 1O Minuten bei 10.000 ü/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit einer Iprozentigen Lösung von Streptomycinsulfat versetzt. Das Gemisch wird durch Zentrifugieren in den Niederschlag und die überstehende Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird in der vorgenannten Pufferlösung A, der noch 0,2 Mol Magnesiumchlorid zugesetzt worden sind, suspendiert. Es wird eine überstehende Flüssigkeit erhalten, die das Restriktionsenzym Bsu R enthält.

Die überstehende Streptomycinlösung wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 40 bis 80 % der Sättigungskonzentration versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in d_er pufferlösung A suspendiert und unter Einsatz dieser Pufferlösung dialysiert. Das Dialysat wird durch eine mit

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AcA 34 beschickte Säule (2,2 cm χ 58 cm) geschickt, wobei das Eluieren unter Verwendung einer 1 % Glycerin und 0,3 Mol Natriumchlorid enthaltenden Pufferlösung erfolgt. Die Aktivität von Bsu 1247 I findet sich in der 150 bis 220 ml Fraktion

5 des Eluats.

Außerdem wird eine Dialyse unter Einsatz einer 10 % Glycerin enthaltenden Pufferlösung durchgeführt. Das Dialysat wird durch eine mit DE 52 gefüllte Adsorptionskolonne geschickt. Man eluiert mit der Pufferlösung A, die 10 % Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist.

Bsu 1247 I in gereinigter Form wird in der Fraktion gesammelt,-die mit der Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentra-

15 tion von 0,12 bis 0,2 Mol eluiert worden ist.

Beispiel 2

Die Transformante "ISMRBE 17 (ATCC Nr. 315 22) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt. Die das Restriktionsenzym Bsu R enthaltende Fraktion wird aus der Streptomycin-Fällung isoliert.

Die überstehende Streptomycin-Lösung wird gemäß Beispiel 1 behandelt. Die Aktivitäten der Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 I werden in der 150 bis 220 ml Fraktion des Eluats bestimmt. Diese Fraktion wird unter Einsatz der 1O % Glycerin enthaltenden Pufferlösung A dialysiert. Das Dialysat wird durch eine mit DEAE-Cellulose und DE 52 gefüllte Adsorptionssäule geschickt. Man eluiert mit einer Pufferlösung A,

30 die 10 % Glycerin enthält und einen linearen Gradienten

der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist. Die mit der Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentra'-tion von 0,12 bis 0,2 Mol eluierte Fraktion wird gesammelt und und unter Einsatz einer 10 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert =«6,8), die 10 % Glycerin, 0,1 mMol EDTA und 5 mMol 2-Mercaptoäthanol enthält, dialysiert. Das Dialysat

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Ι wird an einer mit Phosphocellulose P-11 beschickten Säule adsorbiert. Das Eluieren erfolgt mit einer Kaliumchloridlösung, die einen linearen Konzentrationsgradienten von O bis 0,6 Mol aufweist. In der Fraktion, die durch die Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,22 bis 0,32 Mol eluiert wird, wird Bsu 1247 I gesammelt. Bsu 1231 I wird in der Fraktion gesammelt, die durch die Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,20 bis 0,38 Mol eluiert wird.

¹⁰ Beispiel3

Die Transformante ISMBF 21 (ATCC 31525) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt, wobei eine Streptomycin enthaltende überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Die Aktivitäten der Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 II finden sich in der 150 bis 220 ml Fraktion, die durch Behandeln der vorgenannten überstehenden Flüssigkeit gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist. Die so erhaltene Fraktion wird gemäß Beispiel 2 behandelt. Insbesondere wird die Fraktion unter Einsatz einer 10 % Glycerin enthaltenden Pufferlösung A

^2C* dialysiert und an einer mit DEAE-Cellulose und DE 52 beschickten Säule adsorbiert. Man eluiert mit einer Pufferlösung A, die 10 % Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist. Die durch die Pufferlösung A mit einer Konzentration von 0,12 bis o,2 eluierte Fraktion wird gesammelt und unter Verwendung einer 10 mMol Kaliumphosphat enthaltenden Pufferlösung (pH-Wert = 6,8), in der 10 % Glycerin, 0,1 Mol EDTA und 5 mMol 2-Mercaptoäthanol vorliegen, dialysiert. Die Dialysefraktion wird an einer mit Phosphocellulose P-11 beschickten Säule adsorbiert.

Man eluiert mit einer Kaliumchloridlösung, die einen linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,8 Mol aufweist. Bsu 1231 II in gereinigter Form wird in der Fraktion gesammelt, die durch Eluieren mit der Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,65 bis 0,70 Mol erhalten wird. Bsu 1247 I liegt in der Fraktion vor, die durch die Kaliumchloridlö-

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sung mit einer Konzentration von 0,22 bis 0,32 Mol eluiert wird.

Beispiel 4

Die Transformante ISE 15 (ATCC 31527) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt. Man erhält eine Streptomycin enthaltende überstehende Flüssigkeit. Die Aktivität des Restriktionsenzyms Bsu 1231 I findet sich in der 150 bis 220 ml Fraktion, die durch Behandeln der vorgenannten, Streptomycin enthaltenden überstehenden Flüssigkeit gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist. Die anfallende Fraktion wird gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt. Insbesondere wird die Fraktion unter Einsatz einer 10 % Glycerin enthaltenden Pufferlösung A dialysiert und dann an einer mit DE 52 beschickten Säule absorbiert.

Man eluiert mit einer Pufferlösung A, die 10 % Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist,.Bsu 1231 I in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von

20 0,12 bis 0,18 Mol eluiert wird.

Beispiel5

Die Transformante ISF 18 (ATCC 31523) wird gemäß Beispiel 4 gezüchtet und weiterbehandelt. Bsu 1231 II in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,20 bis 0,30 Mol eluiert wird.

Beispiel 6

Die Transformante ISB 8 (ATCC 31524) wird gemäß Beispiel 4 gezüchtet und weiterbehandelt. Bsu 1247 I in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,12 bis O,20 Mol eluiert wird.

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Claims

" Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleasen " Priorität: 28. Juli 1978, Japan, Nr. 92 094/78 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleasen, dadurc h gekennzeichnet, daß man eine Transformante der Gattung Bacillus vermehrt, aus den er haltenen Zellen einen zeilfreien Extrakt abtrennt und diesen fraktioniert und/oder auftrennt, wobei mindestens zwei Desoxyribonucleasen mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften erhalten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Abtrennen des Extrakts solche Zellen einsetzt, die während des Zeitraums der logarithmischen Wachstumsphase bis zum Beginn der stationären Wachstumsphase erhalten worden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Fraktionieren und/oder Auftrennen mindestens eine der Maßnahmen Streptomycin-Behandlung, Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und Affxnitätschromatographie anwendet.

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— O _

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Desoxyribonucleasen aus der Reihe Bsu R, Bsu 1247 I, Bsu 1231 I und Bsu 1231 II mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Transformante der Gattung Bacillus aus der Reihe Bacillus subtilis ISMRB 9, Bacillus subtilis ISMRBE 17, Bacillus subtilis ISMBF 21, Bacillus subtilis ISE 15 _r

10 Bacillus subtilis ISF 18 und Bacillus subtili.s ISB 8 züchtet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß " man zum Abtrennen des Extrakts solche Zellen einsetzt, die

während des Zeitraums der logarithmischen Wachstumsphase

bis zum Beginn der stationären Wachstumsphase erhalten worden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß 20 man zum Fraktionieren und/oder Auftrennen mindestens eine der Maßnahmen Streptomycin-Behandlung, Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie anwendet.

25 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Desoxyribonucleasen aus der Reihe Bsu R, Bsu 1247 I, Bsu 1231 I und Bsu 1231 II mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften isoliert.

9. Transformante Bacillus subtilis ISMRB 9, Bacillus subtilis ISMRBE 17, Bacillus subtilis ISMBF 21, Bacillus subtilis ISE 15, Bacillus subtilis ISF 18 und Bacillus subtilis ISB 8.

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