DE3527682C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Restriktionsendonuklease SplI sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Eine Restriktionsendonuklease ist allgemein eine Desoxyribonuklease, die verschiedene spezifische Basensequenzen in doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA)- Molekülen erkennt und die Stränge spaltet. Diese Restriktions­ endonukleasen sind brauchbar beim Studium der Struktur und der Funktion von DNA, da sie die Stränge eines langen DNA-Moleküls an spezifischen Stellen spalten können, wobei DNA-Fragmente gebildet werden, die man einer Basensequenz- Analyse unterwerfen kann. Weiter sind sie wesentlich als Reagenzien, die in der Gentechnologie außerordentlich wertvoll sind.

Durch die Erfindung wird eine Restriktions­ endonuklease geschaffen, die als biochemisches Reagenz außerordentlich wertvoll ist und die aus Algen stammt.

In der Erfindung wurde festgestellt, daß Algen, die zur Gattung Spirulina gehören, eine unbekannte Restriktionsendonuklease SplI erzeugen, die spezifisch DNA spaltet.

Die neue Restriktionsendonuklease SplI der Erfindung hat die im Anspruch 1 angegebenen physikochemischen Eigenschaften.

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Herstellen der neuen Restriktionsendonuklease SplI (vgl. hierzu den Anspruch 2).

Die Stellen, an denen die Restriktionsendonuklease SplI der Erfindung ΦX 174 RF-DNA spaltet, wurden festgestellt durch Verdauen dieser ΦX RF-DNA mit derRestriktionsendonuklease nach der Erfindung sowie mit einer Restriktionsendonuklease bekannter Eigenschaften. Als Ergebnis wurde geschlossen, daß die Restriktionsendonuklease der vorliegenden Erfindung die ΦX 174 RF-DNA in den Positionen Nr. 430±20 und 2810±20 spaltet, wobei man diese Positionen zugeordnet hat durch Bezugnahme auf die durch Pst I gespaltene Position, die als Nr. 0 bezeichnet ist. λ-DNA wurde dem gleichen Verfahrren unterworfen und dabei festgestellt, daß dei Restriktionsendonuklease der Erfindung diese λ-DNA in der Position Nr. 19 000±500 spaltet. Es wurde weiter festgestellt, daß die Restriktionsendonuklease der Erfindung weder pBR 322 noch pAO 3 spaltet. Diese Tatsachen und eine computerisierte Untersuchung durch C. Fuchs et al. (siehe Gene, Band 10, Seiten 357 bis 370, 1980) lassen annehmen, daß die Nukleotidsequenz der DNA, die durch die Restriktionsendonuklease der Erfindung erkannt wird, CGTACG ist. Die gespaltene Stelle der Erkennungssequenz der Endonuklease der Erfindung wurde weiter dadurch bestimmt, daß man die endständige Basensequenz der beiden Fragmente analysierte, die durch Spalten der ΦX 174 RF-DNA mit der Endonuklease der Erfindung erhalten wurden, und zwar erfolgte die Analyse nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren (siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 74, 560, 1977).

Im folgenden wird das oben erwähnte Verfahren detailliert beschrieben:

Die ΦX 174 RF-DNA wurde mit der Endonuklease nach der Erfindung vollkommen zersetzt und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um das endständige Phosphat eines DNA-Fragmentes zu entfernen. Nachfolgend wurde dem 5′-Ende des DNA-Framgentes unter Verwendung von Polynukleotid- Kinase und ( γ-³²P) Adenosintriphosphat ein radioaktives Phosphat angefügt, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das an jedem Ende ³²P-Phosphat aufweist, das dann mit Tth HB 8I gespalten und einer 5% Acrylamidgel- Elektrophorese unterworfen wurde, um ein Fragment zu erhalten, das nur an einem Ende mit ³²P markiert war. Von den vier radioaktiven Banden, die bei der Elektrophorese festgestellt wurden, extrahierte man die bei 65 bp und 250 bp Länge separat und analysierte das 5′-Ende jeder Bande nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren, wie oben beschrieben. Dabei wurde festgestellt, daß die Basensequenz in der Nähe der gespaltenen Stelle folgendermaßen ist:

Das obige Ergebnis läßt annehmen, daß das Enzym der Erfindung

erkennt und eine Spaltposition von

bildet. Die hier untersuchte Spaltposition der ΦX 174 RF-DNA ist Nr. 414, was gut mit der oben beschriebenen Spaltstelle Nr. 430±20 übereinstimmt.

Die erkannte Spaltstelle der Endonuklease der vorliegenden Erfindung ist daher die Folgende

wobei die gespaltene Position durch die vertikalen Pfeile gekennzeichnet ist. Die Restriktionsendonuklease der Erfindung wird gemäß der Nomenklatur von Smith und Nathans als SplI bezeichnet (vergleiche J. Mol. Biol., Band 81, 419-423, 1973)

Die Restriktionsendonuklease SplI, die eine neue Restriktionsendonuklease ist, weil ihre Substratspezifität in der Liste der Restriktionsendonukleasen von Richard J. Roberts nicht gefunden werden kann (vergleich Nucleic Acids Research, Band 12, γ167, 1984), hat die folgenden Eigenschaften:

(1) Substratspezifität

Tabelle 1 zeigt die Zahl der Positionen in denen die Endonuklease nach der Erfindung verschiedene Substrat- DNA spaltet.

Substrat-DNA
Zahl der gespaltenen Positionen
λ-DNA
1
Col E1	2
pBR 322	0
ΦX 174 RF	2

Die Endonuklease erkennt die folgende Basensequenz:

und spaltet diese Sequenz an den Phosphordiesterbindungen zwischen C und G, wobei DNA-Fragmente entstehen, die einen einzigen Strang aufweisen und vier Basen am 5′-Ende umfassen.

(2) NaCl-Konzentration

Die Endonuklease weist eine Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0 bis 200 mM und die maximale Aktivität bei 100 bis 120 mM auf, wozu man Lösungen benutzt, die auf eine NaCl-Konzentration von 0 bis 200 mM eingestellt sind und man die Behandlung in der gleichen Weise ausführt, wie bei der Messung ihres Titers, wie unten noch beschrieben wird.

(3) Optimaler pH

Die Endonuklease weist eine Aktivität im pH-Bereich von 5,5 bis 10,0 und die maximale Aktivität in einem pH-Bereich von 7,0 bis 7,5 auf, wozu man Lösungen benutzt, die hinsichtlich des pH-Wertes auf 3,5 bis 5,5; 5,5 bis 7,5; 7,2 bis 9,0 und 8,6 bis 11,0 eingestellt sind, und zwar mit Acetat, Tris-Malat/Natriumhydroxid, Trihydrochlorid beziehungsweise Glycin/Natriumhydroxid, und man die Behandlung in der gleichen Weise ausführt, wie bei der Messung ihres Titers, wie im folgenden beschrieben wird.

(4) Optimale Reaktionstemperatur

Die Endonuklease weist eine Aktivität in einem Temperaturbereich von 20 bis 65°C auf, und es wurde festgestellt, daß die optimale Reaktionstemperatur im Bereich von 50 bis 55°C liegt, wenn die Bestimmung in der gleichen Weise vorgenommen wird, wie die Messung ihres Titers, wie im folgenden beschrieben wird, außer, daß die Reaktionstemperatur im Bereich von 20 bis 75°C variiert wird.

(5) Inaktivierung (Temperaturstabilität)

Eine Testlösung der Endonuklease wurde auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und in der gleichen Weise behandelt, wie bei der Messung ihres Titers, wie im folgenden beschrieben wird. Es wurde festgestellt, daß das Enzym der vorliegenden Erfindung bei 75°C vollkommen inaktiviert wird.

(6) Bestimmung des Titers

Die Endonuklease wird zu einer Lösung hinzugegeben, die 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH-Wert 7,5) 7 mM MgCl₂, 7 mM 2- Mercaptoethanol, 100 mM NaCl, 0,01% Rinderserumalbumin und verschiedene Bakteriophagen-DNA oder Plasmid-DNA enthält, wobei man die erhaltene Mischung 60 min bei 55°C reagieren läßt. Die Reaktionsprodukte werden einer 0,7% Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, und die erhaltenen Agaroseplatten werden in Gegenwart von Ethidiumbromid mit UV bestrahlt. Die abgegebene Fluoreszenz wird fotografiert, um das elektrophoretische Muster als Banden nachzuweisen. Die Zahl der Banden, Positionen und Mengen jeder Bande werden gemessen.

(7) Aktivierung

Die Endonuklease wird mit 5 bis 20 mM Mg²⁺ aktiviert, wobei kein weiterer Kofaktor, wie ATP oder S-Adenosylmethionin erforderlich ist.

(8) Molekulargewicht

Durch Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G150 wurde das Molekulargewicht der Endonuklease zu 400 000±30 000 bestimmt.

Beispiele für die Algen, die die Restriktionsendonuklease SplI erzeugen, sind einige bekannte Stämme, einschließlich Spirulina platensis M-185 und Spirulina maxima UTEX LB-2342 und Spirulina platensis Unterart siamese, die aus einem Salzsee in Äthiopien isoliert worden sind. S. platensis M-185 ist ein bekannter Stamm, der im Institut für Angewandte Mikrobiologie der Universität Tokio, einer systematischen Mikroalgenkultur-Sammlung deponiert ist, während S. maxima UTEX LB-2342 ein bekannter Stamm ist, der in der Algenkultur- Sammlung der Universität von Texas, Austin, deponiert ist.

Spirulina kann in üblicher Weise gezüchtet werden. Es ist bevorzugt, sie in einem Medium zu züchten, das Natriumbikarbonat als einen Hauptbestandteil enthält und das Medium während der Inkubation bei einem pH-Wert von 8 bis 9,5 zu halten.

Nach Abschluß der Inkubation wird die Kulturbrühe filtriert, um die Zellen auf Papier- oder Gewebefiltern zu sammeln. Die Endonuklease kann in einer üblichen Weise extrahiert und gereinigt werden. So werden zum Beispiel die erhaltenen Zellen in einer Pufferlösung suspendiert, mit Ultraschall zerstört und dann zentrifugiert, um einen zellfreien Extrakt zu ergeben. Der Extrakt wird mit 5 bis 10 Gewichtsprozent Streptomycinsulfat oder Polyethylenimin behandelt, mit Ammoniumsulfat fraktioniert, und er wird gereinigt mittels Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Phosphorzellulose oder DEAE-Zellulose, mittels Affinitäts-Chromatographie unter Einsatz von Heparinagarose oder DNA-Zellulose oder mittels einer Kombination dieser Verfahren, um die erwünschte Endonuklease zu erhalten.

Die Erfindung schafft erfolgreich eine neue Restriktionsendonuklease durch Einsatz von Spirulina, die sich einfach züchten läßt und aus der man die erwünschte Endonuklease leicht extrahieren kann. Auf diese Weise trägt die Erfindung zu verschiedenen Studien auf dem Gebiet der Biochemie, zur Gentechnologie und ähnlichem bei, wo Restriktionsendonukleasen erforderlich sind.

Die Algen, die SplI produzieren, und die zur Gattung Spirulina gehören, haben häufig noch andere Restriktionsendonukleasen, wie die Isochizomeren Tth 111I, HaeIII, PvuI und PvuII. So ist zum Beispiel die Anwesenheit von zwei weiteren Restriktionsendonukleasen mit den Beziehungen SplII und SplIII außer SplI in S. platensis bestätigt. SplII ist ein Isoschizomer von Tth 111I, das von dem Stamm Thermus thermophilus 111 produziert wird, während SplIII ein Isoschizomer von HaeIII ist, das von dem Stamm Haemophilus aegyptius ATCC-11116. Andererseits hat S. maxima drei Restriktionsendonukleasen mit den Bezeichnungen SmxII, SmxIII und SmxIV außer SplI, die auch SmadI oder SmxI genannt wird. SmxII ist ein Isoschizomer von Tth 111I, die durch den Stamm T. thermophilus 111 produziert wird. SmxIII ist ein Isoschizomer von PvuI, die von Proteus vulgaris produziet wird, und SmxIV ist ein Isoschizomer von PvuII, die von P. vulgaris produziert wird.

Diese Restriktionsendonukleasen außer SplI können selbstverständlich nacheinander oder gleichzeitig während der Extraktion und Isolation von SplI isoliert werden. Es ist bevorzugt, daß das Überstehende des zellfreien Extraktes, das durch Entfernen der DNA erhalten wird, mit Ammoniumsulfat fraktioniert und durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Einsatz von DEAE- Zellulose oder in ähnlicher Weise getrennt wird, gefolgt von einer Reinigung mittels der vorgenannten Ionenaustausch- Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder eine Kombination dieser Verfahren.

Um die Erfindung weiter zu erläutern, werden die folgenden Beispiele angegeben, in denen die Prozentsätze Gewichtsprozente sind.

Beispiel 1

S. platensis M-185 wurde auf dem in der folgenden Tabelle 2 aufgeführten SOT-Medium inokuliert, um bei 560 nm ein OD von 0,1 zu ergeben, wobei der genannte Stamm unter Schütteln und Belichten mit 7000 Lux bei 35°C gezüchtet wurde. Nach sieben Tagen wurde die Trübung bei 560 nm zu OD 1,5 bestimmt. 50 l der erhaltenen Kulturlösung wurden mit einem 500-Maschen- Gewebefilter filtriert, und man erhielt etwa 100 g Zellen im feuchten Zustand.

Zusammensetzung des SOT-Mediums
NaHCO₃|16,8 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
NaNO₃	2,5 g/l
K₂SO₄	1,0 g/l
NaCl	7,0 g/l
MgSO₄ × 7 H₂O	0,2 g/l
CaCl₂ × 7 H₂O	0,04 g/l
FeSO₄ × 7 H₂O	0,01 g/l
EDTA	0,08 g/l
Lösung A₅	1 ml/l
H₃BO₃	2,85 g/l
MnCl₂ × 4 H₂O	1,81 g/l
ZnSO₄ × 7 H₂O	0,22 g/l
CuSO₄ × 5 H₂O	0,08 g/l
MoO₃	0,015 g/l

Um die Aktivität der Restritkionsendonuklease SplI zu bestimmen, wurde diese zu einer Lösung hinzugegeben, die 1 µg Col E1 als Substrat-DNA, 10 mM Trishydrochlorid, 7 mM MgCl₂, 7 mM 2-Mercaptoethanol und 100 mM NaCl (pH 7,5) enthielt, so daß man ein Gesamtvolumen von 50 µl erhielt, und man ließ die erhaltene Mischung für eine Stunde bei 55°C reagieren. Die erhaltenen Produkte wurden durch Agarose- Elektrophorese analysiert. Die enzymatische Aktivität, die zum vollständigen Verdauen von 1 µg DNA unter den obigen Bedingungen erforderlich ist, wurde als eine Einheit definiert.

Die erhaltenen feuchten Zellen wurden in Puffer A suspendiert, der 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,4), 7 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA in einem Volumen enthielt, das dreimal so groß war wie das der Zellen. Die Zellen wurden mit Ultraschall zerstört und eine Stunde bei 10 000 g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen und einen zellfreien Extrakt zu ergeben. Zu diesem Extrakt wurde eine wässerige Lösung von Streptomycinsulfat (5 bis 10%) hinzugegeben, wobei man eine Endkonzentration von 2% erhielt. Die Mischung wurde 30 min gerührt und 20 min bei 15 000 g zentrifugiert, um die endogene DNA sowie RNA zu entfernen und das Überstehende zu ergeben.

Zu dem Überstehenden wurde Ammoniumsulfat in einer Menge hinzugegeben, daß man eine 70%ige gesättigte Lösung erhielt und der gebildete Niederschlag wurde durch 20minütiges Zentrifugieren bei 15 000 g gesammelt. Den gesammelten Niederschlag löste man im Puffer B, der 10 mM Trishydrochlorid (pH 7,3), 7 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA und 10 Volumenprozent Glycerin enthielt und dialysierte gegen den gleichen Puffer über Nacht. Die dialysierte Lösung wurde an einer DEAE-Zellulosesäule (Watman DE 52; 2,5 × 30 cm) adsorbiert, wobei die Säule vorher mit dem Puffer B equilibriert worden war, dann wusch man die Säule mit Puffer B und eluierte mit dem Puffer B bei einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Die Fraktion mit 0,05 bis 0,2 M NaCl wies die Aktivität auf.

Die erhaltene Fraktion wurde gegeben den Puffer C über Nacht dialysiert, wobei der Puffer C Puffer A mit 10% Glycerin enthielt, dann adsorbierte man die Fraktion an einer SP-Sephadex-Säule (3,0 × 30 cm), wusch mit dem Puffer C und eluierte mit dem Puffer C bei einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,6 M. Die Fraktion von 0,2 bis 0,5 M NaCl wies die Aktivität auf. Die aktive Fraktion wurde über Nacht gegen den Puffer B dialysiert, an einer DEAE-Zellulosesäule (1,2 × 15 cm) adsorbiert, mit Puffer B gewaschen und mit Puffer B eluiert bei einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Die Fraktion von 0,05 bis 0,2 M NaCl wies die Aktivität der Restritkionsendonuklease SplI auf, wobei die aktive Fraktion etwa 5000 Einheiten hatte.

Beispiel 2

S. maxima UTEX LB-2342 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wobei man etwa 110 g feuchte Zellen erhielt. Die Restritkionsendonuklease wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Man erhielt eine aktive Fraktion von SplI von etwa 8000 Einheiten.

Beispiel 3

Aktive Fraktionen von Restriktionsenzymen ausgenommen SplI, die aus dem zellfreien Extrakt von S. platensis M-185 wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden, reinigte man in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von DEAE-Zellulose-(Watman DE 52), SP-Sephadex- und DEAE-Zellulosesäulen, wobei man zwei Restritkionsendonuklease, und zwar SplII und SplIII erhielt. SplII (etwa 3000 Einheiten) war ein Isoschizomer von Tth lllI, während SplIII (etwa 4500 Einheiten) ein Isoschizomer von HaeIII war.

Weiter wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise etwa 6000 Einheiten SplI erhalten.

Claims (2)

1. Restriktionsendonuklease SplI mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

• (1) Erkennen der folgenden Basensequenzen in doppelsträngigen Deso­ xyribonukleinsäure (DNA)-Molekülen: und Spalten dieser Sequenzen in den Phosphordiester-Bindungen zwischen C und G, wie durch die vertikalen Pfeile angedeutet, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die einen einzelnen Strang aufweisen, der vier Basen am 5′-Ende umfaßt;
• (2) Spalten der doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure λ-DNA in einer Position, Col E1 in zwei Positionen und ΦX 174 RF in zwei Positionen;
• (3) sie wird mit 5 bis 20 mM Mg²⁺ aktiviert, ohne irgendwelche Kofaktoren zu benötigen;
• (4) Aufweisen einer Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0 bis 200 mM, wobei die optimale NaCl-Konzentration im Bereich von 100 bis 120 mM liegt;
• (5) sie hat einen Arbeits-pH-Wert von 5,5 bis 10,0 und der optimale pH-Wert liegt im Bereich von 7,0 bis 7,5;
• (6) die Arbeitstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 65°C und die optimale Temperatur im Bereich von 50 bis 55°C;
• (7) sie wird durch 60 min bei 75°C vollkommen inaktiviert und
• (8) sie hat ein Molekulargewicht von 400 000±30 000 bei Bestimmung mit einem Gel-Filtrationsverfahren.

2. Verfahren zum Herstellen der Restriktionsendonuklease SplI des Anspruchs 1, gekennzeichnet durch Züchten der Alge Spirulina platensis oder Spirulina maxima Sammeln der Zellen, Herstellen eines zellfreien Extraktes daraus, Entfernen der DNA-Fraktion vom zellfreien Extrakt, Abtrennen der Restritkionsendonuklease SplI und Reinigen durch Ammoniumsulfat- Fraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gel-Filtration oder eine Kombination dieser Methoden.