DE3530218C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Restriktionsendonuklease.

Endonukleasen sind dazu in der Lage, eine spezifische Grundsequenz an einem Deoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekül zu erkennen und die doppelstrangige DNA-Ketten an spezifischen Stellen zu spalten. Als Ergebnis der jüngeren Fortschritte in der Molekulargenetik, der Biochemie und verwandter Wissenschaften ist es nunmehr ersichtlich, daß DNA der Träger für die genetische Information ist. Restriktionsendonukleasen wurden in weitem Umfange für verschiedene Zwecke verwendet (Klärung von genetischen Krankheiten, Massenerzeugung von genetischen Materialien auf der Grundlage von genetischem Engineering etc.). Ungefähr 100 Arten von Endonukleasen wurde bisher aus vielen Mikroorganismen isoliert, wobei jede anhand der spezifischen Grundsequenz sowie anhand des Spaltungsmusters identifiziert wird.

Von diesen sind Sac II, erzeugt durch Streptomyces achromogenes (ATCC 12 767) und Sst II erzeugt durch Streptomyses stanford [(Nucleic Acids Res., Band II, Seite 135 (1983)], als Restriktionsendonukleasen bekannt, welche die nachfolgend angegebene Grundsequenz erkennen und die DNA-Kette an den mit Pfeil markierten Positionen spalten.

(worin C für Cytidin und G für Guanosin stehen).

Sac II und Sst II werfen jedoch Probleme bei ihrer industriellen Anwendung auf. Erwähnt seien die geringe Produktionsausbeute aus den entsprechenden Mikroorganismen sowie die unvermeidbare Kantamination mit Sac I bzw. Sst I.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur industriellen Herstellung einer Restriktionsendonuklease mit der gleichen Erkennungsgrundsequenz und den gleichen Spaltungsstellen wie Sac II und Sst II.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach dem Patentanspruch gelöst.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme wurden jeweils beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegt.

Zum Züchten dieser Mikroorganismen kann jedes Kulturmedium verwendet werden, falls es eine geeignete Kombination aus Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen sowie andere Nährmittel, die durch die verwendeten Mikroorganismen assimilierbar sind, enthält. Der bevorzugte pH des Mediums liegt zwischen 3,5 und 8,0. Man kann jede Schüttelkulturmethode, Rührkulturmethode und Belüftungskulturmethode verwenden, ein Züchten unter Belüftung und Rühren ist jedoch für die Massenerzeugung am zweckmäßigsten. Das Züchten kann bei jeder Temperatur durchgeführt werden, welche die Bildung dieses Enzyms erlaubt, der bevorzugte Bereich liegt jedoch zwischen 20 und 30°C. Die Züchtungszeit schwankt in Abhängigkeit von anderen Bedingungen, das Züchten sollte jedoch fortgesetzt werden, bis ein maximaler Ausstoß an diesem Enzym erreicht worden ist.

Dieses Enzym wird im Prinzip innerhalb von Bakterienzellen gesammelt, die von der Kulturbrühe abgetrennt werden können, beispielsweise durch Zentrifugieren.

Dieses Enzym kann extrahiert und unter Verwendung von bekannten Methoden, wie sie im Zusammenhang mit Restriktionsendonukleasen angewendet werden, gereinigt werden. Die gesammelten mikrobiellen Zellen werden in einem geeigneten Puffer dispergiert und dann durch Ultraschallbehandlung zerbrochen, um eine Extraktion der Endonuklease durch die Pufferlösung zu ermöglichen. Nach der Entfernung des Rückstands durch Ultrazentrifugieren wird Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit zum Aussalzen zugesetzt und der abgeschiedene Niederschlag in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst und gegen einen Puffer mit der gleichen Zusammensetzung dialysiert. Das Dialysat wird durch Ionenaustauscherchromatographie an DEAE-Zellulose und durch Affinitätschromatographie an Affi-Gel-Blue-Agarose und Heparin-Sepharose gereinigt, wobei die erfindungsgemäße Endonuklease erhalten wird. Die Aktivität dieses Enzyms wird nach der nachfolgend beschriebenen Methode ermittelt. Eine Substratlösung mit der in der Tabelle I angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt.
10 mMTris-HCl, pH : 8,0 7 mMMgCl₂ 7 mM2-Mercaptoethanol 0,01%Rinderserumalbumin 1,0 µgλ-DNA (Produkt der Takaru Shuzo Co., Ltd.)

Diese Substratlösung (50 µl) wird auf 37°C vorerhitzt. Die zu testende erfindungsgemäße Endonuklease wird zugesetzt, damit die enzymatische Reaktion bei dieser Temperatur abläuft, worauf die Reaktion nach 60 Minuten durch Zugabe einer Terminatorlösung (1% SDS, 50% Glyzerin, 0,02% Bromphenolblau) abgestoppt wird. Die Reaktionsmischung wird auf ein 1% Agaroseplattengel aufgebracht und die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 10 V/cm während 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die verwendete Pufferlösung besteht aus 90 mM Tris-Boratpuffer (pH 8,3), der 2,5 mM EDTA enthält.

Die DNA-Banden können durch UV-Bestrahlung ermittelt werden, falls 0,5 µg/ml Ethidiumbromid zuvor dem Gel zugesetzt worden sind. Die Elektrophorese wird als beendet angesehen, wenn die Anzahl und die Intensität der Banden der DNA-Fragmente sich nicht mehr verändern.

Die Enzymaktivität, die eine vollständige Zersetzung von 1 µg λ-DNA nach einstündiger Reaktion bei 37°C gewährleistet, wird als eine Einheit definiert.

Das erfindungsgemäße Restriktionsenzym besitzt die nachfolgend angegebenen Eigenschaften:

1. Wirkung und Substratspezifität

Diese Endonuklease ist dazu in der Lage, die nachfolgend angegebene Grundsequenz an einem doppelstrangigen DNA-Molekül zu erkennen und aufzuspalten und ist ein Isoschizomeres der bekannten Endonukleasen Sac II und Sst II

Die Erkennungssequenz dieses Enzyms wird unter Verwendung von λ-DNA, pBR 322 DNA und ⌀ × 174 RFI DNA (Produkte der Takara Shuzo Co., Ltd.) sowie von Adenovirus-Typ-2-DNA (Produkte der Bethesda Research Laboratories) als Substrat bestimmt. Es wurde gefunden, daß dieses Enzym λ-DNA an vier Stellen, ⌀ 174 RFI DNA an einer Stelle und Adenovirus-Typ-2-DNA an mehr als 25 Stellen spaltete, jedoch keine Wirkung auf pBR 322 DNA ausübt. Ferner ließ man die bekannte Restriktionsendonuklease Sac II auf diese Substrate einwirken. Die dabei erhaltenen Spaltenmuster waren mit denjenigen des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms identisch. Daraus wurde geschlossen, daß die Nukleotidsequenz, welche die erfindungsgemäße Endonuklease zu erkennen vermag, 5′-CCGCGG-3′ ist.

Es wurden zwei Methoden angewendet, um die Spaltungspositionen durch die erfindungsgemäße Restriktionsendonuklease zu ermitteln:

Bestimmung der 5′-endständigen Grundfragmente, die dann erhalten werden, wenn Adenovirus-Typ-2-DNA mit der erfindungsgemäßen Endonuklease gespalten wird, und Synthese eines Oligonukleotids, welche die Erkennungssequenz dieses Enzyms trägt, Einwirkung der erfindungsgemäßen Endonuklease und Bestimmung der Kettenlänge der erhaltenen Fragmente. Die experimentelle Methode wird nachstehend näher erläutert.

Adenovirus-Typ-2-DNA wird vollständig mit einer Zubereitung dieses Enzyms digeriert, worauf sich eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Entfernung von endständigen Phosphorsäuren von DNA-Fragmenten anschließt. Radioaktive Phosphorsäure wird dann mit den Endgruppen der DNA-Fragmente unter Verwendung von Polynukleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) und [γ-³²P]ATP verknüpft, die dabei gebildeten Phosphate werden durch Einwirken von P1-Nuklease (Yamasa Shoyu Co., Ltd) bis herab zu Mononukleotiden digeriert und die zersetzten Produkte werden auf einer PEI-Zellulose- Dünnschichtplatte (Masherey and Nagel Co.) analysiert. Das markierte 5′-Mononukleotid, welches nach diesem Test ermittelt wird, besteht aus Guanosin.

Getrennt wird Oligonukleotid d (GACCGCGGTC), das von Natur aus selbstkomplementär ist, nach der Festphasenmethode synthetisiert, die 5′-Endgruppen werden mit Polynukleotidkinase und [γ-³²P]ATP markiert und die Oligonukleotide werden zu einer doppelstrangigen DNA verschmolzen. Diese wird mit dem Enzym gespalten und die Reaktionsprodukte werden an einer DEA-Zellulose-Dünnschichtplatte (Masherey and Nagel Co.) analysiert, wobei markierte Flecken für Hexanukleotid, 5′-GACCGC, erhalten werden.

Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse wurde geschlossen, daß die erfindungsgemäße Endonuklease die nachfolgend angegebene Grundsequenz erkennt und die DNA an den mit Pfeil markierten Positionen spaltet

2. Optimale Bedingungen für die enzymatische Aktivität

• (a) optimale Temperatur
  die optimale Temperatur für dieses Enzym beträgt ungefähr 37°C.
• (b) optimaler pH
  der optimale pH für dieses Enzym liegt zwischen 7,5 und 8,5.
• (c) Salzkonzentration
  die Aktivität wird bei NaCl- und KCL-Konzentrationen von bis zu 40 mM aufrechterhalten, jedoch bei höheren Gehalten inhibiert.
• (d) MgCl₂-Konzentration
  das Enzym wird in Gegenwart von 5 bis 20 mM MgCl₂ aktiv gehalten.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium (160 l) mit der in der folgenden Tabelle II angegebenen Zusammensetzung wird in ein 200 l-Fermentationsgefäß gegeben und in der üblichen Weise sterilisiert.

Glucobactor albidus IFO 3251 wird in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben worden ist, bei 26°C während 36 Stunden nach der Schüttelkulturmethode vermehrt und das erhaltene Inokulum (3 l) wird auf das Kulturmedium in der Fermentationsvorrichtung aufgeimpft und das Züchten bei 26°C während 18 Stunden unter Rühren (250 Upm) und Belüftung (1 vvm) fortgesetzt. Die gewachsenen Zellen werden mit einer gekühlten Zentrifuge gesammelt (Naßausbeute: ungefähr 640 g aus 160 l Kulturmedium).
Glucose5 g Glyzerin15 ml Hefeextrakt5 g Polypepton5 g KH₂PO₄0,5 g K₂HPO₄0,5 g Entionisiertes Wasser1 l pH6,5

Die Mikrobenzellen (200 g) werden in 1000 ml eines extraktiven Puffers (20 mM Tris-HCl, pH: 7,5,10 mM 2-Mercaptoethanol) dispergiert, die Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung zum Aufreißen der Zellwände unterzogen und die erhaltene Mischung wird 1 Stunde zentrifugiert (mit 100 000×g), um den Rückstand zu entfernen.

Dem auf diese Weise erhaltenen Enzymextrakt wird Ammoniumsulfat bis zu einer 80%igen Sättigung zugeführt. Der abgeschiedene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und in einer Pufferlösung A (10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH: 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 5% Glyzerin) aufgelöst und die Lösung über Nacht gegen Puffer A dialysiert.

Das Dialysat wird an DEAE-Zellulose (Whatman Co., DE52), adsorbiert, die in eine 65×95 mm-Säule eingefüllt und mit Puffer A ins Gleichgewicht gesetzt worden ist. Die Säule wird mit Puffer A gewaschen und der adsorbierte Teil mit Puffer A, der KCl enthält eluiert (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 0,6 M). Die Aktivität dieses Enzyms wird in Fraktionen von 0,15 bis 0,23 M der KCl-Konzentration ermittelt.

Diese aktiven Fraktionen werden vereinigt und die vereinigte Lösung wird über Nacht gegen Puffer A dialysiert und das Dialysat wird an Affi-Gel-Blue- Agarose (Produkt der Bio-Rad Laboratories, 100 bis 200 mesh) adsorbiert, die in eine 20×100 mm-Säule eingefüllt und mit der Puffer A ins Gleichgewicht gesetzt worden ist. Nach dem Waschen mit Puffer A wird der adsorbierte Teil mit Puffer A, der KCl enthält (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 1,0 M) eluiert. Die Aktivität dieses Enzyms wird in Fraktionen von 0,44 bis 0,66 M der KCl-Konzentration ermittelt.

Diese aktiven Fraktionen werden vereinigt, die vereinigte Lösung wird über Nacht gegen eine Pufferlösung B (20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH: 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glyzerin) dialysiert und das Dialysat an Heparin-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, CL-6B) eingepackt in eine 10×130 mm-Säule und ins Gleichgewicht gesetzt mit Puffer B, adsorbiert. Nach einem Waschen mit Puffer B wird der adsorbierte Teil mit Puffer B, der KCl enthält (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 0,8 M) eluiert. Die Aktivität dieses Enzyms wird in Fraktionen von 0,20 bis 0,26 M der KCl- Konzentration ermittelt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und die vereinigte Lösung über Nacht gegen Puffer B dialysiert. Das Dialysat wird dann an Heparin-Sepharose (Pharmacia Fine Chemical, CL-6B), eingefüllt in eine 5×50 mm-Säule und ins Gleichgewicht gesetzt mit Puffer B, adsorbiert. Nach einem Waschen mit Puffer B wird der adsorbierte Teil mit Puffer B, der 0,5 M KCl enthält, eluiert, wobei eine Zubereitung dieses Enzyms erhalten wird.

Diese Zubereitung enthält weder eine nichtspezifische Nuklease noch eine Phosphatase.

Auf diese Weise werden 75 000 Einheiten dieses Enzyms aus 200 g der nassen Mikrobenzellen erhalten.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß die Erfindung eine vorteilhafte Methode zur Erzeugung einer Endonuklease mit der gleichen Grunderkennungssequenz und den gleichen Spaltungspositionen wie Sac II und Sst II in industriellem Maßstab ermöglicht.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung einer Restriktionsendonuklease, welche die nachfolgend angegebene Nukleotidsequenz an einer DNA-Kette zu erkennen und in spezifischer Weise die doppelstrangige Kette an den mit Pfeil markierten Positionen zu spalten vermag: (worin C für Cytidin und G für Guanosin stehen), durch Züchten eines Mikroorganismenstammes und Isolieren der Restriktionsendonuklease aus dem gezüchteten Mikrooganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismenstamm Gluconobactor albidus IFO 3251 oder Gluconobactor cerinus IFO 3262 züchtet.