DE3539521A1

DE3539521A1 - Verfahren zur herstellung einer restriktionsendonuklease

Info

Publication number: DE3539521A1
Application number: DE19853539521
Authority: DE
Inventors: Nobutsugu Teradocho Mukoo Hiraoka; Keiko Kyoto Kita; Hiroshi Ootsu Nakajima; Akira Uji Obayashi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1985-11-07
Publication date: 1986-05-15
Also published as: US4724209A; JPS61115490A; GB2166744B; GB8524739D0; GB2166744A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms. Insbesondere befaßt sie sich mit einem Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms, das durch Mikroorganismen gebildet wird, die zu dem Genus Halococcus gehören.

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, welche dazu in der Lage sind, eine spezifische Grundsequenz an einem Deoxyribonukleinsäure(DNA)-Molekül zu erkennen und die doppelstrangige DNA-Kette an spezifischen Stellen zu spalten. Als Ergebnis der neueren Fortschritte auf dem Gebiete de Molekulargenetik, der Biochemie sowie verwandter Wissenschaften steht es nunmehr fest, daß DNA der Träger für die genetische Information ist. Restrxktionsendonukleasen wurden in erheblichem Umfang für verschiedene Zwecke verwendet (Klärung von genetischen Krankheiten, Massenproduktion von genetischen Materialien auf der Basis von genetischem Engineering etc.) Ungefähr 100 Arten von Endonukleasen wurden bisher aus vielen Mikroorganismen isoliert und jede durch die spezifische Grundsequenz sowie durch das Spaltungsmuster identifiziert.

Von diesen ist Mbo I, hergestellt durch Moraxella bovis (ATCC 10900)/T(Nucleic Acids Res., Band 11, Seite 135 (1983) _y bekannt als Restriktionsendonuklease, welche die nachfolgend angegebene Grundsequenz erkennt und die DNA-Kette an den mit Pfeil markierten Positionen spaltet

5¹ ⁷G ATC 3'

3¹ CTA G„ 5¹

(worin A, C, G und T für Adenosin, Cytidin, Guanosin bzw. Thymidin stehen).
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Mbo I weist jedoch Probleme bezüglich seiner industriellen Anwendbarkeit auf. Erwähnt seien die geringe Produktionsausbeute aus Moraxella bovis sowie eine unvermeidbare Verunreinigung mit Mbo II.. 5

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur industriellen Produktion einer Restriktionsendonuklease mit der gleichen Erkennungsgrundsequenz und den gleichen Spaltungsstellen wie Mbo I. 10

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer Restriktionsendonuklease, welche die Grundsequenz, wie sie nachfolgend gezeigt wird, zu erkennen und in spezifischer Weise die DNA-Kette an den mit Pfeilen markierten Positionen zu spalten vermag. Dieses Verfahren besteht darin, einen Mikroorganismus, der zu dem Genus Halococcus gehört und dazu in der Lage ist, dieses Enzym zu erzeugen, zu züchten und das auf diese Weise gebildete Enzym aus der Kulturbrühe zu sammeln

5¹ ^ G ATC — 3¹

3¹ CTA G_A 5¹

(worin A, C, G und T für Adenosin, Cytidin, Guanosin bzw. Thymidin stehen).

Es wurde gefunden, daß ein Enzym mit der gleichen Erkennungsgrundsequenz und der gleichen Spaltungsstellen wie im Falle von Mbo I durch Mikroorganismen erzeugt werden kann, die zu dem Genus Halococcus gehören, und daß dieses Enzym leicht in reiner Form isoliert werden kann, da kein anderes Restriktionsenzym gebildet

—δ-Ι wird. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse basiert die Erfindung.

Jedes Spezies von Halococcus, die dazu in der Lage ist, dieses Enzym zu bilden kann für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden. Ein typisches Beispiel ist Halococcus acetoinfaciens IAM 12094, das beim Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, hinterlegt worden ist.

Zur Kultivierung dieser Mikroorganismen kann jedes Kulturmedium verwendet werden, falls es eine geeignete Kombination aus Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen sowie anderen Nährmitteln enthält, die durch den verwendeten Mikroorganismus assimilierbar sind. Der bevorzugte pH des Mediums liegt zwischen 4,5 und 8,0. Jede Schüttelkultur-, Rührkultur- und Belüftung skul türme thode kann verwendet werden, ein Züchten unter Belüftung und Rühren ist jedoch für eine Massenproduktion am bevorzugtesten. Das Züchten kann bei jeder Temperatur durchgeführt werden, welche eine Bildung dieses Enzyms ermöglicht, ein bevorzugter Bereich liegt jedoch zwischen 30 und 37°C. Die Züchtungszeit schwankt mit den anderen Bedingungen; das Züchten sollte so lange fortgesetzt werden, bis ein maximaler Ausstoß an dem Enzym erreicht worden ist.

Dieses Enzym wird prinzipiell im Inneren von Bakterienzellen angereichert, die aus der Kulturbrühe abgetrennt werden können, beispielsweise durch Zentrifugieren.

Dieses Enzym kann nach bekannten Methoden, wie sie im Zusammenhang mit Restriktionsendonukleasen angewendet werden, extrahiert und gereinigt werden. Die gesammelten Mikrobenzellen werden in einem geeigneten Puffer dispergiert und dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, um eine Extraktion der Endonuklease durch die

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Pufferlösung zu ermöglichen. Nach der Entfernung des Rückstands durch Ultrazentrifugieren wird Ammonium-Sulfat der überstehenden Lösung zum Aussalzen zugesetzt und der sich abscheidende Niederschlag wird in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst und gegen einen Puffer der gleichen Zusammensetzung dialysiert. Das Dialysat wird durch Ionenaustauscherchromatographie an Phosphorzellulose und DEAE-Zellulose und durch Affinitätschromatographie an Heparinsepharose gereinigt, wobei die erfindungsgemäße Endonuklease gewonnen wird.

Die Aktivität dieses Enzyms wird nach der nachfolgend beschriebenen Methode bestimmt. Eine Substratlösung der in der Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt

Tabelle 1
20

1OmM tris-HCl, pH 7,5

7mM MgCl₂

175mM NaCl

7mM 2-Mercaptoethanol

0,01% Rinderserumalbumin

1,0μg Dam~^-DNA

Diese Substratlösung (50 μΐ} wird auf 37⁰C vorerhitzt. Die zu testende erfindungsgemäße Endonuklease wird zugesetzt, um die enzymatisch^ Reaktion bei dieser Temperatur ablaufen zu lassen, worauf die Reaktion 60 Minuten später durch Zugabe einer Stopplösung (1 % SDS, 50 % Glyzerin, 0,02 % Bromphenol blau) abgestoppt wird. Die Reaktionsmischung wird auf ein 1 %-Agaroseplattengel aufgebracht und die Elektrophorese wird bei einer konstanten Spannung von 10 V/cm während 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die verwendete Pufferlö-

mm 7 _

sung besteht aus 90niM-tris--Boratpuffer (pH 8,3), der 2,5 QH EDTA enthält.

DNA-Banden können durch UV-Strahlung festgestellt werden, wenn 0,5 |ig/ml Ethidiumbromid zuvor dem Gel zugesetzt worden sind. Die Elektrophorese wird als beendet betrachtet, wenn die Zahl und die Intensität der Banden für die DNA-Fragmente sich nicht mehr verändern.

Die Enzymaktivität, welche eine vollständige Zersetzung von 1 ^g Dam /^_ -DNA nach 1-stündiger Reaktion bei 37°C gewährleistet, wird als eine Einheit definiert.

Das erfindungsgemäße Restriktionsenzym besitzt die nachfolgend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften .

(1) Aktion und Substratspezifität. Diese Endonuklease ist dazu in der Lage, die nachfolgend angegebene Grundfrequenz an einem doppelstrangigem DNA-Molekül zu erkennen und zu spalten, und ist ein Isoschizomeres der bekannten Endonukleasen Mbo I

5' VG ATC 3¹

3' CTA G_A 5¹

Die Erkennungssequenz dieses Enzyms wird unter Verwendung von Dam •x.-DNA (Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd.) und von Dam ^-DNA als Substrat bestimmt. Das erfindungs gemäße Enzym spaltet Dam /L-DNA unter Bildung von mehr als 50 Fragmenten, zeigt jedoch keine Wirkung auf Dam y^-DNA. Dies legt die Vermutung nahe, daß dieses Enzym an seiner Erkennungsstelle die Grundfrequenz besitzt, die durch Darmgene erkannt wird und eine Methylierung bei A erfährt. Um dies zu bestätigen ließ man die bekannte Restriktionsendonuklease Mbo I auf Dam >£-DNA einwirken. Die dabei erhaltenen Spaltungs-

-δ-muster waren mit denjenigen identisch, die mit dem erfindungsgemäßen Restriktionsenzym ermittelt wurden. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist zu schließen, daß die Nukleotidsequenz, welche die erfindungsgemäße Endonuklease zu erkennen vermag, 5'-GATC-3^! ist.

Die Spaltungspositionen durch die erfindungsgemäße Restriktionsendonuklease wird bestimmt durch Synthetisieren eines Oligonukleotids, welches die Erkennungssequenz des erfindungsgemäßen Enzyms trägt, wobei man das erfindungsgemäße Enzym darauf einwirken läßt und die Kettenlängen der erhaltenen Fragmente mißt. Die experimentelle Methode wird nachfolgend näher erläutert.

Das Oligonukleotid d (GCAGATCTGC), welches eine selbstkomplementäre Natur besitzt, wird durch die Festphasenmethode synthetisiert, die 5'-Enden werden mit Polynukleotidkinase und ffi- pJaTP markiert und die erhalten Oligonukleotidmoleküle werden zu einer doppenstrangigen DNA verschmolzen. Diese wird durch das erfindungsgemäße Enzym gespalten und die Reaktionsprodukte werden auf einer DEAE-Zellulose-Dünnschichtplatte (Masherey and Nagel Co.) analysiert, wobei markierte Flecken für Trinukleotid, 5'-GCA, erhalten werden.

Auf der Grundlage der vorstehend geschilderten Erkenntnisse kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäße Endonuklease die Grundsequenz wie nachfolgend gezeigt wird, erkennt und die DNA an den mit Pfeil markierten Positionen spaltet

5' GATC 3·

3 ' CTAG. 5 '

(2) Optimale Bedingungen für die enzymatische Aktivität

(a) Optimale Temperatur Die optimale Temperatur dieses Enzyms beträgt ungefähr 45⁰C (b) Optimaler pH Der optimale pH für dieses Enzym liegt zwischen 7,1 und 7,5.

(c) Salzkonzentration Die optimale enzymatische Aktivität wird bei NaCl- und KCl-Konzentrationen von bis zu 175 bis 300 mM entwicklet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. 15

Ein Kulturmedium (500 ml) mit der in der Tabelle 2 angebenen Zusammensetzung wird in jeweils 10 konische 1-Kolben eingefüllt und in der typischen Weise sterilisiert.

Tabelle 2	Bactotrypton	10	g
Hefeextrakt	5	g
Glucose	1	g
NaCl	30	g
entionisiertes Wasser	1	1
pH	7,	2

¹ -ίο-

Halococcus acetoinfaciens IAM 12094 wird in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie vorstehend beschrieben worden ist bei 35⁰C während 27 Stunden nach der Schüttelkulturmethode gezüchtet. 200 ml des auf diese Weise erhaltenen Inokulums werden auf das Kulturmedium in den konischen 2 1-Kolben aufgeimpft und das Züchten bei 35⁰C 13 Stunden unter Rühren durchgeführt. Die gewachsenen Zellen werden durch eine gekühlte Zentrifuge (Naßausbeute: ungefähr 15 g aus 5 1 Kulturmedium) gesammelt.

15g der Mikrobenzellen" werden in 200 ml eines extraktiven Puffers (2OmM tris-HCl, pH: 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol) dispergiert, die Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um die Zellwände aufzubrechen, und.die erhaltene Mischung wird während 1 Stunde bei 100000 χ g zur Entfernung des Rückstands zentrifugiert.

Zu dem auf diese Weise erhaltenen Enzymextrakt wird Ammoniumsulfat bis zu einer 80 %igen Sättigung zugeführt. Der Niederschlag, der sich abscheidet wird durch Zentrifugieren gesammelt und in einer Pufferlösung A (1OmM Kaliumphosphatpuffer, pH: 7,5, 1OmM 2-Mercaptoethanol, 5 % Glyzerin) aufgelöst und die Lösung über Nacht gegen den Puffer A dialysiert.

Das Dialysat wird an Phosphorzellulose (Produkt der Whatman Co., P-11) adsorbiert, die in eine 20 χ 80 mm-Säule eingefüllt und mit dem Puffer A ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Säule wird mit dem Puffer A gewaschen und der adsorbierte Teil mit Puffer A eluiert, der KCl enthält (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 1,0M). Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wird in den Fraktionen der 0,05 bis 0,18M KCl-Konzentration festgestellt.

Diese aktiven Fraktionen werden vereinigt, die vereinigte Lösung wird über Nacht gegen den Puffer A dialysiert und das Dialysat wird an DEAE-Zellulose (Whatman, DE-52), welche in eine 12 χ 90 mm-Säule eingefüllt und mit dem Puffer A ins Gleichgewicht gesetzt worden ist, adsorbiert. Nach dem Waschen mit dem Puffer A wird der adsorbierte Teil mit dem Puffer A, der KCl enthält, eluiert (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 1,0M). Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wird in Fraktionen von 0,06 bis 0,14Μ KCl-Konzentration festgestellt.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und die vereinigte Lösung wird über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert und das Dialysat wird an Heparin/Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, CL-6B) eingefüllt in eine 8 χ 100 mm-Säule und ins Gleichgewicht gebracht mit dem Puffer A,adsorbiert. Nach einem Waschen mit dem Puffer A wird der adsorbierte Teil mit dem Puffer A, der KCl enthält, eluiert (linearer Konzentrationsgradient von 0 bis 1,5M). Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wird in den Fraktionen der 0,25 bis 0,3 5M KCl-Konzentration festgestellt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und die vereinigte Lösung gegen einen Puffer dialysiert, der 0,1 M KCl und 50 % Glycerin enthält, wobei eine Zubereitung des erfindungsgemäßen Enzyms erhalten wird. Diese Zubereitung enthält weder nichtspezifische Nuklease noch Phosphatase.
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Auf diese Weise werden 3000 Einheiten dieses Enzyms aus 15 g nasser Mikrobenzellen erhalten.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß durch die Erfindung ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung einer Endonuklease in industriellem Maßstabe ge-

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schaffen wird, welche die gleiche Erkennungssequenz und die gleichen Spaltungspositionen wie Mbo I besitzt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Restriktionsendonuklease

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung einer Restriktionsendonuklease, welche die nachfolgend angegebene Nukletidsequenz an einer DNA-Kette und in spezifischer Weise die doppelstrangige Kette an den mit Pfeil markierten Positionen zu spalten vermag, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der zu dem Genus Halococcus gehört und die erwähnte Restriktionsendonuklease zu erzeugen vermag, gezüchtet wird und das auf diese Weise gebildete Enzym aus der Kulturbrühe gewonnen wird

D-8000 München 2

Isarlorplat7. β

POB 26 02 47
D-8000 München 26

Kabel: Telefon Telecopier Infotec 6400 B Telex

Muebopat 089/221483-7 GII + III (089)2296 43 5-24285

5¹ ^G ATC

3» CTA G_A 5'

5 *

(worin A, C, G und T für Adenosin, Cytidin, Guanosin bzw. Thymidin stehen).