DE3401617A1

DE3401617A1 - Restriktionsendonuklease mae i, ihre gewinnung und verwendung

Info

Publication number: DE3401617A1
Application number: DE19843401617
Authority: DE
Inventors: Rüdiger Prof. Dr.rer.nat. 8401 Niedergebraching Schmitt; Karl O. Prof. Dr.rer.nat. 8400 Regensburg Stetter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1984-01-18
Filing date: 1984-01-18
Publication date: 1985-07-18
Also published as: US4693978A; DE3401617C2

Description

Patentanwälte

DiPL.-lNii.ii. We^käan*m_>Oi?l--Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.¥eickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing. H. LisKA , Dipl.-Phys. Dr. J. Prechtel

3AO1617

HVa

interne Nummer 2600

8000 MÜNCHEN 86 POSTFACH 860 820

M O M LSTR ASS E 22

TELEFON (0 89) 980352 TELEX 522621

TELEGRAMM PATENTWEICKMANN MÖNCHEN

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH Sandhofer Straße 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof

Restrxktxonsendonuklease Mae I, ihre Gewinnung und

Verwendung

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die neue Typ II-Restriktionsendonuklease Mae I, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung.

Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxiribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang eine. Typ II-Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.

Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ II-Restriktionsendonukleasen, die für DNA-Sequenzen spezifisch sind, die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist durch die palindr.ome Erkennungssequenz

5'	N	C	T	A	G	N	5¹
3¹	N	G	A	T	C	N

und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle

Die erfindungsgemäße neue Typ II-Restriktionsendonuklease, die im folgenden als Mae I bezeichnet wird, besitzt ein Temperaturoptimum zwischen 45 und 48⁰C und ein pH-Optimum bei 8,0/45⁰C in Tris/HCl-Puffer. Weitere optimale

2+ Reaktionsparameter sind 250 mM NaCl, 12 bis 18 mM Mg , 6 bis 12 mM 2-Merkaptoethanol. Die Anwesenheit von Mg ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.

Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des Doppelstrangs die identische Sequenz in gegenläufiger Richtung aufweist.

Die Erkennungssequenz und Schnittstelle des Enzyms läßt sich wie folgt feststellen: das Plasmid pBR 322 wird mit Hinf I vollständig verdaut. Die Hinf I Fragmente B und C (517 bp bzw. 506 bp) werden isoliert, ihre 3'-Enden mit alpha-Γ³ ²P/-ATP und Klenow-Polymerase markiert und anschließend mit Alu I gespalten. Aus den hierbei entstehenden markierten Fragmenten wird das 330 bp-Fragment (pBR 322, Position 3036 bis 3366, Länge des Fragments einschließlich Einzelstrang-Enden) isoliert und sequenziert.

Ein Aliquot des 330 bp-Fragmentes wird mit dem erfindungsgemäßen Enzym gespalten, wobei sich die Schnittposition 3223 ergibt.

Die Länge des Hinf I/Mae I-Fragments wird in Sequenzgelen bestimmt. Dabei läuft das Hinf I/Mae I-Fragment im Gel wie das "C" der Sequenzleiter in der Erkennungssequenz 5'-CTAG-3'. Es endet deshalb mit dem Nukleotid T der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Mae I ist also zwischen dem Nucleotid C und T.

Erfindungsgemäß wird die neue Endonuklease Mae I gewonnen, indem man Methanococcus aeolicus DSM 2835 züchtet und.das Enzym aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung können die üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet werden, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz nachgewiesen werden kann. Als Substrat eignet sich beispielsweise pBR 322-DNÄ. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.

Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Mikroorganismus wächst anaerob in Medium III (Microbiol. Reviews 43_, 260-296 (1979)) auf ^₂^^QO2 ^{oder auf Formiat}· ^Er bildet reguläre bis irreguläre Coccen von etwa 2 um Durchmesser, einzeln und zu zweit. Auf Agar werden runde konvexe hellockerfarbene Kolonien mit ca. 2 mm Durchmesser gebildet. Der Mikroorganismus ist Gramnegativ. Die Zellhülle besteht aus Proteinuntereinheiten. Wachstum ist zwischen 25 und 50⁰C mit Optimum bei 45⁰C (2 Stunden Verdoppelungszeit) gegeben. Wachstum tritt auf in Gegenwart von 1,5 bis 5 %, optimal 4 % NaCl. Die DNA- Basenzusammensetzung ist 28,6 % G+C. Der Mikroorganismus unterscheidet sich daher von bekannten Methanococcen durch einen etwas niedrigeren GC-Gehalt der DNA, durch die optimale Wachstumstemperatur von 45⁰C, durch die deutlich größeren Zellen und durch das Vorhandensein neuer Restriktionsenzyme.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der Extrakt wird mit Polyethylenimin bis auf eine Konzen-

tration von 0,65% versetzt, der Niederschlag wird abgetrennt und aus dem überstand wird die bis 60% Ammoniumsulfatsattigung ausfallende Fraktion gewonnen.

Für den Aufschluß eigenen sich die üblichen mechanischen und chemischen Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion, Ultraschall oder enzymatische Verdauung.

Die Feinreinigung der das neue Enzym enthaltenden Ammonsulfatfraktion kann zweckmäßig durch Molekularsiebfraktionierung, Chromatographie über Anionenaustauscher und über Kationenaustauscher sowie abschließender Affinitätschromatographie erfolgen. Als Molekularsiebmaterial hat sich das unter der Handelsbezeichnung Ultrogel ACA 34 handelsübliche Produkt, ein Acrylamid/Agarose Heteropolymerisat aus 3 % Acrylamid und 4 % Agarose, bewährt. Als Anionenaustauscher eignen sich mit Diethylaminoethy!gruppen modifizierte Trägermaterialien auf Basis Sepharose, Cellulose oder synthetischen Polymeren, z. B. das unter der Handelsbezeichnung DEAE-Sephacer^ vertriebene Produkt der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden.

Als Kationenaustauscher werden vorzugsweise Phosphatgruppen enthaltende Substanzen, vorzugsweise Kohlehydrate, beispielsweise Cellulosephosphat und dergleichen verwendet. Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Methanococcus aeolicus DSM 2835 wird in Minimalformiatmedium, welches unten näher beschrieben ist, bei 45°C 3 Tage anaerob wachsen gelassen und dann in stationärer Phase geerntet. 35 g so erhaltener Zellpaste werden in 70 ml Aufschlußpuffer (40 mM Tris/HCl, pH 8,0 / 4⁰C; 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); 7 mM 2-Merkaptoethanol und 0,2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)) suspendiert.

Dann werden die Zellen durch Hochdruckdispersion in einer vorgekühlten Druckzelle bei 1100 bar zweimal aufgeschlossen.

Die Aufschlußsuspension wird mit 0,3 M NH-Cl versetzt. Anschließend werden 7 ml 10%iger Polyethyleniminlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,65 % (V/V) zugesetzt. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei 4⁰C wird der gebildete Niederschlag 60 Minuten bei 27.300 g abzentrifugiert und verworfen. Der überstand wird mit festem (NH.)2^SO4 ki^{s au}f 60 % Sättigung versetzt. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird nach 16 Stunden bei 4⁰C 60 min bei 27.300 g abzentrifugiert.

Das Minimalmedium hat folgende Zusammensetzung:

	g/ltr.
KCl	0,32 g
MgCl₂x6H₂O	2,75 g
MgSO₄x7H₂O	3,45 g
NH₄Cl	0,25 g
CaCl₂x2H₂O	0,15 g
K₂HPO₄	0,15 g
NaCl	18 g

Mineralienelexier * Fe (NH₄)₂(SO₄)₂x7H₂O 10 ml 2 mg

NaHCO₃
(am Schluß zugeben) 5,5 g

Resazurin 0,l%ig Na-Formiat Na-WoIframat 1 ml 15 g 3,3 mg

lösen, 50 ml Reduktxonsmittel bestehend aus:

Na₂S

g/ltr. 12,5 g

durchblubbern lassen

1 η NaOH frisch 75 ml Resazurin 0,i%ig 1 ml

zugeben, pH-Wert mit Ameisensäure auf 6,9 stellen und auf 1 Liter auffüllen, N₂ durchblubbern lassen.

* Mineralienelixier:

Titriplex I HgSO₄x7H₂O

NaCl

FeSO₄x7H₂O CoSO₄ oder CoCl₂ CaCl₂x2H₂O ZnSO.

H₃BO₃

g/ltr. 1,5 g 3,0 g 0,5 g pH-Wert langsam mit 5 η KOH 1,0 g auf 6,5 einstellen 0,1 g 0,1 g 0,1 g 0,1 g 0,01 g 0,01 g 0,01 g 0,01 g

Π c i s ρ χ e L λ

Der nach Beispiel 1 erhaltene Ammoniumsulfatniederschlag wird mit TEMG-Puffer (40 mM Tris/HCl pH 8,0/4⁰C; 0,ImM EDTA; 7 mM 2-Mercaptoethanol; 10% V/V Glycerin) und 0,5mM NaCl aufgenommen und auf eine Ultrogel AcA 34-Molekularsiebsäule von 3x100 cm gegeben. Diese Säule wird mit TEMG-Puffer + 0,5 M NaCl eluiert und die Eluatfraktionen mit Mae I Aktivität werden vereint.

Die vereinten Eluatfraktionen werden an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten Anionenaustauschersäule (DEAE-Sephacel 2x10 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 2 Säulenvolumina TEMG-Puffer wird da,s Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten mit 0 bis 1 M NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen 0,1 bis 0,3 M NaCl. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten Kationenaustauschersäule (Cellulosephosphat P 11/1x10 cm) chromatographiert. Waschen und Elution erfolgt wie bei der Anionenaustauschersäule. Mae I eluiert zwischen 0,4 und 0,6 M NaCl. Die vereinigten enzymhaltigen Fraktionen werden wieder gegen TEMG-Puffer dialysiert und das Dialysat an einer mit TEMG-Puffer equilibrierte Affinitätschromatographiesäule (Heparin-Sepharose CL6B/lx5 cm) chromatographiert. Waschen und Eluieren erfolgt wiederum, wie bei der Anionenaustauschersäule beschrieben. Mae I eluiert zwischen 0,4 und 0,6 M NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0 bei 4°C, enthaltend 0,1 mM EDTA, 10 mM 2-Merkaptoethanol, 100 mM NaCl, 50 Vol% Glycerin, 0,01 Vol% Triton X lOfr-^ dialysiert und bei -2O⁰C aufbewahrt.

Aktivität etwa 10.000 U Mae I (Aktivitätsdefinition: U = 1 μ9 pBR 322-DNA/Stunde bei 45⁰C,vollständig gespalten).

Aktivitätsbestiiranung:

In eine Mischung aus 5 μΐ Inkubationspuffer enthaltend 0,03 M Tris HCl pH 8,0/45⁰C, 1,25 M NaCl, 0,07 M MgCl₃, 0,035 M 2-Merkaptoethanol und 0,05 Vol% Triton X 100 werden 14 μΐ H₃O und 5 μΐ pBR 322-DNA (4 oD/ml) sowie 1 μΐ Mae I Lösung (1 U/μΙ) gegeben. Die Lösung wird 1 Stunde bei 45⁰C gehalten, auf Eis abgekühlt und mit 5μ1 kalter Stoplösung, enthaltend 7 M Harnstoff, 20 Gew.-/V-% Saccharose, 0,06 M EDTA und 0,01 Gew.-/Vol-% Bromphenolblau versetzt. Dann wird auf l%igem Agarosegel 3 bis 4 Stunden bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die erhaltenen Banden werden gegenüber geeigneten DNA-Längenstandards identifiziert.

Claims

Patentansprüche

1. Restriktionsendonuklease, gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz

5' N C [tag N 3¹
3¹ N GA Tic N 5¹

f
und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.

2. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Temperaturoptimum zwischen 45 und 48°C und ein pH-Optimum bei 8,0/45⁰C in Tris/ HCl-Puffer.

3. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man Methanococcus aeolicus DSM 2835 züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt mit Polyethylenimin bis auf eine Konzentration von 0,65 % versetzt, Unlösliches abtrennt und die aus dem überstand bis 60% Ammoniumsulfatsättigung ausfallende Fraktion gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Feinreinigung die Ammoniumsulfatfraktion einer Molekularsiebfraktionierung, einer Chromatographie über schwach basischen Anionenaustauscher, einer Chromatographie über schwach sauren Kationenaustauscher und einer Affinitätschromatographie unterzieht.

6. Verfahren nach Anspruch 5_f dadurch gekennzeichnet, da* man zur Af f initätschroinatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.

7. Verwendung der Restriktionsendonukleas« nach Anspruch 1 oder 2 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz 5'-CTAG-3'.