DE2610958C3

DE2610958C3 - Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686

Info

Publication number: DE2610958C3
Application number: DE19762610958
Authority: DE
Inventors: Hubert Dr. Mayer; Horst Schuette
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1976-03-16
Filing date: 1976-03-16
Publication date: 1978-12-14
Also published as: DE2610958A1; DE2610958B2

Description

Die Restriktionsendonuklease Eco Rl, gewonnen aus Escherichia coli, hat große Bedeutung in der DNA-Analyse (DNA=Desoxyribonukleinsäure) erlangt, da sie eine hohe Substratspezifität aufweist Die spezifische Doppelstrang-Erkennungsstelle an der DNA besitzt dabei folgende Sequenz:

5'- -A/T—G—A—A—T—T—C—A/T- -3'
3'- -T/A—C—T—T—A—A—G—T/A- -5'

Der Pfeil bedeutet die Spaltstelle. Diese zeichnet sich auch dadurch aus, daß sie überlappende Einzelstrangenden erzeugt DNA-Fragmente, die durch Eco RI gespalten werden, lassen sich an ihren Enden reassoziieren und mit Polynucleotidligase verknüpfen. Diese Arbeitsweise gestatte·, DNA-Bruchstücke prokaryotischen und eukaryotischen Ursprungs an replizierfähige DNA, wie Plasmid-DNA oder Phagen-DNA, anzuhängen. Die in vitro rekombinierten DNA-Fragmente können durch Transformation bzw. Transfektion in Bakterienzellen übertragen und vermehrt werden. Es kann somit die Aufgabe gelöst werden, neue genetische Information in Bakterien einzuschleusen. Durch gezielte Auswahl der einzubringenden DNA können mit diesem Verfahren Bakterien genetisch so verändert werden, daß sie wichtige Naturstoffe produzieren.

Es ist aus der Zeitschrift Nature 214 (1967), Seiten - 887 bekannt, daß der Antibiotika-Resistenzfaktor Rl, ein fi ⁺-Faktor, in Escherichia-coli-Resistenzen gegen Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid kodiert und weiter ist aus der Zeitschrift J. Bacteriol. 112, (1972), Seiten 1275-1279 bekannt, daß er die Synthese der Restriktionsendonuklease Eco RI determiniert

Es ist weiter allgemein eine Deletionsmutante dieses RI-Faktors bekannt, der nur noch Resistenz gegen Kanamycin trägt Dieser heißt Rldrd 16. Aus Methods in Melecular Biology, New York, Marcel-Dekker, Inc, V. 7 (1974), Seiten 67 -105, ist ein Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease Eco RI bekannt, in welchem zu ihrer Gewinnung die Zellsubstanz zerstört wird und zu ihrer ersten Anreicherung in mehrstufigen

Fällungsschritten gearbeitet wird. Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet dagegen

den Vorteil, daß zur Gewinnung von Eco RI ein Mikroorganismus, der keine Antibiotika-Resistenz trägt, benutzt wird, außerdem die Zellsubstanz nicht zerstört wird und danach zu ihrer ersten Anreicherung ein einstufiger Fällungsschrift mit Cethyltrimethylammoniumbromid durchgeführt wird.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease Eco RI aus dem Mikroorganismus Escherichia coli SB 5, mit der DSM-Nummer 686, der keine Antibiotika-Resistenz, jedoch

Eco-RI-Aktivität besitzt, gefunden.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert
Die Herstellung des Escherichia coli SB 5, der die DSM-Nummer 686 erhalten hat wurde wie folgt durchgeführt:

b5 Der Faktor Rldrd 16, der Resistenz gegen Kanamycin trägt, wurde in einen Endonuklease I — negativen Stamm Escherichia coli 1100 übertragen. Durch Mutation mit N-Nitroso-N-methyl-N'-Nitroguanidin

(NNMG) wurden Antibiotika-resistenzfreie Kolonien erhalten, Rldrd 16 mut 1 genannt

Aus dem Stamm RY13, bekannt nach Methods in Molecular Biology, La, Seite5, Absatz2, wurde der Faktor der Eco RI determiniert, isoliert und in den Stamm Escherichia coli 1100 Rldrd 16 mut I übertragen. Es wurden weiter Kolonien isoliert, welche keine Antibiotika Resistenz tragen, jedoch Eco RI produzieren. Der im Verfahren der Erfindung verwendete Mikroorganismus Escherichia coli SB 5, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen mit der DSM-Nummer 686 hinterlegt Der Mikroorganismus zeigt Eigenschaften, wie für Escherichia coli K 12-Stämme in Bergeys Manual Determinative Bacteriology, 8-th Edition beschrieben.

Der Mikroorganismus ist sensitiv gegen Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid, determiniert jedoch die Restriktionsendonuklease Eco RL

Das Verfahren der Erfindung wird beispielsweise wie folgt erläutert: Der Mikroorganismus wurde in 300 ml Medium bei 37"C unter Schütteln etwa 6 h vorgezogen. Ein 20-1-Fermenter, 30 min bei 121"C sterilisiert, wurde mit der Vorkultur angeimpft Die Kultur wurde bei 37°C, einer Belüftung von 1000 Nl und einer Drehzahl von 600UpM eines Umwurf-Rührsystems 5-6 h wachsen gelassen. Die 201 Vorkultur wurde anschließend in einen 2001 Fermenter 30 min bei 121° C sterilisiert, steril übergepumpt und bei pH 6,8—7 stabilisiert durch Zutitrieren von 4125%iger NH₄Cl-Losung. Pausenzeit 20 see, Dosagenzeit 2 see, Temperatur 37⁰C, Belüftung 1100 NL Drehzahl 900 UpM, Anfangs-OD578 mn =1,250 (OD=optische Dichte). Nach 8,5 h Wachstumszeit wurde bei einer OD_{578 nm}=22,000 (nm=Nanometer) der Fermentationsprozeß abgebrochen. Nach Abkühlen auf etwa 20° C wurde abzentrifugiert Gesamtfeuchtmasse der Bakterien 7550 g mit ungefähr 80% Wassergehalt

Die Zellen wurden in aliquoten Teilen von 1000 g bei - 20° C eingefroren. Bei der Isolierung des Eco RI durch mechanisches Ablösen in kleinen Mengen wurde 0,5 g Zeilfeuchtmasse, frisch oder nach Einfrieren aufgetaut, mit 3 ml PEM-Pufferlösung (10 KH₂PO₄-K₂HPO₄; pH 7,0; 0,7 mM 2-Mercaptoäthanol und 1 mM EDTA), sowie mit 0,1 m NaCl und zusätzlich mit 0,1 mM PMSF (PMSF= Phenylmethansulfonylfluorid) und mit 0,2% eines nichtionischen Detergenzes versetzt, danach in einem Homogenisator (Typ nach Potter-Elvehjen) 2 · 2,5 min unter Eiskühlung bei 2000 UpM gerührt Nach Zentrifugieren in einer Zentrifuge, Typ »JA 10« bei 10.000 UpM 2°C, 1 h, wurde im Überstand die Eco-RI-Aktivität geprüft

In mittelgroßen Mengen wurden bis 500 g Zellfeuchtmasse frisch oder nach Einfrieren aufgetaut, mit 500 ml PEM-Pufferlösung, sowie mit 0,2 m NaCl und zusätzlich mit 0,1 mM PMSF und mit 0,2% eines nichtionischen Detergenzes versetzt Nach mehrmaligem Durchlauf im Homogenisator (beschrieben in Biochemistry, 5 V, Nr. 9 [19661 Seiten 2932-2938) unter Eiskühlung wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben, abzentrifugiert und im Überstand die Eco-RI-Aktivität bestimmt. In großen Mengen über 500 g Zeilfeuchtmasse, frisch oder nach Einfrieren aufgetaut, wurde mit dem entsprechenden Volumen der gleichen PEM-Pufferlösung und den weiteren Reagentien wie vorstehend fa5 beschrieben versetzt und die Eco-RI-Aktivität mit mechanisch bewegten Glasperlen in einem Mahlbehälter abgelöst.

Mahlbehälter-Größe: 0,61 für kontinuierlichen

Betrieb

Glasperlen-Größe: Durchmesser 1 —1,5 mm, bleifrei
Mahlkörper-Menge: 520 ml
Rührwellen-Drehzahl: 2000 Upm
Mantel: Glas, beifrei
Scheibenwerkstoff: Rostfreier Stahl
Durchflußmenge/h: 5 - 7 l/h
Durchlaufet

Reibspalt-Breite: 0,2 -03 mm
Kühlmantel-Temperatur: - 4° C bis 8° C

Es wurde danach zentrifugiert in der gleichen Zentrifuge wie vorstehend beschrieben, Typ »Ja 10«, bei 10 000 UpM, 2°C, 1 h. Im Überstand wurde dann die Eco-RI-Aktivität bestimmt

Zum klaren Überstand wurde Phosphocellulose gerührt, welche mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M NaCl vorher gewaschen (äquilibriert) wurde. Die Zellulose wurde auf einer Nutsche abgesaugt und mit der PEM-Pufferlösung nachgewaschen. Es wurde dann Eco RI mit der PEM-Pufferlösung und 1 M NaCl eluiert Das Eluat wurde mit Menbranschläuchen konzentriert und gegen PEM-Pufferlösung in 0,1 M NaCl dialysiert Die Eco-RI-Aktivität wurde bestimmt

Das Dialysat wurde auf eine Säule von Phosphocellulose aufgepumpt, die mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M NaCl gewaschen und mit einem linearen Gradienten 03-03 M NaCl eluiert wurde. Die Eco-RI-Aktivität eluierte zwischen 0,45—0,8 M NaCl. Eine Hydroxylapatit-Säule wurde mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M NaCl gewaschen (äquilibriert). Nach Auftrag der aktiven Fraktionen wurde mit der PEM-Pufferlösung gewaschen und mit einem linearen Gradienten 0,01-0,5M KPO₄, pH 7, eluiert. Die gewonnene Restriktionsendonuklease Eco RI ist hochaktiv und frei von unspezifischen, DNA- spaltenden Enzym-Aktivitäten. Die Eco-RI-Aktivität kann im Kühlschrank bei 4°C unter Eiskühlung oder mit Zusatz von 50Vol-% Glycerin aufbewahrt werden; diese kann auch mit 50 Vol-% Glycerin-Zusatz bei -20° C stabil aufbewahrt werden.

Nach H.R Christen, Grundlagen der allgemeinen und anorganischen Chemie, Verlag Sauerländer Aarau, Salle Verlag, Frankfurt/Main, 1969, 2. Auflage, Seite 185, ist der Begriff »Molarität« wie folgt definiert: »Die Molarität einer Lösung ist die Anzahl Mole des gelösten Stoffes in 1 Liter Lösung. Die Molarität — abgekürzt mit m — ist die am häufigsten verwendete Konzentrationsangabe.«

Nach European Journal of Biochemystry, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, (1977) wird in der biochemischen Fachliteratur für die Molarität einer Lösung (Mole pro Liter) »M« oder »mM« (Millimole pro Liter) verwendet. Die Anmelderin versteht unter »M« bzw. »mM« diese gebräuchliche Definition.

Mit der Ablösestufe wurde eine etwa 80%ige Gesamt-Ausbeute an Eco-RI-Aktivität erreicht Es besteht der technische Vorteil für das Verfahren der Erfindung, daß eine hohe spezifische Eco-RI-Aktivität erreicht wird. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die unzerstörte Zellmasse einer Verwendung zugeführt werden kann, wie für die Gewinnung von intrazellulären Substanzen. Das Verfahren der Erfindung bietet weiter den technischen Vorteil, daß in dem einstufigen Fällungsschritt der Zugabe von Cethyltrimethylammoniumbromid-Lösung bis 1 Vol-% Endkonzentration ein Niederschlag mit den störenden Nebenaktivitäten

I 5 6

B entsteht, der durch niedrigstufige Zentrifugation abge- in Molecular Biology, Lc, Seite 2, Absatz 1, auf ihre

§? trennt wird und dadurch in der Lösung (Oberstand) eine Enzym-Aktivität geprüft Es ergaben sich folgende

ν weitere Anreicherung der Eco-RI-Aktivität erreicht Werte: Col EI-DNA wurde einmal, A-DNA sechsmal

I wird. gespalten. Eine modifizierte Aktivität von Eco RI nach

§ Die nach dem Verfahren der Erfindung erzeugte 5 Proc. NatL Acad. ScL (PNAS), USA, 72 (1975), Seiten

i Restriktionsendonuklease Eco RI wurde nach Methods 3310—3314 wurde ebenfalls gefunden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease Eco R] aus dem Mikroorganismus Escherichia coli SB 5 mil der DSM-Nummer 686, der kerne Antibiotika-Resistenz, jedoch Eco-RI-Aktivität besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß unter aeroben Bedingungen Escherichia coli SB 5 mit der DSM-Nummer 686 in einem wäßrigen ι ο Nährmedium aus Proteinen, anorganischen Salzen, Glycerin als C- und Energie-Quelle, in welches Luft oder Or angereicherte Luft bei einer Reaktionstemperatur von 30° —40°C bis zur logarithmischen Phase zugeführt und eine Submerskultur erzeugt is wird, danach aus dem Reaktionssystem die Zellmasse abzentrifugiert und der lösliche Überstand abgeführt wird, danach die Zellmasse in einer wäßrigen PEM-Pufferlösung (10 mM

KH₂PO₄-K₂HPO₄; pH 7,0; 0,7 mM 2-Mercapto- >o äthanol und 1 mM EDTA) mit etwa bis 0,1 M NaCl und gegebenenfalls etwa 0,2%igem, nichtionischem Detergens bei 0—4° C suspendiert wird, danach eine Teilmenge Enzym-Aktivität durch Rühren mit Scherkräften von der im wesentlichen unzerstörten Zellmasse abgelöst, durch Zentrifugieren die Zellmasse abgetrennt und ausgeführt wird, die Lösung unter Rühren mit Cetyltrimethylammoniumbromid bis zu einer 1 vol.-%tigen Endkonzentration zur Beseitigung von störenden Nebenaktivitäten ver- jo setzt, der entstehende Niederschlag abgetrennt und ausgeführt wird, zum Überstand Phosphocellulose eingerührt, mit 0,1 M NaCl-haltigem Puffer gewaschen und danach mit 1 M NaCl-haltigem Puffer durch Waschen eluiert wird, danach gegen 0,1 M NaCl-haltigem Puffer zum Entfernen des überschüssigen NaCl dialysiert, danach die Lösung auf eine Phosphocellulose-Säule gepumpt, die Enzym-Aktivität an die Säule gebunden, die Lösung ausgeführt wird, danach die Enzym-Aktivität mit einem linearen 0,3 -0,8 M NaCl-Gradienten eluiert, in Teilfraktionen gesammelt, die ausgetesteten aktiven Fraktionen, welche Eco-RI-Aktivität enthalten, auf eine Hydroxylapatit-Säule aufgepumpt, nach Waschen mit 0,1 M NaCl-Puffer die gebundene Aktivität mit einem linearen 0,01 -0,5 M Phosphat-Gradienten in Teilfraktionen eluiert wird und die ausgetesteten aktiven Fraktionen über einen Membranschlauch zu einer konzentrierten Restriktionsendonuklease Eco RI von hoher Reinheit eingeengt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ablösung der Eco-RI-Enzymaktivität von den erhaltenen Zellen an der Außenmembran der Zellen gebundene Proteine bei Mengen von etwa 0,5 — 500 g Zeilfeuchtmasse durch Homogenisieren und bei Mengen über 500 g Zellfeuchtmasse mit mechanisch bewegten harten Kügelchen aus Glas, Keramik oder Kunststoff von der im wesentlichen unzerstörten Zellmasse abgelöst werden.