DE2610958B2 - Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686 - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686Info
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Description
Die Restriktionsendonuklease Eco RI, gewonnen aus Escherichia coli, hat große Bedeutung in der DNA-Analyse
(DNA = Desoxyribonukleinsäure) erlangt, da sie eine hohe Substratspezifität aufweist Die spezifische
Doppelstrang-Erkennungsstelle an der DNA besitzt -to
dabei folgende Sequenz:
5'- -A/T—G—A—A—T—T—C—A/T- -3'
3'- -T/A—C—T—T—A—A—G—T/A- -5'
3'- -T/A—C—T—T—A—A—G—T/A- -5'
4r>
Der Pfeil bedeutet die Spaltstelle. Diese zeichnet sich auch dadurch aus, daß sie überlappende Einzelstrangen- ■>
<) den erzeugt DNA-Fragmente, die durch Eco RI gespalten werden, lassen sich an ihren Enden reassoziieren
und mit Polynucleotidligase verknüpfen. Diese Arbeitsweise gestattet, DNA-Bruchstücke prokaryotischen
und eukaryotischen Ursprungs an replizier- rr>
fähige DNA, wie Plasmid-DNA oder Phagen-DNA, anzuhängen. Die in vitro rekombinierten DNA-Fragmente
können durch Transformation bzw. Transfektion in Bakterienzellen übertragen und vermehrt werden. Es
kann somit die Aufgabe gelöst werden, neue genetische m> Information in Bakterien einzuschleusen. Durch gezielte
Auswahl der einzubringenden DNA können mit diesem Verfahren Bakterien genetisch so verändert werden,
daß sie wichtige Naturstoffe produzieren.
Es ist aus der Zeitschrift Nature 214 (1967), Seiten tv'. — 887 bekannt, daß der Antibiotika-Resistenzfaktor
RI, ein fi+-Faktor, in Escherichia-coli-Resistenzen
gegen Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid kodiert und weiter ist aus der
Zeitschrift J. Bacteriol. 112, (1972), Seiten 1275-1279 bekannt, daß er die Synthese der Restriktionsendonuklease
Eco RI determiniert
Es ist weiter allgemein eine Deletionsmutante dieses RI-Faktors bekannt, der nur noch Resistenz gegen
Kanamycin trägt. Dieser heißt Rldrri 16. Aus Methods in
Melecular Biology, New York, Marcel-Dekker, Inc, V. 7
(1974), Seiten 67 -105, ist ein Verfahren zur Herstellung
der Restriktionsendonuklease Eco RI bekannt, in welchem zu ihrer Gewinnung die Zellsubstanz zerstört
wird und zu ihrer ersten Anreicherung in mehrstufigen Fällungsschritten gearbeitet wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet dagegen den Vorteil, daß zur Gewinnung von Eco RI ein
Mikroorganismus, der keine Antibiotika-Resistenz trägt, benutzt wird, außerdem die Zellsubstanz nicht
zerstört wird und danach zu ihrer ersten Anreicherung ein einstufiger Fällungsschrift mit Cethyltrimethylammoniumbromid
durchgeführt wird.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease Eco RI aus dem Mikroorganismus
Escherichia coli SB 5, mit der DSM-Nummer 686, der keine Antibiotika-Resistenz, jedoch
Eco-RI-Aktivität besitzt, gefunden.
Die Herstellung des Escherichia coli SB 5, der die DSM-Nummer 686 erhalten hat wurde wie folgt
durchgeführt:
Der Faktor Rldrd 16, der Resistenz gegen Kanamycin
trägt, wurde in einen Endonuklease I — negativen Stamm Escherichia coli 1100 übertragen. Durch
Mutation mit N-Nitroso-N-methyl-N'-Nitroguanidin
(NNMG) wurden Antibiotika-resistenzfreie Kolonien erhalten, R'drd 16 mut 1 genannt
Aus dem Stamm RY13, bekannt nach Methods in
Molecular Biology, 1. c, Seite 5, Absatz 2, wurde der
Faktor der Eco RI determiniert, isoliert und in den Stamm Escherichia coli 1100 Rldrd 16 mut 1 abertragen.
Es wurden weiter Kolonien isoliert, welche keine Antibiotika Resistenz tragen, jedoch Eco RI produzieren.
Der im Verfahren der Erfindung verwendete Mikroorganismus Escherichia coli SB 5, wurde bei der in
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen mit der DSM-Nummer 686 hinterlegt Der
Mikroorganismus zeigt Eigenschaften, wie für Escherichia coli K 12-Stämme in Bergeys Manual Determinative
Bacteriology, 8-th Edition beschrieben. ι ■>
Der Mikroorganismus ist sensitiv gegen Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid,
determiniert jedoch die Restriktionsendonuklease Eco RI.
Das Verfahren der Erfindung wird beispielsweise wie folgt erläutert: Der Mikroorganismus wurde in 300 ml
Medium bei 37° C unter Schütteln etwa 6 h vorgezogen. Ein 20-1-Fermenter, 30 min bei 121°C sterilisiert wurde
mit der Vorkultur angeimpft Die Kultur wurde bei 37°C, einer Belüftung von 1000 Nl und einer Drehzahl >>
von 600UpM eines Umwurf-Rührsystems 5-6 h
wachsen gelassen. Die 201 Vorkultur wurde anschließend
in einen 2001 Fermenter 30 min bei 121°C sterilisiert steril übergepumpt und bei pH 6,8-7
stabilisiert durch Zutitrieren von 4125%iger NH4Cl-Losung.
Pausenzeit 20 see, Dosagenzeit 2 see, Temperatur
37°C, Belüftung 1100 Nl, Drehzahl 900 UpM, Anfangs-OD578
„m =1,250 (OD=optische Dichte). Nach 8,5 h
Wachstumszeit wurde bei einer OD5781™=22,000
(nm = Nanometer) der Fermentationsprozeß abgebro- jj
chen. Nach Abkühlen auf etwa 200C wurde abzentrifugiert
Gesamtfeuchtmasse der Bakterien 7550 g mit ungefähr 80% Wassergehalt
Die Zellen wurden in aliquoten Teilen von 1000 g bei - 20° C eingefroren. Bei der Isolierung des Eco RI durch
mechanisches Ablösen in kleinen Mengen wurde 0,5 g Zeilfeuchtmasse, frisch oder nach Einfrieren aufgetaut
mit 3 ml PEM-Pufferlösung (10 KH2PO4-K2HPO4;
pH 7,0; 0,7 mM 2-Mercaptoäthanol und 1 mM
EDTA), sowie mit 0,1 m NaCl und zusätzlich mit 0,1 mM v,
PMSF (PMSF=Phenylmethansulfonylfluorid) und mit 0,2% eines nichtionischen Detergenzes versetzt danach
in einem Homogenisator (Typ nach Potter-Elvehjen) 2 · 2,5 min unter Eiskühlung bei 2000 UpM gerührt
Nach Zentrifugieren in einer Zentrifuge, Typ »JA 10« r>o
bei 10.000UpM 2°C, lh, wurde im Überstand die Eco-RI-Aktivität geprüft
In mittelgroßen Mengen wurden bis 500 g Zellfeuchtrnasse frisch oder nach Einfrieren aufgetaut mit 500 ml
PEM-Pufferlösung, sowie mit 0,2 m NaCl und zusätzlich « mit 0,1 mM PMSF und mit 0,2% eines nichtionischen
Detergenzes versetzt Nach mehrmaligem Durchlauf im Homogenisator (beschrieben in Biochemistry, 5 V, Nr. 9
[1966], Seiten 2932-2938) unter Eiskühlung wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben, abzentrifu- w>
giert und im Überstand die Eco-RI-Aktivität bestimmt In großen Mengen über 500 g Zeilfeuchtmasse, frisch
oder nach Einfrieren aufgetaut wurde mit dem entsprechenden Volumen der gleichen PEM-Pufferlösung
und den weiteren Reagentien wie vorstehend tr. beschrieben versetzt und die Eco-RI-Aktivität mit
mechanisch bewegten Glasperlen in einem Mahlbehälter abgelöst.
Betrieb
Glasperlen-Größe: Durchmesser! —1,5 mm, bleifrei
Mahlkörper-Menge: 520 ml
Rührwellen-Drehzahl: 2000 Upm
Mantel: Glas, beifrei
Scheibenwerkstoff: Rostfreier Stahl
Durchflußmenge/h:5-7 l/h
Durchlaufet
Mahlkörper-Menge: 520 ml
Rührwellen-Drehzahl: 2000 Upm
Mantel: Glas, beifrei
Scheibenwerkstoff: Rostfreier Stahl
Durchflußmenge/h:5-7 l/h
Durchlaufet
Reibspalt-Breite: Oi-03 mm
Kühlmantel-Temperatur: - 4° C bis 8° C.
Kühlmantel-Temperatur: - 4° C bis 8° C.
Es wurde danach zentrifugiert in der gleichen Zentrifuge wie vorstehend beschrieben, Typ »Ja 10«, bei
10 000 UpM, 2°C, 1 h. Im Überstand wurde dann die
Eco-RI-Aktivität bestimmt
Zum klaren Überstand wurde Phosphocellulose gerührt welche mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M NaCl
vorher gewaschen (äquilibriert) wurde. Die Zellulose wurde auf einer Nutsche abgesaugt und mit der
PEM-Pufferlösung nachgewaschen. Es wurde dann Eco RI mit der PEM-Pufferlösung und 1 M NaCl eluiert Das
Eluat wurde mit Menbranschläuchen konzentriert und gegen PEM-Pufferlösung in 0,1 M NaCl dialysiert Die
Eco-RI-Aktivität wurde bestimmt
Das Dialysat wurde auf eine Säule von Phosphocellulose aufgepumpt, die mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M
NaCl gewascher, und mit einem linearen Gradienten 03 -0,8 M NaCl eluiert wurde. Die Eco-RI-Aktivität
eluierte zwischen 0,45—0,8 M NaCL Eine Hydroxylapatit-SäuIe
wurde mit PEM-Pufferlösung und 0,1 M NaCI gewaschen (äquilibriert). Nach Auftrag der
aktiven Fraktionen wurde mit der PEM-Pufferlösung gewaschen und mit einem linearen Gradienten
0,01-03 M KPO4, pH 7, eluiert Die gewonnene
Restriktionsendonuklease Eco RI ist hochaktiv und frei von unspezifischen, DNA- spaltenden Enzym-Aktivitäten.
Die Eco-RI-Aktivität kann im Kühlschrank bei 4°C unter Eiskühlung oder mit Zusatz von 50 Vol-%
Glycerin aufbewahrt werden; diese kann auch mit 50 Vol-% Glycerin-Zusatz bei -200C stabil aufbewahrt
werden.
Nach H.R. Christen, Grundlagen der allgemeinen
und anorganischen Chemie, Verlag Sauerländer Aarau, SaIIe Verlag, Frankfurt/Main, 1969, 2. Auflage,
Seite 185, ist der Begriff »Molarität« wie folgt definiert: »Die Molarität einer Lösung ist die Anzahl Mole des
gelösten Stoffes in 1 Liter Lösung. Die Molarität — abgekürzt mit m — ist die am häufigsten verwendete
Konzentrationsangabe.«
Nach European Journal of Biocheniystry, Springer
Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, (1977) wird in der biochemischen Fachliteratur für die Molarität einer
Lösung (Mole pro Liter) »M« oder »mM« (Millimole pro Liter) verwendet Die Anmelderin versteht unter
»M« bzw. »mM« diese gebräuchliche Definition.
Mit der Ablösestufe wurde eine etwa 80%ige Gesamt-Ausbeute an Eco-RI-Aktivität erreicht Es
besteht der technische Vorteil für das Verfahren der Erfindung, daß eine hohe spezifische Eco-RI-Aktivität
erreicht wird. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die unzerstörte Zellmasse einer Verwendung zugeführt
werden kann, wie für die Gewinnung von intrazellulären Substanzen. Das Verfahren der Erfindung bietet weiter
den technischen Vorteil, daß in dem einstufigen Fällungsschritt der Zugabe von Cethyltrimethylammoniumbromid-Lösung
bis 1 Vol-% Endkonzentration ein Niederschlag mit den störenden Nebenaktivitäten
5 6
der durch niedrigstufige Zentnfugation abge- in Molecular Biology, Lc, Seite 2, Absatz 1, auf ihre
rd und dadurch in der Lösung (Überstand) eine Enzym-Aktivität geprüft Es ergaben sich folgende
Anreicherung der Eco-RI-Aktivität erreicht Werte: Col El-DNA wurde einmal, λ-DNA sechsmal
gespalten. Eine modifizierte Aktivität von Eco RI nach
ich dem Verfahren der Erfindung erzeugte 5 Proc. Natl. Acad. Sei. (PNAS), USA, 72 (1975), Selten
»nsendonuklease Eco RI wurde nach Methods 3310 — 3314 wurde ebenfalls gefunden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease Eco RI aus dem Mikroorganismus ■>
Escherichia coli SB 5 mit der DSM-Nummer 686, der keine Antibiotika-Resistenz, jedoch Eco-RI-Aktivität
besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß unter aeroben Bedingungen Escherichia coli SB 5
mit der DSM-Nummer 686 in einem wäßrigen ι ο Nährmedium aus Proteinen, anorganischen Salzen,
Glycerin als C- und Energie-Quelle, in weiches Luft oder O2- angereicherte Luft bei einer Reaktionstemperatur von 30° — 400C bis zur logarithmischen
Phase zugeführt und eine Submerskultur erzeugt r> wird, danach aus dem Reaktionssystem die Zellmasse
abzentrifugiert und der lösliche Überstand abgeführt wird, danach die Zellmasse in einer
wäßrigen PEM-Pufferlösung (10 mM
KH2PO* -K2HPO*; pH 7,0; 0,7 mM 2-Mercaptoäthanol
und 1 mM EDTA) mit etwa bis 0,1 M NaCl und gegebenenfalls etwa 0,2%igem, nichtionischem
Detergens bei 0—4° C suspendiert wird, danach eine
Teilmenge Enzym-Aktivität durch Rühren mit Scherkräften von der im wesentlichen unzerstörten r>
Zellmasse abgelöst, durch Zentrifugieren die Zellmasse
abgetrennt und ausgeführt wird, die Lösung unter Rühren mit Cetyltrimethylammoniumbromid
bis zu einer 1 vol.-%tigen Endkonzentration zur Beseitigung von störenden Nebenaktivitäten ver- so
setzt, der entstehende Niederschlag abgetrennt und ausgeführt wird, zum Überstand Phosphocellulose
eingerührt, mit 0,1 M NaCl-haltigem Puffer gewaschen
und danach mit 1 M NaCl-haltigem Puffer durch Waschen eluiert wird, danach gegen 0,1 M
NaCl-haltigem Puffer zum Entfernen des überschüssigen NaCl dialysiert, danach die Lösung auf eine
Phosphocellulose-Säule gepumpt, die Enzym-Aktivität
an die Säule gebunden, die Lösung ausgeführt wird, danach die Enzym-Aktivität mit einem linearen
0,3-0,8 M NaCl-Gradienten eluiert, in Teilfraktionen
gesammelt, die ausgetesteten aktiven Fraktionen, welche Eco-RI-Aktivität enthalten, auf eine
Hydroxylapatit-Säule aufgepumpt, nach Waschen
mit 0,1 M NaCl-Puffer die gebundene Aktivität mit
einem linearen 0,01-0,5 M Phosphat-Gradienten in Teilfraktionen eluiert wird und die ausgetesteten
aktiven Fraktionen über einen Membranschlauch zu einer konzentrierten Restriktionsendonuklease Eco
RI von hoher Reinheit eingeengt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ablösung der Eco-RI-Enzymaktivität
von den erhaltenen Zellen an der Außenmembran der Zellen gebundene Proteine bei Mengen von etwa 0,5-500 g Zeilfeuchtmasse durch
Homogenisieren und bei Mengen über 500 g Zeilfeuchtmasse mit mechanisch bewegten harten
Kügelchen aus Glas, Keramik oder Kunststoff von der im wesentlichen unzerstörten Zellmasse abgelöst
werden.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19762610958 DE2610958C3 (de) | 1976-03-16 | 1976-03-16 | Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19762610958 DE2610958C3 (de) | 1976-03-16 | 1976-03-16 | Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2610958A1 DE2610958A1 (de) | 1977-09-22 |
DE2610958B2 true DE2610958B2 (de) | 1978-04-27 |
DE2610958C3 DE2610958C3 (de) | 1978-12-14 |
Family
ID=5972569
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19762610958 Expired DE2610958C3 (de) | 1976-03-16 | 1976-03-16 | Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease ECO RI aus dem Mikroorganismus Escherichiacoli SB5 mit der DSM-Nummer 686 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2610958C3 (de) |
-
1976
- 1976-03-16 DE DE19762610958 patent/DE2610958C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2610958A1 (de) | 1977-09-22 |
DE2610958C3 (de) | 1978-12-14 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |