DE3782844T2 - Vektoren fuer die klonierung und expression heterologer gene in hefen und durch diese vektoren transformierte hefestaemme. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft einige Klonierungs- und Expressionsvektoren für heterologe Gene in Hefen sowie die von diesen Vektoren transformierten Hefestämme.
• Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren zur Transformation von Hefen, wobei in den Vektoren die gesamte Nucleotidsequenz des pKD1-Plasmides von Kluyveromyces drosophilarum oder eines Teiles davon vorliegt. Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere durch diese Vektoren transformierten Hefen der Gattung Kluyveromyces.
• Wie allgemein bekannt ist, war bislang die Transformation von Hefen wegen der geringen Verfügbarkeit der Hefeplasmide, die für die Konstruktion von Transformationsvektoren benötigt werden, auf bestimmte Arten beschrankt (Gunge, H., Ann. Rev. Microbiol. 37, 253-276 (1983); Toh-e, A., Tada, S. und Oshima, Y., J. Bacteriol. 151, 1380-1390 (1982); Toh-e, A., Araki, H., Utatsu, I., und Oshima, Y., J. Gen. Microbiol. 130, 2527-2534 (1984))
• Das aus Saccharomyces cerevisiae isolierte 2u-Plasmid war bislang das einzige Plasmid, das erfolgreich für die Transformation der S. cerevisiae angewendet wurde. Vektoren, die von dem 2u-Plasmid stammen bzw. abgeleitet sind, haben jedoch eine niedrige Transformationseffizienz und/oder eine eingeschränkte Fähigkeit gezeigt, in anderen Hefen als in Saccharomyces cerevisiae stabil zu replizieren.
• Demnach wurden ganz offensichtlich Plasmide für die Konstruktion von Vektoren benötigt, die zur Transformation anderer Hefen geeignet sind, insbesondere für industriell wichtige Hefen, einschließlich beispielsweise jener, die der Gattung Kluyveromyces angehören.
• Alle bisherigen Versuche, diesen Bedarf zu befriedigen, waren jedoch nicht sehr erfolgreich.
• Es wurden insbesondere zwei Vektoren für die Transformation von Kluyveromyces lactis verwendet: einer enthielt ein chromosomales DNA-Segment von K. lactis (Das, S. und Hollenberg, C.P., Current Genetics 6, 123-128 (1982)) und der andere stammte von dem linearen Plasmid pGK1, das ebenfalls aus K. lactis isoliert wurde (L. de Louvencourt, H. Fukuhara, H. Heslot, M. Wesolowski, Französische Patentanmeldung Nr. 8209564 der ELF Biorecherche; L. de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154, 737-742 (1982)).
• Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß, obwohl beide der zuvor erwähnten Vektoren Nucleotidsequenzen von K. lactis enthalten, die ihre Replikation in dieser Hefe erlauben, die Effizienz und/oder die Stabilität, der so erhaltenen transformierten Klone ist jedoch ziemlich gering.
• Demgemäß ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Klonierungs- und Expressionsvektoren für Hefen, insbesondere für die Gattung Kluyveromyces, die eine verbesserte Transformationseffizienz aufweisen und die eine höhere Stabilität in den transformierten Zellen zeigen.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, daß dieses Ziel erreicht werden kann, indem als ein wesentlicher Teil der Transformationsvektoren ein Plasmid verwendet wird, das in einem Stamm der Hefe Kluyveromyces drosophilarum im Laufe eines Forschungsprojektes über neue Plasmide entdeckt wurde, das von C. Falcone, L. Frontali und H. Fukuhara (den in der vorliegenden Patentanmeldung genannten Erfindern) durchgeführt wurde.
• Das betreffende Plasmid besteht aus einem zirkulären Duplex- DNA-Molekül eines Umfangs von 1,6 Mikron, das in dem UCD 51-130 Kluyveromyces drosophilarum-Stamm (U.C.D. Collection, University of California, Davis, CA 95616).
• Dieses Plasmid, das pKD1 genannt wird, liegt in den Zellen in hoher Kopienzahl (70-100 pro Zelle) vor und ist von der chromosomalen DNA mittels Standardverfahren auf einfache Weise abtrennbar.
• DNA-Hybridisierungsexperimente bestätigten den wesentlichen Unterschied in der Primärstruktur zwischen diesem Plasmid und dem 2u- und pGK1-Plasmid.
• Das Plasmid existiert innerhalb derselben Zelle in zwei austauschbaren molekularen Formen, die A und B genannt werden, die in gleichen Mengen vorliegen und die sich voneinander durch die Orientierung eines zentralen Segmentes von 2,15 Kilobasen unterscheiden, das in der hier beigefügten Fig. 1 zwischen zwei vertikalen, gestrichelten Linien enthalten ist. Fig. 1 zeigt die Lokalisierung der Stellen für zahlreiche Restriktionsenzyme (wobei sich die Lokalisierung auf die A- und B-Formen von pKD1 bezieht, wenn diese als lineare Moleküle gezeichnet werden), wobei diese Enzyme am linken Rand dieser Figur angegeben sind. Die in horizontaler Richtung angegebene Skala zeigt die Entfernung in Kilobasen (kb) zwischen diesen Stellen auf dem Plasmid. Innerhalb der Segmente angegebene Zahlen geben ihre jeweilige Länge in Basenpaaren an. Die Sternchen geben jene Fragmente an, deren Lokalisierung ungewiß ist.
• Die Sequenzanalyse zeigte in diesem Plasmid die Gegenwart eines DNA-Segmentes von 346 Basenpaaren, das in identischer Sequenz, jedoch in umgekehrter Orientierung, in einer Entfernung von 2136 Nucleotiden nochmals aufgefunden wurde.
• Diese umgekehrte und wiederholte Sequenz (TR-Sequenz) ist wahrscheinlich für den Mechanismus der gegenseitigen Umwandlung zwischen den A- und B-Formen von pKD1 wesentlich, in Analogie zu den Beobachtungen mit dem 2u-Plasmid von S.cerevisiae.
• Aus der Nucleotidsequenz des Plasmids pKD1 wurde das Vorliegen von drei möglichen Genen, die A, B und C genannt werden, abgeleitet (mit jeweiligen Längen von 1341, 1245 und 636 Nucleotiden). Diese Gene scheinen, aufgrund von Sequenzhomologien und vorläufigen Untersuchungen ihrer Funktionen, jeweils respektive zu den FLP-, Rep 1- und Rep 2-Genen analog zu sein, die in dem 2u-Plasmid vorliegen (Broach, J.R., Cell 28, 203-204 (1982)).
• Das pKD1-Plasmid kann vorteilhafterweise zur Konstruktion von Klonierungs- und Expressionsvektoren in Hefen verwendet werden, vor allem weil seine zirkuläre Form einfache Manipulationen erlaubt. Darüber hinaus enthält dieses Plasmid zahlreiche einzige bzw. spezifische Schnittstellen für Restriktionsenzyme wie EcoRI, ClaI und PstI und dieses Merkmal ist auch besonders vorteilhaft für die Insertion heterologer Gene und für die Konstruktion rekombinanter Vektoren.
• Das Vorhandensein von pKD1-Plasmid und von davon stammenden Vektoren in der Zelle in hoher Kopienzahl ist ein weiterer Vorteil, weil es eine Amplifikation der eingefügten heterologen Gene erlaubt.
• Darüber hinaus ist es vorteilhaft, daß weder die Integrität noch die Kontinuität der Sequenz des pKD1-Plasmids zur Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren benötigt wird. Tatsächlich ist es möglich, für die Ziele der vorliegenden Erfindung das zu klonierende Gen in eine der spezifischen Restriktionsstellen einzufügen und so die pKD1-Sequenz zu unterbrechen oder einfach ein Segment zu verwenden, das den Replikationsursprung dieses Plasmids enthält.
• Der konkrete Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Konstruktion von Klonierungs- und Expressionsvektoren für heterologe Gene in Hefen, wobei solche Vektoren mindestens enthalten: die gesamte oder einen Teil der DNA des pKD1-Plasmids (isoliert aus Kluyveromyces drosophilarum) und ein DNA-Segment, das ein beliebiges heterologes Gen trägt, einschließlich der Sequenzen, die die Expression dieses Genes gewährleisten.
• Wenn die gesamte DNA des pKD1-Plasmids verwendet wird, ist es bevorzugt, daß das zu klonierende Gen in eine der spezifischen Restriktionsstellen, insbesondere in die PstI-Stelle, eingefügt wird.
• Unter den Genen, die am besten zum Klonieren geeignet sind, ist es insbesondere das URA3-Gen aus S.cerevisiae wert, in Betracht gezogen zu werden und zwar vorzugsweise als ein Teil des YIP5-Plasmids, das aus der Sequenz des pBR322-Plasmids von Escherichia coli und zusätzlich aus der Sequenz dieses URA3-Genes besteht.
• In einer anderen bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung enthält der Vektor das 1,7 Kb-Segment der DNA des pKD1-Plasmids, das mit dem Enzym BamHI erhalten wird, in die spezifische BamHI-Schnittstelle des YIP5-Plasmids eingefügt.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch Hefen, die durch die zuvor genannten Vektoren transformiert wurden und insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, die Stämme der Gattung Kluyveromyces und spezifischer der Gattung Kluyveromyces lactis.
• Es ist interessanterweise zu bemerken, daß erfindungsgemäß transformierte Hefen vorteilhaft für die Herstellung von Protein verwendet werden können, die durch die in den Vektor eingefügten heterologen Gene kodiert sind. Solche Hefen können beispielsweise von beträchtlicher Bedeutung auf dem Gebiet der Nahrungsmittel (die Produktion von Amylase, Rennin, Pectinase usw.) oder auf pharmazeutischen Gebiet (Insulin, Interferon usw.) sein.
• Zusätzlich können solche transformierten Hefen selbst integrierende Produkte für die Ernährung von Tieren oder lebendem Inventar (Biomasse) bilden.
• Diskussionshalber und zur Veranschaulichung, jedoch nicht einschränkend, wird die Verwendung der Erfindung für die Klonierung und Expression des URA3-Gens von Saccharomyces cerevisiae in einem uraA-Stamm von Kluyveromyces lactis betrachtet. Der uraA-Stamm ist normalerweise unfähig, in einem uracilfreien Medium zu wachsen. Es wurde gezeigt, daß das URA3-Gen, das in von dem pKD1-Plasmid stammenden Vektoren vorliegt, in der Wirtszelle exprimiert wird, und es wurde gezeigt, daß solche Zellen in der Lage sind, in uracilfreien Medien zu wachsen. Dies zeigt, daß das Orotidin-Monophosphat- Decarboxylase-Protein, das von dem URA3-Gen von S. cerevisiae kodiert wird, wirksam von K. lactis synthetisiert wird.
• In der folgenden Erläuterung wird auf die Fig. 2 und 3 der beigefügten Zeichnungen hingewiesen, in denen:
• Fig. 2a schematisch die Struktur der B-Form des pKD1-Plasmids zeigt,
• Fig. 2b das YIP5-Plasmid zeigt,
• Fig. 2c den P1-Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, und Fig. 3 den A15-Vektor gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
Konstruktion von Vektoren, die von dem pKD1-Plasmid stammen, die das URA3-Gen enthalten. Isolierung und Reinigung des pKD1-Plasmids
• Die Plasmid-DNA wurde aus den Protoplasten hergestellt, die aus 2 l einer Kultur von K. drosophilarum erhalten wurden. Nach der Lyse der Protoplasten erhaltene Nukleinsäuren wurden in 40 ml einer Lösung resuspendiert, die 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, enthielt. 40 g CsCl und 4 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 8,5) wurden zu der DNA-haltigen Lösung zugegeben, die dann bei 38000 UpM in einem Beckman 50 Ti-Rotor 40 Stunden lang bei 15ºC zentifugiert wurde. Die DNA wurde mit UV-Licht sichtbar gemacht und die untere Bande, die der Plasmid-DNA entspricht, wurde aus dem Gradienten wiedergewonnen und ein zweites Mal nach dem zuvor beschriebenen Verfahren gereinigt.
pKD1-stämmige Vektoren
• Es wird nun auf besondere Weise auf Fig. 2a hingewiesen, in der pKD1 in der zirkulären, geschlossenen Form gezeigt ist, mit den miteinander gepaarten invertierten und wiederholten Sequenzen (TR-Sequenzen). Die schwarz gezeigten Zonen geben die Lokalisierung der in dem Plasmid vorhandenen Hauptgene an. Zusätzlich sind die Positionen der wichtigsten Restriktionsstellen für die Klonierung und Manipulation des Plasmids gezeigt.
• In dieser Zeichnung ist die B-Form des Plasmids angegeben. Die Form unterscheidet sich von der B-Form durch die Orientierung des Kreises, auf dem sich das Gen B befindet, wie bereits zuvor im einzelnen erläutert wurde.
• Für die Konstruktion des rekombinanten Plasmids wurde pKD1 zunächst an der einzigen bzw. spezifischen PstI-Stelle linearisiert. Gleichzeitig wurde YIP5, das ein rekombinantes Plasmid ist und das Sequenzen des URA3-Genes von Saccharomyces cerevisiae und des Bakterienplasmids pBR322 enthält, ebenfalls an der PstI-Stelle linearisiert. Die Struktur von YIP5 ist in Fig. 2b angegeben, in der die Sequenzen des URA3-Genes von S. cerevisiae in schwarz angegeben sind, und die Sequenzen des Bakterienplasmids pBR322 in weiß angegeben sind, mit den Genen, die für die Ampicillinresistenz (Amp) und Tetracyclinresistenz (Tet) verantwortlich sind. Darüber hinaus ist die Lage einiger einziger bzw. spezifischer Restriktionsstellen gezeigt, die zur Klonierung verwendet werden.
• Die zwei linearisierten Moleküle werden an der gemeinsamen PstI-Stelle mittels DNA-Ligase gemäß einem an sich bekannten Standardverfahren zusammengefügt.
• Das durch diese Verknüpfung erhaltene Plasmid enthält somit die gesamte pKD1-Sequenz, das URA3-Gen und die pBR322-Sequenz. Die letztgenannte Sequenz wurde mit dem Ziel der Amplifikation der konstruierten Vektoren in das Bakterium Escherichia coli eingeführt.
• Das Ligationsreaktionsgemisch wurde direkt zu einer Suspension von E. coli-Zellen des Stammes RR1 zugegeben, die nach einer Behandlung mit Kalziumchlorid zur Transformation kompetent gemacht wurden.
• Die Zellsuspension wurde auf ein festes, tetracyclin-haltiges komplettes Medium aufgetragen. Unter den Tausenden von Kolonien, die erhalten wurden (die daher tetracyclinresistent waren) wurde eine Anzahl von Kolonien ausgewählt, die nicht in der Lage waren, auf einem ampicillin-haltigen Medium zu wachsen. Diese Kolonien (tetracyclinresistent und ampicillinsensitiv), die einen Anteil von etwa 10% darstellten, wurden einzeln auf die Natur des Plasmids, das sie enthielten, untersucht.
• Es wurde gefunden, daß etwa die Hälfte derartiger Kolonien ein rekombinantes Plasmid enthielt, das die gewünschte Struktur aufwies, wie in Fig. 2c gezeigt ist, wobei der PI-Vektor angegeben ist. Die verwendeten Symbole sind dieselben wie die in den Fig. 2a und 2b.
• Bei diesem Verfahren wurde auch ein anderer Vektor, der als P3 bezeichnet wird, konstruiert, der sich von P1 dadurch unterscheidet, daß er die A-Form von pKD1 enthält.
• Das A15-Plasmid ist ein anderes rekombinantes Molekül, das von pKD1 abstammt. Letzteres wurde mit dem Restriktionsenzym mittels BamHI verdaut und ein Fragment von 1700 Basenpaaren wurde isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit dem linearisierten Molekül von YIP5 gemischt, das an seiner einzigen bzw. spezifischen BamHI-Stelle geschnitten worden war. Nach der Ligation und der Amplifikation in E.coli wurde, wie zuvor beschrieben, ein Klon ausgewählt, der Resistenz gegen Ampicillin und Sensitivität gegen Tetracyclin zeigte. Aus diesem Klon wurde ein rekombinantes Plasmid isoliert, und das Plasmid enthielt, wie erwartet, das BamHI-Fragment von pKD1, das URA3-Gen und die Sequenz von pBR322.
• In der Fig. 3, die sich auf die Konstruktion des A15-Vektors bezieht, ist die Insertionsstelle bzw. der Insertionspunkt des 1,7 Kb-BamHI-Fragments (in schwarz) von pKD1 in dem YIP5-Plasmid angegeben. Die Symbole sind die gleichen wie in den vorherigen Figuren.
• Die Vektoren, die wie zuvor erläutert unter Verwendung von pKD1, dem URA3-Gen und den Sequenzen von pBR322 konstruiert wurden und die eine Replikation in E. coli erlauben, wurden von den bereits beschriebenen Klonen von E. coli gereinigt und dann für die Transformation eines uraA-Stammes von Kluyveromyces lactis verwendet.
Transformation von Kluyveromyces lactis
• Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß die uraA-Mutation von K. lactis durch das URA3-Gen von S. cerevisiae komplementiert werden konnte (L. de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154, 737-742 (1982)). Es wurde daher ein Stamm von K. lactis verwendet, der diese Mutation enthielt, um die Transformation mit Hybridplasmiden, die aus pKD1-Sequenzen und dem URA3-Gen bestehen, nachzuweisen.
• Der Stamm MW98-8C (a, uraA, Arg, Lys, K&spplus;, R&spplus;), der im Orsay- Laboratorium von dem CBS 2359-Stamm von K. lactis isoliert wurde, wurde in einem flüssigen Medium, das 2 96 Glucose, 1 96 Hefeextrakt und 1% Bactopepton enthielt, 18 Stunden lang bei 28ºC in einem Schüttelbad gezüchtet.
• Die Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase mittels einem Standardverfahren in Protoplasten überführt.
• Die Protoplasten wurden in STC-Puffer (1 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) bei einer Konzentration von etwa 10% pro ml resuspendiert. Ein Aliquot dieser Suspension, üblicherweise 0,1 ml, wurde dann mit 0,2-0,5 ug der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen P1-, P3- und A15-Vektoren und der Kontrollplasmide gemischt.
• Nach 10 Minuten wurde die Suspension 2 Minuten lang auf 42ºC erwärmt und dann mit einem Volumen Polyethylenglycol 4000 gemischt. Nach weiteren 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Suspension zentrifugiert und die Sphäroplasten wurden gewaschen und in SOS-Puffer (100 ml des letzteren enthalten: 50 ml 2 M Sorbit, 33,5 ml YEP-Medium, 0,65 ml 1 M CaCl&sub2;, 135 ul 1%iges Uracil und 15 ml Wasser) resuspendiert.
• 0,1 ml Aliquote der Sphäroplastensuspension wurden zu 4 ml W-Medium (das bei 45ºC flüssig gehalten wurde und das die Zusätze enthielt, die andere als die Uracilauxotrophien komplementieren) zugegeben, und dann auf Petrischalen gegossen, die festes W-Medium enthielten.
• Das Wachstum der Kolonien wurde nach 3-4tägiger Inkubation bei 28ºC beobachtet.
• Die folgende Tabelle 1 gibt die Anzahl und die Stabilität der Transformationsexperimente des Kluyveromyces lactis-Stammes MW98-8C durch die Vektoren an, die von dem pKD1-Plasmid abstammen. Tabelle 1 Vektor Anzahl der ura-Transformanten a) Stabilität der Transformanten b) a) Die Anzahl der Transformanten ist der in 2-3 Versuchen erhaltene Durchschnittswert, wobei 0,2-0,5 ug Plasmid-DNA verwendet wurde. b) Die Stabilität ist als Prozentsatz von ura&spplus;-Kolonien angegeben, die nach 6 Generationen in einem nichtselektiven Medium erhalten wurden.
• Nur solche Protoplasten, zu denen ein Plasmid gegeben wurde, das eine pKD1-Sequenz enthält, führten zur Bildung von Kolonien, die daher ura&spplus; waren. Im Falle von YIP5, das keine pKD1-Sequenzen enthält, wurden Kolonien erst nach der Zugabe von Uracil im Wachstumsmedium beobachtet.
• DNA wurde aus einigen Kolonien extrahiert, die mit von pKD1 stammenden Vektoren transformiert wurden, und es wurde das Vorliegen eines Plasmids beobachtet, dessen Restriktionskarte mit der Karte des für die Transformation verwendeten Plasmids identisch war.
• Wie aus der Tabelle zu sehen ist, ist das pKD1-DNA-Fragment, das in A15 enthalten ist, für sich allein ausreichend, um die Replikation des rekombinanten Vektors zu fördern. Andere Vektoren, die diese pKD1-Region nicht enthalten, sind nicht in der Lage, Kluyveromyces lactis zu transformieren. Die Transformationseffizienz des A15-Vektors und die Stabilität der so erhaltenen Transformanten sind jedoch niedriger als diejenigen, die bei den anderen Vektoren beobachtet werden. Dies legt nahe, daß dem AlS-Vektor einige pKD1-Sequenzen fehlen, die eine wichtige Rolle bei der Plasmiderhaltung aufweisen könnten.
• Die Stabilität der Transformanten, die mit den P1- und P3-Vektoren erhalten werden, die das gesamte pKD1-Plasmid enthalten, ist bei weitem die höchste bisher beobachtete Transformation von Kluyveromyces.
• Dies ist für industrielle Anwendungen, die durch diese Vektoren transformierte Hefen umfassen, von größtem Vorteil.
• Bei der Erläuterung der vorliegenden Erfindung ist auf einige spezielle Aspekte besonders hingewiesen worden, es versteht sich jedoch, daß Modifikationen und Änderungen durch den entsprechenden Fachmann eingeführt werden können, ohne von Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims (9)

1. Klonierungs- und Expressionsvektoren für heterologe Gene in Hefen, wobei solche Vehikel dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens enthalten: die gesamte DNA des pKD1-Plasmids (isoliert aus Kluyveromyces drosophilarum) oder einen Teil davon, und ein DNA-Segment, das ein beliebiges heterologes Gen trägt, einschließlich Sequenzen, die die Expression dieses Genes gewährleisten.

2. Vektor nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen in eine der spezifischen Restriktionsstellen des pKD1-Plasmids eingefügt ist.

3. Vektor nach Anspruch 2, wobei die spezifische Restriktionsstelle die PstI-Stelle ist.

4. Vektor nach den Ansprüchen 1-3, wobei das heterologe Gen das URA3-Gen von Saccharomyces cerevisiae ist.

5. Vektor nach Anspruch 4, wobei das DNA-Segment, das das URA3-Gen trägt, die DNA des YIP5-Plasmides ist.

6. Vektor nach Anspruch 5, der das DNA-Fragment mit einer Länge von 1,7 Kilobasen des pKD1-Plasmids enthält, wobei das Fragment mit dem Enzym BamHI erhalten wird und an der spezifischen BamHI-Stelle des YIP5-Plasmides eingefügt ist.

7. Hefen, die durch die in den Ansprüchen 1-6 beschriebenen Vektoren transformiert sind.

8. Hefen nach Anspruch 7, die zu der Gattung Kluyveromyces gehören.

9. Hefen nach Anspruch 8, die zu der Spezies Kluyveromyces lactis gehören.