DE3853548T2

DE3853548T2 - Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit einer Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe und Mikroorganismen dafür.

Info

Publication number: DE3853548T2
Application number: DE3853548T
Authority: DE
Inventors: Roland Gerhard Lageveen; Bernard Witholt
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Priority date: 1987-01-15
Filing date: 1988-01-14
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2008-01-15
Also published as: NL8700085A; EP0277674B1; JP2790630B2; DE3853548D1; EP0277674A1; US5032512A; CA1297439C; JPS63273483A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, die eine Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe enthalten, durch Züchten von Mikroorganismen, die gegenüber der Anwesenheit von bulk-apolaren Phasen resistent sind und ein Alkanhydroxylase- Enzymsystem aufweisen, das sie zur Endoxidation eines aliphatischen Substrats oder einer aliphatischen Seitenkette eines Substrats befähigt, unter aeroben Bedingungen und in Gegenwart eines solchen Substrats und Gewinnung des gebildeten Oxidationsproduktes.
Ein ähnliches Verfahren wird beschrieben in der These "A Biotechnological Approach to the Synthesis of Epoxides" von M.J. de Smet (Groningen, 1982). Wie dort ausgeführt wird, sind einige Bakterien, wie Pseudomonas oleovorans, in der Lage, unter aeroben Bedingungen auf unterschiedlichen nicht-aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie Octan, Octen, Octanol, usw., zu wachsen. Pseudomonas oleovorans kann dies aufgrund eines plasmid-kodierten Monooxygenase-Systems, das die erste Oxidationsstufe bei der Zersetzung des Kohlenwasserstoffsubstrats katalysiert. Diese Monooxygenase, oder besser insbesondern das Alkanhydroxylase-System, das die Hydroxylierung einer Methyl-Endgruppe von n-Alkanen und die Umwandlung von End-n-Alkanen in die entsprechenden 1,1-Oxide katalysiert, besteht aus einer omega-Hydroxylase, die in der cytoplasmischen Membran angeordnet ist und ein Molargewicht von 41 kDa aufweist, einem eisen- und schwefelhaltigen cytoplasmischen Protein mit einem Molargewicht von 19 kDa (genannt Rubredoxin) und einem cytoplasmischen Flavoprotein mit einem Molargewicht von 55 kDa (genannt Rubredoxin-Reduktase).
Damit Bakterien auf Kohlenwasserstoffen, wie Alkanen, wachsen können, müssen sie in der Lage sein, das erste Oxidationsprodukt weiter umzuwandeln. Bei Pseudomonas oleovorans wird das n-Alkanol weiter oxidiert für diesen Zweck zu einem Aldehyd, das seinerseits zu einer entsprechenden Fettsäure oxidiert wird, die anschließend durch β-Oxidation weiter aufgebrochen wird. Die Umwandlung von Alkanol in Aldehyd wird katalysiert bei Pseudomonas oleovorans durch Alkoholdehydrogenase-Enzyme. Das OCT-Plasmid von P. oleovorans enthält u.a. Gene, die für das Alkanhydroxylase-System (alkBA-Gene), für eine Alkoholdehydrogenase (alkC-Gen), die in der cytoplasmischen Membran angeordnet ist, und die Regulationsgene (alkR-Gene), die für deren Expression notwendig sind, kodieren. Die für die weitere Oxidation des Aldehyds zu Fettsäure und für die β-Oxidation der Fettsäure verantwortlichen Gene sind jedoch auf dem Chromosom angeordnet.
Bakterien, wie P. oleovorans, können in Systemen gezüchtet werden, die zwei flüssige Phasen enthalten, worin die Bakterien selbst in der wäßrigen Phase enthalten sind und das Substrat die apolare Phase bildet, unter Bildung des ersten Reaktionsproduktes, bestehend aus n-Alkanolen und/oder n-Epoxyalkanen, gemäß der Natur des Substrates. Diese Möglichkeit eines biokatalytischen Verfahrens wurde in der vorstehend genannten These von M.J. de Smet studiert, einschließlich der Möglichkeit der Bildung von Verbindungen, wie 1,2-Epoxyoctan und 1,2-Epoxydecan durch Züchten von P. oleovorans in Zwei-Phasen-Systemen unter aeroben Bedingungen unter Verwendung von Olefinen, wie n-Octen und n-Decen, als eine Kohlenstoffquelle.
Ein wichtiger Nachteil der Herstellung von Alkanolen, die auf diese Weise durchgeführt wurde, ist jedoch, daß die verwendeten Mikroorganismen den gebildeten Alkanol weiter umwandeln, so daß die Produktion behindert ist. Im Falle von aus Olefinen gebildeten 1,3-Epoxyalkanen ist außerdem ein weiteres Aufbrechen möglich, wahrscheinlich auf dem Weg über eine Hydroxylierung der freien Methylgruppe.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das diesen Nachteil ausschließt und gekennzeichnet ist durch Verwendung von Mikroorganismen, die genetisch derart manipuliert worden sind, daß sie noch in der Lage sind, die Endoxidation des Substrats zu einer Verbindung durchzuführen, die eine Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe aufweist, jedoch nicht mehr in der Lage ist, das Oxidationsprodukt in signifikantem Maße weiter umzusetzen.
Die Natur des Substrates ist eng verwandt mit der Natur des gewünschten Oxidationsproduktes. Wenn beispielsweise n-Octanol das gewünschte Oxidationsprodukt ist, wird das zu wählende Substrat n-Octan sein. Wenn die Herstellung von 1,2-Epoxyoctan gewünscht wird, wird das zu verwendende Substrat n-Octen sein. In Abhängigkeit von der Natur des Substrates und der Natur der verwendeten Mikroorganismen, insbesondere der Spezifität des Alkanhydroxylase-Enzymsystems davon, wird das Oxidationsprodukt manchmal ein Gemisch von verschiedenen Verbindungen sein, beispielsweise ein Gemisch, bestehend aus einem 1,2-Epoxyalkan und einem Alkenol, wenn ein Olefin als das Substrat verwendet worden ist. Die Natur der verwendeten Mikroorganismen und des Alkanhydroxylase- Enzymsystems davon ist ebenfalls bestimmend für die Natur des Substrates, das verwendet werden kann.
Vorzugsweise werden erfindungsgemäß Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas oleovorans oder der Spezies Pseudomonas putida verwendet, am meisten bevorzugt ein Mikroorganismus der Spezies Pseudomonas oleovorans. Solche Mikroorganismen können von Natur aus auf n-Alkanen und n-Alkenen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen wachsen, jedoch ist das Alkanhydroxylase-Enzymsystem davon ebenso effektiv mit anderen Substraten, wie Propen, Buten, Tetradecen, Hexadecen, Tetradecan, n-Alkadiene mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, n-Alkansäuren mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, Phenylalkane, Phenylalkene usw.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung - ist gekennzeichnet durch die Verwendung von einem oder mehreren n-Alkanen, n-Alkenen und/oder n-Alkadienen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen als das Substrat.
Im Prinzip können verschiedene Arten genetischer Manipulation angewandt werden, um die Kapazität der Mikroorganismen, das erste Oxidationsprodukt weiter umzuwandeln, zu reduzieren. Obgleich Mikroorganismen wie P. oleovorans mehrere Gene enthalten, die für Alkanoldehydrogenase kodieren, wurde überraschenderweise gefunden, daß die Entaktivierung oder Entfernung des plasmidischen Alkanoldehydrogenase-Gens (d.h. dasjenige, das auf einem Plasmid angeordnet ist) in einer beachtlichen Zerstörung der Kapazität des Bakteriums, das erste Oxidationsprodukt weiter umzuwandeln, resultiert. Tatsächlich sind Mikroorganismen mit Mutationen in diesem plasmidischen Alkanoldehydrogenase-Gen, wobei diese Mutationen auf den Mutationsort gerichtet sein können und ausreichen, die Expression dieses aktiven Alkanoldehydrogenase-Enzyms zu verhindern, Beispiele für Mikroorganismen, die sich zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Mikroorganismen können erhalten werden durch Verwendung eines Wirtes, dessen natürliches Plasmid entnommen wurde und der mit einem rekombinaten Plasmid ausgestattet wurde, das die alkBA/R-Gene enthält, die für das Alkanhydroxylase-System kodieren und kein Gen enthalten, das für ein aktives Alkanoldehydrogenase-Enzym kodiert.
Das natürlich vorkommende OCT-Plasmid enthält die erforderlichen Gene im alkBAC- Operon, das positiv reguliert wird durch die Produkte der alkR-Regulationsgene. Die alkBA-Gene, die für das Alkanhydroxylase-Enzymsystem kodieren, und die alkR-Regulationsgene können in einem geeigneten Wirt geklont werden unter Verwendung eines geeigneten Vektorsystems, z.B. pLARFI-Vektoren (Friedman et al Gene 18 (1982), 289-296). Ein geeignetes rekombinantes Plasmid, das diese alkBA- und alkR-Gene enthält und das plasmidische Alkanoldehydrogenase-Gen alkC nicht enthält, ist das Plasmid pGEc 41 auf der Basis von pLAFRI.
Ein E. coli-Stamm, der dieses Plasmid pGEc 41 enthält, ist hinterlegt worden beim Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baarn, Niederlande, am 15. Januar 1987 (E. coli DH1 (pGEc 41), CBS 102-87).
Pseudomonas oleovorans, dessen natürliches Plasmid ersetzt worden ist durch das Plasmid pGEc 41 oder ein ähnliches Plasmid, das alkBA/R-Gene enthält, sind nicht mehr imstande, auf Alkanen, Alkenen und Alkanolen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen zu wachsen, zumindest wachsen sie wesentlich weniger gut auf solchen Substraten, als die Wildtyp- Bakterien. Jedoch sind sie noch resistent gegenüber der Anwesenheit von bulk-apolaren Phasen und können folglich in Gegenwart eines Nährmediums mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle gezüchtet werden, wie Pyruvat, Citrat oder Glucose, in Systemen mit zwei flüssigen Phasen, nämlich einer wäßrigen Phase, enthaltend die Bakterien, und einer organischen Phase, die bis zu 99 Vol.-% betragen kann, ohne wesentliche Schädigung der Bakterien. Für ein gutes Wachstum ist es empfehlenswert, den pH-Wert des Systems bei einem Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise 6,8 bis 7,0, zu halten und die Temperatur bei einem Wert unter 37ºC, vorzugsweise 20 bis 34ºC und am meisten bevorzugt 28 bis 32ºC, zu halten. Um einen guten Kontakt zwischen der organischen Phase und der wäßrigen Phase mit Bakterien zu bewirken und ein gutes Vermischen zu bewirken und außerdem das Risiko der Produktinhibierung herabzusetzen, ohne gleichzeitig eine Schädigung der Bakterien zu verursachen, wird der Inhalt des Reaktors vorzugsweise kontinuierlich gerührt bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 bis 1000 UpM oder anderweitig bewegt in einem vergleichbaren Maße.
Um eine negative Wirkung des sich bildenden Produktes auf die Umwandlung des Substrates soweit wie möglich herabzusetzen, besteht ein weiteres bevorzugtes Merkmal der Erfindung darin, daß eine zweite organische Phase verwendet wird, die das sich bildende Oxidationsprodukt von der wäßrigen Phase wirksamer entfernt aufgrund eines Verteilungskoeffizienten für das Produkt, der gegenüber Wasser ziemlich vorteilhaft ist. Für diesen Zweck erwiesen sich beispielsweise Cyclohexan, Cyclohexanol, Phthalsäureester und Diester, wie Dibutylphthalat, als geeignet. Durch Zugabe beispielsweise von Dibutylphthalat als zweite organische Phase bei der mikrobiologischen Herstellung von Octanol aus Octan gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, kann die endgültige Produktkonzentration verdoppelt werden.
Die Erfindung wird in und durch den nachfolgenden experimentellen Abschnitt erläutert.

1. Genetisches Manipulieren

a. Bakterielle Ausgangsstämme:

Die für die genetische Manipulation verwendeten Ausgangsstämme werden in Tabelle A aufgezeigt.

b. Medien

E. coli und P. putida wurden gezüchtet auf L-Medium oder E*-Medium mit einer Nährstoffquelle (0,2% Gewicht/Volumen) und erforderlichen Aminosäuren (0,01% Gewicht/Volumen).
L-Medium enthält: 5 g/l Hefeextrakt
10 g/l Bacto-trypton
10 g/l NaCl
pH eingestellt auf 7.5
E*-Medium enthält: 3,5 g/l NaNH&sub4;HPO&sub4; 4 H&sub2;O
7,5 g/l K&sub2;HPO&sub4; 3 H&sub2;O
3,7 g/l KH&sub2;PO&sub4;
Nach der Sterilisierung wurden 10 ml einer sterilen 100 mM MgSO&sub4;-Lösung und 1 ml einer Spurenelement-Lösung, genannt 1000 x MT, zugesetzt. 1000 x MT enthält je Liter:
2,78 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O
1,98 g MnCl&sub2; 4H&sub2;O
52,81 g CoSO&sub4; 7H&sub2;O
1,47 g CaCl&sub2; 2H&sub2;O
0,17 g CuCl&sub2; 2H&sub2;O
0,29 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O.
Für das Wachstum auf Octan wurden die Stämme gezüchtet auf Platten mit E*-Medium mit 1,5% (Gewicht/Volumen) Agarose bei 32ºC in geschlossenen Kanistern mit Octandampf. Für eie Auswahl für Tetracyclin-Resistenz wurde diese Substanz zu einer Konzentration von 15 ug/ml aufgefüllt.

c.DNA-Isolierung

Plasmid DNA von E. coli und P. putida wurde isoliert nach der Methode von H.C. Birnboim und J. Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979); 1513-1523.

d. Enzyme

Restriktions-Endonucleasen, T4 DNA-Ligase und Hühnereiweiß-Lysozym wurden erhalten von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Bundesrepublik Deutschland) und Bethesda Research Labs GmbH (Neu Isenburg, Bundesrepublik Deutschland). Sie wurden gemäß den Anweisungen des Liferanten verwendet.

e. Mutaqenese von GPo-12

GPo-1 wurde gezüchtet auf L-Medium zu einer Zelldichte von 0,1 mg/ml in einem Schüttelwasserbad bei 32ºC. Nitrosoguanidin (NTG) wurde zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml, und die Inkubierung wurde weitere 30 Minuten lang fortgesetzt. Die Zellen wurden anschließend zentrifugiert (5000 g, 5 Minuten) und resuspendiert in frischem L-Medium zu einer Zelldichte von 0,05 ug/ml. Anschließend wurde die Kultur über Nacht inkubiert bei 32ºC und dann verdünnt und auf L-Mediumplatten gegeben, um isolierte Kolonien herzustellen. Diese wurden auf E*-Medium mit Glucose getestet, E*-Medium mit Octandampf und auf E*-Medium mit Octanoldampf.
Von den 3500 gefundenen Kolonien waren 7 nicht mehr in der Lage, auf Octan zu wachsen,
wuchsen jedoch auf Octanol, und diese wurden weiter erforscht für den Mutationstyp. Dies zeigte, daß sie alle das OCT-Plasmid verloren hatten. Einer dieser 7 Mutanten wurde GPo-12 genannt. Wenn das OCT-Plasmid in diesen Stamm wieder eingeführt wird, verhält sich dieser Stamm wie ein normales GPo-1.

f. Genetische Verfahren

Die Mobilisierung von pLARFI von E. coli zu P. putida wurde durchgeführt durch die "triparenterale Paarungs"-Methode, beschrieben von Friedman et al., Gene 16 (1982), 289-296. Nachdem der Donor-Stamm, der Empfänger- und der Helfer-Stammüber Nacht auf L-Platte gezüchtet worden waren, wurden die Exkonjuganten ausgewählt durch Replikaplattierung auf Platten mit E*-Medium, das außerdem Tetracyclin, Glucose und die erforderlichen Aminosäuren enthielt.
Die Transformation von E. coli mit Plasmid DNA wurde durchgeführt durch die Methode von Cohen et al. (Cohen SN, Chang AC und HSU L, Proc.Natl.Acad.Sci. 69 (1972), 2110-2114). In-vitro-Lambda-Phagenpackungsextrakt wurde hergestellt, und pLAFRI-DNA wurde gepackt nach der Methode von Hohn (Hohn, B in: R.Wu (ed), Methods in Enzymology 68 (1979), S. 299-309, Academic Press Inc., New York).
Für die Transduktionen wurde E. coli HB 101 verwendet (Boyer et al.). Es wurde über Nacht in 5 ml L-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden danach zentrifugiert und in 5 ml 10 mM MgSO&sub4; resuspendiert und so über Nacht gehalten. Am nächsten Tag wurden diese verhungerten E. coli-Zellen mit der korrekten Menge an in vitro- Packungscosmiden vermischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Danach wurden 0,2 ml L-Medium zugesetzt und die Zellsuspension bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert. Die Transduktanten von E. coli wurden dann auf eine L-Platte mit Tetracyclin plattiert.

g. Konstruktion von Stämmen

pGEc29 (pLAFRI mit 16,9 kb Insert, enthaltend das alkBAC Operon) und pGEc40 (pLAFRI mit 18 kb Insert, enthaltend den alkR-Locus) wurden miteinander ligasiert in einem 1:1-Verhältnis nach Digestion mit EcoRI. Das Ligasierungsgemisch wurde in vitro in lambda-Bakteriophagenköpfe gepackt und HB101 (E. coli) wurde mit diesem Gemisch transduziert. Um die Transduktanten zu identifizieren, wurde das Material für Tetracyclinresistenz ausgewählt. Auf diese Weise wurde ein Plasmid (pGEc47) in E. coli HB101 erhalten, das in pLAFRI sowohl das 18 kb als auch das 16,9 kb Insert enthielt. Außerdem wurde ein Plasmid erhalten (pGEc41), das den vollständigen alkR-Locus und von einer spontanen Deletion einen Teil des alkBAC-Operons, d.h. alkBA (siehe Figur 3b) enthielt. Dieses Plasmid enthielt demgemäß nicht die plasmid-kodierte Alkanoldehydrogenase (alkC). Bezüglich genetische Determinanten von pGEc41 und pGEc47 siehe Tabelle C. Beide Plasmide pGEc41 und pGEc47 wurden in P. putida und den vom Plasmid befreiten P. oleovorans-Stamm GPo-12 durch Konjugation eingeführt (siehe unter f). Bezüglich Wachstumseigenschaften siehe Tabelle B.
Der verwendete Vektor pLAFRI (Tc, Tra, Mob, RK2-Replikationseinheit) wurde von Friedman et al., Gene 18 (1982), 289-296 beschrieben. Alle die DNA-Fragmente, auf die Bezug genommen wurde, wurden von einer Genbank des gesamten P. oleovorans- Genoms isoliert. Diese Genbank wurde konstruiert durch Eggink und beschrieben in:
Innovations in Biotechnology (1984), Band 22, E.Houwink und R.R. van der Meer (eds.), S. 373-380.
Die Selektion erfolgte durch Komplementation, wie in Tabelle C dargelegt.
Die Plasmide pGEc 29, pGEc 40 und pGEc 47 wurden erhalten durch ligation mit EcoRI, das mit pLAFRI digeriert worden war.
Figur 1 erläutert das Restriktionsdiagramm des EcoRI-Fragmentes B, das in pGEc 40 eingeführt wurde, welches Fragment den alkR-Locus enthält.
Figur 2 zeigt das Restriktionsdiagramm des EcoRI-Fragmentes A, das den alkBAC-Operon enthält, in pGEc29 eingeführt.
Figur 3a zeigt das Restriktionsdiagramm des Inserts in pGEc47, das das alkBAC-Operon und den alkR-Lokus enthält.
Figur 3b zeigt das Restriktionsdiagramm des Inserts in pGEc41, das aus EcoRI-Fragmenten A und B besteht, mit einer Deletion von 5 kb im alkBAC-Operon. Die mit dieser Deletion verlorengegangenen Restriktionsstellen sind in der Figur gezeigt. In diesem Sinne gehört die EcoRI-Stelle zwischen die beiden Fragmente. Die Deletion erstreckt sich auf den Bereich stromabwärts des alkBAC-Operons, wo es zwischen den Sstl- und Pstl-Stellen in der 12,0- und 12,2-Position endet. Die Deletion umfaßt nur einen kleinen Teil (von 0,1 bis 0,5 kb) des Fragmentes B, so daß der alkR-Locus außerhalb der Deletion verblieb. Durch Wachstumsversuche, u.a. mit dem PpS81-Stamm, der eine Mutation in der chromosomal-enkodierten Alkanoldehydrogenase aufweist, zeigte es sich, daß die Deletion das plasmidische Alkanoldehydrogenase-Gen betraf: während der GPp-10 (PpS-81 pGEc47)-Stamm so schnell auf Octan wuchs, wie GPp-9 (PpG-1 pGEc41), fand man, daß der GPp-11 (PpS-81 pGEc41)-Stamm sehr spärlich auf Octan wuchs. Tabelle A Bakterienstämme Stamm Quelle Gentyp Plasmid P. oleovorans GPo-1 E. coli HB-101 Nieder***) Benson*) Boyer**) *) S.A. Benson. "Alkane utilization in Pseudomonas putida", Ph. D. Thesis University of Chicago 1978. **) H.B. Boyer und D. Roulland-Ducroix, J.Mol.Biol. 41 (1969), 459-472 ***) M. Nieder und J.Shapiro, J. Bacteriol. 122 (1975), 93-98. Tabelle B. Wachstumn auf Octan, getestet auf Platten mit Octandampf. Quelle Wachstum Tabelle C. Rekombinante Plasmide von pLAFRI und alk-Sequenzen Plasmid Insert(s) relevante Eigenschaften Fragmente A und B mit einer Deletion von 5 kb Komplentation Mutationen (1): M. Fennewald, phD These University of Chicago 1979

a. Optimale Verfahrensbedingungen

Um die optimalen Verfahrensbedingungen für Alkanhydroxylierung und Alkenepoxidation zu bestimmen, wurde das Optimum für das Wachstum von P. oleovorans in Gemischen von E*-Medium und Alkanen oder Alkenen in Rührtankreaktoren mit einem Arbeitsvolumen von 1 l bestimmt.
P. oleovorans wurde über Nacht auf E*-Medium mit Octan vorgezüchtet. Die Hauptkulturen wurden zu einer Zelldichte von 0,1 mg Zelle Trockengewicht/ml wäßrige Phase bei 450 nM inokkuliert, wie durch Witholt beschrieben (Witholt B., J.Bacteriol. 109 (1972), 350-364). Aus den daraus resultierenden Wachstumskurven wurde die Wachstumsgeschwindigkeit bestimmt. Das Gesamtvolumen der wäßrigen Phase und der organischen Phase betrug immer 700 ml.
Nachstehende Optima wurden bestimmt:
pH: Das Wachstum von P. oleovorans auf n-Alkanen ist möglich zwischen Werten von 5 und 9. Das pH-Optimum rangiert zwischen pH 6,8 und 7,0.
Temperatur: P. oleovorans kann auf n-Alkanen bei Temperaturen unterhalb von 37ºC wachsen, mit einem klaren Optimum bei etwa 30ºC.
Rührgeschwindigkeiten: Rührgeschwindigkeiten in kleinen Fermentoren erwiesen sich für das Wachstum als optimal zwischen 500 und 1000 UpM.
Fraktion organische Phase: Beim Variieren des %(V/V) Alkans relativ zum Gesamtreaktions-
volumen fand man, daß P.oleovorans auf 0,5 bis 99 % organischer Phase wachsen kann, ohne daß die Kultur wesentlich geschädigt wird.

b. Herstellung von 1-Octanol und Epoxyoctan durch rekombinante Stämme

Für die Herstellung von 1-Octanol aus n-Octan und 1,2-Epoxyoctan aus Octen durch die manipulierten Stämme wurden diese auf E*-Medium gezüchtet mit Pyruvat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Stämme wurden von E*-Platten auf 5 ml L-Medium inokkuliert und auf diesen bei 30ºC 8 Stunden lang in Gegenwart von Tetracyclin vorgezüchtet.
Anschließend wurden sie auf 50 ml E*-Medium, das 1% (Gewicht/Volumen) Pyruvat und Tetracyclin enthielt, in 250 ml Erlenmeyer übertragen und über Nacht auf Schüttelplatten bei 200 UpM und 30ºC gezüchtet. Am nächsten Tag wurden sie auf E*-Medium und 20% (V/V) organischer Phase in Fermentoren übertragen zu einer Zelldichte von 0,1 bis 0,2 mg Zelle Trockengewicht/ml wäßrige Phase. Das Gesamtendvolumen betrug 700 ml, wovon 140 ml organische Phase (Octan oder Octen) und 560 ml wäßrige Phase war.
Unter Bedingungen, die sich als optimal für das Wachstum auf Alkanen erwiesen, d.h. pH 7,0 (kontrolliert mit 2N KOH und 2N H&sub2;SO&sub4;) und einer Temperatur von 30ºC, Rührgeschwindigkeit 700 UpM und Sauerstoffdruck über 50% Luftsättigung, wurde die Produktion durch genetisch manipulierte Stämme sowohl während des Wachstums auf Pyruvat und während der darauffolgenden stationären Phase als ein Ergebnis der Stickstoffbegrenzung bestimmt. Die Produktkonzentrationen in der organischen Phase wurden gemessen. Die Produktion wird dargestellt als die spezifische Aktivität der Zellkultur in Figur 4 in uMol gebildetes Produkt/Minute/g Trockenzellmasse. Diese spezifische Aktivität ist für die getesteten Stämme hoch, fiel jedoch rapide ab während der exponentiellen Wachstumsphase und der stationären Phase.
Man fand, daß dieser merkliche Produktionsabfall teilweise durch Produktinhibierung erklärt werden kann, die weitestgehend verhindert werden kann durch Zugabe einer zweiten organischen Phase, die das gebildete Produkt (1-Octanol) von der wäßrigen Phase wirksamer sammeln kann. Cyclohexan, Cyclohexanol und Diester von Phthalaten erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet. Insbesondere Dibutylphthalat ergibt eine zweifach höhere Endproduktionskonzentration.
Die Epoxidation von Octen durch diese Stämme bleibt jedoch niedrig, wahrscheinlich als Ergebnis einer verringerten Resistenz der manipulierten Stämme gegenüber der organischen Phase.
Figur 4 zeigt die Produktion von Octanol und 1,2-Epoxyoctan der getesteten Stämme als die spezifische Aktivität der Zellkultur in uMol Produkt je Minute je Gramm trockene Zellmasse. Die gestrichelten Linien zeigen die Transition zur stationären Phase an.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit einer Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe, wobei Mikroorganismen, die gegen die Anwesenheit von bulk-apolaren Phasen resistent sind und über ein Alkanhydroxylase-Enzymsystem verfügen, das sie zu einer Endoxidation eines aliphatischen Substrats oder einer aliphatischen Seitenkette eines Substrats befähigt, unter aeroben Bedingungen und in Gegenwart eines solchen Substrats gezüchtet werden und das gebildete Oxidationsprodukt gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas verwendet, die durch Deletion eines Teiles des plasmidischen Alkanoldehydrogenase-Gens alkC, dessen Anordnung auf dem OCT-Plasmid in den Figuren 2, 3a und 3b gezeigt ist, derart genetisch manipuliert worden sind, daß sie noch die Endoxidation des Substrats zu einer Verbindung mit einer Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe durchführen können, aber nicht mehr imstande sind, das Oxidationsprodukt in signifikantem Maße weiter umzusetzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat ein oder mehrere n-Alkane, n-Alkene und/oder n-Alkadiene mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas oleovorans oder der Gattung Pseudomonas putida verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pseudomonas oleovorans-stamm verwendet, in dem mindestens das plasmidische Alkanoldehydrogenase-Gen entfernt oder unwirksam gemacht worden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pseudomonas oleovorans-Stamm verwendet, dessen natürliches Plasmid durch ein Plasmid, das die für das Alkanhydroxylase-System kodierenden alkBA/R-Gene enthält und kein Gen enthält, das für ein wirksames Alkanoldehydrogenase- Enzym kodiert, ersetzt worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pseudomonas oleovorans-Stamm verwendet, dessen natürliches Plasmid durch das Plasmid pGEc41 (CBS 102.87) ersetzt worden ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen bei einem Temperatur von 20º bis 34º C, vorzugsweise 28º bis 32º C, in einem System mit zwei Flüssigkeitsphasen, dessen pH auf einen Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,8 bis 7,0, eingestellt wird, gezüchtet werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktorinhalt mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 bis 1000 U.p.M. gerührt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährboden verwendet wird, der eine geeignete Kohlenstoffquelle, wie Pyruvat, Citrat und/oder Glucose, enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite organische Phase, wie Dibutylphthalat, Cyclohexan und/oder Cyclohexanol, in der das Oxidationsprodukt löslich ist, verwendet wird.

11. Mikroorganismen, die gegen die Anwesenheit von bulkapolaren Phasen resistent sind und über ein Alkanhydroxylase- Enzymsystem verfügen, das sie zu einer Endoxidation eines aliphatischen Substrats oder einer aliphatischen Seitenkette eines Substrats befähigt, welche Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas sind und durch Deletion eines Teiles des plasmidischen Alkanoldehydrogenase-Gens alkC, dessen Anordnung auf dem OCT-Plasmid in den Figuren 2, 3a und 3b gezeigt ist, derart genetisch manipuliert worden sind, daß sie noch die Endoxidation des Substrats zu einer Verbindung mit einer Hydroxyl- oder Epoxy-Endgruppe durchführen können, aber nicht mehr imstande sind, das Oxidationsprodukt in signifikantem Maße weiter umzusetzen.

12. Mikroorganismen nach Anspruch 11 der Gattung Pseudomonas oleovorans oder der Gattung Pseudomonas putida.

13. Mikroorganismen nach Anspruch 12 der Gattung Pseudomonas oleovorans, in denen mindestens das plasmidische Alkanoldehydrogenase-Gen entfernt oder unwirksam gemacht worden ist.

14. Mikroorganismen nach Anspruch 12 der Gattung Pseudomonas oleovorans, in denen das natürliche Plasmid durch ein Plasmid, das die für das Alkanhydroxylase-System kodierenden alkaBA/R- Gene enthält und kein Gen enthält, das für ein wirksames Alkanoldehydrogenase- Enzym kodiert, ersetzt worden ist.

15. Mikroorganismen nach Anspruch 14 der Gattung Pseudomonas oleovorans, in denen das natürliche Plasmid durch das Plasmid pGEc41 (CBS 102.87) ersetzt worden ist.