JP2790630B2 - 末端に水酸基またはエポキシ基を有する化合物の製造法およびそれに適した微生物 - Google Patents
末端に水酸基またはエポキシ基を有する化合物の製造法およびそれに適した微生物Info
- Publication number
- JP2790630B2 JP2790630B2 JP63006747A JP674788A JP2790630B2 JP 2790630 B2 JP2790630 B2 JP 2790630B2 JP 63006747 A JP63006747 A JP 63006747A JP 674788 A JP674788 A JP 674788A JP 2790630 B2 JP2790630 B2 JP 2790630B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- plasmid
- dehydrogenase
- alkanol
- oleovorans
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，微生物を培養することにより，末端に水酸
基またはエポキシ基を有する化合物を製造する方法に関
する。上記微生物は，無極性相が大容量存在しても影響
を受けにくく，そして，脂肪族基質または基質の脂肪族
側鎖の末端酸化を行うことのできるアルカン−ヒドロキ
シラーゼ酵素系を有する。上記培養は，上記基質の存在
下，好気的条件下で行われ，酸化生成物が回収される。
基またはエポキシ基を有する化合物を製造する方法に関
する。上記微生物は，無極性相が大容量存在しても影響
を受けにくく，そして，脂肪族基質または基質の脂肪族
側鎖の末端酸化を行うことのできるアルカン−ヒドロキ
シラーゼ酵素系を有する。上記培養は，上記基質の存在
下，好気的条件下で行われ，酸化生成物が回収される。
（従来の技術） 類似した方法は,M.J.de Smet（Groningen,1982）によ
る論文「エポキシド合成の生物工学的アプローチ」に記
載されている。そこに述べられているように，シュード
モナス オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）の
ようにある種のバクテリアは，好気性条件下，種々の非
芳香性炭化水素（例えば，オクタン，オクテン，オクタ
ノールなど）に生育することが可能である。シュードモ
ナス オレオボランスが上記のように生育可能であるの
は，プラスミドによりコードされるモノオキシゲナーゼ
系（炭化水素基質の分解における最初の酸化工程を触媒
する）のためである。このモノオキシゲナーゼは，特に
アルカン−ヒドロキシラーゼ系（ｎ−アルカンの末端メ
チル基のヒドロキシル化と，末端ｎ−アルケンの対応す
る1,1−オキシドへの変換とを触媒する）は，細胞質膜
に局在する分子量41kDaのω−ヒドロキシラーゼ；分子
量19kDaの鉄および硫黄含有細胞質タンパク（ルブレド
キシンと呼ばれる）；および分子量55kDaの細胞質フラ
ビンタンパク（ルブレドキシンレダクターゼと呼ばれ
る）から構成されている。
る論文「エポキシド合成の生物工学的アプローチ」に記
載されている。そこに述べられているように，シュード
モナス オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）の
ようにある種のバクテリアは，好気性条件下，種々の非
芳香性炭化水素（例えば，オクタン，オクテン，オクタ
ノールなど）に生育することが可能である。シュードモ
ナス オレオボランスが上記のように生育可能であるの
は，プラスミドによりコードされるモノオキシゲナーゼ
系（炭化水素基質の分解における最初の酸化工程を触媒
する）のためである。このモノオキシゲナーゼは，特に
アルカン−ヒドロキシラーゼ系（ｎ−アルカンの末端メ
チル基のヒドロキシル化と，末端ｎ−アルケンの対応す
る1,1−オキシドへの変換とを触媒する）は，細胞質膜
に局在する分子量41kDaのω−ヒドロキシラーゼ；分子
量19kDaの鉄および硫黄含有細胞質タンパク（ルブレド
キシンと呼ばれる）；および分子量55kDaの細胞質フラ
ビンタンパク（ルブレドキシンレダクターゼと呼ばれ
る）から構成されている。
アルカンのような炭化水素に生育し得るバクテリアに
ついては，それらは，最初の酸化生成物をさらに変換す
る能力が必要である。シュードモナス オレオボランス
においては，この目的のために,n−アルカノールはさら
にアルデヒドに酸化される。このアルデヒドは次に，対
応する脂肪酸に酸化され，次に，さらにβ酸化により分
解する。シュードモナス オレオボランスにおいては，
アルカノールがアルデヒドに変化するのは，アルコール
デヒドロゲナーゼ酵素により触媒される。シュードモナ
ス オレオボランスのOCTプラスミドは，特に，アルカ
ン−ヒドロキシラーゼ系をコードする遺伝子（alkBA遺
伝子），アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子（alkＣ遺伝子）（上記アルカン−ヒドロキシラーゼ
系およびアルコールデヒドロゲナーゼは，細胞質膜に局
在して存在する），そして，それらの発現に必要な制限
遺伝子（alkＲ遺伝子）を有する。しかし，上記アルデ
ヒドを脂肪酸に酸化するのに関与する遺伝子，および該
脂肪酸をβ酸化により脂肪酸とするのに関与する遺伝子
は，染色体中に局在している。
ついては，それらは，最初の酸化生成物をさらに変換す
る能力が必要である。シュードモナス オレオボランス
においては，この目的のために,n−アルカノールはさら
にアルデヒドに酸化される。このアルデヒドは次に，対
応する脂肪酸に酸化され，次に，さらにβ酸化により分
解する。シュードモナス オレオボランスにおいては，
アルカノールがアルデヒドに変化するのは，アルコール
デヒドロゲナーゼ酵素により触媒される。シュードモナ
ス オレオボランスのOCTプラスミドは，特に，アルカ
ン−ヒドロキシラーゼ系をコードする遺伝子（alkBA遺
伝子），アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子（alkＣ遺伝子）（上記アルカン−ヒドロキシラーゼ
系およびアルコールデヒドロゲナーゼは，細胞質膜に局
在して存在する），そして，それらの発現に必要な制限
遺伝子（alkＲ遺伝子）を有する。しかし，上記アルデ
ヒドを脂肪酸に酸化するのに関与する遺伝子，および該
脂肪酸をβ酸化により脂肪酸とするのに関与する遺伝子
は，染色体中に局在している。
シュードモナス オレオボランスのようなバクテリア
は,2つの液相を含む系内で培養され得る。このような系
においては，バクテリア自身は，水相中に含有され，基
質自身は無極性相を形成し,n−アルカノールおよび／ま
たはｎ−エポキシアルカンでなる（それは，基質の性質
による）最初の反応生産物が生産される。この生物触媒
反応の可能性は，前述のM.J.de Smetによる論文（前
述）中で研究されている。この論文においては,n−オク
テンおよびｎ−デセンのようなオレフィンを炭素源とし
て使用し，シュードモナス オレオボランスを２相系で
好気性条件下にて培養し,1,2−エポキシオクタンおよび
1,2−エポキシデカンのような化合物を生産する可能性
が述べられている。
は,2つの液相を含む系内で培養され得る。このような系
においては，バクテリア自身は，水相中に含有され，基
質自身は無極性相を形成し,n−アルカノールおよび／ま
たはｎ−エポキシアルカンでなる（それは，基質の性質
による）最初の反応生産物が生産される。この生物触媒
反応の可能性は，前述のM.J.de Smetによる論文（前
述）中で研究されている。この論文においては,n−オク
テンおよびｎ−デセンのようなオレフィンを炭素源とし
て使用し，シュードモナス オレオボランスを２相系で
好気性条件下にて培養し,1,2−エポキシオクタンおよび
1,2−エポキシデカンのような化合物を生産する可能性
が述べられている。
しかし，この方法によって行われるアルカノールの生
産において重大の欠点は，使用される微生物が，生成し
たアルカノールをさらに変換するため，生産が抑制され
ることである。オレフィンから生成する1,2−エポキシ
アルカンの場合においては，おそらく，遊離メチル基に
よるヒドロキシル化により，さらに分解する可能性もあ
る。
産において重大の欠点は，使用される微生物が，生成し
たアルカノールをさらに変換するため，生産が抑制され
ることである。オレフィンから生成する1,2−エポキシ
アルカンの場合においては，おそらく，遊離メチル基に
よるヒドロキシル化により，さらに分解する可能性もあ
る。
（発明の構成） 本発明方法は，この欠点を解決するものであり，遺伝
子操作された微生物を使用することにより特徴づけられ
る。上記遺伝子操作は，基質の末端酸化を行い末端に水
酸基もしくはエポキシ基を有する化合物とすることが可
能であるが，該酸化生成物をもはやさらに有意な程度に
変換することがないように，行われる。
子操作された微生物を使用することにより特徴づけられ
る。上記遺伝子操作は，基質の末端酸化を行い末端に水
酸基もしくはエポキシ基を有する化合物とすることが可
能であるが，該酸化生成物をもはやさらに有意な程度に
変換することがないように，行われる。
この基質の性質は所望の酸化生成物の性質に密接に関
連する。例えば，所望の酸化生成物がｎ−オクタノール
である場合には，選択される基質はｎ−オクタンであ
る。1,2−エポキシオクタンを生産することが望ましい
場合には，用いられる基質はｎ−オクテンである。使用
される基質の性質および微生物の性質に依存して，特
に，アルカン−ヒドロキシラーゼ酵素系では特異的に，
基質としてオレフィンを使用した場合には，酸化生成物
は，時には種々の化合物の混合物となる。例えば,1,2−
エポキシアルカンおよびアルケノールを含有する混合物
となる。使用される微生物およびアルカン−ヒドロキシ
ラーゼ酵素系はまた，使用し得る基質の性質を決定し得
る。
連する。例えば，所望の酸化生成物がｎ−オクタノール
である場合には，選択される基質はｎ−オクタンであ
る。1,2−エポキシオクタンを生産することが望ましい
場合には，用いられる基質はｎ−オクテンである。使用
される基質の性質および微生物の性質に依存して，特
に，アルカン−ヒドロキシラーゼ酵素系では特異的に，
基質としてオレフィンを使用した場合には，酸化生成物
は，時には種々の化合物の混合物となる。例えば,1,2−
エポキシアルカンおよびアルケノールを含有する混合物
となる。使用される微生物およびアルカン−ヒドロキシ
ラーゼ酵素系はまた，使用し得る基質の性質を決定し得
る。
本発明によれば，好ましくは，シュードモナスオレオ
ボランス種またはシュードモナス プチダ（Pseudomona
s putida）種の微生物，最も好ましくはシュードモナ
ス オレオボランス種が用いられる。このような微生物
は，本来,6〜12個の炭素原子を有するｎ−アルカンおよ
びｎ−アルケンに生育することが可能であるが，アルカ
ン−ヒドロキシラーゼ酵素系はまた，他の基質にも有効
である。そのような基質としては，例えば，プロペン，
ブテン，テトラデセン，ヘキサデセン，テトラデカン,6
〜12個の炭素原子を有するｎ−アルカジエン,6〜12個の
炭素原子を有するｎ−アルカン酸，フェニルアルカン，
フェニルアルケンなどがある。
ボランス種またはシュードモナス プチダ（Pseudomona
s putida）種の微生物，最も好ましくはシュードモナ
ス オレオボランス種が用いられる。このような微生物
は，本来,6〜12個の炭素原子を有するｎ−アルカンおよ
びｎ−アルケンに生育することが可能であるが，アルカ
ン−ヒドロキシラーゼ酵素系はまた，他の基質にも有効
である。そのような基質としては，例えば，プロペン，
ブテン，テトラデセン，ヘキサデセン，テトラデカン,6
〜12個の炭素原子を有するｎ−アルカジエン,6〜12個の
炭素原子を有するｎ−アルカン酸，フェニルアルカン，
フェニルアルケンなどがある。
本発明の好適な実施態様は,1種またはそれ以上のｎ−
アルカン,n−アルケンおよび／またはｎ−アルカジエン
（いずれも６〜12個の炭素原子を含む）を使用すること
により特徴づけられる。
アルカン,n−アルケンおよび／またはｎ−アルカジエン
（いずれも６〜12個の炭素原子を含む）を使用すること
により特徴づけられる。
原則的に，最初の酸化生成物をさらに変換する微生物
の能力を減じるために，種々の遺伝子操作法が利用され
得る。シュードモナス オレオボランスのような微生物
は，アルカノールデヒドロゲナーゼをコードするいくつ
かの遺伝子を含有するにもかかわらず，驚くべきこと
に，プラスミド上のアルカノールデヒドロゲナーゼ遺伝
子（つまりプラスミドに位置する遺伝子）の不活性化も
しくは除去により，バクテリアが最初の酸化生成物をさ
らに変換する能力が著しく減じられるということが，見
い出された。もちろん，このプラスミドのアルカノール
デヒドロゲナーゼ遺伝子により変異した微生物（その変
異は，部位特異的であり，この活性アルカノールデヒド
ロゲナーゼ酵素の発現を妨げるのに充分であり得る）
は，本発明方法に使用するのに適した微生物の例であ
る。
の能力を減じるために，種々の遺伝子操作法が利用され
得る。シュードモナス オレオボランスのような微生物
は，アルカノールデヒドロゲナーゼをコードするいくつ
かの遺伝子を含有するにもかかわらず，驚くべきこと
に，プラスミド上のアルカノールデヒドロゲナーゼ遺伝
子（つまりプラスミドに位置する遺伝子）の不活性化も
しくは除去により，バクテリアが最初の酸化生成物をさ
らに変換する能力が著しく減じられるということが，見
い出された。もちろん，このプラスミドのアルカノール
デヒドロゲナーゼ遺伝子により変異した微生物（その変
異は，部位特異的であり，この活性アルカノールデヒド
ロゲナーゼ酵素の発現を妨げるのに充分であり得る）
は，本発明方法に使用するのに適した微生物の例であ
る。
本発明方法に適した微生物は，そのものが本来有する
（天然の）プラスミドを取り出したところの宿主を用
い，それに組換え体プラスミドを付与することにより得
られる。上記組換え体プラスミドは，アルカン−ヒドロ
キシラーゼ系をコードするalkBA/R遺伝子を含み，そし
て，活性アルカノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードす
る遺伝子を含有しない。
（天然の）プラスミドを取り出したところの宿主を用
い，それに組換え体プラスミドを付与することにより得
られる。上記組換え体プラスミドは，アルカン−ヒドロ
キシラーゼ系をコードするalkBA/R遺伝子を含み，そし
て，活性アルカノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードす
る遺伝子を含有しない。
天然の（本来の）OCTプラスミドは，alkＲ制御遺伝子
の生産物により制御されるalkBACオペロン中に，必要と
される遺伝子を有する。アルカン−ヒドロキシラーゼ酵
素系をコードするこのalkBA遺伝子およびalkＲ制御遺伝
子は，適当なベクター系（例えば,pLAFRIベクター（Fri
edmanら,Gene18（1982）,289−296）を用いて，適当な
宿主中にクローン化され得る。これらalkBAおよびalkＲ
遺伝子を有し，そして，プラスミドのアルカノールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を欠く適当な組換え体プラスミド
は，プラスミドpGEc41（pLAFRIに基づく）である。
の生産物により制御されるalkBACオペロン中に，必要と
される遺伝子を有する。アルカン−ヒドロキシラーゼ酵
素系をコードするこのalkBA遺伝子およびalkＲ制御遺伝
子は，適当なベクター系（例えば,pLAFRIベクター（Fri
edmanら,Gene18（1982）,289−296）を用いて，適当な
宿主中にクローン化され得る。これらalkBAおよびalkＲ
遺伝子を有し，そして，プラスミドのアルカノールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を欠く適当な組換え体プラスミド
は，プラスミドpGEc41（pLAFRIに基づく）である。
このプラスミドpGEc41を含む，イー．コリ（E.coli）
株はCentraalbureau voor Schimmelcultures at Baarn,
The Netherlandsに1987年１月15日に，イー．コリDH1
（pGEc41）,CBS102−87として寄託された。
株はCentraalbureau voor Schimmelcultures at Baarn,
The Netherlandsに1987年１月15日に，イー．コリDH1
（pGEc41）,CBS102−87として寄託された。
本来のプラスミドがalkBA/R遺伝子を含むpGEc41また
はそれに類似するプラスミドに置き換えられたシュード
モナス オレオボランスは，もはや，炭素原子が６〜12
個のアルカン，アルケン，およびアルカノールに生育す
ることができない。少なくとも，それらは，そのような
基質に，野性型のバクテリアに比べて有意に劣る状態で
生育する。しかし，それらは，無極性相が大量に存在し
てもそれに対する抵抗性をいまだに有する。従って，そ
れらは，適当な炭素源（例えば，ピルビン酸塩，クエン
酸塩またはグルコース）を含む栄養培地の存在下にて２
液相系（つまり，バクテリアを含む水相，および有機
相）で培養され得る。上記液相は，バクテリアに実質的
な損害を与えず，そして，全量の99容量％であり得る。
良好に生育させるためには，該系のpHを５から９の間，
好ましくは6.8から7.0に制御し，温度を37℃を下回る
値，好ましくは20〜34℃，最も好ましくは28〜32℃に制
御することが推奨される。有機相および水相と，バクテ
リアとの間に接触を良好にし，撹拌を充分に行い，生成
物抑制の危険を減少させ，かつ同時に，バクテリアに損
傷を与えないためには，反応器内の内容物を，好ましく
は,500〜1000rpmの割合で撹拌し続けるか，または同程
度に振盪する。
はそれに類似するプラスミドに置き換えられたシュード
モナス オレオボランスは，もはや，炭素原子が６〜12
個のアルカン，アルケン，およびアルカノールに生育す
ることができない。少なくとも，それらは，そのような
基質に，野性型のバクテリアに比べて有意に劣る状態で
生育する。しかし，それらは，無極性相が大量に存在し
てもそれに対する抵抗性をいまだに有する。従って，そ
れらは，適当な炭素源（例えば，ピルビン酸塩，クエン
酸塩またはグルコース）を含む栄養培地の存在下にて２
液相系（つまり，バクテリアを含む水相，および有機
相）で培養され得る。上記液相は，バクテリアに実質的
な損害を与えず，そして，全量の99容量％であり得る。
良好に生育させるためには，該系のpHを５から９の間，
好ましくは6.8から7.0に制御し，温度を37℃を下回る
値，好ましくは20〜34℃，最も好ましくは28〜32℃に制
御することが推奨される。有機相および水相と，バクテ
リアとの間に接触を良好にし，撹拌を充分に行い，生成
物抑制の危険を減少させ，かつ同時に，バクテリアに損
傷を与えないためには，反応器内の内容物を，好ましく
は,500〜1000rpmの割合で撹拌し続けるか，または同程
度に振盪する。
基質の変換により生成した生成物の不利な効果をでき
る限り最小とするために，本発明のさらに好ましい実施
態様においては，第２の有機相が使用される。この有機
相は，水相で生成する酸化生成物を，該生成物の分配係
数に基づいて，より効果的に水相から除去する。上記生
成物は，使用する有機相に対して，水よりも非常に親和
性を示す。このような目的においては，例えば，シクロ
ヘキサン，シクロヘキサノール，フタル酸エステルおよ
びジエステル（例えばフタル酸ジブチル）が適当である
ことが見出された。例えば，第２の有機相としてフタル
酸ジブチルを，本発明方法による微生物を用いたオクタ
ンからのオクタノールの製造系に加えることにより，生
成物の最終濃度は２倍となり得る。
る限り最小とするために，本発明のさらに好ましい実施
態様においては，第２の有機相が使用される。この有機
相は，水相で生成する酸化生成物を，該生成物の分配係
数に基づいて，より効果的に水相から除去する。上記生
成物は，使用する有機相に対して，水よりも非常に親和
性を示す。このような目的においては，例えば，シクロ
ヘキサン，シクロヘキサノール，フタル酸エステルおよ
びジエステル（例えばフタル酸ジブチル）が適当である
ことが見出された。例えば，第２の有機相としてフタル
酸ジブチルを，本発明方法による微生物を用いたオクタ
ンからのオクタノールの製造系に加えることにより，生
成物の最終濃度は２倍となり得る。
本発明は，次の実施例のなかで，そして，次の実施例
により説明される。
により説明される。
（実施例） 1.遺伝子操作 a.使用されるバクテリアの株 遺伝子操作に用いられるバクテリアの株は，表Ａに示
される。
される。
b.培地 イー．コリおよびシュードモナス プチダは，栄養源
（0.2％w/v）および必要とされるアミノ酸（0.01％w/
v）を含むＬ培地またはＥ＊培地で培養を行った。
（0.2％w/v）および必要とされるアミノ酸（0.01％w/
v）を含むＬ培地またはＥ＊培地で培養を行った。
Ｌ培地 含有成分： 5g/ 酵母抽出物 10g/ バクトトリプトン 10g/ NaCl pHを7.5に調整 Ｅ＊培地 含有成分： 3.5g/ NaNH4HPO4・4H2O 7.5g/ K2HPO4.3H2O 3.7g/ KH2PO4 滅菌後,100mM MgSO4溶液（滅菌）10ml,および微量成
分溶液（1000×MTと呼ばれる）1mlを加えた。1000×MT
は１あたり次の成分を含有する： 2.78g FeSO4・7H2O 1.98g MnCl2・4H2O 2.81g CoSO4・7H2O 1.47g CaCl2・2H2O 0.17g CuCl2・2H2O 0.29g ZnSO4・7H2O オクタンで生育させる場合には，使用される株は，ア
ガロース1.5％（W/V）を含むＥ＊培地を用い，密閉キャ
ニスター中，オクタン蒸気雰囲気下で32℃にて培養を行
った。テトラサイクリン耐性により選抜を行うために，
テトラサイクリンを15μg/mlの濃度にまで添加した。
分溶液（1000×MTと呼ばれる）1mlを加えた。1000×MT
は１あたり次の成分を含有する： 2.78g FeSO4・7H2O 1.98g MnCl2・4H2O 2.81g CoSO4・7H2O 1.47g CaCl2・2H2O 0.17g CuCl2・2H2O 0.29g ZnSO4・7H2O オクタンで生育させる場合には，使用される株は，ア
ガロース1.5％（W/V）を含むＥ＊培地を用い，密閉キャ
ニスター中，オクタン蒸気雰囲気下で32℃にて培養を行
った。テトラサイクリン耐性により選抜を行うために，
テトラサイクリンを15μg/mlの濃度にまで添加した。
c.DNAの単離 イー．コリおよびシュードモナス プチダのプラスミ
ドDNAは,H.C.BmirnboimおよびJ.Doly（Nucl.Acids Res.
7（1979）;1513−1523）の方法により単離された。
ドDNAは,H.C.BmirnboimおよびJ.Doly（Nucl.Acids Res.
7（1979）;1513−1523）の方法により単離された。
d.酵素 制限エンドヌクレアーゼ,T4 DNAリガーゼおよびニワ
トリ卵白リゾチームは,Boehringer Mannheim GmbH（Man
nheim,Federal Republic of Germany）およびBethesda
Research Labs GmbH（Neu Isenburg,Federal Republic
of Germany）から入手した。これらは，供給業者の指示
書に従って使用された。
トリ卵白リゾチームは,Boehringer Mannheim GmbH（Man
nheim,Federal Republic of Germany）およびBethesda
Research Labs GmbH（Neu Isenburg,Federal Republic
of Germany）から入手した。これらは，供給業者の指示
書に従って使用された。
e.GPo−12の突然変異誘発 GPo−１を32℃の水浴中で振盪しながら，細胞密度が
0.1mg/mlになるまでＬ培地で培養した。この培養液にニ
トロソグアニジン（NTG）を終濃度が50μg/mlとなるよ
うに添加し，さらに30分間インキュベーションを続け
た。その後この細胞を遠心分子（5000g,5分間）し，細
胞密度が0.05μg/mlとなるように新しいＬ培地に再懸濁
した。その後この培養物を32℃で１晩インキュベート
し，次いで単離コロニーを得るために希釈してＬ平板培
地にプレートした。これらの培養物は，グルコースを含
有するＥ＊培地，オクタン蒸気雰囲気下のＥ＊培地，お
よびオクタノール蒸気雰囲気下のＥ＊培地で試験を行っ
た。3,500コロニーが得られ，そのうちの７コロニーは
オクタンでは増殖不可能であったが，オクタノールでは
増殖し，これらのコロニーをさらに突然変異の型につい
て調べた。この試験は，これらのコロニーがすべてOCT
プラスミドを欠失していることを示した。これらの７突
然変異体のうちの１つは,GPo−12と命名された。OCTプ
ラスミドがこの株に再導入された場合，該株は通常のGP
o−１のような性質を示す。
0.1mg/mlになるまでＬ培地で培養した。この培養液にニ
トロソグアニジン（NTG）を終濃度が50μg/mlとなるよ
うに添加し，さらに30分間インキュベーションを続け
た。その後この細胞を遠心分子（5000g,5分間）し，細
胞密度が0.05μg/mlとなるように新しいＬ培地に再懸濁
した。その後この培養物を32℃で１晩インキュベート
し，次いで単離コロニーを得るために希釈してＬ平板培
地にプレートした。これらの培養物は，グルコースを含
有するＥ＊培地，オクタン蒸気雰囲気下のＥ＊培地，お
よびオクタノール蒸気雰囲気下のＥ＊培地で試験を行っ
た。3,500コロニーが得られ，そのうちの７コロニーは
オクタンでは増殖不可能であったが，オクタノールでは
増殖し，これらのコロニーをさらに突然変異の型につい
て調べた。この試験は，これらのコロニーがすべてOCT
プラスミドを欠失していることを示した。これらの７突
然変異体のうちの１つは,GPo−12と命名された。OCTプ
ラスミドがこの株に再導入された場合，該株は通常のGP
o−１のような性質を示す。
f.遺伝的方法 pLAFRIのイー．コリからシュードモナス プチダへの
移動は,Friedmannら,Gene 16（1982）,289−296により
記載されている“三親接合（triparentalmating）”に
より行った。供与菌株，受容菌株，およびヘルパー菌株
がＬ平板培地で１晩培養されている場合，テトラサイク
リン，グルコース，および必須アミノ酸を含有するＥ＊
平板培地にプレートするレプリカ法により接合体を選択
した。
移動は,Friedmannら,Gene 16（1982）,289−296により
記載されている“三親接合（triparentalmating）”に
より行った。供与菌株，受容菌株，およびヘルパー菌株
がＬ平板培地で１晩培養されている場合，テトラサイク
リン，グルコース，および必須アミノ酸を含有するＥ＊
平板培地にプレートするレプリカ法により接合体を選択
した。
プラスミドDANでのイー．コリの形質転換は,Cohenら
の方法（Cohen SN,Chang ACおよびHSU L,Proc.Natl.Aca
d.Sci.69（1972）,2110−2114）により行った。インビ
トロでλファージパッケージの抽出を行い,pLAFRIのDNA
をHohnの方法（Hohn,B:R.Wu（編）,Methods in Enzymol
ogy 68（1979）,pp 299−309,Academic Press Inc.,New
York）によりパッケージングした。
の方法（Cohen SN,Chang ACおよびHSU L,Proc.Natl.Aca
d.Sci.69（1972）,2110−2114）により行った。インビ
トロでλファージパッケージの抽出を行い,pLAFRIのDNA
をHohnの方法（Hohn,B:R.Wu（編）,Methods in Enzymol
ogy 68（1979）,pp 299−309,Academic Press Inc.,New
York）によりパッケージングした。
形質導入にはイー．コリHB101を用いた（Boyerら），
この大腸菌を5mlのＬ培地で１晩培養した。次に細胞を
遠心分離し,5mlの10mM MgSO4に再懸濁し,1晩静置した。
翌日，これらの飢餓状態のイー．コリ細胞をインビトロ
におけるパッケージコスミドの正確な量と混合し，室温
で15分間インキュベートした。その後,0,2mlのＬ培地を
添加し，細胞懸濁液を37℃で１時間インキュベートし
た。次いで，イー．コリの形質導入体をテトラサイクリ
ンを含有するＬ平板培地にプレートした。
この大腸菌を5mlのＬ培地で１晩培養した。次に細胞を
遠心分離し,5mlの10mM MgSO4に再懸濁し,1晩静置した。
翌日，これらの飢餓状態のイー．コリ細胞をインビトロ
におけるパッケージコスミドの正確な量と混合し，室温
で15分間インキュベートした。その後,0,2mlのＬ培地を
添加し，細胞懸濁液を37℃で１時間インキュベートし
た。次いで，イー．コリの形質導入体をテトラサイクリ
ンを含有するＬ平板培地にプレートした。
g.株の構築 pGEc29（alkBACオペロンを含む16.9kbの挿入断片を有
するpLAFRI）とpGEc40（alkＲ遺伝子座を含む18kbの挿
入断片を有するpLAFRI9とを，EcoRIで消化した後に1:1
の割合で互いに結合させた。この結合混合物をインビト
ロでλファージの頭殻にパッケージングし，この混合物
でHB101（イー．コリ）の形質導入を行った。形質導入
体を同定するために，この材料をテトラサイクリン耐性
について選択した。このように,18kbおよび16.9kbの両
方の挿入断片をpLAFRI内に有するプラスミド（pGEc47）
がイー．コリHB101内で得られた。さらに，完全なalkＲ
遺伝子座および自然的な欠失によりalkBACオペロンの一
部のみ，つまりalkBAを含むプラスミド（pGEc41）が得
られた（第３図ｂを参照のこと）。それゆえにこのプラ
スミドは，プラスミドがコードしているアルカノールデ
ヒドロゲナーゼ（alkＣ）を欠いている。pGEc41およびp
GEc47の遺伝子的決定因子については表Ｃを参照のこ
と。pGEc41およびpGEc47の両方のプラスミドを，シュー
ドモナス プチダおよびプラスミドが除去されているシ
ュードモナス オレオボランスGPo−12株に接合により
導入した（上記ｆを参照のこと）。増殖の特性について
は表Ｂを参照のこと。
するpLAFRI）とpGEc40（alkＲ遺伝子座を含む18kbの挿
入断片を有するpLAFRI9とを，EcoRIで消化した後に1:1
の割合で互いに結合させた。この結合混合物をインビト
ロでλファージの頭殻にパッケージングし，この混合物
でHB101（イー．コリ）の形質導入を行った。形質導入
体を同定するために，この材料をテトラサイクリン耐性
について選択した。このように,18kbおよび16.9kbの両
方の挿入断片をpLAFRI内に有するプラスミド（pGEc47）
がイー．コリHB101内で得られた。さらに，完全なalkＲ
遺伝子座および自然的な欠失によりalkBACオペロンの一
部のみ，つまりalkBAを含むプラスミド（pGEc41）が得
られた（第３図ｂを参照のこと）。それゆえにこのプラ
スミドは，プラスミドがコードしているアルカノールデ
ヒドロゲナーゼ（alkＣ）を欠いている。pGEc41およびp
GEc47の遺伝子的決定因子については表Ｃを参照のこ
と。pGEc41およびpGEc47の両方のプラスミドを，シュー
ドモナス プチダおよびプラスミドが除去されているシ
ュードモナス オレオボランスGPo−12株に接合により
導入した（上記ｆを参照のこと）。増殖の特性について
は表Ｂを参照のこと。
用いたベクターpLAFRI（Tc,Tra,Mob,RK2レプリコン）
はFriedmanら,Gene 18（1982）,289−296により記載さ
れたものである。関連するDNA断片は全て，シュードモ
ナス オレオボランスの全ゲノムの遺伝子ライブラリー
から単離した。この遺伝子ライブラリーはEgginkにより
作成され,Innovations in Biotechnology（1984）,Vol.
22,E.HouwinkおよびR.R.van der Meer（編）,pp 373−3
80に記載されたものである。
はFriedmanら,Gene 18（1982）,289−296により記載さ
れたものである。関連するDNA断片は全て，シュードモ
ナス オレオボランスの全ゲノムの遺伝子ライブラリー
から単離した。この遺伝子ライブラリーはEgginkにより
作成され,Innovations in Biotechnology（1984）,Vol.
22,E.HouwinkおよびR.R.van der Meer（編）,pp 373−3
80に記載されたものである。
選択は，表Ｃに示すような相補性により影響を受け
た。
た。
プラスミドpGEc29,pGEc40およびpGEc47は，EcoRIで消
化したpLAFRIを結合することにより得た。
化したpLAFRIを結合することにより得た。
第１図は,pGEc40に挿入したEcoRI断片Ｂの制限酵素切
断地図を示すものであり，該断片はalkＲ遺伝子座を有
している。
断地図を示すものであり，該断片はalkＲ遺伝子座を有
している。
第２図は，alkBACオペロンを有しており,pGEc29に挿
入されたEcoRI断片Ａの制限酵素切断地図を示す。
入されたEcoRI断片Ａの制限酵素切断地図を示す。
第３図ａは，alkBACオペロンおよびalkＲ遺伝子座を
有する,pGEc47への挿入断片の制限酵素切断地図を示
す。
有する,pGEc47への挿入断片の制限酵素切断地図を示
す。
第３図ｂは，alkBACオペロン部分が5kb欠失しているE
coRI断片ＡおよびＢからなる,pGEc41への挿入断片の制
限酵素切断地図を示す。この欠失で失われた制限部位
は，図中に示されている。この影響のために，EcoRI部
位は２つの断片に属している。欠失はalkBACオペロンの
下流領域にまで及び,12.0と12.2の位置におけるSst Iと
Pst I部位との間で終わっている。この欠失部分は断片
Ｂの小部分（0.1〜0.5kb）のみからなっており，そのた
めalkＲ遺伝子座は欠失部分の外側に保持されている。
増殖の試験により，特にアルカノールデヒドロゲナーゼ
をコードする染色体における突然変異を有するPpS81株
は，プラスミドのアルカノールデヒドロゲナーゼ遺伝子
に関する欠失を示していた：一方,GPp−10（PpS−81・p
GEc47）株はGPp−９（PpG−１・pGEc41）と同様にオク
タンを含有する培地で迅速に増殖し,GPp−11（PpS−81
・pGEc41）株はオクタンを含有する培地ではほとんど増
殖しないことが見い出された。
coRI断片ＡおよびＢからなる,pGEc41への挿入断片の制
限酵素切断地図を示す。この欠失で失われた制限部位
は，図中に示されている。この影響のために，EcoRI部
位は２つの断片に属している。欠失はalkBACオペロンの
下流領域にまで及び,12.0と12.2の位置におけるSst Iと
Pst I部位との間で終わっている。この欠失部分は断片
Ｂの小部分（0.1〜0.5kb）のみからなっており，そのた
めalkＲ遺伝子座は欠失部分の外側に保持されている。
増殖の試験により，特にアルカノールデヒドロゲナーゼ
をコードする染色体における突然変異を有するPpS81株
は，プラスミドのアルカノールデヒドロゲナーゼ遺伝子
に関する欠失を示していた：一方,GPp−10（PpS−81・p
GEc47）株はGPp−９（PpG−１・pGEc41）と同様にオク
タンを含有する培地で迅速に増殖し,GPp−11（PpS−81
・pGEc41）株はオクタンを含有する培地ではほとんど増
殖しないことが見い出された。
2.末端に水酸基またはエポキシ基を有する化合物の調製 a.工程の至適条件 アルカンのヒドロキシル化およびアルケンのエポキシ
化についての工程の至適条件を決定するために，使用溶
液が１の撹拌反応タンクに入れたＥ＊培地およびアル
カン類またはアルケン類の混合物中でシュードモナス
オレオボランスの増殖の至適条件を決めた。
化についての工程の至適条件を決定するために，使用溶
液が１の撹拌反応タンクに入れたＥ＊培地およびアル
カン類またはアルケン類の混合物中でシュードモナス
オレオボランスの増殖の至適条件を決めた。
シュードモナス オレオボランスは，オクタン存在下
のＥ＊培地で前培養を１晩行った。主な培養物を,B.Wit
hlt（Witholt B,J.Bacteriol 109（1972）,350−364）
により記載されているように,450nmで測定される細胞密
度が0.1mgの細胞乾燥重量/ml水相となるように接種し
た。得られた増殖曲線から増殖率を決定した。水相と有
機相とを合わせた全容積は常に700mlであった。
のＥ＊培地で前培養を１晩行った。主な培養物を,B.Wit
hlt（Witholt B,J.Bacteriol 109（1972）,350−364）
により記載されているように,450nmで測定される細胞密
度が0.1mgの細胞乾燥重量/ml水相となるように接種し
た。得られた増殖曲線から増殖率を決定した。水相と有
機相とを合わせた全容積は常に700mlであった。
以下のように至適条件が決定された： pH:n−アルカン類でのシュードモナス オレオボラン
スの増殖は,5〜９の間の値で可能であった。至適pHの範
囲はpH6.8〜7.0の間である。
スの増殖は,5〜９の間の値で可能であった。至適pHの範
囲はpH6.8〜7.0の間である。
温度：シュードモナス オレオボランスはｎ−アルカン
類で,37℃以下の温度で増殖でき，明らかな至適温度は
約30℃である。
類で,37℃以下の温度で増殖でき，明らかな至適温度は
約30℃である。
撹拌速度：小容量の発酵容器での撹拌速度は，増殖のた
めには500〜1000rpmの間が至適であることが判明した。
めには500〜1000rpmの間が至適であることが判明した。
分画有機相：反応溶液の全容積に対するアルカンの％
（v/v）を変化させると，シュードモナス オレオボラ
ンスは明らかに損傷をうけることなく0.5〜99％の有機
相で増殖し得る。
（v/v）を変化させると，シュードモナス オレオボラ
ンスは明らかに損傷をうけることなく0.5〜99％の有機
相で増殖し得る。
b.遺伝子組換え株による１−オクタノールおよびエポキ
シ−オクタンの生産 遺伝子操作された株によるｎ−オクタンからの１−オ
クタノールの生産，およびオクタンからの1,2−エポキ
シオクタンの生産のために，これらの株は炭素源および
エネルギー源としてピルビン酸塩を含有するＥ＊培地で
培養した。この株をＥ＊平板培地から5mlのＬ培地に接
種し，テトラサイクリンの存在下で前培養を30℃,8時間
行った。
シ−オクタンの生産 遺伝子操作された株によるｎ−オクタンからの１−オ
クタノールの生産，およびオクタンからの1,2−エポキ
シオクタンの生産のために，これらの株は炭素源および
エネルギー源としてピルビン酸塩を含有するＥ＊培地で
培養した。この株をＥ＊平板培地から5mlのＬ培地に接
種し，テトラサイクリンの存在下で前培養を30℃,8時間
行った。
その後，これら前培養物を250mlのエルレンマイアー
フラスコ内の１％（w/v）ピルビン酸塩およびテトラサ
イクリンを含有する50mlのＥ＊培地に移し，振盪板上,2
00rpm,30℃で１晩培養した。翌日，これら培養物をＥ＊
培地および20％（v/v）有機相を入れた発酵容器に,0.1
〜0.2mgの細胞乾燥重量/ml水相の細胞密度となるように
移した。最終的な全容積は700mlであり，そのうち140ml
は有機相（オクタンまたはオクテン），そして560mlは
水相であった。
フラスコ内の１％（w/v）ピルビン酸塩およびテトラサ
イクリンを含有する50mlのＥ＊培地に移し，振盪板上,2
00rpm,30℃で１晩培養した。翌日，これら培養物をＥ＊
培地および20％（v/v）有機相を入れた発酵容器に,0.1
〜0.2mgの細胞乾燥重量/ml水相の細胞密度となるように
移した。最終的な全容積は700mlであり，そのうち140ml
は有機相（オクタンまたはオクテン），そして560mlは
水相であった。
アルカン類での増殖に至適であることが認められた条
件下で，つまり,pH7.0（2N KOHおよび2N H2SO4で調整）
および30℃の温度，撹拌速度700rpmおよび酵素分圧が約
50％空気飽和の条件下で，遺伝子操作された株による生
産を，ピルビン酸塩での増殖の間およびそれに続く窒素
制限の結果としての定常期の間の両方で調べた。有機相
中の生産物濃度を測定した。生産は，第４図に細胞培養
物の比活性として，生成された生産物μmol/分/g乾燥細
胞容積で示す。この比活性は試験した株で高値である
が，対数増殖期と定常期の間に急速に低下する。
件下で，つまり,pH7.0（2N KOHおよび2N H2SO4で調整）
および30℃の温度，撹拌速度700rpmおよび酵素分圧が約
50％空気飽和の条件下で，遺伝子操作された株による生
産を，ピルビン酸塩での増殖の間およびそれに続く窒素
制限の結果としての定常期の間の両方で調べた。有機相
中の生産物濃度を測定した。生産は，第４図に細胞培養
物の比活性として，生成された生産物μmol/分/g乾燥細
胞容積で示す。この比活性は試験した株で高値である
が，対数増殖期と定常期の間に急速に低下する。
生産におけるこの著しい低下は，一部は生成物阻害に
よるものであり得る。この生成物阻害は，生成された生
産物（１−オクタノール）を水相からより効果的に回収
する第二の有機相を添加することにより，大部分を防ぎ
得る。シクロヘキサン，シクロヘキサノールおよびフタ
ル酸のジエステル類がこの目的に適切であることが見出
されている。特に，フタル酸ジブチルは最終生産物濃度
を２倍に増加させる。
よるものであり得る。この生成物阻害は，生成された生
産物（１−オクタノール）を水相からより効果的に回収
する第二の有機相を添加することにより，大部分を防ぎ
得る。シクロヘキサン，シクロヘキサノールおよびフタ
ル酸のジエステル類がこの目的に適切であることが見出
されている。特に，フタル酸ジブチルは最終生産物濃度
を２倍に増加させる。
しかしながら，これらの株によるオクテンのエポキシ
化は低いままであり，これはおそらく遺伝子操作を行っ
た株の有機相への抵抗性が低下したためである。
化は低いままであり，これはおそらく遺伝子操作を行っ
た株の有機相への抵抗性が低下したためである。
第４図は，試験した株のオクタノールおよび1,2−エ
ポキシオクタンの生産を，細胞培養物の比活性としてμ
mol生産物／分/g乾燥細胞容積で示す。点線は定常期へ
の移行を示す。
ポキシオクタンの生産を，細胞培養物の比活性としてμ
mol生産物／分/g乾燥細胞容積で示す。点線は定常期へ
の移行を示す。
第１図はpGEc40に挿入されたEcoRI断片Ｂの制限酵素切
断地図，第２図はpGEc29に挿入されたEcoRI断片Ａの制
限酵素切断地図，第３図ａはpGEc47への挿入断片の制限
酵素切断地図，第３図ｂはpGEc41への挿入断片の制限酵
素切断地図，第４図ａおよびｂは遺伝子組換え株による
オクタノールおよびエポキシ−オクタンの生産を示すグ
ラフである。
断地図，第２図はpGEc29に挿入されたEcoRI断片Ａの制
限酵素切断地図，第３図ａはpGEc47への挿入断片の制限
酵素切断地図，第３図ｂはpGEc41への挿入断片の制限酵
素切断地図，第４図ａおよびｂは遺伝子組換え株による
オクタノールおよびエポキシ−オクタンの生産を示すグ
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 7/02 - 7/22 C12N 1/20 - 1/21 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (15)
- 【請求項１】シュードモナス オレオボランス（Pseudo
monas oleovorans）由来のω−ヒドロキシラーゼ，ルブ
レドキシン，およびルブレドキシンレダクターゼからな
るアルカン−ヒドロキシラーゼ酵素系を有し，そしてプ
ラスミドにコードされる活性アルカノールデヒドロゲナ
ーゼが存在しないように遺伝子操作されているPseudomo
nas属の微生物を用いて，末端に水酸基またはエポキシ
基を有する酸化生成物を製造するための方法であって， 該方法は，該微生物を該栄養培地内で培養する工程，お
よび形成された該酸化生成物を回収する工程を包含し， 該微生物は，好気条件下で大容量の非水相を含有する水
性栄養培地中で該酵素系により脂肪族基質または基質の
脂肪族側鎖の末端酸化を行い，そして該活性なアルカノ
ールデヒドロゲナーゼが存在しないことによって該酸化
生成物のさらなる酸化を防ぎ， 該微生物は，該非水相の存在に抵抗性であり，そして 該微生物は,OCTプラスミドにおける位置が以下に示され
る，プラスミドにコードされるアルカノールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子alk Cの部分を欠失することにより遺伝子
操作された，方法： - 【請求項２】前記基質として,6〜12個の炭素原子を有す
るｎ−アルカン,n−アルケンおよび／またはｎ−アルカ
ジエンの１種またはそれ以上を用いる特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 - 【請求項３】シュードモナス オレオボランス（Pseudo
monas oleozorans）またはシュードモナス プチダ（Ps
eudomonas putida）の微生物を用いる特許請求の範囲第
１項または２項に記載の方法。 - 【請求項４】少なくともプラスミドのアルカノール−デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子が除去されるかまたは不活性化さ
れているシュードモナス オレオボランスに属する株を
用いる特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】天然のプラスミドが，アルカン−ヒドロキ
シラーゼ系をコードするalkBA/R遺伝子を含むが，活性
アルカノール−デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝
子を含まないプラスミドで置換されているシュードモナ
ス オレオボランスに属する株を用いる特許請求の範囲
第３項に記載の方法。 - 【請求項６】天然のプラスミドがプラスミドpGEc 41で
置換されているシュードモナスオレオボランスに属する
株を用いる特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】前記微生物が,20〜34℃，好ましくは28〜3
2℃の温度にて,pHが５〜9,好ましくは6.8〜7.0の値であ
るように調整されている二液相系で培養される特許請求
の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】反応容器の内容物が撹拌速度500〜1000rpm
で撹拌される特許請求の範囲第１項から第７項のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項９】適当な炭素源，例えばピルビン酸塩，クエ
ン酸塩および／またはグルコースを含む栄養培地を用い
る特許請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１０】前記酸化生成物が可溶な第２有機相，例
えばジブチルフタレート，シクロヘキサンおよび／また
はシクロヘキサノールを添加する特許請求の範囲第１項
から第９項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】シュードモナス オレオボランス（Pseu
domonas oleovorans）由来のω−ヒドロキシラーゼ，ル
ブレドキシン，およびルブレドキシンレダクターゼから
なるアルカン−ヒドロキシラーゼ酵素系を有し，そして
プラスミドにコードされる活性アルカノールデヒドロゲ
ナーゼが存在しないように遺伝子操作されているPseudo
monas属の微生物であって， 該微生物は，好気条件下で大容量の非水相を含有する水
性栄養培地中で該酵素系により脂肪族基質または脂肪族
側鎖の末端酸化を行い，そして該活性なアルカノールデ
ヒドロゲナーゼが存在しないことによって該酸化生成物
のさらなる酸化を防ぎ， 該微生物は，該非水相の存在に抵抗性であり， 該微生物は,OCTプラスミドにおける位置が以下に示され
る，プラスミドにコードされるアルカノールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子alk Cの部分を欠失することにより遺伝子
操作された，微生物： - 【請求項１２】シュードモナス オレオボランス（Pseu
domonas oleovorans）またはシュードモナス プチダ
（Pseudomonas putida）に属する特許請求の範囲第11項
に記載の微生物。 - 【請求項１３】少なくともプラスミドのアルカノール−
デヒドロゲナーゼ遺伝子が除去されるかまたは不活性化
されているシュードモナス オレオボランスに属する特
許請求の範囲第12項に記載の微生物。 - 【請求項１４】天然のプラスミドが，アルカン−ヒドロ
キシラーゼ系をコードするalkBA/R遺伝子を含むが，活
性アルカノール−デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺
伝子を含まないプラスミドで置換されているシュードモ
ナス オレオボランスに属する特許請求の範囲第12項に
記載の微生物。 - 【請求項１５】天然のプラスミドがプラスミドpGEc 41
で置換されているシュードモナスオレオボランスに属す
る特許請求の範囲第14項に記載の微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8700085A NL8700085A (nl) | 1987-01-15 | 1987-01-15 | Werkwijze voor het bereiden van verbindingen met eindstandige hydroxyl- of epoxygroep; daarvoor bruikbare microorganismen. |
| NL8700085 | 1987-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63273483A JPS63273483A (ja) | 1988-11-10 |
| JP2790630B2 true JP2790630B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=19849416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63006747A Expired - Lifetime JP2790630B2 (ja) | 1987-01-15 | 1988-01-14 | 末端に水酸基またはエポキシ基を有する化合物の製造法およびそれに適した微生物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5032512A (ja) |
| EP (1) | EP0277674B1 (ja) |
| JP (1) | JP2790630B2 (ja) |
| CA (1) | CA1297439C (ja) |
| DE (1) | DE3853548T2 (ja) |
| NL (1) | NL8700085A (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5518907A (en) * | 1989-06-07 | 1996-05-21 | Center For Innovative Technology | Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway |
| US5334520A (en) * | 1990-05-25 | 1994-08-02 | Center For Innovative Technology | Production of poly-beta-hydroxybutyrate in transformed escherichia coli |
| CZ279464B6 (cs) * | 1990-09-24 | 1995-05-17 | Lonza A.G. | Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, hybridní plasmidy pL05 a p L04 uložené v mikroorganismech Pseudomonas putida a Escherichia coli |
| IE75349B1 (en) * | 1991-03-07 | 1997-08-27 | Lonza Ag | A process for the terminal hydroxylation of ethyl groups on aromatic 5- or 6-membered heterocyclic compounds |
| US6524812B1 (en) | 1993-10-07 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Genes encoding resistance to DNA alkylating agents |
| US6495348B1 (en) * | 1993-10-07 | 2002-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mitomycin biosynthetic gene cluster |
| US20030201227A1 (en) * | 1996-12-17 | 2003-10-30 | Perriello Felix Anthony | Remediation of odorous media |
| US7182871B2 (en) * | 1996-12-17 | 2007-02-27 | Global Biosciences, Inc. | Wastewater treatment with alkanes |
| EP1149918A1 (de) * | 2000-04-27 | 2001-10-31 | Creavis Gesellschaft für Technologie und Innovation mbH | Verfahren zur Oxidation von Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Mikroorganismen |
| DE102010015807A1 (de) | 2010-04-20 | 2011-10-20 | Evonik Degussa Gmbh | Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt |
| DE102011110945A1 (de) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Evonik Degussa Gmbh | Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt |
| EP2620504A1 (en) * | 2012-01-25 | 2013-07-31 | Evonik Industries AG | Process for oxidizing alkenes employing the Pseudomonas putida GPo1 AlkB monooxygenase |
| EP3143075B1 (en) | 2014-05-16 | 2022-05-18 | Carbios | Process of recycling mixed pet plastic articles |
| US10287561B2 (en) | 2014-10-21 | 2019-05-14 | Carbios | Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof |
| WO2016097325A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Carbios | Plastic compound and preparation process |
| US10508269B2 (en) | 2015-03-13 | 2019-12-17 | Carbios | Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof |
| EP3307812B1 (en) | 2015-06-12 | 2024-05-08 | Carbios | Biodegradable polyester composition and uses thereof |
| WO2017108577A1 (en) | 2015-12-21 | 2017-06-29 | Carbios | Recombinant yeast cells producing polylactic acid and uses thereof |
| WO2017198786A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | Carbios | A process for degrading plastic products |
| US10920290B2 (en) | 2017-02-15 | 2021-02-16 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Engineered bacterial strain that reduces antibiotic-resistant Enterococcus colonization in the GI tract |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3813316A (en) * | 1972-06-07 | 1974-05-28 | Gen Electric | Microorganisms having multiple compatible degradative energy-generating plasmids and preparation thereof |
| EP0062492B1 (en) * | 1981-04-02 | 1986-07-02 | Imperial Chemical Industries Plc | Microbiological oxidation process |
| CA1189807A (en) * | 1982-06-28 | 1985-07-02 | Ching-Tsang Hou | Microbiological process for oxidation of alkanes, vinyl compounds and secondary alcohols |
| WO1984001154A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Amgen | Method and materials for the microbiological oxidation of aromatic hydrocarbons |
-
1987
- 1987-01-15 NL NL8700085A patent/NL8700085A/nl not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-01-14 JP JP63006747A patent/JP2790630B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-14 DE DE3853548T patent/DE3853548T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-14 CA CA000556478A patent/CA1297439C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-14 US US07/143,826 patent/US5032512A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-14 EP EP88200052A patent/EP0277674B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL8700085A (nl) | 1988-08-01 |
| EP0277674A1 (en) | 1988-08-10 |
| US5032512A (en) | 1991-07-16 |
| CA1297439C (en) | 1992-03-17 |
| JPS63273483A (ja) | 1988-11-10 |
| DE3853548T2 (de) | 1995-09-21 |
| EP0277674B1 (en) | 1995-04-12 |
| DE3853548D1 (de) | 1995-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2790630B2 (ja) | 末端に水酸基またはエポキシ基を有する化合物の製造法およびそれに適した微生物 | |
| JP3023984B2 (ja) | カンジダ・トロピカリスゲノムの部位特異的一時変異方法 | |
| KR100662896B1 (ko) | 유전자 변형된 미생물의 폴리하이드록시알카노에이트 생성체 | |
| JPH03103193A (ja) | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 | |
| JP2000512483A (ja) | バニリンの生産 | |
| CA2113551A1 (fr) | Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes | |
| AU754472B2 (en) | Novel genetically modified lactic acid bacteria having modified diacetyl reductase activities | |
| JP2799380B2 (ja) | 新規酵素 | |
| WO2007049716A1 (ja) | 新規プラスミドベクター及びプラスミドを安定に保持する形質転換体 | |
| Cantrell et al. | Identification and characterization of plasmids in hydrogen uptake positive and hydrogen uptake negative strains of Rhizobium japonicum | |
| CA2582969A1 (en) | Process for producing 4-vinylguaiacol by biodecarboxylation of ferulic acid | |
| WO2005052152A1 (ja) | マクロライド系化合物の水酸化に関与するｄｎａ | |
| JPH084515B2 (ja) | 有機化合物の製造方法 | |
| CN113061560A (zh) | 一种拟无枝酸菌的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| US5173428A (en) | Microorganisms suitable for producing compounds containing a terminal hydroxyl or epoxy group | |
| JPH1156372A (ja) | ユビキノン−１０の生成方法 | |
| US4824781A (en) | Microbiologically produced d(-)-mandelate-dehydrogenase process for obtaining it and its use | |
| JP4221476B2 (ja) | イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻 | |
| FR2780733A1 (fr) | Polynucleotide, vecteur et cellule hote le contenant, polypeptide correspondant, procede pour leur production et leur utilisation | |
| EP0500188B1 (en) | Process for the preparation of alpha-acetolactic acid | |
| US9340809B2 (en) | Microbial conversion of sugar acids and means therein | |
| US5747310A (en) | Gene integration into chromosomes of lactobacillus delbrueckii species and integrants thereof | |
| JP4505620B2 (ja) | イコサペンタエン酸を産生する微生物及びイコサペンタエン酸の製造方法 | |
| AU783660B2 (en) | Lactic acid bacteria transformed to be provided with respiratory metabolism, and ferments comprising said lactic acid bacteria | |
| JP4012955B2 (ja) | ドコサヘキサエン酸を産生する微生物及びドコサヘキサエン酸の製造方法 |