JP3023984B2 - カンジダ・トロピカリスゲノムの部位特異的一時変異方法 - Google Patents
カンジダ・トロピカリスゲノムの部位特異的一時変異方法Info
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- C12P7/44—Polycarboxylic acids
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
- Y10S435/924—Candida tropicalis
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 この発明は、酵母菌カンジダ・トロピカリス（Candid
a tropicalis）のゲノムの高度に特異的な一時変異法に
関する。また、この発明は、重複的なPOX4およびPOX5遺
伝子分断をおこなうカンジダ・トロピカリス菌株および
ジカルボン酸を製造するための該菌株の使用法に関す
る。
a tropicalis）のゲノムの高度に特異的な一時変異法に
関する。また、この発明は、重複的なPOX4およびPOX5遺
伝子分断をおこなうカンジダ・トロピカリス菌株および
ジカルボン酸を製造するための該菌株の使用法に関す
る。
2.関連技術の説明 脂肪酸ジオ酸（dioic acid）は、香料、ポリマー、接
着剤およびマクロライド抗生物質の製造用原料として多
様な用途を有する化学的中間体である。長鎖を有する
α，ω−ジカルボン酸の化学的合成法がいくつか知られ
ているが、該合成は容易ではなく、大抵の場合は短鎖を
有する化合物との混合物が得られるので、複雑な精製工
程が必要となる。アルカン、脂肪酸またはエステルの微
生物による変換によって長鎖ジオ酸を製造する方法も知
られているが、現在の生物学的アプローチには限界があ
るので、化学的合成法が依然として好適な方法とされて
いる。
着剤およびマクロライド抗生物質の製造用原料として多
様な用途を有する化学的中間体である。長鎖を有する
α，ω−ジカルボン酸の化学的合成法がいくつか知られ
ているが、該合成は容易ではなく、大抵の場合は短鎖を
有する化合物との混合物が得られるので、複雑な精製工
程が必要となる。アルカン、脂肪酸またはエステルの微
生物による変換によって長鎖ジオ酸を製造する方法も知
られているが、現在の生物学的アプローチには限界があ
るので、化学的合成法が依然として好適な方法とされて
いる。
炭素源としてアルカンまたは脂肪酸を用いる培養にお
いて、副生成物としてα，ω−ジカルボン酸を分泌する
酵母菌の菌株がいくつか知られている。特に、カンジダ
属に属する酵母菌、例えば、カンジダ・アルビカンス
（C.albicans）、カンジダ・クロアカエ（C.cloaca
e）、カンジダ・グイレルモンジイ（C.guillermondi
i）、カンジダ・インターメジア（C.intermedia）、カ
ンジダ・リポリチカ（C.lipolytica）、カンジダ・マル
トサ（C.maltosa）、カンジダ・パラプシロシス（C.par
apsilosis）およびカンジダ・ゼイレノイデス（C.zeyen
oides）等によってこの種のジカルボン酸が生産される
ことが知られている［Arg.Biol.Chem.、第35巻、第2033
頁〜第2042頁（1971年）参照］。また、C11〜C18の鎖長
を有するジカルボン酸を生産するカンジダ・トロピカリ
スの菌株もいくつか知られている［オキノ（Okino）ら
著、ローレンス（BM Lawrence）、ムークヘルイェー
（BD Mookherjee）およびウィリス（BJ Willis）編、
「風味と芳香」：世界的な展望。精油、風味および芳香
に関する第10回国際会議の会報。エルセヴィーア・サイ
エンス・パブリシャーズ・ビーブイ（Elsevier Science
Pub−lishers BV）（アムステルダム、1988年）］。
さらに、該カンジダ・トロピカリス菌株はいくつかの特
許の基礎にもなっている［ビューラー（Buehler）およ
びシンドラー（Schindler）著、「バイオテクノロジー
における脂肪族炭化水素」、レーム（J.Rehm）およびリ
ード（G.Reed）編、第169巻、フェアラーク・ヘミー（V
erlag Chemie）、ヴァインハイム（1984年）参照］。
炭化水素基質を、酵母菌ミクロソーム内で酵母酸化する
方法は確立されている。例えば、ｎ−アルカン基質は細
胞内へ輸送された後、特異的なチトクロムP450系によっ
て脂肪アルコールにヒドロキシル化される［アプル．マ
イクロビオール．バイオテクノール（Appl.Microbiol.B
iotechnol.）、第28巻、第589頁〜第597頁（1988年）参
照］。次いで、２段階の酸化、即ち、アルコールオキシ
ダーゼによる触媒酸化［ケンプ（Kemp）ら、アプル．マ
イクロビオール．アンド バイオテクノール（Appl.Mic
robiol.and Biotechnol.、第28巻、第370頁〜第374頁
（1988年）参照］およびアルデヒドデヒドロゲナーゼに
よる触媒酸化によって対応する脂肪酸が得られる。脂肪
酸は同じ反応経路によって対応するジカルボン酸まで酸
化することができる。脂肪酸のω−酸化によれば、CoA
活性化を必要とすることなく、ω−ヒドロキシ脂肪酸お
よびそのアルデヒド誘導体を経て、対応するジカルボン
酸を得ることができる。しかしながら、脂肪酸とジカル
ボン酸は、対応するアシル−CoAエステルに活性化した
後は、ペルオキシソーム内でのβ−酸化経路を経て短鎖
化合物まで減成することができる。哺乳類の系において
は、ω−酸化による脂肪酸とジカルボン酸生成物は等速
度でそれらのCoAエステルまで活性化され、ミトコンド
リアおよびペルオキシソームによるβ−酸化の基質とな
る［ジェイ・バイオケム（J.Biochem.）、第102巻、第2
25頁〜第234頁（1987年）参照］。酵母菌の場合には、
β−酸化はペルオキシソーム内で起こるだけである［ア
グル．ビオール．ケム（Agr.Biol.Chem.）、第49巻、第
1821頁〜第1828頁（1985年）参照］。
いて、副生成物としてα，ω−ジカルボン酸を分泌する
酵母菌の菌株がいくつか知られている。特に、カンジダ
属に属する酵母菌、例えば、カンジダ・アルビカンス
（C.albicans）、カンジダ・クロアカエ（C.cloaca
e）、カンジダ・グイレルモンジイ（C.guillermondi
i）、カンジダ・インターメジア（C.intermedia）、カ
ンジダ・リポリチカ（C.lipolytica）、カンジダ・マル
トサ（C.maltosa）、カンジダ・パラプシロシス（C.par
apsilosis）およびカンジダ・ゼイレノイデス（C.zeyen
oides）等によってこの種のジカルボン酸が生産される
ことが知られている［Arg.Biol.Chem.、第35巻、第2033
頁〜第2042頁（1971年）参照］。また、C11〜C18の鎖長
を有するジカルボン酸を生産するカンジダ・トロピカリ
スの菌株もいくつか知られている［オキノ（Okino）ら
著、ローレンス（BM Lawrence）、ムークヘルイェー
（BD Mookherjee）およびウィリス（BJ Willis）編、
「風味と芳香」：世界的な展望。精油、風味および芳香
に関する第10回国際会議の会報。エルセヴィーア・サイ
エンス・パブリシャーズ・ビーブイ（Elsevier Science
Pub−lishers BV）（アムステルダム、1988年）］。
さらに、該カンジダ・トロピカリス菌株はいくつかの特
許の基礎にもなっている［ビューラー（Buehler）およ
びシンドラー（Schindler）著、「バイオテクノロジー
における脂肪族炭化水素」、レーム（J.Rehm）およびリ
ード（G.Reed）編、第169巻、フェアラーク・ヘミー（V
erlag Chemie）、ヴァインハイム（1984年）参照］。
炭化水素基質を、酵母菌ミクロソーム内で酵母酸化する
方法は確立されている。例えば、ｎ−アルカン基質は細
胞内へ輸送された後、特異的なチトクロムP450系によっ
て脂肪アルコールにヒドロキシル化される［アプル．マ
イクロビオール．バイオテクノール（Appl.Microbiol.B
iotechnol.）、第28巻、第589頁〜第597頁（1988年）参
照］。次いで、２段階の酸化、即ち、アルコールオキシ
ダーゼによる触媒酸化［ケンプ（Kemp）ら、アプル．マ
イクロビオール．アンド バイオテクノール（Appl.Mic
robiol.and Biotechnol.、第28巻、第370頁〜第374頁
（1988年）参照］およびアルデヒドデヒドロゲナーゼに
よる触媒酸化によって対応する脂肪酸が得られる。脂肪
酸は同じ反応経路によって対応するジカルボン酸まで酸
化することができる。脂肪酸のω−酸化によれば、CoA
活性化を必要とすることなく、ω−ヒドロキシ脂肪酸お
よびそのアルデヒド誘導体を経て、対応するジカルボン
酸を得ることができる。しかしながら、脂肪酸とジカル
ボン酸は、対応するアシル−CoAエステルに活性化した
後は、ペルオキシソーム内でのβ−酸化経路を経て短鎖
化合物まで減成することができる。哺乳類の系において
は、ω−酸化による脂肪酸とジカルボン酸生成物は等速
度でそれらのCoAエステルまで活性化され、ミトコンド
リアおよびペルオキシソームによるβ−酸化の基質とな
る［ジェイ・バイオケム（J.Biochem.）、第102巻、第2
25頁〜第234頁（1987年）参照］。酵母菌の場合には、
β−酸化はペルオキシソーム内で起こるだけである［ア
グル．ビオール．ケム（Agr.Biol.Chem.）、第49巻、第
1821頁〜第1828頁（1985年）参照］。
カンジダ・トロピカリスを含む大部分の酵母菌による
発酵によって製造されるジカルボン酸は大抵の場合、元
の基質に比べて一対もしくはそれ以上の対の炭素原子部
だけ短く、一般に混合物である「オギノら、1965年；シ
オおよびウチオ、1971年；レームおよびライフ、1980
年；ヒルら、1986年］。これは、ペルオキシソームによ
るβ−酸化によっておこなわれる基質と生成物の減成に
起因する。この一連の酵素反応によって、活性化アシル
−CoAは、２つの炭素アセチル−CoA部分の回路的な（cy
clic manner）開裂を経て漸進的に短くなる。アシル−C
oAからそのエノイル−CoA誘導体への酸化を含むこの経
路の最初の段階は、アシル−CoAオキシダーゼによる触
媒作用を受ける。エノイル−CoAは、３−ケトアシル−C
oAチオラーゼによるα−炭素とβ−炭素の間の開裂に対
する先行必要条件となるエノイル−CoAヒドラターゼと
３−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼの作用に
よって代謝されてβ−ケト酸となる。これらの後者の反
応を部分的に妨害する突然変異は、不飽和または３−ヒ
ドロキシ−モノカルボン酸もしくは３−ヒドロキシ−ジ
カルボン酸を生成させる（モイスデファー、1988年）。
これらの望ましくない副生成物は、ジカルボン酸の生物
学的製造法の場合にもしばしば生成する。適当な突然変
異体を使用することによって、ジオ酸の生成量を実質的
に増加させることができることが知られている［シイオ
およびウチオ、1971年；フルカワら、1986年；ヒルら、
1986年；オキノら、1986年］。野生型酵母菌は、ジカル
ボン酸を生産するとしても、その生産量は非常にわずか
である。多くの場合、アルカン、脂肪酸またはジカルボ
ン酸基質上での生長能に部分的に欠陥のある突然変異体
がジカルボン酸の収量を増加させることが証明されてい
る。しかしながら、これらの突然変異体には、これらの
化合物を生長用炭素源として利用する機能が低いという
以外の特徴はない。たぶん、この種の突然変異体のジカ
ルボン酸生産能は、β−酸化経路の部分的阻害によって
高められるであろう。さらに、β−酸化を抑制すること
が知られている化合物（即ち、アクリレート）もジカル
ボン酸の収量を増大させる（ゾウおよびジュイシェン、
1988年）。
発酵によって製造されるジカルボン酸は大抵の場合、元
の基質に比べて一対もしくはそれ以上の対の炭素原子部
だけ短く、一般に混合物である「オギノら、1965年；シ
オおよびウチオ、1971年；レームおよびライフ、1980
年；ヒルら、1986年］。これは、ペルオキシソームによ
るβ−酸化によっておこなわれる基質と生成物の減成に
起因する。この一連の酵素反応によって、活性化アシル
−CoAは、２つの炭素アセチル−CoA部分の回路的な（cy
clic manner）開裂を経て漸進的に短くなる。アシル−C
oAからそのエノイル−CoA誘導体への酸化を含むこの経
路の最初の段階は、アシル−CoAオキシダーゼによる触
媒作用を受ける。エノイル−CoAは、３−ケトアシル−C
oAチオラーゼによるα−炭素とβ−炭素の間の開裂に対
する先行必要条件となるエノイル−CoAヒドラターゼと
３−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼの作用に
よって代謝されてβ−ケト酸となる。これらの後者の反
応を部分的に妨害する突然変異は、不飽和または３−ヒ
ドロキシ−モノカルボン酸もしくは３−ヒドロキシ−ジ
カルボン酸を生成させる（モイスデファー、1988年）。
これらの望ましくない副生成物は、ジカルボン酸の生物
学的製造法の場合にもしばしば生成する。適当な突然変
異体を使用することによって、ジオ酸の生成量を実質的
に増加させることができることが知られている［シイオ
およびウチオ、1971年；フルカワら、1986年；ヒルら、
1986年；オキノら、1986年］。野生型酵母菌は、ジカル
ボン酸を生産するとしても、その生産量は非常にわずか
である。多くの場合、アルカン、脂肪酸またはジカルボ
ン酸基質上での生長能に部分的に欠陥のある突然変異体
がジカルボン酸の収量を増加させることが証明されてい
る。しかしながら、これらの突然変異体には、これらの
化合物を生長用炭素源として利用する機能が低いという
以外の特徴はない。たぶん、この種の突然変異体のジカ
ルボン酸生産能は、β−酸化経路の部分的阻害によって
高められるであろう。さらに、β−酸化を抑制すること
が知られている化合物（即ち、アクリレート）もジカル
ボン酸の収量を増大させる（ゾウおよびジュイシェン、
1988年）。
従って、アシル−CoAオキシダーゼによる触媒作用を
受ける最初の反応におけるβ−酸化経路を有効に妨害す
ることが望ましい。この場合、完全な妨害をおこなえ
ば、β−酸化経路によるジカルボン酸生成物の再利用を
防止すると共に、基質をω−酸化経路に再び向けること
によって、ジカルボン酸の収量を増加させることができ
る。さらに、この種の突然変異体の使用によって、β−
酸化に関連する望ましくない鎖修飾、例えば、不飽和
化、ヒドロキシル化または鎖短縮を防止すべきである。
酵素が完全に不活性化されたランダム突然変異誘発によ
って得られる突然変異体は得られていない。カンジダ・
トロピカリスアシル−CoAオキシダーゼ遺伝子をクロン
化してシークエンス化することは知られているが（オカ
ザキら、1986年）、カンジダ・トロピカリスゲノムの標
的化突然変異誘発法が知られていないために、染色体ア
シル−CoAオキシダーゼ遺伝子の特異的な不活性化が妨
げられている。ピチア（Pichia）属の酵母菌における標
的化遺伝子の分断法がヨーロッパ特許出願第0 226 752
号明細書に開示されている。しかしながら、カンジダ・
トロピカリスにおける標的化突然変異誘発に関しては、
本発明によって初めて開示されるものである。
受ける最初の反応におけるβ−酸化経路を有効に妨害す
ることが望ましい。この場合、完全な妨害をおこなえ
ば、β−酸化経路によるジカルボン酸生成物の再利用を
防止すると共に、基質をω−酸化経路に再び向けること
によって、ジカルボン酸の収量を増加させることができ
る。さらに、この種の突然変異体の使用によって、β−
酸化に関連する望ましくない鎖修飾、例えば、不飽和
化、ヒドロキシル化または鎖短縮を防止すべきである。
酵素が完全に不活性化されたランダム突然変異誘発によ
って得られる突然変異体は得られていない。カンジダ・
トロピカリスアシル−CoAオキシダーゼ遺伝子をクロン
化してシークエンス化することは知られているが（オカ
ザキら、1986年）、カンジダ・トロピカリスゲノムの標
的化突然変異誘発法が知られていないために、染色体ア
シル−CoAオキシダーゼ遺伝子の特異的な不活性化が妨
げられている。ピチア（Pichia）属の酵母菌における標
的化遺伝子の分断法がヨーロッパ特許出願第0 226 752
号明細書に開示されている。しかしながら、カンジダ・
トロピカリスにおける標的化突然変異誘発に関しては、
本発明によって初めて開示されるものである。
カンジダ・トロピカリス種の菌株を用いることによる
不飽和C14〜C16モノカルボン酸の発酵によってジカルボ
ン酸を製造する技術が米国特許第4,474,882号明細書に
開示されている。不飽和ジカルボン酸の二重結合の数と
位置は、出発原料に対応する。別の特殊な微生物を使用
する類似法が、米国特許第3,975,234号および同第4,33
9,536号各明細書、英国特許明細書第1,405,026号、およ
び独国特許公報第21 64 626号、同28 53 847号、同29 3
7 292号、同29 51 177号および同21 40 133号に記載さ
れている。
不飽和C14〜C16モノカルボン酸の発酵によってジカルボ
ン酸を製造する技術が米国特許第4,474,882号明細書に
開示されている。不飽和ジカルボン酸の二重結合の数と
位置は、出発原料に対応する。別の特殊な微生物を使用
する類似法が、米国特許第3,975,234号および同第4,33
9,536号各明細書、英国特許明細書第1,405,026号、およ
び独国特許公報第21 64 626号、同28 53 847号、同29 3
7 292号、同29 51 177号および同21 40 133号に記載さ
れている。
上記のいずれの方法によっても、目的とするジカルボ
ン酸を工業的に十分な量で得ることができないのが現状
である。
ン酸を工業的に十分な量で得ることができないのが現状
である。
発明の概要 本発明の一つの観点によれば、染色体標的遺伝子に対
するホモロジーまたは染色体標的遺伝子の側部に位置す
るDNA配列に対するホモロジーを有するDNA配列が両端部
に位置する選択可能な標識遺伝子を含む線状DNAフラグ
メントを用いてカンジダ・トロピカリス宿主細胞を形質
転換することを含む、カンジダ・トロピカリスゲノムの
部位特異的一時変異法が提供される。
するホモロジーまたは染色体標的遺伝子の側部に位置す
るDNA配列に対するホモロジーを有するDNA配列が両端部
に位置する選択可能な標識遺伝子を含む線状DNAフラグ
メントを用いてカンジダ・トロピカリス宿主細胞を形質
転換することを含む、カンジダ・トロピカリスゲノムの
部位特異的一時変異法が提供される。
本発明の別の観点によれば、下記の（ａ）〜（ｃ）の
工程を含む、選択可能な標識を用いてあらかじめ原栄養
体に形質転換された細胞に対する栄養要求体の表現型の
取戻方法が提供される：（ａ）選択可能な該標識を不活
性化させることによって、予め形質転換された該菌株か
ら誘導された栄養要求体の突然変異体を同定して分離す
る偶発的突然変異のための選択もしくはスクリーニング
処理をおこない、（ｂ）該突然変異体の栄養要求体の表
現型を確認し、次いで、（ｃ）適当な遺伝子プローブへ
のサザン交雑（Southern hybridization）によって該突
然変異体の親遺伝子型を確認する。
工程を含む、選択可能な標識を用いてあらかじめ原栄養
体に形質転換された細胞に対する栄養要求体の表現型の
取戻方法が提供される：（ａ）選択可能な該標識を不活
性化させることによって、予め形質転換された該菌株か
ら誘導された栄養要求体の突然変異体を同定して分離す
る偶発的突然変異のための選択もしくはスクリーニング
処理をおこない、（ｂ）該突然変異体の栄養要求体の表
現型を確認し、次いで、（ｃ）適当な遺伝子プローブへ
のサザン交雑（Southern hybridization）によって該突
然変異体の親遺伝子型を確認する。
本発明のさらに別の観点によれば、下記の（ａ）〜
（ｃ）の工程を含む、選択可能な標識を用いて予め原栄
養体へ形質転換された細胞への栄養要求体の表現型の別
の取戻方法が提供される：（ａ）選択可能な標識遺伝子
の中央の解読配列のインビトロ欠失によって非機能化さ
れた該標識遺伝子を用いて原栄養体の宿主細胞を形質転
換させることによって栄養要求体の突然変異体を生成さ
せ、（ｂ）該突然変異体の栄養要求体の表現型を確認
し、次いで、（ｃ）該突然変異体の遺伝子型を確認す
る。
（ｃ）の工程を含む、選択可能な標識を用いて予め原栄
養体へ形質転換された細胞への栄養要求体の表現型の別
の取戻方法が提供される：（ａ）選択可能な標識遺伝子
の中央の解読配列のインビトロ欠失によって非機能化さ
れた該標識遺伝子を用いて原栄養体の宿主細胞を形質転
換させることによって栄養要求体の突然変異体を生成さ
せ、（ｂ）該突然変異体の栄養要求体の表現型を確認
し、次いで、（ｃ）該突然変異体の遺伝子型を確認す
る。
本発明のさらにまた別の観点によれば、カンジダ・ト
ロピカリス宿主菌株の染色体のPOX4A、POX4Bおよび２つ
のPOX5遺伝子を分断させることを含む、カンジダ・トロ
ピカリス内でのβ−酸化経路をその最初の反応において
完全に阻害する方法が提供される。
ロピカリス宿主菌株の染色体のPOX4A、POX4Bおよび２つ
のPOX5遺伝子を分断させることを含む、カンジダ・トロ
ピカリス内でのβ−酸化経路をその最初の反応において
完全に阻害する方法が提供される。
本発明の他の観点によれば、窒素源、有機基質および
補基質を含有する培地内においてカンジダ・トロピカリ
ス菌株H5343を培養することを含む、実質上純粋なω−
ジカルボン酸を実質上定量的な収率で製造する方法が提
供される。
補基質を含有する培地内においてカンジダ・トロピカリ
ス菌株H5343を培養することを含む、実質上純粋なω−
ジカルボン酸を実質上定量的な収率で製造する方法が提
供される。
図面の簡単な説明 図1Aは、POX4分断カセットの空間的な関係を示す模式
図である。
図である。
図1Bは、POX5分断カセットの空間的な関係を示す模式
図である。
図である。
図２は、POX遺伝子配列の分断プロセスを示す模式図
である。
である。
図３は、種々の形質転換体からPOX4およびPOX5プロー
ブへEcoR1消化されたゲノムDNAのサザン交雑を示す模式
図である。
ブへEcoR1消化されたゲノムDNAのサザン交雑を示す模式
図である。
図４は、阻害されたPOX遺伝子を有する菌株の系統お
よび各菌株において阻害されたPOX遺伝子の同一性を示
すダイヤグラムである。
よび各菌株において阻害されたPOX遺伝子の同一性を示
すダイヤグラムである。
好ましい態様の説明 本発明の一つの観点によれば、カンジダ・トロピカリ
スゲノムの一般的な部位特異的一時変異法が提供され
る。この方法は、染色体の標的遺伝子の置換体として遺
伝子分断カセットを使用することに基づく。この置換遺
伝子は、選択可能な標識遺伝子を用いる挿入的不活性化
によって不機能化される。この分断カセット（disrupti
on cassette）は、天然のカンジダ・トロピカリスゲノ
ムに対するホモロジーを有するDNAフラグゲント、選択
可能な標識遺伝子および天然のカンジダ・トロピカリス
ゲノムに対するホモロジーを有するDNAフラグメントが
連続的に配列された線状DNAフラグメントである。２つ
の側部の配列は、必ずしも必要ではないが、好ましく
は、未分断酵母菌ゲノム内における隣接DNA配列であ
り、該酵母菌ゲノム内への分断カセットの組込み部位へ
直接連なる。
スゲノムの一般的な部位特異的一時変異法が提供され
る。この方法は、染色体の標的遺伝子の置換体として遺
伝子分断カセットを使用することに基づく。この置換遺
伝子は、選択可能な標識遺伝子を用いる挿入的不活性化
によって不機能化される。この分断カセット（disrupti
on cassette）は、天然のカンジダ・トロピカリスゲノ
ムに対するホモロジーを有するDNAフラグゲント、選択
可能な標識遺伝子および天然のカンジダ・トロピカリス
ゲノムに対するホモロジーを有するDNAフラグメントが
連続的に配列された線状DNAフラグメントである。２つ
の側部の配列は、必ずしも必要ではないが、好ましく
は、未分断酵母菌ゲノム内における隣接DNA配列であ
り、該酵母菌ゲノム内への分断カセットの組込み部位へ
直接連なる。
分断カセットは、分離標的遺伝子内への選択可能な標
識のサブクローニング（subcloning）によって構成され
る。標的遺伝子とは無関係の選択可能ないずれのタイプ
の標識も、標的遺伝子の分断に使用することができる。
好ましくは、選択可能な標識は、分断カセットが形質転
換される細胞に対して特定の表現型を付与する標識であ
る。最も好ましくは、選択可能な標識は、栄養要求体へ
可逆的に変化し得る形質転換細胞に原栄養体の表現型を
付与するので、選択可能な同一標識は、同一菌株におけ
るその後の多重遺伝子分断に使用することができる。
識のサブクローニング（subcloning）によって構成され
る。標的遺伝子とは無関係の選択可能ないずれのタイプ
の標識も、標的遺伝子の分断に使用することができる。
好ましくは、選択可能な標識は、分断カセットが形質転
換される細胞に対して特定の表現型を付与する標識であ
る。最も好ましくは、選択可能な標識は、栄養要求体へ
可逆的に変化し得る形質転換細胞に原栄養体の表現型を
付与するので、選択可能な同一標識は、同一菌株におけ
るその後の多重遺伝子分断に使用することができる。
例えば、特定のピリミジンに対する栄養要求体である
カンジダ・トロピカリス形質転換宿主は、特定のピリミ
ジンの合成に必要な選択可能な機能性標識遺伝子を有す
る分断カセットによって原栄養体へ形質転換される。該
特定のピリミジンに対して原栄養体となる得られた形質
転換体は、ピリミジンが欠乏する培地内での生長能によ
って選択される。これらの形質転換体は、非機能性標的
遺伝子による機能性標的遺伝子の置換に基づく標的化遺
伝子分断部を含む。
カンジダ・トロピカリス形質転換宿主は、特定のピリミ
ジンの合成に必要な選択可能な機能性標識遺伝子を有す
る分断カセットによって原栄養体へ形質転換される。該
特定のピリミジンに対して原栄養体となる得られた形質
転換体は、ピリミジンが欠乏する培地内での生長能によ
って選択される。これらの形質転換体は、非機能性標的
遺伝子による機能性標的遺伝子の置換に基づく標的化遺
伝子分断部を含む。
この方法は、カンジダ・トロピカリスのPOX4およびPO
X5遺伝子の分断に好適に利用できるので、得られる菌株
はα，ω−ジカルボン酸の製造に使用できる。POX4およ
びPOX5遺伝子は長鎖アシル−CoAオキシダーゼの異なる
サブユニット、即ち、それぞれPXP−４およびPXP−５と
して指定されるペルオキシソームのポリペプチド（PX
P）をコード化する。これらのPXPは、アルカンおよび脂
肪酸基質の減成において作用する種々の関連酵素を含有
するカンジダ・トロピカリス中に存在する細胞内オルガ
ネラであるペルオキシソーム中に見出される。従って、
これらのPXPをコード化するPOX4およびPOX5遺伝子の分
断は、脂肪酸のβ−酸化を効果的に阻害するので、基質
はω−酸化経路へ再び移行し、一方、ω−酸化経路にお
けるジカルボン酸生成物の再利用は防止される。
X5遺伝子の分断に好適に利用できるので、得られる菌株
はα，ω−ジカルボン酸の製造に使用できる。POX4およ
びPOX5遺伝子は長鎖アシル−CoAオキシダーゼの異なる
サブユニット、即ち、それぞれPXP−４およびPXP−５と
して指定されるペルオキシソームのポリペプチド（PX
P）をコード化する。これらのPXPは、アルカンおよび脂
肪酸基質の減成において作用する種々の関連酵素を含有
するカンジダ・トロピカリス中に存在する細胞内オルガ
ネラであるペルオキシソーム中に見出される。従って、
これらのPXPをコード化するPOX4およびPOX5遺伝子の分
断は、脂肪酸のβ−酸化を効果的に阻害するので、基質
はω−酸化経路へ再び移行し、一方、ω−酸化経路にお
けるジカルボン酸生成物の再利用は防止される。
好ましい方法においては、ウラシル（Ura-）に対して
栄養要求体的なカンジダ・トロピカリス形質転換宿主
は、一端に1.2Kbの５′−POX5配列が位置して他端に2.7
Kbの３′−POX5配列が位置したURA3A機能性遺伝子また
は一端に2.1Kbの５′−POX4配列が位置して他端に4.5Kb
の３′−POX4配列が位置したURA3A機能性遺伝子を有す
る分断カセットによって、ウラシル原栄養体へ形質転換
される。形質転換された細胞はウラシルに対して原栄養
体的となり、ウラシルの不存在下での生長能によって選
択される。前者の場合、カンジダ・トロピカリスのPOX5
遺伝子の一つは分断され、アシル−CoAオキシダーゼの
特有のイソ酵素であるPXP−５をコード化することがで
きなくなる。後者の場合、POX4遺伝子の一つは分断さ
れ、アシル−CoAオキダーゼの別の特有のイソ酵素であ
るPXP−４をコード化することができなくなる。
栄養要求体的なカンジダ・トロピカリス形質転換宿主
は、一端に1.2Kbの５′−POX5配列が位置して他端に2.7
Kbの３′−POX5配列が位置したURA3A機能性遺伝子また
は一端に2.1Kbの５′−POX4配列が位置して他端に4.5Kb
の３′−POX4配列が位置したURA3A機能性遺伝子を有す
る分断カセットによって、ウラシル原栄養体へ形質転換
される。形質転換された細胞はウラシルに対して原栄養
体的となり、ウラシルの不存在下での生長能によって選
択される。前者の場合、カンジダ・トロピカリスのPOX5
遺伝子の一つは分断され、アシル−CoAオキシダーゼの
特有のイソ酵素であるPXP−５をコード化することがで
きなくなる。後者の場合、POX4遺伝子の一つは分断さ
れ、アシル−CoAオキダーゼの別の特有のイソ酵素であ
るPXP−４をコード化することができなくなる。
本発明の別の観点によれば、選択可能な標識を用いて
予め原栄養体に形質転換された細胞に対する栄養要求体
の表現型の取戻方法であって、まず、第一に、選択可能
な標識を不活性化させることによって、栄養要求体の突
然変異体を分離する偶発的突然変異のための選択もしく
はスクリーニング処理をおこない、次いで、突然変異体
の栄養要求体の表現型を確認し、さらに、適当な遺伝子
プローブへのサザン交雑によって突然変異体の親遺伝子
型を確認することを含む該取戻方法が提供される。この
方法においては、選択可能な標識遺伝子内で起こる偶発
的部位突然変異によって、栄養要求体の表現型は分断突
然変異体に取戻される。
予め原栄養体に形質転換された細胞に対する栄養要求体
の表現型の取戻方法であって、まず、第一に、選択可能
な標識を不活性化させることによって、栄養要求体の突
然変異体を分離する偶発的突然変異のための選択もしく
はスクリーニング処理をおこない、次いで、突然変異体
の栄養要求体の表現型を確認し、さらに、適当な遺伝子
プローブへのサザン交雑によって突然変異体の親遺伝子
型を確認することを含む該取戻方法が提供される。この
方法においては、選択可能な標識遺伝子内で起こる偶発
的部位突然変異によって、栄養要求体の表現型は分断突
然変異体に取戻される。
好ましい態様においては、偶発的に形成されるUra−
突然変異体を、Ura+細胞に対して毒性のウラシル経路中
間体の類似体である５−フルオロチン酸（５−FOA）を
含有する培地内での生長能によって選択することによ
り、Ura-栄養要求体の表現型を、予めUra+原栄養体に形
質転換された細胞に取戻させる。５−FOAの存在下での
選択によって、選択可能な非機能性URA3A標識を有さな
い分離物の同定が可能となる。これらの細胞の表現型
は、該細胞がウラシルの不存在下では生長しないという
事実によって確認される。これらの細胞の親遺伝子型は
適当な遺伝子プローブへのサザン交雑によって確認され
る。
突然変異体を、Ura+細胞に対して毒性のウラシル経路中
間体の類似体である５−フルオロチン酸（５−FOA）を
含有する培地内での生長能によって選択することによ
り、Ura-栄養要求体の表現型を、予めUra+原栄養体に形
質転換された細胞に取戻させる。５−FOAの存在下での
選択によって、選択可能な非機能性URA3A標識を有さな
い分離物の同定が可能となる。これらの細胞の表現型
は、該細胞がウラシルの不存在下では生長しないという
事実によって確認される。これらの細胞の親遺伝子型は
適当な遺伝子プローブへのサザン交雑によって確認され
る。
選択可能な標識を用いて予め原栄養体へ形質転換され
た細胞への栄養要求体の表現型の別の取戻方法は、直接
的な欠失法を利用する。この方法においては、原栄養体
細胞は、中央の解読配列の少なくとも一部のインビトロ
欠失によって非機能化された選択可能な非機能性標識遺
伝子によって形質転換される。インビトロ欠失は、選択
可能な標識遺伝子を含むプラスミドを形成させ、次い
で、選択可能な標識遺伝子を中央の解読配列の特定の切
断部位で切断する制限エンドヌクレアーゼを用いて該プ
ラスミドを線状化させることによっておこなうことがで
きる。制限された選択可能な標識遺伝子の一部分を各端
部に有する得られたフラグメントは、該フラグメントの
端部からヌクレオチド（bp）を切除してより短い新しい
欠失フラグメントを形成する前進型エキソヌクレアーゼ
にさらされる。この新しいフラグメントは連結反応によ
って再び環状になり、選択可能な標識もしくはその一部
の欠失を含む新しいプラスミドを形成する。このプラス
ミドは、元のプラスミドに含まれていた特定の制限部位
を有さない。何故ならば、該部位は前進型エキソヌクレ
アーゼの作用によって除去されるからである。欠失遺伝
子は、修飾された選択可能な標識遺伝子の端部のプラス
ミドを切断する１種もしくはそれ以上の制限酵素による
切断によってプラスミドから遊離し、次いで、選択可能
な機能性標識遺伝子によって予め原栄養体的にされた細
胞に形質転換される。形質転換された細胞は、選択可能
な機能性標識遺伝子が非機能性標識遺伝子によって置換
されるために、栄養要求体的になる。これらの突然変異
体の栄養要求体は、特定の栄養素の不存在下での生長不
能を調べることによって確認される。これらの突然変異
体の菌株遺伝子型は、宿主細胞のゲノム内に含まれる選
択可能な標識遺伝子中に予め存在する特定の制限エンド
ヌクレアーゼ部位の不存在についてのスクリーニングに
よって確認される。
た細胞への栄養要求体の表現型の別の取戻方法は、直接
的な欠失法を利用する。この方法においては、原栄養体
細胞は、中央の解読配列の少なくとも一部のインビトロ
欠失によって非機能化された選択可能な非機能性標識遺
伝子によって形質転換される。インビトロ欠失は、選択
可能な標識遺伝子を含むプラスミドを形成させ、次い
で、選択可能な標識遺伝子を中央の解読配列の特定の切
断部位で切断する制限エンドヌクレアーゼを用いて該プ
ラスミドを線状化させることによっておこなうことがで
きる。制限された選択可能な標識遺伝子の一部分を各端
部に有する得られたフラグメントは、該フラグメントの
端部からヌクレオチド（bp）を切除してより短い新しい
欠失フラグメントを形成する前進型エキソヌクレアーゼ
にさらされる。この新しいフラグメントは連結反応によ
って再び環状になり、選択可能な標識もしくはその一部
の欠失を含む新しいプラスミドを形成する。このプラス
ミドは、元のプラスミドに含まれていた特定の制限部位
を有さない。何故ならば、該部位は前進型エキソヌクレ
アーゼの作用によって除去されるからである。欠失遺伝
子は、修飾された選択可能な標識遺伝子の端部のプラス
ミドを切断する１種もしくはそれ以上の制限酵素による
切断によってプラスミドから遊離し、次いで、選択可能
な機能性標識遺伝子によって予め原栄養体的にされた細
胞に形質転換される。形質転換された細胞は、選択可能
な機能性標識遺伝子が非機能性標識遺伝子によって置換
されるために、栄養要求体的になる。これらの突然変異
体の栄養要求体は、特定の栄養素の不存在下での生長不
能を調べることによって確認される。これらの突然変異
体の菌株遺伝子型は、宿主細胞のゲノム内に含まれる選
択可能な標識遺伝子中に予め存在する特定の制限エンド
ヌクレアーゼ部位の不存在についてのスクリーニングに
よって確認される。
上述の好ましい態様においては、Ura+栄養要求体の表
現型は、野生型URA3遺伝子を含むプラスミドをKpn Iで
制限することによって、選択可能なURA3標識で予めUra+
原栄養体に形質転換された細胞へ修飾される。このよう
にして得られる線状DNAフラグメントはBal31によって消
化され、次いで、再結合することによって、側部に2.4K
bのURA3Aホモロジーを有する50bpURA3A欠失を保有する
プラスミドを形成する。欠失URA3遺伝子は、EcoR IとPs
t Iによるプラスミドの消化によって線状DNAフラグメン
トとして遊離された後、Ura+原栄養体の宿主細胞（菌株
H51）に形質転換される。Ura-形質転換体は回収され、
それらの栄養要求体は、ウラシル欠乏培地内での該形質
転換体の生長不能によって確認される。Ura-栄養要求体
の突然変異体は、URA3A遺伝子プローブへのサザン交雑
による菌株H51dKpn染色体内での50bp染色体欠失の証明
によって確認される。菌株H51の7.1Kbと1.4KbのKpn Iフ
ラグメントが、菌株H51dKpn中の8.5KbのKpn Iフラグメ
ントによって置換されることがこれによって示される。
現型は、野生型URA3遺伝子を含むプラスミドをKpn Iで
制限することによって、選択可能なURA3標識で予めUra+
原栄養体に形質転換された細胞へ修飾される。このよう
にして得られる線状DNAフラグメントはBal31によって消
化され、次いで、再結合することによって、側部に2.4K
bのURA3Aホモロジーを有する50bpURA3A欠失を保有する
プラスミドを形成する。欠失URA3遺伝子は、EcoR IとPs
t Iによるプラスミドの消化によって線状DNAフラグメン
トとして遊離された後、Ura+原栄養体の宿主細胞（菌株
H51）に形質転換される。Ura-形質転換体は回収され、
それらの栄養要求体は、ウラシル欠乏培地内での該形質
転換体の生長不能によって確認される。Ura-栄養要求体
の突然変異体は、URA3A遺伝子プローブへのサザン交雑
による菌株H51dKpn染色体内での50bp染色体欠失の証明
によって確認される。菌株H51の7.1Kbと1.4KbのKpn Iフ
ラグメントが、菌株H51dKpn中の8.5KbのKpn Iフラグメ
ントによって置換されることがこれによって示される。
上述の方法は、宿主菌株内で表現型の変化をもたらす
選択可能ないずれの標識系にも適用できるものである。
選択可能な適当な標識としては他に例えば、HIS4、POX4
A、POX4BまたはPOX5遺伝子も含まれるが、これらに限定
されない。選択可能な標識がHIS4遺伝子の場合、宿主細
胞はヒスチジンに対して栄養要求体となる。４種の染色
体POX遺伝子が遺伝子分断によって不活性化される場合
には、選択可能な標識は該４種のPOX遺伝子のいずれで
あってもよい。この場合、POX遺伝子によって形質転換
された突然変異体は、単一の炭素源としてアルカンもし
くは脂肪酸エステルを含有する培地内での生長能によっ
て選択される。
選択可能ないずれの標識系にも適用できるものである。
選択可能な適当な標識としては他に例えば、HIS4、POX4
A、POX4BまたはPOX5遺伝子も含まれるが、これらに限定
されない。選択可能な標識がHIS4遺伝子の場合、宿主細
胞はヒスチジンに対して栄養要求体となる。４種の染色
体POX遺伝子が遺伝子分断によって不活性化される場合
には、選択可能な標識は該４種のPOX遺伝子のいずれで
あってもよい。この場合、POX遺伝子によって形質転換
された突然変異体は、単一の炭素源としてアルカンもし
くは脂肪酸エステルを含有する培地内での生長能によっ
て選択される。
本発明のさらに別の観点によれば、カンジダ・トロピ
カリス宿主菌株のPOX4A、POX4Bおよび２種のPOX5遺伝子
を分断することによって、カンジダ・トロピカリス中で
のβ−酸化経路をその最初の反応において完全に阻害す
る方法が提供される。４種のPOX遺伝子が分断される配
列は重要ではなく、全ての該POX遺伝子が分断されるこ
とだけが必要である。カンジダ・トロピカリスのこれら
のPOX遺伝子の全てが分断されると、これらの遺伝子
は、β−酸化経路に必要な機能性アシル−CoAオキシダ
ーゼイソ酵素をコード化することはできなくなる。従っ
て、この経路に必要な酵素が合成されなくなるので、該
微生物はβ−炭素原子上で脂肪酸を酸化することはでき
なくなる。このため、β−酸化経路によるジカルボン酸
の減成も妨げられるが、基質はω−酸化経路へ再び導か
れる。従って、４種のPOX遺伝子の全てが分断されたカ
ンジダ・トロピカリス菌株は実質上純粋なα，ω−ジカ
ルボン酸を実質上定量的な収率で合成するようになる。
何故ならば、望ましくない副生成物、例えば、β−ヒド
ロキシ酸、不飽和酸またはより短鎖の酸を生成する生合
成経路が機能しなくなるからである。
カリス宿主菌株のPOX4A、POX4Bおよび２種のPOX5遺伝子
を分断することによって、カンジダ・トロピカリス中で
のβ−酸化経路をその最初の反応において完全に阻害す
る方法が提供される。４種のPOX遺伝子が分断される配
列は重要ではなく、全ての該POX遺伝子が分断されるこ
とだけが必要である。カンジダ・トロピカリスのこれら
のPOX遺伝子の全てが分断されると、これらの遺伝子
は、β−酸化経路に必要な機能性アシル−CoAオキシダ
ーゼイソ酵素をコード化することはできなくなる。従っ
て、この経路に必要な酵素が合成されなくなるので、該
微生物はβ−炭素原子上で脂肪酸を酸化することはでき
なくなる。このため、β−酸化経路によるジカルボン酸
の減成も妨げられるが、基質はω−酸化経路へ再び導か
れる。従って、４種のPOX遺伝子の全てが分断されたカ
ンジダ・トロピカリス菌株は実質上純粋なα，ω−ジカ
ルボン酸を実質上定量的な収率で合成するようになる。
何故ならば、望ましくない副生成物、例えば、β−ヒド
ロキシ酸、不飽和酸またはより短鎖の酸を生成する生合
成経路が機能しなくなるからである。
本発明のさらにまた別の観点によれば、カンジダ・ト
ロピカリス菌株H5343を、窒素源、有機基質および補基
質を含有する培地内で培養することを含む、実質上純粋
なα，ω−ジカルボン酸を実質上定量的な収率で製造す
る方法が提供される。培地は、微生物の培養において窒
素源として常用されているいずれの無機窒素源または有
機窒素源を含有していてもよい。無機窒素源としては、
硝酸のアルカリ金属塩、例えば、硝酸ナトリウムおよび
硝酸カリウム、アンモニウム塩、例えば、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよび硫酸
アンモニウム等が挙げられる。有機窒素源としては、尿
素、トウモロコシ浸漬リカー、酵母抽出物および当業者
に既知の他の有機窒素源が挙げられる。有機基質として
は、少なくとも１個の末端炭素がメチル基であるC4〜C
22の脂肪族化合物のいずれを用いてもよい。このような
化合物としては、アルカン、アルケン、アルキン、カル
ボン酸およびそのエステル並びにアレン等が例示され
る。好ましい基質は、炭素原子数が約４〜約22のアルカ
ン、および炭素原子数が約４〜約22のアシル基を有する
脂肪酸およびこれらのメチルエステルやエチルエステル
等である。最も好ましい基質はドデカン、トリデカン、
テトラデカン、オレイン酸、オレイン酸メチル、パルミ
チン酸メチル、パルミトオレイン酸メチルおよびミリス
チン酸メチルである。
ロピカリス菌株H5343を、窒素源、有機基質および補基
質を含有する培地内で培養することを含む、実質上純粋
なα，ω−ジカルボン酸を実質上定量的な収率で製造す
る方法が提供される。培地は、微生物の培養において窒
素源として常用されているいずれの無機窒素源または有
機窒素源を含有していてもよい。無機窒素源としては、
硝酸のアルカリ金属塩、例えば、硝酸ナトリウムおよび
硝酸カリウム、アンモニウム塩、例えば、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよび硫酸
アンモニウム等が挙げられる。有機窒素源としては、尿
素、トウモロコシ浸漬リカー、酵母抽出物および当業者
に既知の他の有機窒素源が挙げられる。有機基質として
は、少なくとも１個の末端炭素がメチル基であるC4〜C
22の脂肪族化合物のいずれを用いてもよい。このような
化合物としては、アルカン、アルケン、アルキン、カル
ボン酸およびそのエステル並びにアレン等が例示され
る。好ましい基質は、炭素原子数が約４〜約22のアルカ
ン、および炭素原子数が約４〜約22のアシル基を有する
脂肪酸およびこれらのメチルエステルやエチルエステル
等である。最も好ましい基質はドデカン、トリデカン、
テトラデカン、オレイン酸、オレイン酸メチル、パルミ
チン酸メチル、パルミトオレイン酸メチルおよびミリス
チン酸メチルである。
補基質は、グルコース、フルクトース、マルトース、
グリセロールおよび酢酸ナトリウムから成る群から選択
される。好ましい補基質はグルコースである。カンジダ
・トロピカリスH5343のβ−酸化経路は全体的に阻害さ
れ、基質の酸化からエネルギーが得られないので、補基
質は必要となる。基質と共にグルコースを一定の割合で
添加することによって、細胞用のエネルギー源の供給と
基質のα，ω−ジカルボン酸への部分酸化との間のバラ
ンスが保たれる。
グリセロールおよび酢酸ナトリウムから成る群から選択
される。好ましい補基質はグルコースである。カンジダ
・トロピカリスH5343のβ−酸化経路は全体的に阻害さ
れ、基質の酸化からエネルギーが得られないので、補基
質は必要となる。基質と共にグルコースを一定の割合で
添加することによって、細胞用のエネルギー源の供給と
基質のα，ω−ジカルボン酸への部分酸化との間のバラ
ンスが保たれる。
好ましい態様においては、ペプトン3g/、酵母抽出
物6g/、酵母窒素塩基（Difco）6.7g/、酢酸ナトリ
ウム3g/およびグルコース75g/を含有する発酵培地
を調製し、該培地を15psiの圧力下、121℃で加熱殺菌す
る。グリセロールを15％含有するストック培養物を該培
地に接種し、菌株H5343を30℃において、最大細胞密度
を得るのに十分な時間生長させる。最大細胞密度は、波
長625nmにおける吸収度約60〜約70によって示される該
培地の濁度の測定によって決定される。最大細胞密度は
生菌数約1.5×109に相当する。
物6g/、酵母窒素塩基（Difco）6.7g/、酢酸ナトリ
ウム3g/およびグルコース75g/を含有する発酵培地
を調製し、該培地を15psiの圧力下、121℃で加熱殺菌す
る。グリセロールを15％含有するストック培養物を該培
地に接種し、菌株H5343を30℃において、最大細胞密度
を得るのに十分な時間生長させる。最大細胞密度は、波
長625nmにおける吸収度約60〜約70によって示される該
培地の濁度の測定によって決定される。最大細胞密度は
生菌数約1.5×109に相当する。
最大細胞密度が得られた後、培地のpHは約7.5から約
9.5に上昇するが、好ましい値は8.3〜8.8の範囲であ
る。補基質は、発酵肉汁１リットルあたり、約0.5〜約
2.5g/時の割合で添加する。グルコースの好ましい添加
速度は、発酵肉汁１リットルあたり、約1.5〜約1.75g/
時である。基質補基質（グルコース）と共に同時に添加
するが、その添加速度は、基質の濃度が発酵肉汁１リッ
トルあたり約４〜約40gに維持されるようにする。基質
の好ましい添加量は、発酵肉汁１リットルあたり約10〜
約20gである。発酵は、連続法の場合には、上述のよう
に、無期限に続行することが出来、バッチ法の場合に
は、発酵容器の可使用容量に達するまで続行される。
9.5に上昇するが、好ましい値は8.3〜8.8の範囲であ
る。補基質は、発酵肉汁１リットルあたり、約0.5〜約
2.5g/時の割合で添加する。グルコースの好ましい添加
速度は、発酵肉汁１リットルあたり、約1.5〜約1.75g/
時である。基質補基質（グルコース）と共に同時に添加
するが、その添加速度は、基質の濃度が発酵肉汁１リッ
トルあたり約４〜約40gに維持されるようにする。基質
の好ましい添加量は、発酵肉汁１リットルあたり約10〜
約20gである。発酵は、連続法の場合には、上述のよう
に、無期限に続行することが出来、バッチ法の場合に
は、発酵容器の可使用容量に達するまで続行される。
上記のように、α，ω−ジカルボン酸の好ましい製法
においては、４種のPOX遺伝子の全てが阻害された菌株H
5343を使用する。実際には、POX遺伝子の一部が阻害さ
れた他の９種の菌株（図４参照）も上述の方法において
使用することができる。
においては、４種のPOX遺伝子の全てが阻害された菌株H
5343を使用する。実際には、POX遺伝子の一部が阻害さ
れた他の９種の菌株（図４参照）も上述の方法において
使用することができる。
以下の実施例は本発明を例示的に説明するものであ
り、本発明はこれらの実施例によって限定されるもので
はない。
り、本発明はこれらの実施例によって限定されるもので
はない。
実施例１ POX5分断カセットの調製 カンジダ・トロピカリスの染色体POX5遺伝子の分断物
の調製においては、選択可能なURA3A標識を、プラスミ
ドpKD1d BamH Iに含まれる分離POX5遺伝子内へサブクロ
ーン化した（実施例22参照）。POX5遺伝子は予めクロー
ン化させ、そのDNA配列を決定した［オカサキら、1988
年、PNAS、米国83、第1232頁〜第1236頁］。POX5分断ベ
クターを発生させるため、カンジダ・トロピカリスURA3
A遺伝子を含むプラスミドpCU2dSac I（実施例21参照）1
2ugを、Nru I制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によ
って線状化させた。BamH Iリンカー（linker）を標準的
な方法によってこれらのDNAフラグメントに連結させ
［マニアチス（Maniatis）］ら、［モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・
マニュアル（Ａ Laboratory Manual）］、コールド・
スプリング・ハーバー、1982年参照］、次いでBamH I制
限エンドヌクレアーゼを用いる消化をおこなった後、UR
A3A遺伝子を2.2KbのBamH I制限フラグメント上に遊離さ
せた。次いで、URA3A遺伝子は、1.25ugのBamH Iで線状
化された脱隣酸化pKD1dBamH Iプラスミドに連結させた
（実施例22参照）。このプラスミドは、3.9KbのEcoR1制
限フラグメント上において、pBR322の特定のEcoR1部位
にクローン化されたカンジダ・トロピカリスPOX5遺伝子
を有する。特定のPOX5のBamH I部位へのURA3Aのサブク
ローニングを促進するために、pBR322のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子内のBamH I部位を、クレナウ（Klenow）ポ
リメラーゼによる充填とその後の部分的なBamH I消化に
よって予め破壊させた。連結混合物（ligation mixtur
e）を使用することによって、大腸菌DH5α［BRL、ベゼ
スダ、メリーランド、米国］をアンピシリン耐性に形質
転換させた。95のアンピシリン耐性形質転換体からのプ
ラスミドの制限分析の結果、予想された構造を有するプ
ラスミドが判明した。このプラスミド、即ち、指定され
たpKD1−URA3Aは、2.2KbのBamH Iフラグメント上におい
て特定のPOX5のBamH I制限部位（位置：＃1178）にクロ
ーン化されたURA3A遺伝子を有しており、1.2Kbの５′−
POX5配列と2.7Kbの3'−POX5配列を側部に有する。EcoR1
制限エンドヌクレアーゼを用いる該プラスミドの消化に
よって、カンジダ・トロピカリス染色体POX5遺伝子の分
断に適した５′−pox5−URA3A−pox5−３′カセットが
遊離された（図1B参照）。
の調製においては、選択可能なURA3A標識を、プラスミ
ドpKD1d BamH Iに含まれる分離POX5遺伝子内へサブクロ
ーン化した（実施例22参照）。POX5遺伝子は予めクロー
ン化させ、そのDNA配列を決定した［オカサキら、1988
年、PNAS、米国83、第1232頁〜第1236頁］。POX5分断ベ
クターを発生させるため、カンジダ・トロピカリスURA3
A遺伝子を含むプラスミドpCU2dSac I（実施例21参照）1
2ugを、Nru I制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によ
って線状化させた。BamH Iリンカー（linker）を標準的
な方法によってこれらのDNAフラグメントに連結させ
［マニアチス（Maniatis）］ら、［モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・
マニュアル（Ａ Laboratory Manual）］、コールド・
スプリング・ハーバー、1982年参照］、次いでBamH I制
限エンドヌクレアーゼを用いる消化をおこなった後、UR
A3A遺伝子を2.2KbのBamH I制限フラグメント上に遊離さ
せた。次いで、URA3A遺伝子は、1.25ugのBamH Iで線状
化された脱隣酸化pKD1dBamH Iプラスミドに連結させた
（実施例22参照）。このプラスミドは、3.9KbのEcoR1制
限フラグメント上において、pBR322の特定のEcoR1部位
にクローン化されたカンジダ・トロピカリスPOX5遺伝子
を有する。特定のPOX5のBamH I部位へのURA3Aのサブク
ローニングを促進するために、pBR322のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子内のBamH I部位を、クレナウ（Klenow）ポ
リメラーゼによる充填とその後の部分的なBamH I消化に
よって予め破壊させた。連結混合物（ligation mixtur
e）を使用することによって、大腸菌DH5α［BRL、ベゼ
スダ、メリーランド、米国］をアンピシリン耐性に形質
転換させた。95のアンピシリン耐性形質転換体からのプ
ラスミドの制限分析の結果、予想された構造を有するプ
ラスミドが判明した。このプラスミド、即ち、指定され
たpKD1−URA3Aは、2.2KbのBamH Iフラグメント上におい
て特定のPOX5のBamH I制限部位（位置：＃1178）にクロ
ーン化されたURA3A遺伝子を有しており、1.2Kbの５′−
POX5配列と2.7Kbの3'−POX5配列を側部に有する。EcoR1
制限エンドヌクレアーゼを用いる該プラスミドの消化に
よって、カンジダ・トロピカリス染色体POX5遺伝子の分
断に適した５′−pox5−URA3A−pox5−３′カセットが
遊離された（図1B参照）。
実施例２ POX4分断カセットの調製 染色体POX4遺伝子の分断物の調製においては、選択可
能なURA3A標識を、プラスミドpKD3dBamH Iに含まれる分
離POX4遺伝子内へサブクローン化した（実施例23参
照）。POX4遺伝子は予めクローン化させ、そのDNA配列
を決定した［オラサキら、1986年、PNAS、米国83第1232
頁〜第1236頁］。POX4分断ベクターを発生させるため、
プラスミドpCU2dSac I（実施例21参照）12ugを、Nru I
制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によって線状化さ
せた。BamH Iリンカーを標準的な方法によってこれらの
DNAフラグメントに連結させ（マニアチスらの前記文献
参照）、次いで、BamH I制限エンドヌクレアーゼを用い
る消化をおこなった後、URA3A遺伝子を2.2KbのBamH I制
限フラグメント上に遊離させた。次いで、URA3A遺伝子
は、0.75ugのBamH Iで線状化された脱隣酸化pKD3dBamH
Iプラスミドに連結させた。このプラスミドは、6.6Kbの
Hind IIIフラグメント上において、pBR322の特定のHind
III制限部位にクローン化されたPOX4遺伝子を有する。
POX4遺伝子の特定BamH I部位へのURA3Aのサブクローニ
ングを促進するために、pBR322のテトラサイクリン耐性
遺伝子内のBamH I制限部位を、クレナウポリメラーゼに
よる充填とその後の部分的なBamH I消化によって予め破
壊させた。連結混合物を使用することによって、大腸菌
DH5α［BRL、ベゼスダ、メリーランド、米国］をアンピ
シリン耐性に形質転換させた。92の形質転換体からのプ
ラスミドDNAの制限分析の結果、予想された構造を有す
るプラスミドが判明した。このプラスミド、即ち、指定
されたpKD3−URA3Aは、2.2KbのBamH Iフラグメント上に
おいて特定のPOX4のBamH I部位（位置：＃2101）にクロ
ーン化されたURA3A遺伝子を有しており、2.1Kbの５′−
POX4配列と4.5Kbの３′−POX4配列を側部に有する。Eco
R1制限エンドヌクレアーゼを用いる該プラスミドの消化
によって、カンシダ・トロピカリス染色体POX4遺伝子の
分断に適した５′−pox4−URA3−pox4−３′カセットが
遊離された（図1A参照）。
能なURA3A標識を、プラスミドpKD3dBamH Iに含まれる分
離POX4遺伝子内へサブクローン化した（実施例23参
照）。POX4遺伝子は予めクローン化させ、そのDNA配列
を決定した［オラサキら、1986年、PNAS、米国83第1232
頁〜第1236頁］。POX4分断ベクターを発生させるため、
プラスミドpCU2dSac I（実施例21参照）12ugを、Nru I
制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によって線状化さ
せた。BamH Iリンカーを標準的な方法によってこれらの
DNAフラグメントに連結させ（マニアチスらの前記文献
参照）、次いで、BamH I制限エンドヌクレアーゼを用い
る消化をおこなった後、URA3A遺伝子を2.2KbのBamH I制
限フラグメント上に遊離させた。次いで、URA3A遺伝子
は、0.75ugのBamH Iで線状化された脱隣酸化pKD3dBamH
Iプラスミドに連結させた。このプラスミドは、6.6Kbの
Hind IIIフラグメント上において、pBR322の特定のHind
III制限部位にクローン化されたPOX4遺伝子を有する。
POX4遺伝子の特定BamH I部位へのURA3Aのサブクローニ
ングを促進するために、pBR322のテトラサイクリン耐性
遺伝子内のBamH I制限部位を、クレナウポリメラーゼに
よる充填とその後の部分的なBamH I消化によって予め破
壊させた。連結混合物を使用することによって、大腸菌
DH5α［BRL、ベゼスダ、メリーランド、米国］をアンピ
シリン耐性に形質転換させた。92の形質転換体からのプ
ラスミドDNAの制限分析の結果、予想された構造を有す
るプラスミドが判明した。このプラスミド、即ち、指定
されたpKD3−URA3Aは、2.2KbのBamH Iフラグメント上に
おいて特定のPOX4のBamH I部位（位置：＃2101）にクロ
ーン化されたURA3A遺伝子を有しており、2.1Kbの５′−
POX4配列と4.5Kbの３′−POX4配列を側部に有する。Eco
R1制限エンドヌクレアーゼを用いる該プラスミドの消化
によって、カンシダ・トロピカリス染色体POX4遺伝子の
分断に適した５′−pox4−URA3−pox4−３′カセットが
遊離された（図1A参照）。
実施例３ カンジダ・トロピカリス染色体POX5遺伝子の分断 カンジダ・トロピカリスSU−２株（ATCC20913）のス
フェロプラストを、EcoR1で消化したpKD1−URA3Aでウラ
シル原栄養体に形質転換した。この実施例、そして以下
の実施例において、カンジダ・トロピカリスは以下の手
法によって形質転換した： カンジダ・トロピカリスのあるコロニーをおよそ10ml
のYEPDメディウムに接種し、振とう培養を30℃で一晩行
った。吸収（A600）がおよそ0.01〜0.1になるように細
胞液を希釈し、YEPDメディウム中、30℃で細胞を対数増
殖期に保持した。その後A600が0.01のこの培養物0.03ml
を100mlのYEPDメディウムに接種し、30℃で一晩振とう
培養した。A600が0.2〜0.3の時点で培養物を1500×ｇ、
５分間の遠心分離によって収穫したのち、細胞を１×10
mlの滅菌水、１×10mlの新たに作成したSED（SED＝1Mソ
ルビトール、25mMのEDTA、50mMのDTT、フィルター滅
菌）、１×10mlの1Mソルビトールで洗浄し、その後この
細胞を5mlのSCEバッファー（SCE＝0.1Mソルビトール、1
00mMくえん酸ナトリウム、pH5.8、10mMのEDTA）に再懸
濁した。この混合物に4mg/mlのザイモラーゼ20000（Zym
olase 20000）を20ul添加し、このメディウムを30℃で
インキュベートした。スフェロプラストの生成は以下の
ようにモニターした：細胞液の100ulのアリコートを900
ulの0.2％SDSと900ulの1Mソルビトールにそれぞれ添加
した。ザイモラーゼとのインキュベーションは細胞がSD
S中で溶菌するがソルビトール中ではしない（通常15〜3
0分間のインキュベーション）時点で終了させた。スフ
ェロプラストの生成は効果的であり、評価した99％の細
胞が浸透圧に感受性であった。インキュベーションの終
了時に、スフェロプラストを1000×ｇ、10分間の遠心分
離によって１×10mlの1Mソルビトール、１×10mlの滅菌
Cas（CaS＝1Mソルビトール、10mM塩化カルシウム、フィ
ルター滅菌）で洗浄し、細胞を0.6mlのCaSに再懸濁し
た。形質転換は、DNA試料（20ulまで）を12×75mmの滅
菌ポリプロピレンチューブに添加して行った；このDNA
は水あるいはTEバファー中に保持した。各DNA試料に100
ulのスフェロプラストを添加し、この混合物を20分間室
温でインキュベートした。その後この混合物に1mlのPEG
溶液（PEG溶液＝20％ポリエチレングリコール−3350、1
0mM塩かカルシウム、10mMトリスHCl、pH7.4、フィルタ
ー滅菌）を加え、室温で15分間インキュベートした。10
00×ｇで10分間、この試料を遠心分離したのち、PEG溶
液をデカンテーションで除き、試料を150ulのSOS（SOS
＝1Mソルビトール、30％YEPD培地、10mM塩化カルシウ
ム、フィルター滅菌）に再懸濁し、この再懸濁した試料
を室温で30分間インキュベートした。そしてこの試料に
滅菌1Mソルビトールを850ul添加した。細胞の再生（reg
eneration）のために、各試料10ulおよび990ulのアリコ
ートを、50℃に保持した融解再生寒天（regeneration a
gar）の10mlアリコートに添加し、混合物を再生寒天の1
0mlの固体基底寒天層を有するプレート上に流し込んだ
（再生寒天を調製するには、240mlの水中に9gのバクト
ーアガー（bacto−agar）および13.5gのKC1を含むもの
をオートクレーブし、オートクレーブ後、ここに30mlの
20％滅菌デキストロースと30mlの滅菌10X YNBを添加
し、この混合物を55℃に保持した。）。10mlの基底寒天
層は、形質転換試料を調製する30分前にプレート上に流
し込んだ。スフェロプラストの再生は効率的であり、10
％以上であった。カンジダ・トロピカリスのura3菌株、
例えばSU−２株の形質転換は高頻度で起こる。この形質
転換の頻度はおよそ、DNA1ugにつき5000〜20000のUra+
コロニーというものである。閉じた環状および直鎖状の
両方のプラスミドDNAが高い形質転換の頻度を示した。
その効率は、LiCl形質転換法を用いたもののおよそ10か
ら100倍低い物であった。
フェロプラストを、EcoR1で消化したpKD1−URA3Aでウラ
シル原栄養体に形質転換した。この実施例、そして以下
の実施例において、カンジダ・トロピカリスは以下の手
法によって形質転換した： カンジダ・トロピカリスのあるコロニーをおよそ10ml
のYEPDメディウムに接種し、振とう培養を30℃で一晩行
った。吸収（A600）がおよそ0.01〜0.1になるように細
胞液を希釈し、YEPDメディウム中、30℃で細胞を対数増
殖期に保持した。その後A600が0.01のこの培養物0.03ml
を100mlのYEPDメディウムに接種し、30℃で一晩振とう
培養した。A600が0.2〜0.3の時点で培養物を1500×ｇ、
５分間の遠心分離によって収穫したのち、細胞を１×10
mlの滅菌水、１×10mlの新たに作成したSED（SED＝1Mソ
ルビトール、25mMのEDTA、50mMのDTT、フィルター滅
菌）、１×10mlの1Mソルビトールで洗浄し、その後この
細胞を5mlのSCEバッファー（SCE＝0.1Mソルビトール、1
00mMくえん酸ナトリウム、pH5.8、10mMのEDTA）に再懸
濁した。この混合物に4mg/mlのザイモラーゼ20000（Zym
olase 20000）を20ul添加し、このメディウムを30℃で
インキュベートした。スフェロプラストの生成は以下の
ようにモニターした：細胞液の100ulのアリコートを900
ulの0.2％SDSと900ulの1Mソルビトールにそれぞれ添加
した。ザイモラーゼとのインキュベーションは細胞がSD
S中で溶菌するがソルビトール中ではしない（通常15〜3
0分間のインキュベーション）時点で終了させた。スフ
ェロプラストの生成は効果的であり、評価した99％の細
胞が浸透圧に感受性であった。インキュベーションの終
了時に、スフェロプラストを1000×ｇ、10分間の遠心分
離によって１×10mlの1Mソルビトール、１×10mlの滅菌
Cas（CaS＝1Mソルビトール、10mM塩化カルシウム、フィ
ルター滅菌）で洗浄し、細胞を0.6mlのCaSに再懸濁し
た。形質転換は、DNA試料（20ulまで）を12×75mmの滅
菌ポリプロピレンチューブに添加して行った；このDNA
は水あるいはTEバファー中に保持した。各DNA試料に100
ulのスフェロプラストを添加し、この混合物を20分間室
温でインキュベートした。その後この混合物に1mlのPEG
溶液（PEG溶液＝20％ポリエチレングリコール−3350、1
0mM塩かカルシウム、10mMトリスHCl、pH7.4、フィルタ
ー滅菌）を加え、室温で15分間インキュベートした。10
00×ｇで10分間、この試料を遠心分離したのち、PEG溶
液をデカンテーションで除き、試料を150ulのSOS（SOS
＝1Mソルビトール、30％YEPD培地、10mM塩化カルシウ
ム、フィルター滅菌）に再懸濁し、この再懸濁した試料
を室温で30分間インキュベートした。そしてこの試料に
滅菌1Mソルビトールを850ul添加した。細胞の再生（reg
eneration）のために、各試料10ulおよび990ulのアリコ
ートを、50℃に保持した融解再生寒天（regeneration a
gar）の10mlアリコートに添加し、混合物を再生寒天の1
0mlの固体基底寒天層を有するプレート上に流し込んだ
（再生寒天を調製するには、240mlの水中に9gのバクト
ーアガー（bacto−agar）および13.5gのKC1を含むもの
をオートクレーブし、オートクレーブ後、ここに30mlの
20％滅菌デキストロースと30mlの滅菌10X YNBを添加
し、この混合物を55℃に保持した。）。10mlの基底寒天
層は、形質転換試料を調製する30分前にプレート上に流
し込んだ。スフェロプラストの再生は効率的であり、10
％以上であった。カンジダ・トロピカリスのura3菌株、
例えばSU−２株の形質転換は高頻度で起こる。この形質
転換の頻度はおよそ、DNA1ugにつき5000〜20000のUra+
コロニーというものである。閉じた環状および直鎖状の
両方のプラスミドDNAが高い形質転換の頻度を示した。
その効率は、LiCl形質転換法を用いたもののおよそ10か
ら100倍低い物であった。
続いて5ugのEcoR1で消化したpKD1−URA3Aによって形
質転換し、およそ200個の有糸分裂的に安定な（mitotic
ally stable）Ura+形質転換体を回収した。11の形質転
換体をその後ドデカン（dodecane）上の増殖に対して、
およびPOX5とURA3Aのプローブに対してのEcoR1によって
消化されたゲノムDNAの、標準的な方法（マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー1982年）
によるサザン交雑によってスクリーニングした。11の形
質転換体すべてがドデカン上で増殖し、野生種と対照的
であった。EcoR1で消化したこれらの形質転換体からの
ゲノムDNAのPOX5プローブへのハイブリダイゼーション
は、野生種にはない6.1KbのEcoR1フラグメントの存在を
明らかにした（これらの形質転換体の代表として、H51
と名付けた菌株を図３に示した）。このフラグメント
は、野生種のPOX5のEcoR1フラグメント（3.9Kb）（図３
にSU−２株として示している）よりおよそ2.2Kb大き
く、野生種のPOX5ローカスのPOX5−URA3A分断カセット
との交換体に相当する。この6.1KbのEcoR1フラグメント
はまた、URA3Aプローブによっても検出することができ
る。しかしながら、POX5プローブに対するハイブリダイ
ゼーションはこれらの各形質転換体内のPOX5遺伝子（3.
9Kb）の他の野生種コピーの存在を「カバーしない」。
このEcoR1ハイブリダイゼーションパターンは、分断カ
ッセトの一倍体POX5遺伝子内へのタンデム組み込み（ta
ndem integratiom）または２倍体ローカスにおけるひと
つのPOX5遺伝子の分断の両方を反映することができる。
再生種における3.9KbのPOX5EcoR1フラグメントに対する
POX5プローブのより強いハイブリダイズは、通常POX5遺
伝子が２コピーあることを示唆している。この可能性を
確かめるため、形質転換体からのゲノムDNAをNco Iで消
化し、上記のようにサザン交雑によって分析した。POX5
−URA3A分断カッセト内には内部Nco I部位がないので、
Nco I消化によるフラグメントのサイズは染色体内の組
み込み部位に最も近いNco I部位に依存する。こうし
て、一回交叉組み込みの結果の縦列繰り返しが大きな一
本鎖フラグメントとなって現れる一方、２倍体ローカス
におけるPOX5遺伝子分断からは２本のフラグメントが得
られる。POX5遺伝子プローブへのハイブリダイゼーショ
ンは２本のNco Iフラグメントが各形質転換体に存在し
ていることを、野生種には、唯一より高いハイブリダイ
ゼーション強度で検出できることを示す。各形質転換体
内の２本のフラグメントのうち大きいほうのみがURA3A
遺伝子プローブに対するハイブリダイゼーションによっ
て検出でき、POX5−URA3A分断カッセトとの染色体POX5
遺伝子の交換が予想されるサイズと一致する。これはカ
ンジダ・トロピカリス内の遺伝子分断の最初の証拠を示
す。加えて、これはカンジダ・トロピカリスが２倍体酵
母であり、各遺伝子の２つのコピーを有することの、最
初の明らかな証拠である。そのうえ、この結果は、サブ
クローン化されたURA3A遺伝子フラグメントの、染色体U
RA3A遺伝子以外の部位に組み込んだ場合にSU−２株のウ
ラシル欠損を補完する能力によってURA3A形質転換系の
有用性を示すものである。かようにして、Nco Iハイブ
リダイゼーションパターンは明らかに、H51と名付けら
れた（pox51:URA3A/POX5/POX4A/POX4B）これらの形質転
換体に起こる分断、通常２倍体のローカスにおけるPOX5
遺伝子の一つのコピーの分断を確立した。
質転換し、およそ200個の有糸分裂的に安定な（mitotic
ally stable）Ura+形質転換体を回収した。11の形質転
換体をその後ドデカン（dodecane）上の増殖に対して、
およびPOX5とURA3Aのプローブに対してのEcoR1によって
消化されたゲノムDNAの、標準的な方法（マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー1982年）
によるサザン交雑によってスクリーニングした。11の形
質転換体すべてがドデカン上で増殖し、野生種と対照的
であった。EcoR1で消化したこれらの形質転換体からの
ゲノムDNAのPOX5プローブへのハイブリダイゼーション
は、野生種にはない6.1KbのEcoR1フラグメントの存在を
明らかにした（これらの形質転換体の代表として、H51
と名付けた菌株を図３に示した）。このフラグメント
は、野生種のPOX5のEcoR1フラグメント（3.9Kb）（図３
にSU−２株として示している）よりおよそ2.2Kb大き
く、野生種のPOX5ローカスのPOX5−URA3A分断カセット
との交換体に相当する。この6.1KbのEcoR1フラグメント
はまた、URA3Aプローブによっても検出することができ
る。しかしながら、POX5プローブに対するハイブリダイ
ゼーションはこれらの各形質転換体内のPOX5遺伝子（3.
9Kb）の他の野生種コピーの存在を「カバーしない」。
このEcoR1ハイブリダイゼーションパターンは、分断カ
ッセトの一倍体POX5遺伝子内へのタンデム組み込み（ta
ndem integratiom）または２倍体ローカスにおけるひと
つのPOX5遺伝子の分断の両方を反映することができる。
再生種における3.9KbのPOX5EcoR1フラグメントに対する
POX5プローブのより強いハイブリダイズは、通常POX5遺
伝子が２コピーあることを示唆している。この可能性を
確かめるため、形質転換体からのゲノムDNAをNco Iで消
化し、上記のようにサザン交雑によって分析した。POX5
−URA3A分断カッセト内には内部Nco I部位がないので、
Nco I消化によるフラグメントのサイズは染色体内の組
み込み部位に最も近いNco I部位に依存する。こうし
て、一回交叉組み込みの結果の縦列繰り返しが大きな一
本鎖フラグメントとなって現れる一方、２倍体ローカス
におけるPOX5遺伝子分断からは２本のフラグメントが得
られる。POX5遺伝子プローブへのハイブリダイゼーショ
ンは２本のNco Iフラグメントが各形質転換体に存在し
ていることを、野生種には、唯一より高いハイブリダイ
ゼーション強度で検出できることを示す。各形質転換体
内の２本のフラグメントのうち大きいほうのみがURA3A
遺伝子プローブに対するハイブリダイゼーションによっ
て検出でき、POX5−URA3A分断カッセトとの染色体POX5
遺伝子の交換が予想されるサイズと一致する。これはカ
ンジダ・トロピカリス内の遺伝子分断の最初の証拠を示
す。加えて、これはカンジダ・トロピカリスが２倍体酵
母であり、各遺伝子の２つのコピーを有することの、最
初の明らかな証拠である。そのうえ、この結果は、サブ
クローン化されたURA3A遺伝子フラグメントの、染色体U
RA3A遺伝子以外の部位に組み込んだ場合にSU−２株のウ
ラシル欠損を補完する能力によってURA3A形質転換系の
有用性を示すものである。かようにして、Nco Iハイブ
リダイゼーションパターンは明らかに、H51と名付けら
れた（pox51:URA3A/POX5/POX4A/POX4B）これらの形質転
換体に起こる分断、通常２倍体のローカスにおけるPOX5
遺伝子の一つのコピーの分断を確立した。
２つのPOX5遺伝子のうちの一方のみが遺伝子分断の結
果機能的に不活性化される。残りのPOX5遺伝子の選択的
な分断が、POX5活性を機能的に不活性化させるのに必要
である。分析した11の形質転換体のすべてが染色体POX5
ローカスにおける予期したPOX5遺伝子分断を有してい
た。染色体URA3Aローカスにおける組み込みによってはU
ra+形質転換体は全く回収されなかった。
果機能的に不活性化される。残りのPOX5遺伝子の選択的
な分断が、POX5活性を機能的に不活性化させるのに必要
である。分析した11の形質転換体のすべてが染色体POX5
ローカスにおける予期したPOX5遺伝子分断を有してい
た。染色体URA3Aローカスにおける組み込みによってはU
ra+形質転換体は全く回収されなかった。
実施例４ カンジダ・トロピカリス染色体POX4遺伝子の分断 カンジダ・トロピカリスのSU−２株（ATCC20913）の
スフェロプラストを、10ugのEcoR1で消化したpKD3−URA
3Aで、実施例３に述べたようにしてウラシル原栄養性に
形質転換した。およそ160個の有糸分裂的に安定なUra+
形質転換体が回収できた。すべてはドデカンあるいはメ
チルラウレートを増殖のために資化する能力を示した。
９つのUra+形質転換体の部位特異的遺伝子分断をサザン
交雑によって先に述べたようにスクリーニングした。Ec
oR1で消化したこれらの形質転換体のうちの６つからの
ゲノムDNAのPOX4プローブへのハイブリダイゼーション
により、野生種には存在しない13KbのEcoR1フラグメン
トが存在していることを明らかになった（これらの形質
転換体のうちの代表は図３のH41株である）。このフラ
グメントは野生種POX4のEcoR1フラグメント（9.8Kb）
（図３にSU−２株として示した）よりおよそ2.2kb大き
く、野生種POX4ローカスのPOX4−URA3A分断カセットと
の交換体と一致する。この13KbのEcoR1フラグメントは
また、URA3AプローブによってH41株内に検出できるが、
SU−２株内では検出できない。しかしながら、POX4プロ
ーブに対するハイブリダイゼーションはまた、各これら
の形質転換体中に他の野生種のPOX4遺伝子のコピーの存
在を「カバーできない」ということはカンジダ・トロピ
カリスはPOX4ローカスにおいても２倍体であることを示
す。Hpa Iで消化したゲノムDNAのPOX4プローブへのハイ
ブリダイゼーションは、２つの染色体がこの制限部位で
異種接合体（heterozygous）であり、このため形質転換
体DNAが組み込まれた染色体を区別する。EcoR1およびHp
a Iハイブリダイゼーションのパターンを比較すること
によって分析した９つのUra+形質転換体のうち２つは、
１個のPOX4遺伝子の正確な遺伝子分断を含有し、３つに
は１個のPOX4遺伝子内にシングルクロスオーバー組み込
みがあり（そのうちのひとつはマルチプルタンデム型組
み込みであった）、４つはシングルクロスオーバー組み
込みおよび遺伝子分断が一方あるいは両方の染色体にあ
った。POX4遺伝子のうちの一方だけに正確な分断を有す
る株をH41と名付けた（POX5/POX5/pox4A:URA3A/POX4B）
（図３）。
スフェロプラストを、10ugのEcoR1で消化したpKD3−URA
3Aで、実施例３に述べたようにしてウラシル原栄養性に
形質転換した。およそ160個の有糸分裂的に安定なUra+
形質転換体が回収できた。すべてはドデカンあるいはメ
チルラウレートを増殖のために資化する能力を示した。
９つのUra+形質転換体の部位特異的遺伝子分断をサザン
交雑によって先に述べたようにスクリーニングした。Ec
oR1で消化したこれらの形質転換体のうちの６つからの
ゲノムDNAのPOX4プローブへのハイブリダイゼーション
により、野生種には存在しない13KbのEcoR1フラグメン
トが存在していることを明らかになった（これらの形質
転換体のうちの代表は図３のH41株である）。このフラ
グメントは野生種POX4のEcoR1フラグメント（9.8Kb）
（図３にSU−２株として示した）よりおよそ2.2kb大き
く、野生種POX4ローカスのPOX4−URA3A分断カセットと
の交換体と一致する。この13KbのEcoR1フラグメントは
また、URA3AプローブによってH41株内に検出できるが、
SU−２株内では検出できない。しかしながら、POX4プロ
ーブに対するハイブリダイゼーションはまた、各これら
の形質転換体中に他の野生種のPOX4遺伝子のコピーの存
在を「カバーできない」ということはカンジダ・トロピ
カリスはPOX4ローカスにおいても２倍体であることを示
す。Hpa Iで消化したゲノムDNAのPOX4プローブへのハイ
ブリダイゼーションは、２つの染色体がこの制限部位で
異種接合体（heterozygous）であり、このため形質転換
体DNAが組み込まれた染色体を区別する。EcoR1およびHp
a Iハイブリダイゼーションのパターンを比較すること
によって分析した９つのUra+形質転換体のうち２つは、
１個のPOX4遺伝子の正確な遺伝子分断を含有し、３つに
は１個のPOX4遺伝子内にシングルクロスオーバー組み込
みがあり（そのうちのひとつはマルチプルタンデム型組
み込みであった）、４つはシングルクロスオーバー組み
込みおよび遺伝子分断が一方あるいは両方の染色体にあ
った。POX4遺伝子のうちの一方だけに正確な分断を有す
る株をH41と名付けた（POX5/POX5/pox4A:URA3A/POX4B）
（図３）。
実施例５ URA3選択可能標識システムの再生 （Ａ）URA3A選択可能標識内の偶発的突然変異によるウ
ラシル栄養要求性株の選択 カンジダ・トロピカリスSU−２（Ura-）株およびH51
（Ura+）株を様々な濃度の、ウラシル経路の中間体の類
縁体であり、Ura+細胞に対して毒性である５−フルオロ
オロチックアシッドを含有した培地内での成育を試験し
た。両方の株はYEPD培地（２％バクト−ペプトン、２％
グルコース、１％バクト−イースト抽出液）内でミッド
−ログ（mid−log）相のまで増殖させ、様々な希釈度の
FOA培地上（ボーク（Boeke）ら、モレック．ジェン．ジ
ェネット（Molec.Gen.Genet.）第197巻、第345〜346頁
（1984年））あるいはYEPD培地上へ撒いた。
ラシル栄養要求性株の選択 カンジダ・トロピカリスSU−２（Ura-）株およびH51
（Ura+）株を様々な濃度の、ウラシル経路の中間体の類
縁体であり、Ura+細胞に対して毒性である５−フルオロ
オロチックアシッドを含有した培地内での成育を試験し
た。両方の株はYEPD培地（２％バクト−ペプトン、２％
グルコース、１％バクト−イースト抽出液）内でミッド
−ログ（mid−log）相のまで増殖させ、様々な希釈度の
FOA培地上（ボーク（Boeke）ら、モレック．ジェン．ジ
ェネット（Molec.Gen.Genet.）第197巻、第345〜346頁
（1984年））あるいはYEPD培地上へ撒いた。
カンジダ・トロピカリスSU−２株は、500、750および
1000ug/mlの５−FOAの存在下それぞれ71.6％、50.3％お
よび14.8％の生存率を示した。匹敵する条件下におい
て、Ura+形質転換体（H51）は3.6×10-6以下の生存率し
か示さなかった。500ug/ml以下の濃度ではUra+フェノタ
イプ中に残る偶発的な５−FOA抵抗性株の増殖が認めら
れた。このため、750ug/mlの5FOAの存在下において非−
機能性URA3Aマーカーを有する分離物を同定することが
できる。
1000ug/mlの５−FOAの存在下それぞれ71.6％、50.3％お
よび14.8％の生存率を示した。匹敵する条件下におい
て、Ura+形質転換体（H51）は3.6×10-6以下の生存率し
か示さなかった。500ug/ml以下の濃度ではUra+フェノタ
イプ中に残る偶発的な５−FOA抵抗性株の増殖が認めら
れた。このため、750ug/mlの5FOAの存在下において非−
機能性URA3Aマーカーを有する分離物を同定することが
できる。
実施例６ URA3選択可能標識系の再生 （Ｂ）調節された染色体の欠失 プラスミドpCU3dKpn IをURA3A遺伝子内にある唯一のK
pn I部位からの前進性のBal31欠失によって構築した。
これらの構築には、プラスミドpCU3の10ugのアリコート
をKpn I制限エンドヌクレアーゼで消化して開環し、そ
の後部分的にBal31ヌクレアーゼ（0.05U/ug,30℃で５、
10、20または30分間）で消化した。続いてDNAポリメラ
ーゼ・クレノウ（Klenow）フラグメントによる処置によ
って、このプラスミドは低いDNA濃度（0.05ug/ul）にお
けるリガーション（ligation）によって再環化した。こ
のリガーション混液を大腸菌（E.coli）HB101をアンピ
シリン耐性に形質転換するのに用い、あるいはEcoR1とP
st Iで消化してカンジダ・トロピカリスH51の直接形質
転換を行った。３つのプラスミドはKpn I部位の欠失を
含み、Bgl II部位の方にのびており、大腸菌のアンピシ
リン耐性形質転換体から得られるる。これらのプラスミ
ドから分離された欠失カセットは、URA3Aの大部分の相
同性（Kb）を保持しつつ比較的小さなURA3A欠失（bp）
を生成するのに用いられ、そしてEcoR1とPst Iによるこ
のプラスミドの消化によって遊離させられる。H51株
は、先に精製し、50bpの欠失スパンのURA3AのKpn I部位
を有することがわかっているEcoR1/Pst Iで消化したpCU
3dKpn Iの20ugと、LiCl手法（イトウ（Ito）ら、ジェイ
・バクテリオール（J.Bacteriol）第153巻第163〜168頁
（1983年））あるいはスフェロプラスト手法で形質転換
した。スフェロプラスト形質転換は、スフェロプラスト
をその次ぎのスクリーニングへの回収率を上昇させるた
めに再生培地の表面上で再生させたことを除いては先に
述べたように行った。Ura-単離物は続いてニスタチン濃
度（以下に述べる）によって同定し、ある場合には５−
FOA抵抗性で選択した。形質転換プレートの表面の細胞
を滅菌YEPD培地で洗浄し、最初のA600が0.1となるよう
にYEPDへ接種し、A600が0.4に到達するまで30℃で培養
した。細胞は遠心分離によって（5000×g,5分間）回収
し、500ml滅菌フラスコ内の100mlのイースト・カーボン
・ベース（YCB;11g/L;ディフコ（Difco））に接種し
た。培養は200rpmで振とうしながら30℃で21時間行っ
た。細胞をその後遠心分離（5000×g,5分間）し、一度
滅菌蒸留水で洗浄し、500mlのフラスコ中の100mlの最少
培地（イースト・ナイトロジェン・ベース6.7g/L、デキ
ストロース20g/L）に再懸濁した。この細胞は振とう（2
00rpm）しながら、30℃で７時間インキュベートした。
その後ニスタチン（50000ユニット/ml保存液（メタノー
ル内）；シグマ（Sigma）＃N3503）を最終濃度が35ユニ
ット/mlとなるように添加し、細胞を30℃で振とう（200
rpm）しながら35分間インキュベートした。この培養物
は滅菌蒸留水で２度洗浄し、10mlの滅菌蒸留水に再懸濁
した。ニスタチン処置を施した細胞（0.1mlアリコー
ト）を選択プレート（YNB6.7g/L、デキストロース20g/
L、寒天20g/L、ウラシル50mg/L、ウリジン150mg/L、ウ
リジン−５−ホスフェート150mg/L、５−フルオロオロ
チックアシッド750mg/L）上へ撒いた。これらのプレー
トは30℃で最高２週間インキュベートし、その間、プレ
ート上で成育したコロニーを滅菌した歯科用ピックでか
きとり先と同様に調製した一連の第２選択プレート上に
移した。インキュベーションは４日間、30℃で行った。
単離されたものはその後、ウラシル添加または非添加の
最少培地のプレートへ移した。ウラシルなしで成育でき
ないコロニーをさらに分析した。H51スフェロプラスト
のpCU3dKpn I（50bpのURA3A欠失と2.4KbのURA3Aのフラ
ンキング遺伝子とのホモロジーを有する）による形質転
換体から回収した25のUra-単離体の性質を、EcoR1で消
化したゲノムDNAのPOX5プローブに対するサザン交雑に
よって解析したところ、13個の単離体が分断されたPOX5
遺伝子内に予期した分断を含有していたことが示され
た。これらの株はH51dKpn（pox5:ura3A/POX5/POX4A/POX
4B）と名付けられた。残りの単離体は有糸分裂組換体の
代表となる。H51dKpn内のURA3AのKpn I部位の隣の50bp
染色体の欠失は、Kpn Iで消化したゲノムDNAのPOX5およ
びURA3A遺伝子プローブに対するサザン交雑によってさ
らに確認した。予期した通り、URA3Aプローブで検出さ
れたH51の7.1Kbと1.4KbのKpnIフラグメントが、H51dKpn
内の8.5KbのKpn Iフラグメントによって書き換えられ
た。幾つかの独立したH51dKpn単離体の逆転頻度はすべ
て１×10-8以下であった。
pn I部位からの前進性のBal31欠失によって構築した。
これらの構築には、プラスミドpCU3の10ugのアリコート
をKpn I制限エンドヌクレアーゼで消化して開環し、そ
の後部分的にBal31ヌクレアーゼ（0.05U/ug,30℃で５、
10、20または30分間）で消化した。続いてDNAポリメラ
ーゼ・クレノウ（Klenow）フラグメントによる処置によ
って、このプラスミドは低いDNA濃度（0.05ug/ul）にお
けるリガーション（ligation）によって再環化した。こ
のリガーション混液を大腸菌（E.coli）HB101をアンピ
シリン耐性に形質転換するのに用い、あるいはEcoR1とP
st Iで消化してカンジダ・トロピカリスH51の直接形質
転換を行った。３つのプラスミドはKpn I部位の欠失を
含み、Bgl II部位の方にのびており、大腸菌のアンピシ
リン耐性形質転換体から得られるる。これらのプラスミ
ドから分離された欠失カセットは、URA3Aの大部分の相
同性（Kb）を保持しつつ比較的小さなURA3A欠失（bp）
を生成するのに用いられ、そしてEcoR1とPst Iによるこ
のプラスミドの消化によって遊離させられる。H51株
は、先に精製し、50bpの欠失スパンのURA3AのKpn I部位
を有することがわかっているEcoR1/Pst Iで消化したpCU
3dKpn Iの20ugと、LiCl手法（イトウ（Ito）ら、ジェイ
・バクテリオール（J.Bacteriol）第153巻第163〜168頁
（1983年））あるいはスフェロプラスト手法で形質転換
した。スフェロプラスト形質転換は、スフェロプラスト
をその次ぎのスクリーニングへの回収率を上昇させるた
めに再生培地の表面上で再生させたことを除いては先に
述べたように行った。Ura-単離物は続いてニスタチン濃
度（以下に述べる）によって同定し、ある場合には５−
FOA抵抗性で選択した。形質転換プレートの表面の細胞
を滅菌YEPD培地で洗浄し、最初のA600が0.1となるよう
にYEPDへ接種し、A600が0.4に到達するまで30℃で培養
した。細胞は遠心分離によって（5000×g,5分間）回収
し、500ml滅菌フラスコ内の100mlのイースト・カーボン
・ベース（YCB;11g/L;ディフコ（Difco））に接種し
た。培養は200rpmで振とうしながら30℃で21時間行っ
た。細胞をその後遠心分離（5000×g,5分間）し、一度
滅菌蒸留水で洗浄し、500mlのフラスコ中の100mlの最少
培地（イースト・ナイトロジェン・ベース6.7g/L、デキ
ストロース20g/L）に再懸濁した。この細胞は振とう（2
00rpm）しながら、30℃で７時間インキュベートした。
その後ニスタチン（50000ユニット/ml保存液（メタノー
ル内）；シグマ（Sigma）＃N3503）を最終濃度が35ユニ
ット/mlとなるように添加し、細胞を30℃で振とう（200
rpm）しながら35分間インキュベートした。この培養物
は滅菌蒸留水で２度洗浄し、10mlの滅菌蒸留水に再懸濁
した。ニスタチン処置を施した細胞（0.1mlアリコー
ト）を選択プレート（YNB6.7g/L、デキストロース20g/
L、寒天20g/L、ウラシル50mg/L、ウリジン150mg/L、ウ
リジン−５−ホスフェート150mg/L、５−フルオロオロ
チックアシッド750mg/L）上へ撒いた。これらのプレー
トは30℃で最高２週間インキュベートし、その間、プレ
ート上で成育したコロニーを滅菌した歯科用ピックでか
きとり先と同様に調製した一連の第２選択プレート上に
移した。インキュベーションは４日間、30℃で行った。
単離されたものはその後、ウラシル添加または非添加の
最少培地のプレートへ移した。ウラシルなしで成育でき
ないコロニーをさらに分析した。H51スフェロプラスト
のpCU3dKpn I（50bpのURA3A欠失と2.4KbのURA3Aのフラ
ンキング遺伝子とのホモロジーを有する）による形質転
換体から回収した25のUra-単離体の性質を、EcoR1で消
化したゲノムDNAのPOX5プローブに対するサザン交雑に
よって解析したところ、13個の単離体が分断されたPOX5
遺伝子内に予期した分断を含有していたことが示され
た。これらの株はH51dKpn（pox5:ura3A/POX5/POX4A/POX
4B）と名付けられた。残りの単離体は有糸分裂組換体の
代表となる。H51dKpn内のURA3AのKpn I部位の隣の50bp
染色体の欠失は、Kpn Iで消化したゲノムDNAのPOX5およ
びURA3A遺伝子プローブに対するサザン交雑によってさ
らに確認した。予期した通り、URA3Aプローブで検出さ
れたH51の7.1Kbと1.4KbのKpnIフラグメントが、H51dKpn
内の8.5KbのKpn Iフラグメントによって書き換えられ
た。幾つかの独立したH51dKpn単離体の逆転頻度はすべ
て１×10-8以下であった。
実施例７ URA3選択可能標識系の再生 C.URA3A選択可能標識内の偶発的突然変異： H53株の構築 （pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4A/POX4B） H53株（pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4A/POX4B）はH51
のUra-類縁体（H51Ura-）をpKD1−URA3AからのPOX5−UR
A3A分断カセットによる、Ura+への以下のようにして形
質転換するのに続いて単離された：形質転換DNAのない
場合にH51から回収される幾つかの偶発的な５−FOA抵抗
株単離体のPOX5EcoR1のハイブリダーゼーションパター
ンはH51と同じであったがフェノタイプがUra-であるこ
とがわかった。この株はH51Ura-（pox5:ura3A/POX5/POX
4A/POX4B）と名付けられた。これらの誘導体は、URA3A
遺伝子内の分断したPOX5ローカスにおいて偶発的なポイ
ントミューテーションをおこし、それゆえURA3A選択可
能標識あるいは特に、POX5−URA3A分断カセットで再形
質転換して効果的に残存機能性POX5遺伝子を不活性化す
る。それゆえ、Ura-のフェノタイプとH51のハイブリダ
ーゼーションパターンを有する20個の単離体をそれぞれ
10ugのEcoR1で消化したpKD1−URA3AでUra+に形質転換す
ることができる。３つの株は、逆転頻度（Ura+フェノタ
イプに対する）がUra+形質転換体の同定をたやすくする
のに十分低い。EcoR1で消化したゲノムDNAのPOX5プロー
ブに対するサザン交雑による、これら３つの株からの28
のUra+形質転換体の解析により、H51の２倍のハイブリ
ダーゼーション強度を有する唯一の6.1KbのEcoR1フラグ
メントを有する９つの形質転換体が同定された。これら
の形質転換体はH53（pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4/POX4
B）と名付けられ、POX5遺伝子の両方のコピーをに分断
があり、図３に示した。これらの株はドデカンを唯一の
炭素源としてでも増殖できる。残りの形質転換体はH51
と同じであり、オリジナルの分断しているPOX5遺伝子に
おける逆転、遺伝子コンバーションまたは遺伝子の交換
の産物であろう。
のUra-類縁体（H51Ura-）をpKD1−URA3AからのPOX5−UR
A3A分断カセットによる、Ura+への以下のようにして形
質転換するのに続いて単離された：形質転換DNAのない
場合にH51から回収される幾つかの偶発的な５−FOA抵抗
株単離体のPOX5EcoR1のハイブリダーゼーションパター
ンはH51と同じであったがフェノタイプがUra-であるこ
とがわかった。この株はH51Ura-（pox5:ura3A/POX5/POX
4A/POX4B）と名付けられた。これらの誘導体は、URA3A
遺伝子内の分断したPOX5ローカスにおいて偶発的なポイ
ントミューテーションをおこし、それゆえURA3A選択可
能標識あるいは特に、POX5−URA3A分断カセットで再形
質転換して効果的に残存機能性POX5遺伝子を不活性化す
る。それゆえ、Ura-のフェノタイプとH51のハイブリダ
ーゼーションパターンを有する20個の単離体をそれぞれ
10ugのEcoR1で消化したpKD1−URA3AでUra+に形質転換す
ることができる。３つの株は、逆転頻度（Ura+フェノタ
イプに対する）がUra+形質転換体の同定をたやすくする
のに十分低い。EcoR1で消化したゲノムDNAのPOX5プロー
ブに対するサザン交雑による、これら３つの株からの28
のUra+形質転換体の解析により、H51の２倍のハイブリ
ダーゼーション強度を有する唯一の6.1KbのEcoR1フラグ
メントを有する９つの形質転換体が同定された。これら
の形質転換体はH53（pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4/POX4
B）と名付けられ、POX5遺伝子の両方のコピーをに分断
があり、図３に示した。これらの株はドデカンを唯一の
炭素源としてでも増殖できる。残りの形質転換体はH51
と同じであり、オリジナルの分断しているPOX5遺伝子に
おける逆転、遺伝子コンバーションまたは遺伝子の交換
の産物であろう。
実施例８ 菌株H534の開発 （pox5:ura3A/pox5:ura3A/pox4A:URA3A/POX4B） この株はPOX5の両方のコピーとPOX4の一つのコピーに
分断を有し、上記の手法で開発した。H53のUra-誘導体
（H53Ura-:pox5:ura3A/pox5:ura3A/POX4A/POX4B）を単
離し、上記のようにして解析し、その後pKD3−URA3Aか
らのPOX4分断カセットによって形質転換してUra+とし
た。POX4とPOX5プローブの両方に対するサザン交雑によ
ってスクリーニングしたUra+形質転換体の50％は、予期
したPOX4分断（H534−図３）を有していた。FOAr、Ura-
誘導体で低いURA+復帰頻度がこの変異体から（H534Ura-
と名付けられた;pox5:ura3A/pox5:ura3A/pox4A:ura3A/P
OX4B）残存機能性POX4遺伝子の分断を調製する上で得ら
れた。
分断を有し、上記の手法で開発した。H53のUra-誘導体
（H53Ura-:pox5:ura3A/pox5:ura3A/POX4A/POX4B）を単
離し、上記のようにして解析し、その後pKD3−URA3Aか
らのPOX4分断カセットによって形質転換してUra+とし
た。POX4とPOX5プローブの両方に対するサザン交雑によ
ってスクリーニングしたUra+形質転換体の50％は、予期
したPOX4分断（H534−図３）を有していた。FOAr、Ura-
誘導体で低いURA+復帰頻度がこの変異体から（H534Ura-
と名付けられた;pox5:ura3A/pox5:ura3A/pox4A:ura3A/P
OX4B）残存機能性POX4遺伝子の分断を調製する上で得ら
れた。
実施例９ 菌株H45の開発 （pox5:URA3A/POX5/pox4A:ura3A/POX4B） この、POX4およびPOX5の両方の遺伝子の１つのコピー
に分断を有する菌株は、上記のようにして開発された。
いくつかのUra+復帰頻度が２×10-7以下を示すH41株か
らの、FOA抵抗性、Ura-誘導体を単離し、POX4プローブ
に対するサザン交雑によって、EcoR1制限パターンがH41
と同じものをスクリーニングした。いくつかのカンジデ
ートは分断POX4ローカスにおいてURA3A遺伝子の好まし
いポイント変異を含み、これを回収してH41Ura-（POX5/
POX5/pox4:ura3A/POX4B）と名付けた。
に分断を有する菌株は、上記のようにして開発された。
いくつかのUra+復帰頻度が２×10-7以下を示すH41株か
らの、FOA抵抗性、Ura-誘導体を単離し、POX4プローブ
に対するサザン交雑によって、EcoR1制限パターンがH41
と同じものをスクリーニングした。いくつかのカンジデ
ートは分断POX4ローカスにおいてURA3A遺伝子の好まし
いポイント変異を含み、これを回収してH41Ura-（POX5/
POX5/pox4:ura3A/POX4B）と名付けた。
H45株は、続いてH41ura-株をpKD1−URA3AからのPOX5
分断カセットによって形質転換して単離した。すべての
Ura+形質転換体をPOX5プローブに対するサザン交雑によ
って分析したところ、予期したようにPOX5に分断を含有
していた（H45−図３）。
分断カセットによって形質転換して単離した。すべての
Ura+形質転換体をPOX5プローブに対するサザン交雑によ
って分析したところ、予期したようにPOX5に分断を含有
していた（H45−図３）。
実施例10 H41B株の開発 （POX5/POX5/POX4A/pox4B:URA3A） POX4Bを不活化するため、非相同的フランキング配列
（non−homologous flanking sequences）を欠き、変異
誘発を支配するのには主として構造遺伝子の相同的配列
に依存する、不完全なPOX4分断カセットでSU−２をUra+
に形質転換した。この形質転換のためのPOX4を調製する
ために、通常のpKD3URA3からの8.3KbのEcoR1分断カセッ
トをBal31とSal Iで消化し、およそ5KbでURA3A選択可能
な標識にフランキングである構造遺伝子のほとんどを含
有するフラグメントを調製した。このDNAはSU−２をUra
+に形質転換するのに使用したものである。Hpa Iで消化
したゲノムDNAのPOX4プローブに対するサザン交雑によ
ってスクリーニングした20のSU−３形質転換体のうちひ
とつが予期したPOX4分断を有していた。この株をH41B
（POX5/POX5/POX4A/pox4B:URA3A）と名付け、ゲノムDNA
のEcoR1あるいはHpa Iで消化したゲノムDNAをPOX4A、UR
A3AおよびpBR322をプローブとしたサザン交雑によって
確認した。この株のEcoR1ハイブイダイゼーションのプ
ロフィールは図３に示したH41のものと同じであった。H
41Bからの5FOA抵抗性、ウラシル要求性誘導体（H41B Ur
a-:POX5/POX5/POX4A/pox4B:ura3A）をダブルPOX4変異
体、H43を構築するために調製した。
（non−homologous flanking sequences）を欠き、変異
誘発を支配するのには主として構造遺伝子の相同的配列
に依存する、不完全なPOX4分断カセットでSU−２をUra+
に形質転換した。この形質転換のためのPOX4を調製する
ために、通常のpKD3URA3からの8.3KbのEcoR1分断カセッ
トをBal31とSal Iで消化し、およそ5KbでURA3A選択可能
な標識にフランキングである構造遺伝子のほとんどを含
有するフラグメントを調製した。このDNAはSU−２をUra
+に形質転換するのに使用したものである。Hpa Iで消化
したゲノムDNAのPOX4プローブに対するサザン交雑によ
ってスクリーニングした20のSU−３形質転換体のうちひ
とつが予期したPOX4分断を有していた。この株をH41B
（POX5/POX5/POX4A/pox4B:URA3A）と名付け、ゲノムDNA
のEcoR1あるいはHpa Iで消化したゲノムDNAをPOX4A、UR
A3AおよびpBR322をプローブとしたサザン交雑によって
確認した。この株のEcoR1ハイブイダイゼーションのプ
ロフィールは図３に示したH41のものと同じであった。H
41Bからの5FOA抵抗性、ウラシル要求性誘導体（H41B Ur
a-:POX5/POX5/POX4A/pox4B:ura3A）をダブルPOX4変異
体、H43を構築するために調製した。
実施例11 菌株H43の開発 （POX5/POX5/pox4A:URA3A/pox4B:ura3A） この、両方のPOX4遺伝子に分断を含有する株はH41BUr
a-をさらに、pKD3−URA3AからのPOX4分断カセットでUra
+へ形質転換して単離した。Hpa Iで消化したゲノムDNA
のPOX4Aプローブに対するサザン交雑でスクリーニング
した20のUra+形質転換体中７つが図３に示したような、
予期した構造を有していた。
a-をさらに、pKD3−URA3AからのPOX4分断カセットでUra
+へ形質転換して単離した。Hpa Iで消化したゲノムDNA
のPOX4Aプローブに対するサザン交雑でスクリーニング
した20のUra+形質転換体中７つが図３に示したような、
予期した構造を有していた。
実施例12 菌株H534Bの開発 （pox5:ura3A/pox5:ura3A/POX4A/pox4B:URA3A） この、POX4B遺伝子と同様に、両方のPOX5遺伝子に分
断を有する株は上記のようにして開発した。この株はH5
3のウラシル要求性誘導体（H53Ura-）の、POX4Aベース
の不完全な分断カセットでPOX4B遺伝子を標的とするた
めの形質転換に続いて単離した。Sac Iで消化したゲノ
ムDNAのPOX4Aプローブに対するサザン交雑によってスク
リーニングした23のURA+遺伝子のうちの２つが予期した
POX4B遺伝子の分断を有していた。H534BのEcrR1ハイブ
リダンゼーションパターンは、図３に示したようにH534
と同じであった。
断を有する株は上記のようにして開発した。この株はH5
3のウラシル要求性誘導体（H53Ura-）の、POX4Aベース
の不完全な分断カセットでPOX4B遺伝子を標的とするた
めの形質転換に続いて単離した。Sac Iで消化したゲノ
ムDNAのPOX4Aプローブに対するサザン交雑によってスク
リーニングした23のURA+遺伝子のうちの２つが予期した
POX4B遺伝子の分断を有していた。H534BのEcrR1ハイブ
リダンゼーションパターンは、図３に示したようにH534
と同じであった。
実施例13 菌株H435の開発 （pox5:URA3A/POX5/pox4A:ura3A/pox4B:ura3A） この、両方のPOX4遺伝子および一方のPOX5遺伝子に分
断を有する株は、H43のウラシル要求性誘導体株（H43Ur
a-）とEcoR1で消化したpKD1−URA3AからのPOX5分断カセ
ットとの形質転換によって構築した。EcoR1で消化した
ゲノムDNAのPOX5プローブに対するサザン交雑によって
スクリーニングした10のUra+形質転換体のうちの８つが
図３に示したような予期した構造を有していた。
断を有する株は、H43のウラシル要求性誘導体株（H43Ur
a-）とEcoR1で消化したpKD1−URA3AからのPOX5分断カセ
ットとの形質転換によって構築した。EcoR1で消化した
ゲノムDNAのPOX5プローブに対するサザン交雑によって
スクリーニングした10のUra+形質転換体のうちの８つが
図３に示したような予期した構造を有していた。
実施例14 H5343株の開発 （pox5:ura3A/pox5:ura3A/pox4A:ura3A/pox4B:URA3A） この、すべてのPOX4およびPOX5遺伝子が不活性化され
ている株は、H534のウラシル要求性株（H534Ura-）をpK
D3−URA3Aからの、POX4Aベースの不完全な分断カセット
との形質転換に続いて単離した。Sac Iで消化したゲノ
ムDNAのPOX4Aプローブに対するサザン交雑によってスク
リーニングした100の形質転換体のうちの３つが、POX4B
遺伝子に分断を含有していた（図３）。H5343をさらにP
OX5プローブに体するサザン交雑によって評価したとこ
ろ先のすべての分断を保持していることが確かめられ
た。すべてのこの系統の先の変異体とはちがい、H5343
をはドデカンあるいはメチルラウレートを増殖のための
単一炭素源として資化することはもはや不可能である。
ている株は、H534のウラシル要求性株（H534Ura-）をpK
D3−URA3Aからの、POX4Aベースの不完全な分断カセット
との形質転換に続いて単離した。Sac Iで消化したゲノ
ムDNAのPOX4Aプローブに対するサザン交雑によってスク
リーニングした100の形質転換体のうちの３つが、POX4B
遺伝子に分断を含有していた（図３）。H5343をさらにP
OX5プローブに体するサザン交雑によって評価したとこ
ろ先のすべての分断を保持していることが確かめられ
た。すべてのこの系統の先の変異体とはちがい、H5343
をはドデカンあるいはメチルラウレートを増殖のための
単一炭素源として資化することはもはや不可能である。
実施例15 ドデカンのH53株による発酵による1,12−ドデカンジオ
酸の製造 通常の発酵条件（実施例20）下におけるH53株による
ドデカンの発酵で232時間以内に、34％の基質変換効率
でおよそ138g/製造された。最終製造速度は0.55g//
hrであった。生成物は85.7％がドデカンジオ酸であっ
た。その他の生成物はおもにアジピン酸であった。メチ
ルラウレートを基質とした場合は、H534は223時間以内
に34.6％の基質変換効率で115.3g/のジカルボン酸を
製造した。生成速度は0.49g/l/hr.であった。生成物の8
9.1％はドデカン酸であり、含有される残りの化合物は
おもにアジピン酸であった。
酸の製造 通常の発酵条件（実施例20）下におけるH53株による
ドデカンの発酵で232時間以内に、34％の基質変換効率
でおよそ138g/製造された。最終製造速度は0.55g//
hrであった。生成物は85.7％がドデカンジオ酸であっ
た。その他の生成物はおもにアジピン酸であった。メチ
ルラウレートを基質とした場合は、H534は223時間以内
に34.6％の基質変換効率で115.3g/のジカルボン酸を
製造した。生成速度は0.49g/l/hr.であった。生成物の8
9.1％はドデカン酸であり、含有される残りの化合物は
おもにアジピン酸であった。
実施例16 ドデカンあるいはメチルラウレートのH534株による発酵
からの1,12−ドデカンジオ酸の製造 通常の発酵条件（実施例20）下におけるH534株による
ドデカンの発酵で233時間以内に、32.1％の基質変換効
率でおよそ139g/製造された。最終製造速度は0.58g/
/hrであった。生成物は82.7％がドデカンジオ酸であ
った。その他の生成物はおもにアジピン酸であった。メ
チルラウレートを基質とした場合は、H534は223時間以
内に34.6％の基質変換効率で115.3g/のジカルボン酸
を製造した。生成速度は0.49g//hrであった。生成物
の89.1％のドデカンジオ酸であった。残りの化合物はお
もにアジピン酸であった。
からの1,12−ドデカンジオ酸の製造 通常の発酵条件（実施例20）下におけるH534株による
ドデカンの発酵で233時間以内に、32.1％の基質変換効
率でおよそ139g/製造された。最終製造速度は0.58g/
/hrであった。生成物は82.7％がドデカンジオ酸であ
った。その他の生成物はおもにアジピン酸であった。メ
チルラウレートを基質とした場合は、H534は223時間以
内に34.6％の基質変換効率で115.3g/のジカルボン酸
を製造した。生成速度は0.49g//hrであった。生成物
の89.1％のドデカンジオ酸であった。残りの化合物はお
もにアジピン酸であった。
実施例17 H5343株の発酵によるジカルボン酸の製造 H5343株の発酵は、生成物相が6g/hから15g/hのレベル
である間に30％（v/v）のグルコース共基質を添加する
以外は標準的な発酵条件（実施例20）でおこなった。ド
デカン、トリデカン、テトラデカンまたはメチルミリス
テート基質は標準発酵法に沿って、生成相の間に添加し
た。
である間に30％（v/v）のグルコース共基質を添加する
以外は標準的な発酵条件（実施例20）でおこなった。ド
デカン、トリデカン、テトラデカンまたはメチルミリス
テート基質は標準発酵法に沿って、生成相の間に添加し
た。
ドテカン（99.0％純度）を基質とすると、この株は23
2時間の間に80％の基質変換効率で127g/のジカルボン
酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は0.9g//hr
である。生成物は98.4％がドデカンジオ酸であった。
2時間の間に80％の基質変換効率で127g/のジカルボン
酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は0.9g//hr
である。生成物は98.4％がドデカンジオ酸であった。
トリデカン（99.0％純度）を基質とすると、この株は
114時間の間に92％の基質変換効率で101.8g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は1.2g/
/hrである。生成物は98.6％がブラスイリック酸（Bra
ssylyc acid）であった。
114時間の間に92％の基質変換効率で101.8g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は1.2g/
/hrである。生成物は98.6％がブラスイリック酸（Bra
ssylyc acid）であった。
テトラデカン（99.0％純度）を基質とすると、この株
は160時間の間に96％の基質変換効率で103g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は0.85g/
/hrである。生成物は98.0％がテトラデカン酸であっ
た。
は160時間の間に96％の基質変換効率で103g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は0.85g/
/hrである。生成物は98.0％がテトラデカン酸であっ
た。
トリデカン（95.0％純度）を基質とすると、この株は
213時間の間に99.5％の基質変換効率で213g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は1.33g/
/hrである。生成物は94.5％がテトラデカンジオ酸で
あった。
213時間の間に99.5％の基質変換効率で213g/のジカル
ボン酸を生成する。この発酵の間の最高生産性は1.33g/
/hrである。生成物は94.5％がテトラデカンジオ酸で
あった。
総合的な実験方法 実施例18 菌株の評価 A.H5343株の有糸分裂的安定性 POX遺伝子分断の有糸分裂的安定性を調べるため、H53
43株をYEPD培地（２％グルコース、２％ペプトン、１％
イースト抽出物）内で持続的にトランスファーして培養
し、10日以上の間毎日アルカン資化フェノタイプへの
「復帰」を、YEPD培地上へ連続的に希釈した物を添加す
る（その世代（generation）の全数を決定するために、
生存細胞数を得るため）のと同様にして、0.1mlのアリ
コートをドデカンを単一炭素源として含有するイースト
・ナイトロジェン・ベース・アガー（ディフコ）上へ撒
いた。91世代後、アルカン資化性の単離体は回収でき
ず、この変異株の安定性を証明した。
43株をYEPD培地（２％グルコース、２％ペプトン、１％
イースト抽出物）内で持続的にトランスファーして培養
し、10日以上の間毎日アルカン資化フェノタイプへの
「復帰」を、YEPD培地上へ連続的に希釈した物を添加す
る（その世代（generation）の全数を決定するために、
生存細胞数を得るため）のと同様にして、0.1mlのアリ
コートをドデカンを単一炭素源として含有するイースト
・ナイトロジェン・ベース・アガー（ディフコ）上へ撒
いた。91世代後、アルカン資化性の単離体は回収でき
ず、この変異株の安定性を証明した。
実施例19 B.アシル−CoA酸化酵素活性に対する酵素的試験 アシル−CoAオキシダーゼ活性に対する試験による菌
株の生化学的評価を行った。各菌株に対して接種物はグ
ルコースベースの培地（YEPD）で30時間増殖させ、続い
てイースト抽出物（0.3％）およびグルコース（1.5％）
かドデカン（1.5％）あるいはメチルラウレート（0.5
％）のどれかを含有するイースト・ナイトロジェン・ベ
ース・メディア（ディフコ）中で40時間の誘導を行っ
た。抽出物は、洗浄した細胞懸濁液をフレンチ・プレッ
シャー・セル（French Pressure Cell）（1260psi）を
繰り返して通し細胞残渣を遠心分離（13000×ｇ）で除
いて調製した。活性はシミズ（Shimizu）ら、バイオケ
ム・バイオフィズ・レス・コミュン（Biochem.Biophys.
Res.Commun.）第91巻第108〜113頁（1979年））の方法
で測定した。活性はC6−CoA、C10−CoA、およびC12−Co
Aの基質に関してそれぞれ独立に測定し、タンパク質含
量に対して標準化した。部分的Ｂ−酸化遮断を含有する
いくつかの変異体においては、あきらかにひとつのPOX
遺伝子産物の欠損が残りの機能性POX遺伝子の過発現に
よって補償されているため、アシル−CoA酸化酵素活性
はコントロール菌株であるSU−２より高くなっている。
しかしながら、これらの変異体における上昇したレベル
のアシル−CoA酸化酵素活性にもかかわらず、基質のか
なりの部分はオメガ−酸化経路（以下を見よ）に向け直
される。このことは、POX遺伝子産物は機能的に同一で
ないだけではなく、生理学的にも自己完結性（self−su
fficient）でないということを示す。
株の生化学的評価を行った。各菌株に対して接種物はグ
ルコースベースの培地（YEPD）で30時間増殖させ、続い
てイースト抽出物（0.3％）およびグルコース（1.5％）
かドデカン（1.5％）あるいはメチルラウレート（0.5
％）のどれかを含有するイースト・ナイトロジェン・ベ
ース・メディア（ディフコ）中で40時間の誘導を行っ
た。抽出物は、洗浄した細胞懸濁液をフレンチ・プレッ
シャー・セル（French Pressure Cell）（1260psi）を
繰り返して通し細胞残渣を遠心分離（13000×ｇ）で除
いて調製した。活性はシミズ（Shimizu）ら、バイオケ
ム・バイオフィズ・レス・コミュン（Biochem.Biophys.
Res.Commun.）第91巻第108〜113頁（1979年））の方法
で測定した。活性はC6−CoA、C10−CoA、およびC12−Co
Aの基質に関してそれぞれ独立に測定し、タンパク質含
量に対して標準化した。部分的Ｂ−酸化遮断を含有する
いくつかの変異体においては、あきらかにひとつのPOX
遺伝子産物の欠損が残りの機能性POX遺伝子の過発現に
よって補償されているため、アシル−CoA酸化酵素活性
はコントロール菌株であるSU−２より高くなっている。
しかしながら、これらの変異体における上昇したレベル
のアシル−CoA酸化酵素活性にもかかわらず、基質のか
なりの部分はオメガ−酸化経路（以下を見よ）に向け直
される。このことは、POX遺伝子産物は機能的に同一で
ないだけではなく、生理学的にも自己完結性（self−su
fficient）でないということを示す。
H43株はPOX5アイソザイム機能を有する。この菌株か
らの抽出物は、メチルラウレート誘導細胞では３つすべ
ての基質に対して、およびドデカン誘導細胞ではC6−Co
Aに対しての活性がSU−２株より低かった。特異的活性
は、C10−CoAまたはC6−CoAのどちらより、C12−CoAに
対する方が高かった。こういうことから、POX5アイソザ
イムは「長鎖活性」機能を有する。これに対して、H53
を分析すると、広い基質範囲にかかるPOX4アイソザイム
機能は、より短い鎖の基質において最高の特異的活性を
示すことが明らかになった。C6−CoAあるいはC10−CoA
基質に対する特異的活性はC12−CoAに対するものより高
かった。これらの結果はPOX4とPOX5アイソザイムは鎖長
に対する特異性に違いがあることを示す。グルコースで
誘導した場合はPOX4アイソザイムを含有する変異株のみ
が機能的にアシル−CoA活性を示した。このことは、POX
4タンパク質が唯一構造的にアシル−CoA酸化酵素アイソ
ザイムを発現することを示す。活性のレベルはPOX4分断
を含有し、そのためPOX4タンパク質を少なくとも幾つか
は欠いている変異株のみにおいて野生種よりも減少し
た。グルコース上で増殖させたH43にはほとんどあるい
は全く活性が検出できなかったことは、POX5がこれらの
条件下においては発現されないことを示唆する。
らの抽出物は、メチルラウレート誘導細胞では３つすべ
ての基質に対して、およびドデカン誘導細胞ではC6−Co
Aに対しての活性がSU−２株より低かった。特異的活性
は、C10−CoAまたはC6−CoAのどちらより、C12−CoAに
対する方が高かった。こういうことから、POX5アイソザ
イムは「長鎖活性」機能を有する。これに対して、H53
を分析すると、広い基質範囲にかかるPOX4アイソザイム
機能は、より短い鎖の基質において最高の特異的活性を
示すことが明らかになった。C6−CoAあるいはC10−CoA
基質に対する特異的活性はC12−CoAに対するものより高
かった。これらの結果はPOX4とPOX5アイソザイムは鎖長
に対する特異性に違いがあることを示す。グルコースで
誘導した場合はPOX4アイソザイムを含有する変異株のみ
が機能的にアシル−CoA活性を示した。このことは、POX
4タンパク質が唯一構造的にアシル−CoA酸化酵素アイソ
ザイムを発現することを示す。活性のレベルはPOX4分断
を含有し、そのためPOX4タンパク質を少なくとも幾つか
は欠いている変異株のみにおいて野生種よりも減少し
た。グルコース上で増殖させたH43にはほとんどあるい
は全く活性が検出できなかったことは、POX5がこれらの
条件下においては発現されないことを示唆する。
H5343にはアシル−CoA酸化酵素活性（基質はC4−CoA
からC18−AoAの範囲）が検出されなかったことは、アシ
ル−CoA酸化酵素の機能をコードする全ての遺伝子が不
活化されていることを示す。この変異株はもはやアルカ
ンあるいは脂肪酸の基質を唯一の炭素源として増殖する
ことができず、ここに述べた多種遺伝子分断はＢ−酸化
経路を完全に遮断する。
からC18−AoAの範囲）が検出されなかったことは、アシ
ル−CoA酸化酵素の機能をコードする全ての遺伝子が不
活化されていることを示す。この変異株はもはやアルカ
ンあるいは脂肪酸の基質を唯一の炭素源として増殖する
ことができず、ここに述べた多種遺伝子分断はＢ−酸化
経路を完全に遮断する。
実施例20 標準発酵方法 発酵は15Lの発酵槽（バイオスタット・イー（Biostat
E.）ビーブラウン・インコーポレイテッド（B.Braun,I
nc.）内で10L以下の培養物で、BL1囲い込みプレキュエ
ーション（precuations）およびNIHの組換えDNA分子を
含む研究のためのガイドラインに特定されているグッド
・ラボラトリー・プラクティスを用いて行った。
E.）ビーブラウン・インコーポレイテッド（B.Braun,I
nc.）内で10L以下の培養物で、BL1囲い込みプレキュエ
ーション（precuations）およびNIHの組換えDNA分子を
含む研究のためのガイドラインに特定されているグッド
・ラボラトリー・プラクティスを用いて行った。
発酵培地には、3g/のペプトン、6g/のイースト抽
出液、6.7g/のイースト・ナイトロジェン・ベース
（ディフコ）、3g/の酢酸ナトリウムおよび75g/の
グルコースを含有する。この培地は15psiで121℃で加熱
することによって滅菌した。2mlの15％グリセロール保
存培養物を接種した種培養物は、発酵槽への接種に先立
ってこの培地500ml中に、24時間、250rpm、30℃で培養
して調製した。接種に続いて、この培養物の30℃におけ
るpHを8.3に（6NのKOHで調節して）、溶解酸素量を80％
に（2vvm吹き込み速度および500〜1200rpm）、有機基質
を添加する前に625nmの吸光度が約60から70を達成する
まで（約24時間）保った。この発酵工程の最初の段階に
おいて、グルコースは培養物に使い尽くされてしまう。
基質および共基質はその後毎日有機基質の４〜60g/の
範囲の濃度を保つように添加した。共基質は１時間あた
りおよそ1.5から1.75グラム、発酵液１リットルにつき
添加した。市販の消泡剤もまた発酵槽に必要に応じて添
加しても良い。試料は生成物のレベルと残存基質をガラ
スクロマトグラフィーで調べるため基本的に毎日取っ
た。
出液、6.7g/のイースト・ナイトロジェン・ベース
（ディフコ）、3g/の酢酸ナトリウムおよび75g/の
グルコースを含有する。この培地は15psiで121℃で加熱
することによって滅菌した。2mlの15％グリセロール保
存培養物を接種した種培養物は、発酵槽への接種に先立
ってこの培地500ml中に、24時間、250rpm、30℃で培養
して調製した。接種に続いて、この培養物の30℃におけ
るpHを8.3に（6NのKOHで調節して）、溶解酸素量を80％
に（2vvm吹き込み速度および500〜1200rpm）、有機基質
を添加する前に625nmの吸光度が約60から70を達成する
まで（約24時間）保った。この発酵工程の最初の段階に
おいて、グルコースは培養物に使い尽くされてしまう。
基質および共基質はその後毎日有機基質の４〜60g/の
範囲の濃度を保つように添加した。共基質は１時間あた
りおよそ1.5から1.75グラム、発酵液１リットルにつき
添加した。市販の消泡剤もまた発酵槽に必要に応じて添
加しても良い。試料は生成物のレベルと残存基質をガラ
スクロマトグラフィーで調べるため基本的に毎日取っ
た。
実施例21 プラスミドpCU2dSac Iの構築 URA3A遺伝子を含有する5.8KbのDNAフラグメントをYEp
13−ベースのカンジダ・トロピカリスゲノムライブラリ
ープラスミドであるpCU1（ATCC67867）から得た。この
フラグメントの制限酵素マッピングを楽にするために、
大部分のフラグメントを、マルチプルクローニングサイ
トあるいはポリリンカーを有し、小さな（2686塩基
対）、pBR322-でM13mp19ベースのクローニングベクター
pUC19（ヤーニッシュ−ペロン（Yanisch−Perron C.）
ら、ジーン（Gene）第33巻第103〜119頁（1985年））内
にサブクローン化した。このプラスミドを構築するため
に、pUC1からの、カンジダ・トロピカリスDNAをほとん
ど含有する6.2KbのEcoR1フラグメントをpUC19のEcoR1部
位に挿入し、プラスミドpCU2を調製した。サブクローン
化したフラグメントの片方の端にはYEp13の377塩基対が
含まれており、反対側は右手のBamH I−Sau3A I分岐点
からおよそ50塩基対の位置にあるEcoR1部位で終わって
いる。pUC2dSac Iを構築するために、pCU2からの2.8Kb
のEcoR1/Sac I制限フラグメントをpUC19のポリリンカー
配列中のEcoR1/Sac I部位内へサブクローン化した。
13−ベースのカンジダ・トロピカリスゲノムライブラリ
ープラスミドであるpCU1（ATCC67867）から得た。この
フラグメントの制限酵素マッピングを楽にするために、
大部分のフラグメントを、マルチプルクローニングサイ
トあるいはポリリンカーを有し、小さな（2686塩基
対）、pBR322-でM13mp19ベースのクローニングベクター
pUC19（ヤーニッシュ−ペロン（Yanisch−Perron C.）
ら、ジーン（Gene）第33巻第103〜119頁（1985年））内
にサブクローン化した。このプラスミドを構築するため
に、pUC1からの、カンジダ・トロピカリスDNAをほとん
ど含有する6.2KbのEcoR1フラグメントをpUC19のEcoR1部
位に挿入し、プラスミドpCU2を調製した。サブクローン
化したフラグメントの片方の端にはYEp13の377塩基対が
含まれており、反対側は右手のBamH I−Sau3A I分岐点
からおよそ50塩基対の位置にあるEcoR1部位で終わって
いる。pUC2dSac Iを構築するために、pCU2からの2.8Kb
のEcoR1/Sac I制限フラグメントをpUC19のポリリンカー
配列中のEcoR1/Sac I部位内へサブクローン化した。
実施例２ プラスミドpKD1dBamH1の構築 カンジダ・トロピカリスPOX5遺伝子は最初、pC50（広
島大学（日本、広島）のカミリョウ教授から得た）から
得た3.9KbEcoR1制限フラグメント上の、pBR322の唯一の
EcoR1部位に標準的な手法（マニアティスら、モレキュ
ラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、コー
ルド・スプリング・ハーバー1982年）を用いてpKD1と名
付けられたプラスミドを構築した。このサブクローン化
したPOX5遺伝子の、特定のPOX5のBamH1部位（位置＃117
8）内へのサブクローニングによるカンジダ・トロピカ
リスURA3A遺伝子のような選択可能標識遺伝子の挿入に
よる不活性化によるインビトロの分断をたやすくするた
め、テトラサイクリン耐性遺伝子pBR322内にある邪魔な
BamH1部位は、BamH1制限エンドヌクレアーゼによる部分
的なpKD1の消化、およびその後のDNAポリメラーゼによ
る結合性の末端の充填および分子内ブラント−エンド
（blunt−end）連結して破壊された。
島大学（日本、広島）のカミリョウ教授から得た）から
得た3.9KbEcoR1制限フラグメント上の、pBR322の唯一の
EcoR1部位に標準的な手法（マニアティスら、モレキュ
ラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、コー
ルド・スプリング・ハーバー1982年）を用いてpKD1と名
付けられたプラスミドを構築した。このサブクローン化
したPOX5遺伝子の、特定のPOX5のBamH1部位（位置＃117
8）内へのサブクローニングによるカンジダ・トロピカ
リスURA3A遺伝子のような選択可能標識遺伝子の挿入に
よる不活性化によるインビトロの分断をたやすくするた
め、テトラサイクリン耐性遺伝子pBR322内にある邪魔な
BamH1部位は、BamH1制限エンドヌクレアーゼによる部分
的なpKD1の消化、およびその後のDNAポリメラーゼによ
る結合性の末端の充填および分子内ブラント−エンド
（blunt−end）連結して破壊された。
連結されたDNAは大腸菌HB101をアンピシリン耐性に形
質転換するのに用い、５個のアンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性形質転換体からのプラスミドうちの２
個は予期した構造を示した。pKD1dBamH1と名付けられた
プラスミドのBamH1消化によって、カンジダ・トロピカ
リスURA3A遺伝子を優位いつのPOX5のBamH1部位にサブク
ローニングするのに適当な１本の線状制限フラグメント
が得られる。
質転換するのに用い、５個のアンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性形質転換体からのプラスミドうちの２
個は予期した構造を示した。pKD1dBamH1と名付けられた
プラスミドのBamH1消化によって、カンジダ・トロピカ
リスURA3A遺伝子を優位いつのPOX5のBamH1部位にサブク
ローニングするのに適当な１本の線状制限フラグメント
が得られる。
実施例23 プラスミドpKD3dBamH1の構築 カンジダ・トロピカリスPOX遺伝子は最初、プラスミ
ドpC1（広島大学（日本、広島）のカミリョウ教授から
得た）からの6.6KbのHind III制限フラグメント上、pBR
322の唯一のHind III部位に標準的な手法（マニアティ
スら、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバー1982年）を
用いてサブクローン化した。このサブクローン化したPO
X4遺伝子の、特定のPOX4のBamH1部位（位置＃2101）内
へのサブクローニングによるカンジダ・トロピカリスUR
A3A遺伝子のような選択可能標識遺伝子の挿入による不
活性化によるインビトロの分断をたやすくするため、テ
トラサイクリン耐性遺伝子pBR322内にある邪魔なBamH1
部位は、BamH1制限エンドヌクレアーゼによる部分的なp
KD3の消化、およびその後のDNAポリメラーゼ（クレナ
ウ）による結合性の末端の充填および分子内ブラント−
エンド（blunt−end）連結して破壊された。
ドpC1（広島大学（日本、広島）のカミリョウ教授から
得た）からの6.6KbのHind III制限フラグメント上、pBR
322の唯一のHind III部位に標準的な手法（マニアティ
スら、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバー1982年）を
用いてサブクローン化した。このサブクローン化したPO
X4遺伝子の、特定のPOX4のBamH1部位（位置＃2101）内
へのサブクローニングによるカンジダ・トロピカリスUR
A3A遺伝子のような選択可能標識遺伝子の挿入による不
活性化によるインビトロの分断をたやすくするため、テ
トラサイクリン耐性遺伝子pBR322内にある邪魔なBamH1
部位は、BamH1制限エンドヌクレアーゼによる部分的なp
KD3の消化、およびその後のDNAポリメラーゼ（クレナ
ウ）による結合性の末端の充填および分子内ブラント−
エンド（blunt−end）連結して破壊された。
連結されたDNAは大腸菌HB101をアンピシリン耐性に形
質転換するのに用い、これらのアンピシリン耐性、テト
ラサイクリン感受性形質転換体からのプラスミドうちの
２個は予期した構造を示した。pKD3dBamH1と名付けられ
たプラスミドのBamH1消化によって、カンジダ・トロピ
カリスURA3A遺伝子を特定のPOX4遺伝子内にサブクロー
ニングするのに適当な１本の線状制限フラグメントが得
られる。
質転換するのに用い、これらのアンピシリン耐性、テト
ラサイクリン感受性形質転換体からのプラスミドうちの
２個は予期した構造を示した。pKD3dBamH1と名付けられ
たプラスミドのBamH1消化によって、カンジダ・トロピ
カリスURA3A遺伝子を特定のPOX4遺伝子内にサブクロー
ニングするのに適当な１本の線状制限フラグメントが得
られる。
微生物の寄託 SU−２株（ATCC 20913）、プラスミドpCU1（ATCC 6
7867）を含有する大腸菌（HB101）、およびH5343株（AT
CC 20962）の生培養物は、20852エムディー、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ12301番（12301 Parklawn
Drive,Rockville,MD 20852）に住所を有するアメリカン
・タイプ・カルチャーコレクション（American Type Cu
lture Collection）に、特許手続上の微生物の寄託の国
際承認に関するブタペスト条約に基づいて寄託した。
7867）を含有する大腸菌（HB101）、およびH5343株（AT
CC 20962）の生培養物は、20852エムディー、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ12301番（12301 Parklawn
Drive,Rockville,MD 20852）に住所を有するアメリカン
・タイプ・カルチャーコレクション（American Type Cu
lture Collection）に、特許手続上の微生物の寄託の国
際承認に関するブタペスト条約に基づいて寄託した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:74） (72)発明者 エイリッヒ、エル・ダッドレイ アメリカ合衆国 95403 カリフォルニ ア、サンタ・ローザ、チューリップツリ ー・ロード 1400番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/19
Claims (66)
- 【請求項１】ターゲット遺伝子に相同を有するかあるい
はターゲット遺伝子をはさむDNA配列に相同を有するDNA
配列により両端部ではさまれている、選択できる標識遺
伝子を含む直鎖状DNAフラグメントでカンジダ・トロピ
カリス宿主細胞を形質転換する工程を含む、カンジダ・
トロピカリス・ゲノムの部位特異的改変方法。 - 【請求項２】選択できる標識遺伝子がURA3A、URA3B、HI
S4、POX4A、POX4B又はPOX5遺伝子である請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】選択できる標識遺伝子がURA3Aである請求
項２記載の方法。 - 【請求項４】選択できる標識遺伝子がURA3Bである請求
項２記載の方法。 - 【請求項５】直鎖DNAフラグメントが、第一端部で1.2Kb
5′POX5配列により、および第二端部で2.7Kb3′POX5配
列によりはさまれたURA3A遺伝子である請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】直鎖DNAフラグメントが、第一端部で2.1Kb
5′POX4配列により、および第二端部で4.5Kb3′POX4配
列によりはさまれたURA3A遺伝子である請求項１記載の
方法。 - 【請求項７】さらに、（ａ）該選択できるマーカーが不
活性化された自然突然変異株を選択して、先に原栄養体
に形質転換した株より誘導される栄養要求性株を同定
し、単離する工程； （ｂ）該自然突然変異株の栄養素要求表現型を確認する
工程； （ｃ）サザン・ハイブリダイゼーション法により、該自
然突然変異株の親株の遺伝子型を確認する工程 からなる選択できる標的遺伝子を含む直鎖状DNAフラグ
メントにて原栄養体に形質変換させたカンジダ・トロピ
カリス細胞に、栄養素要求表現型を復元させる工程をさ
らに含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】該自然突然変異株がウラシル要求型である
請求項７記載の方法。 - 【請求項９】該自然突然変異株がヒスチジン要求型であ
る請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】さらに、（ａ）先に原栄養体に形質転換
した宿主細胞を、選択できる標識遺伝子の中央コード化
配列のインビトロ欠失により非機能性とした、非機能性
の選択できる標識遺伝子にて形質転換して栄養素要求体
突然変異株を製造する工程； （ｂ）この突然変異株の栄養素要求表現型を確認する工
程； （ｃ）この突然変異株の遺伝子型の系統を確認する工程 からなる選択できる標的遺伝子を含む直鎖状DNAフラグ
メントにて原栄養体に形質変換させたカンジダ・トロピ
カリス細胞に、栄養素要求表現型を復元させる工程を含
む、請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】原栄養体細胞がさらにカンジダ・トロピ
カリスのURA3栄養素要求体をURA3A又はURA3B選択可能標
識遺伝子で形質転換して得られ、かつ非機能性の選択で
きる標識遺伝子がカンジダ・トロピカリスURA3AまたはU
RA3B遺伝子から誘導される請求項第10項記載の方法。 - 【請求項１２】カンジダ・トロピカリスの宿主株のPOX4
A,POX4B,および両方のPOX5遺伝子を分断することを特徴
とするカンジダ・トロピカリスのβ−酸化経路をその最
初のコミッテッド反応において完全にブロッキングする
方法。 - 【請求項１３】窒素源、有機基質及び共基質を含む培地
中でカンジダ・トロピカリスがH5343株を培養すること
を特徴とする、実質的に定量的な収率で実質的に純粋な
α，ω−ジカルボン酸を製造する方法。 - 【請求項１４】培地の初期pHが6.5である請求項13記載
の方法。 - 【請求項１５】最大細胞濃度に達した後の培地のpHを8.
3から8.8に維持する請求項13記載の方法。 - 【請求項１６】培地中の基質の濃度が10から20g/であ
る請求項13記載の方法。 - 【請求項１７】共基質がアルカリ培地１リットル当たり
1.5から1.75g/時間加えられる請求項13記載の方法。 - 【請求項１８】基質が炭素数４から22のアルカンである
請求項13記載の方法。 - 【請求項１９】アルカンがドデカン、トリデカン、また
はテトラデカンである請求項18記載の方法。 - 【請求項２０】アルカンがドデカンである請求項19記載
の方法。 - 【請求項２１】基質が、エステルのアシル部が４から22
の炭素数を有するエステルである請求項13記載の方法。 - 【請求項２２】エステルがこのエステルのアシル部が12
から18の炭素数を有する脂肪酸のエチルエステルまたは
メチルエステルである請求項21記載の方法。 - 【請求項２３】エステルがメチルミリステート、メチル
パルミテート、メチルパルミトオレート、またはメチル
オレエートである請求項22記載の方法。 - 【請求項２４】基質が炭素数４から22のカルボン酸であ
る請求項13記載の方法。 - 【請求項２５】脂肪酸が12から18の炭素数を有する請求
項22記載の方法。 - 【請求項２６】脂肪酸がオレイン酸である請求項25記載
の方法。 - 【請求項２７】分断染色体POX4A遺伝子を有するカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項２８】POX4A遺伝子がURA3A選択可能マーカーに
より分断されている請求項27記載のカンジダ・トロピカ
リス細胞。 - 【請求項２９】POX4A遺伝子がURA3B選択可能マーカーに
よって分断されている請求項27記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３０】POX4A遺伝子がHIS4選択可能マーカーに
よって分断されている請求項27記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３１】分断染色体POX4B遺伝子を有するカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項３２】POX4B遺伝子がURA3A選択可能マーカーに
よって分断されている請求項31記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３３】POX4B遺伝子がURA3B選択可能マーカーに
よって分断されている請求項31記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３４】POX4B遺伝子がHIS4選択可能マーカーに
よって分断されている請求項31記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３５】分断染色体POX5遺伝子を有するカンジダ
・トロピカリス細胞。 - 【請求項３６】POX5遺伝子がURA3A選択可能マーカーに
よって分断されている請求項35記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３７】POX5遺伝子がURA3B選択可能マーカーに
よって分断されている請求項35記載のカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項３８】POX5遺伝子がHIS4選択可能マーカーによ
って分断されている請求項35記載のカンジダ・トロピカ
リス細胞。 - 【請求項３９】染色体POX4Aおよび染色体POX5遺伝子の
一方が分断されているカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４０】POX4およびPOX5遺伝子がURA3A選択可能
マーカーによって分断されている請求項39記載のカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４１】POX4AおよびPOX5遺伝子がURA3B選択可能
マーカーによって分断されている請求項39記載のカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４２】POX4AおよびPOX5遺伝子がHIS4選択可能
マーカーによって分断されている請求項39記載のカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４３】分断された染色体POX4AおよびPOX4B遺伝
子を有するカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４４】POX4AおよびPOX4B遺伝子がURA3A選択可
能マーカーによって分断されている請求項43記載のカン
ジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４５】POX4AおよびPOX4B遺伝子がURA3B選択可
能マーカーによって分断されている請求項43記載のカン
ジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４６】POX4AおよびPOX4B遺伝子がHIS4選択可能
マーカーによって分断されている請求項43記載のカンジ
ダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４７】染色体POX5遺伝子の両方のコピーが分断
されているカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４８】染色体POX5遺伝子の両方のコピーがURA3
A選択可能マーカーによって分断されている請求項47記
載のカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項４９】染色体POX5遺伝子の両方のコピーがURA3
B選択可能マーカーによって分断されている請求項47記
載のカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項５０】染色体POX5遺伝子の両方のコピーがHIS4
選択可能マーカーによって分断されている請求項47記載
のカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項５１】染色体POX4A遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーが分断されているカンジダ・トロピカリ
ス細胞。 - 【請求項５２】染色体POX4A遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがURA3A選択可能マーカーによって分断
されている請求項51記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項５３】染色体POX4A遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがURA3B選択可能マーカーによって分断
されている請求項51記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項５４】染色体POX4A遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがHIS4選択可能マーカーによって分断さ
れている請求項51記載のカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項５５】染色体POX4B遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーが分断されているカンジダ・トロピカリ
ス細胞。 - 【請求項５６】染色体POX4B遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがURA3A選択可能マーカーによって分断
されている請求項55記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項５７】染色体POX4B遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがURA3B選択可能マーカーによって分断
されている請求項55記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項５８】染色体POX4B遺伝子と染色体POX5遺伝子
の両方のコピーがHIS4選択可能マーカーによって分断さ
れている請求項55記載のカンジダ・トロピカリス細胞。 - 【請求項５９】染色体POX4AおよびPOX4B遺伝子と染色体
POX5遺伝子の両方のコピーが分断されているカンジダ・
トロピカリス細胞。 - 【請求項６０】染色体POX4AおよびPOX4B遺伝子および染
色体POX5遺伝子の両方のコピーがURA3A選択可能マーカ
ーによって分断されている請求項59記載のカンジダ・ト
ロピカリス細胞。 - 【請求項６１】染色体POX4AおよびPOX4B遺伝子および染
色体POX5遺伝子の両方のコピーがURA3B選択可能マーカ
ーによって分断されている請求項59記載のカンジダ・ト
ロピカリス細胞。 - 【請求項６２】染色体POX4AおよびPOX4B遺伝子と染色体
POX5遺伝子の両方のコピーがHIS4選択可能マーカーによ
って分断されている請求項59記載のカンジダ・トロピカ
リス細胞。 - 【請求項６３】染色体POX5遺伝子の一方と染色体POX4A
およびPOX4B遺伝子が分断されているカンジダ・トロピ
カリス細胞。 - 【請求項６４】染色体POX5遺伝子の一方と染色体POX4A
およびPOX4B遺伝子がURA3A選択可能マーカーによって分
断されている請求項63記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項６５】染色体POX5遺伝子の一方と染色体POX4A
およびPOX4B遺伝子がURA3B選択可能マーカーによって分
断されている請求項63記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。 - 【請求項６６】染色体POX5遺伝子の一方と染色体POX4A
およびPOX4B遺伝子がHIS4選択可能マーカーによって分
断されている請求項63記載のカンジダ・トロピカリス細
胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US432,091 | 1989-11-06 | ||
| US07/432,091 US5254466A (en) | 1989-11-06 | 1989-11-06 | Site-specific modification of the candida tropicals genome |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05501501A JPH05501501A (ja) | 1993-03-25 |
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3500500A Expired - Lifetime JP3023984B2 (ja) | 1989-11-06 | 1990-11-06 | カンジダ・トロピカリスゲノムの部位特異的一時変異方法 |
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|---|---|
| US (1) | US5254466A (ja) |
| EP (1) | EP0499622B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5962285A (en) * | 1995-09-08 | 1999-10-05 | Henkel Corporation | Process for making polycarboxylic acids |
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| US6143532A (en) * | 1996-08-28 | 2000-11-07 | Henkel Corporation | Process for recovering carboxylic acids from a fermentation broth |
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| EP1273663A3 (en) * | 1997-07-21 | 2004-02-04 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Transformed yeast strains and their use fore the production of monoterminal and diterminal aliphatic carboxylates |
| CA2293737A1 (en) * | 1997-07-21 | 1999-01-28 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Transformed yeast strains and their use for the production of monoterminal and diterminal aliphatic carboxylates |
| US6410302B1 (en) * | 1998-04-20 | 2002-06-25 | Forskarpatent I Syd Ab | Genetically engineered yeast and mutants thereof for the efficient fermentation of lignocellulose hydrolysates |
| US20030077795A1 (en) | 1999-03-10 | 2003-04-24 | Wilson C. Ron | Cytochrome P450 monooxygenase and NADPH Cytochrome P450 oxidoreductase genes and proteins related to the omega hydroxylase complex of candida tropicals and methods relating thereto |
| US6331420B1 (en) | 1998-05-01 | 2001-12-18 | C. Ron Wilson | Cytochrome P450 monooxygenase and NADPH cytochrome P450 oxidoreductase genes and proteins related to the omega hydroxylase complex of Candida tropicalis and methods relating thereto |
| US6004784A (en) * | 1998-09-14 | 1999-12-21 | General Electric Co. | Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids |
| US6066480A (en) * | 1998-09-21 | 2000-05-23 | General Electric Company | Method for high specific bioproductivity of α,ω-alkanedicarboxylic acids |
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