JP3443605B2 - 間性ヘテロ接合フィコマイセス - Google Patents
間性ヘテロ接合フィコマイセスInfo
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- phycomyces
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- strains
- carotene
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はカロチノイドの微生物生産に関する。詳しく
は、本発明は間性ヘテロ接合フィコマイセス（intersex
ual heterozygous Phycomyces）株によるβ−カロチン
の生産に関する。また、本発明はこれらの株による醗酵
後に得られた精製β−カロチンに関する。
は、本発明は間性ヘテロ接合フィコマイセス（intersex
ual heterozygous Phycomyces）株によるβ−カロチン
の生産に関する。また、本発明はこれらの株による醗酵
後に得られた精製β−カロチンに関する。
発明の背景
1950年後半および1960年前半に、ムコラレス（Mucora
les）株、特にブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea t
rispora）、コアネフォラ・ククルビタルム（Choanepho
ra cucurbitarum）及びフィコマイセス・ブラケスレア
ヌス（Phycomyces blakesleeanus）が、カロチノイドの
生産のための醗酵法を開発するために研究されていた。
これらの菌類の野生型の株はカロチノイド、特にβ−カ
ロチンを蓄積する。しかしながら、純粋培養物で得るこ
とができる量は商業上の生産には微々たるものである。
les）株、特にブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea t
rispora）、コアネフォラ・ククルビタルム（Choanepho
ra cucurbitarum）及びフィコマイセス・ブラケスレア
ヌス（Phycomyces blakesleeanus）が、カロチノイドの
生産のための醗酵法を開発するために研究されていた。
これらの菌類の野生型の株はカロチノイド、特にβ−カ
ロチンを蓄積する。しかしながら、純粋培養物で得るこ
とができる量は商業上の生産には微々たるものである。
β−カロチンは、プロビタミンＡを含み、そして報告
によれば抗癌活性を有する脂質可溶性の黄色の化学物質
である。食品、化粧品、薬品及び医薬工業における種々
の用途が報告されている。
によれば抗癌活性を有する脂質可溶性の黄色の化学物質
である。食品、化粧品、薬品及び医薬工業における種々
の用途が報告されている。
β−カロチン生産を増大する幾つかの方法は、反対の
交配型、（＋）または（−）の株の同時培養に基いてい
る。反対の交配型の菌糸間の相互作用は、トリスポリン
酸（trisporic acids）の生成をもたらし、そして増進
されたβ−カロチン蓄積をもたらす。バッチ型の醗酵法
における反対の交配型のブラケスレア・トリスポラ株の
同時培養がヘッセルチン（Hesseltine）及びアンダーソ
ン（Anderson）により開発された（米国特許第2,865,81
4号及び同第2,890,989号明細書）。パイロットプラント
規模まで、その方法はβ−カロチンを生成するのに有望
な方法のように見えた。β−イオネンが添加されて醗酵
槽中の２種の株のβ−カロチン生産を刺激した。何年か
後に、この方法は幾つかの工業会社により最適化され
た。多数のその他の添加剤がβ−カロチン蓄積を刺激す
るのに使用された。しかしながら、これらの開発は最早
続行されなかった。何となれば、これらの方法は工業規
模でβ−カロチンを製造する化学的方法とコスト−価格
レベルで競合し得ないことが明らかになったからであ
る。
交配型、（＋）または（−）の株の同時培養に基いてい
る。反対の交配型の菌糸間の相互作用は、トリスポリン
酸（trisporic acids）の生成をもたらし、そして増進
されたβ−カロチン蓄積をもたらす。バッチ型の醗酵法
における反対の交配型のブラケスレア・トリスポラ株の
同時培養がヘッセルチン（Hesseltine）及びアンダーソ
ン（Anderson）により開発された（米国特許第2,865,81
4号及び同第2,890,989号明細書）。パイロットプラント
規模まで、その方法はβ−カロチンを生成するのに有望
な方法のように見えた。β−イオネンが添加されて醗酵
槽中の２種の株のβ−カロチン生産を刺激した。何年か
後に、この方法は幾つかの工業会社により最適化され
た。多数のその他の添加剤がβ−カロチン蓄積を刺激す
るのに使用された。しかしながら、これらの開発は最早
続行されなかった。何となれば、これらの方法は工業規
模でβ−カロチンを製造する化学的方法とコスト−価格
レベルで競合し得ないことが明らかになったからであ
る。
現在、前者のUSSRのみにおいて、プラントがブラケス
レア・トリスポラからβ−カロチンを生産するのに使用
されている。農業上の廃棄物が、その醗酵の原料として
使用され、得られたβ−カロチンが飼料添加剤として使
用される。
レア・トリスポラからβ−カロチンを生産するのに使用
されている。農業上の廃棄物が、その醗酵の原料として
使用され、得られたβ−カロチンが飼料添加剤として使
用される。
その間に、学理的研究は好都合のモデル系として糸状
菌類フィコマイセス・ブラケスレアヌスを使用するβ−
カロチン生合成の生化学及び調節に集中した。フィコマ
イセスのβ−カロチンの合成は厳密な代謝調節を受け
る。調節遺伝子の突然変異が、この厳密な調節を克服し
得る。古典的突然変異実験が、刺激因子の不在下でさえ
も強く増大されたβ−カロチン生産性を有する株の発達
をもたらした。野生型フィコマイセス株は暗所でバイオ
マスの乾燥重量1g当たり約50μｇのβ−カロチンを含
む。調節単一突然変異体は乾燥重量1g当たり6mgまでの
β−カロチンを含むことがわかった。乾燥重量1g当たり
10mg以上のβ−カロチンを含む二重突然変異体が単離さ
れた。
菌類フィコマイセス・ブラケスレアヌスを使用するβ−
カロチン生合成の生化学及び調節に集中した。フィコマ
イセスのβ−カロチンの合成は厳密な代謝調節を受け
る。調節遺伝子の突然変異が、この厳密な調節を克服し
得る。古典的突然変異実験が、刺激因子の不在下でさえ
も強く増大されたβ−カロチン生産性を有する株の発達
をもたらした。野生型フィコマイセス株は暗所でバイオ
マスの乾燥重量1g当たり約50μｇのβ−カロチンを含
む。調節単一突然変異体は乾燥重量1g当たり6mgまでの
β−カロチンを含むことがわかった。乾燥重量1g当たり
10mg以上のβ−カロチンを含む二重突然変異体が単離さ
れた。
フィコマイセス・ブラケスレアヌスは横細胞壁（隔
壁）を含まない菌糸を有する糸状菌類であり、こうして
全菌糸体は数百万の核を含む単一の集合細胞または多核
体と考えることができる。その他の菌類とは異なり、菌
糸は決して一緒に融合しない。それ故、融合は、プロト
プラスト融合法もしくはマイクロサージェリーの如き人
工的な方法を使用することにより、または性周期の構造
体の移植により達成し得るにすぎない（オオタキ（T.Oo
taki）著、Phycomyces、セルダ−オルメド（E.Cerda−O
lmedo）及びリプソン（ED Lipson）編集、（1987）,CSH
Laboratory Press,345−349;スアレツ（T.Suarez）ら
著、同文献351−353）。菌類の再生は接合胞子及び生殖
胞子を伴う性周期により、または栄養生殖により起こり
得る（Phycomyces、セルダ−オルメド及びリプソン編
集、（1987）,CSH Laboratory Press,2）。
壁）を含まない菌糸を有する糸状菌類であり、こうして
全菌糸体は数百万の核を含む単一の集合細胞または多核
体と考えることができる。その他の菌類とは異なり、菌
糸は決して一緒に融合しない。それ故、融合は、プロト
プラスト融合法もしくはマイクロサージェリーの如き人
工的な方法を使用することにより、または性周期の構造
体の移植により達成し得るにすぎない（オオタキ（T.Oo
taki）著、Phycomyces、セルダ−オルメド（E.Cerda−O
lmedo）及びリプソン（ED Lipson）編集、（1987）,CSH
Laboratory Press,345−349;スアレツ（T.Suarez）ら
著、同文献351−353）。菌類の再生は接合胞子及び生殖
胞子を伴う性周期により、または栄養生殖により起こり
得る（Phycomyces、セルダ−オルメド及びリプソン編
集、（1987）,CSH Laboratory Press,2）。
反対の交配型の２種の株の交配法の減数分裂生産物で
ある生殖胞子及び得られる菌糸体は通常同核共存性（ho
mokaryotic）であり、即ち、全てのそれらの核は遺伝的
に同一であるが、少数の異核共存性（heterokaryotic）
の生殖胞子が正常な交配中でさえも自然に形成される。
その結果、生殖胞子の幾つかが（＋）核及び（−）核の
混合物を含む間性異核共存体を生じる。
ある生殖胞子及び得られる菌糸体は通常同核共存性（ho
mokaryotic）であり、即ち、全てのそれらの核は遺伝的
に同一であるが、少数の異核共存性（heterokaryotic）
の生殖胞子が正常な交配中でさえも自然に形成される。
その結果、生殖胞子の幾つかが（＋）核及び（−）核の
混合物を含む間性異核共存体を生じる。
このような異核共存体は正常な菌糸体とは形態学的に
異なる。菌糸体はβ−カロチンの増大された蓄積により
明色を示し、そして所謂シュードフォア（pseudphore）
である特徴的な構造が形成される。
異なる。菌糸体はβ−カロチンの増大された蓄積により
明色を示し、そして所謂シュードフォア（pseudphore）
である特徴的な構造が形成される。
間性異核共存体の維持及び増殖は困難である。何とな
れば、その核は分裂して一つの交配型のみの核を有する
菌糸体のセクターをもたらすという明らかな傾向を示す
からである。両方の核が核の分裂を最小にするために劣
性致死突然変異を含む間性の異核共存性株の構成は、ム
リロ・アラウジョ（F.J.Murillo Araujo）ら（米国特許
第4,318,987号）が過剰生産性の（superproducing）株
をつくるのに成功した戦略であった。脱調節変異体（de
regulated mutant）の間性異核共存体として記載し得る
これらの株は、乾燥重量1g当たり25mgまでのβ−カロチ
ンを生産することがわかった。
れば、その核は分裂して一つの交配型のみの核を有する
菌糸体のセクターをもたらすという明らかな傾向を示す
からである。両方の核が核の分裂を最小にするために劣
性致死突然変異を含む間性の異核共存性株の構成は、ム
リロ・アラウジョ（F.J.Murillo Araujo）ら（米国特許
第4,318,987号）が過剰生産性の（superproducing）株
をつくるのに成功した戦略であった。脱調節変異体（de
regulated mutant）の間性異核共存体として記載し得る
これらの株は、乾燥重量1g当たり25mgまでのβ−カロチ
ンを生産することがわかった。
しかしながら、これらの劣性致死突然変異により、核
の比を或る程度調節したとしても、間性の異核共存性株
はβ−カロチン生産に最適ではない。これらの間性の異
核共存性株は野生型の株よりも成長が極めて悪く、更に
それらはめったに胞子を形成しないか、または決して胞
子を形成しない。
の比を或る程度調節したとしても、間性の異核共存性株
はβ−カロチン生産に最適ではない。これらの間性の異
核共存性株は野生型の株よりも成長が極めて悪く、更に
それらはめったに胞子を形成しないか、または決して胞
子を形成しない。
発明の要約
本発明は間性ヘテロ接合フィコマイセス株を開示す
る。
る。
また、本発明は、間性ヘテロ接合フィコマイセス株が
増大された安定性を示し、それらが従来利用可能な間性
異核共存体よりも良好に成長し、またそれらがその他の
利用可能な安定な株と比較して増大されたβ−カロチン
生産性を示すことを開示する。
増大された安定性を示し、それらが従来利用可能な間性
異核共存体よりも良好に成長し、またそれらがその他の
利用可能な安定な株と比較して増大されたβ−カロチン
生産性を示すことを開示する。
更に、本発明は性的異質接合性のムコラレス、特にフ
ィコマイセス、更に特別にはフィコマイセス・ブラケス
レアヌスを得る方法を提供する。
ィコマイセス、更に特別にはフィコマイセス・ブラケス
レアヌスを得る方法を提供する。
また、本発明は選択マーカーを使用しないフィコマイ
セスの形質転換方法を提供する。
セスの形質転換方法を提供する。
更に、本発明は間性ヘテロ接合フィコマイセス・ブラ
ケスレアヌス株の使用を含むβ−カロチンの生産方法を
提供する。この方法は必要により本発明のフィコマイセ
スの深部培養の使用を含む。
ケスレアヌス株の使用を含むβ−カロチンの生産方法を
提供する。この方法は必要により本発明のフィコマイセ
スの深部培養の使用を含む。
また、本発明はヘテロ接合株の生育後にβ−カロチン
を精製することにより得られたβ−カロチンを提供す
る。
を精製することにより得られたβ−カロチンを提供す
る。
発明の詳細な説明
本発明は、間性ヘテロ接合性のムコラレス株、特にフ
ィコマイセス株、更に特別にはフィコマイセス・ブラケ
スレアヌス株を開示する。
ィコマイセス株、更に特別にはフィコマイセス・ブラケ
スレアヌス株を開示する。
本発明の状況において、間性ヘテロ接合体という表示
は、完全に二倍体のゲノムを有する株から交配型遺伝子
のみに関して二倍体である株までの範囲のフィコマイセ
ス株の全スペクトルに関して使用される。全ての株が両
方の親の交配型遺伝子を少なくとも含むという事実のた
めに、それらは間性ヘテロ接合体と称されてもよい。
は、完全に二倍体のゲノムを有する株から交配型遺伝子
のみに関して二倍体である株までの範囲のフィコマイセ
ス株の全スペクトルに関して使用される。全ての株が両
方の親の交配型遺伝子を少なくとも含むという事実のた
めに、それらは間性ヘテロ接合体と称されてもよい。
本発明の間性ヘテロ接合フィコマイセス株は、平衡致
死間性異核共存体よりも良好な生育性能及び胞子形成を
示す。また、これらの株は、野生型の株や、同じ脱調節
突然変異を有するが間性ではない株よりも高いβ−カロ
チン生産を有する。
死間性異核共存体よりも良好な生育性能及び胞子形成を
示す。また、これらの株は、野生型の株や、同じ脱調節
突然変異を有するが間性ではない株よりも高いβ−カロ
チン生産を有する。
現在まで、二倍体フィコマイセス株はフィコマイセス
に関する文献に記載されていなかった。異核共存体で核
融合により二倍体を得ようとする試みは今まで失敗して
いた。フィコマイセスの或る種の株に見られる大きな株
はロビナウ（C.F.Robinow,Can.J.Microbiol.３（195
7）,791−798）により二倍体であると推測された。セル
ダ−オルメド及びリプソン（Phycomyces（1987）（Cold
Spring Harbor Laboratory Press））はフィコマイセ
スに関する現在の知識の広範囲にわたるほぼ完全な総覧
を呈示している。
に関する文献に記載されていなかった。異核共存体で核
融合により二倍体を得ようとする試みは今まで失敗して
いた。フィコマイセスの或る種の株に見られる大きな株
はロビナウ（C.F.Robinow,Can.J.Microbiol.３（195
7）,791−798）により二倍体であると推測された。セル
ダ−オルメド及びリプソン（Phycomyces（1987）（Cold
Spring Harbor Laboratory Press））はフィコマイセ
スに関する現在の知識の広範囲にわたるほぼ完全な総覧
を呈示している。
本発明は間性ヘテロ接合フィコマイセス株の構成及び
これらの株によるβ−カロチンの生産を記載する。
これらの株によるβ−カロチンの生産を記載する。
間性ヘテロ接合体は幾つかの方法によりつくることが
できる。それらのうちの二つがここに概説される。一つ
の方法は、反対の交配型の株から得られた完全な核を融
合して完全二倍体核を形成することである。減数分裂中
の染色体Ｉの非分離または二倍体の有糸分裂増殖中のそ
の他の染色体のランダムな損失は部分二倍体を生じ、こ
れらの全てが本発明の範囲内にある。その他の方法は、
その他の交配型を有する株の核への一つの交配型遺伝子
座のコピーの導入である。
できる。それらのうちの二つがここに概説される。一つ
の方法は、反対の交配型の株から得られた完全な核を融
合して完全二倍体核を形成することである。減数分裂中
の染色体Ｉの非分離または二倍体の有糸分裂増殖中のそ
の他の染色体のランダムな損失は部分二倍体を生じ、こ
れらの全てが本発明の範囲内にある。その他の方法は、
その他の交配型を有する株の核への一つの交配型遺伝子
座のコピーの導入である。
下記の方法が間性ヘテロ接合株を得るのに使用し得
る。
る。
ａ）低度数の二倍体を生じる選択株の交配、または
ｂ）その他の交配型からの遺伝子による一つの交配型の
胞子嚢の形質転換。この場合、交配型遺伝子が形質転換
されることが好ましい。
胞子嚢の形質転換。この場合、交配型遺伝子が形質転換
されることが好ましい。
本発明の間性ヘテロ接合フィコマイセス・ブラケスレ
アヌス株は両方の方法で得られた。
アヌス株は両方の方法で得られた。
フィコマイセスの形質転換法は下記の文献に記載され
ている（T.Suarez,Ph.D.Thesis（1985）,University of
Salamanca,Spain;J.L.Revuelta及びM.Jayaram,Proc.Na
t.Acad.Sci.U.S.A.83（1986）,7344−7347;T.Suarez及
びA.P.Eslava,Mol.Gen.Genet.212（1988）,120−123;J.
Arnauら,Mol.Gen.Genet.212（1988）,375−377）。プロ
トプラスト形質転換は所望のDNAを含むプラスミドを受
容株に導入するのに使用される。これらの著者により得
られた低い形質転換度数は、交配型の特別なコピーを含
む形質転換体が現れることを起こりそうにしない。
ている（T.Suarez,Ph.D.Thesis（1985）,University of
Salamanca,Spain;J.L.Revuelta及びM.Jayaram,Proc.Na
t.Acad.Sci.U.S.A.83（1986）,7344−7347;T.Suarez及
びA.P.Eslava,Mol.Gen.Genet.212（1988）,120−123;J.
Arnauら,Mol.Gen.Genet.212（1988）,375−377）。プロ
トプラスト形質転換は所望のDNAを含むプラスミドを受
容株に導入するのに使用される。これらの著者により得
られた低い形質転換度数は、交配型の特別なコピーを含
む形質転換体が現れることを起こりそうにしない。
オオタキら（Japan J.Genet.66（1991）,189−196）
は、形質転換効率がかなり増大される方法を記載されて
いる。マイクロインジェクションが使用されて、形質転
換効率を10％まで上昇する。それにもかかわらず、G418
が選択マーカーとして使用される。
は、形質転換効率がかなり増大される方法を記載されて
いる。マイクロインジェクションが使用されて、形質転
換効率を10％まで上昇する。それにもかかわらず、G418
が選択マーカーとして使用される。
本発明は、マイクロインジェクションを使用し、選択
マーカーを使用しないで操作する新規な形質転換方法を
記載する。その方法は間性ヘテロ接合フィコマイセスを
生じる。その方法は、下記の工程； −（＋）交配型または（−）交配型を有するフィコマイ
セス株のDNAを単離する工程、 −このDNAを選択マーカーを必要としない適当なベクタ
ー中でクローン化する工程、 −得られたベクターをマイクロインジェクションにより
反対の交配型のフィコマイセス株に導入する工程、 −間性ヘテロ接合株をスクリーニングする工程 を含む。
マーカーを使用しないで操作する新規な形質転換方法を
記載する。その方法は間性ヘテロ接合フィコマイセスを
生じる。その方法は、下記の工程； −（＋）交配型または（−）交配型を有するフィコマイ
セス株のDNAを単離する工程、 −このDNAを選択マーカーを必要としない適当なベクタ
ー中でクローン化する工程、 −得られたベクターをマイクロインジェクションにより
反対の交配型のフィコマイセス株に導入する工程、 −間性ヘテロ接合株をスクリーニングする工程 を含む。
形質転換体を得る別の可能性は、交配型のいずれか一
つのクローン化されていないDNAの使用である。これ
は、異種DNAが導入されないという利点を有する。
つのクローン化されていないDNAの使用である。これ
は、異種DNAが導入されないという利点を有する。
交配型遺伝子座に関してヘテロ接合である株を得るた
めに、（＋）交配型または（−）交配型を有する株が受
容株として使用し得る。低いβ−カロチン生産性の株が
出発株として使用でき、また既に多量のβ−カロチンを
生産する受容株が使用し得る。
めに、（＋）交配型または（−）交配型を有する株が受
容株として使用し得る。低いβ−カロチン生産性の株が
出発株として使用でき、また既に多量のβ−カロチンを
生産する受容株が使用し得る。
好適な（＋）受容株の例は、野生型の株、例えばNRRL
1554、car F変異体、例えば、S563、または好ましくはc
ar S突然変異及びcar F突然変異の両方を有する変異
体、例えば、S566である。供与体DNAとして、反対の交
配型（−）の株、例えば、野生型NRRL1555、car F S561
またはS562、car S car F S568またはS569のDNAが使用
し得る。
1554、car F変異体、例えば、S563、または好ましくはc
ar S突然変異及びcar F突然変異の両方を有する変異
体、例えば、S566である。供与体DNAとして、反対の交
配型（−）の株、例えば、野生型NRRL1555、car F S561
またはS562、car S car F S568またはS569のDNAが使用
し得る。
特に高生産性株が受容体として使用される場合、過剰
生産性形質転換体を目視検査により選択することは困難
であることがある。その場合には、ジフェニルアミン等
の如きβ−カロチン生合成の特定の阻害物質が、着色の
レベルを抑制して過剰生産性形質転換体の選択を可能に
するのに使用し得る。また、colA-バックグラウンド中
の交配型連鎖マーカーcolAの同時形質転換につき選択す
ることにより所望の形質転換体の検出を容易にすること
が可能である。colA+フェノタイプを獲得した形質転換
体は、colA株（これらは制限コロニー形態を有する）中
で活発な外殖として現れる。
生産性形質転換体を目視検査により選択することは困難
であることがある。その場合には、ジフェニルアミン等
の如きβ−カロチン生合成の特定の阻害物質が、着色の
レベルを抑制して過剰生産性形質転換体の選択を可能に
するのに使用し得る。また、colA-バックグラウンド中
の交配型連鎖マーカーcolAの同時形質転換につき選択す
ることにより所望の形質転換体の検出を容易にすること
が可能である。colA+フェノタイプを獲得した形質転換
体は、colA株（これらは制限コロニー形態を有する）中
で活発な外殖として現れる。
間性ヘテロ接合体のスクリーニングは、目視検査によ
り、または間性形態学に基づいて行い得る。更に、間性
ヘテロ接合株は、テスター（＋）株及び（−）株に対す
る性反応の不在により性質を調べることができる。シュ
ードフォアは間性ヘテロ接合株の別の性質を調べる特徴
を形成する。
り、または間性形態学に基づいて行い得る。更に、間性
ヘテロ接合株は、テスター（＋）株及び（−）株に対す
る性反応の不在により性質を調べることができる。シュ
ードフォアは間性ヘテロ接合株の別の性質を調べる特徴
を形成する。
得られた間性ヘテロ接合フィコマイセス株は、プレー
ト上の６日の生育後に乾燥重量1g当たり10mgより多いβ
−カロチンを含む。β−カロチンの量は乾燥重量1g当た
り20mgより多いことが好ましく、その量は乾燥重量1g当
たり25mgより多いことが更に好ましい。生育条件は、22
℃で最少固形培地を含む暗所のプレートである。
ト上の６日の生育後に乾燥重量1g当たり10mgより多いβ
−カロチンを含む。β−カロチンの量は乾燥重量1g当た
り20mgより多いことが好ましく、その量は乾燥重量1g当
たり25mgより多いことが更に好ましい。生育条件は、22
℃で最少固形培地を含む暗所のプレートである。
生産性の更なる増加が、β−カロチン合成の活性化因
子、例えばビタミンＡ、β−イオネンまたは当業界で知
られている同様の化合物の添加により得られると予想さ
れる。
子、例えばビタミンＡ、β−イオネンまたは当業界で知
られている同様の化合物の添加により得られると予想さ
れる。
実験
間性ヘテロ接合フィコマイセス株の培養及びβ−カロ
チン生産に使用される最少グルコース−アスパラギン寒
天培地を、以下のようにして調製した。
チン生産に使用される最少グルコース−アスパラギン寒
天培地を、以下のようにして調製した。
グルコース−アスパラギン寒天培地
溶液A:L−アスパラギン2.0g、KH2PO45.0g、濃縮液20m
l、蒸留水480ml。
l、蒸留水480ml。
溶液B:グルコース20g、寒天20g、蒸留水500ml（固形培
地）。
地）。
別々にオートクレーブ処理し、混合する。
濃縮液（50x）
蒸留水800mlに、以下の順序で夫々の薬品を添加し、
次の薬品の添加の前に良く溶解する。MgSO4・7H2O 25
g、チアミン・HCl 100mg、微量元素原液5ml、カルシウ
ム原液10ml。容積を蒸留水で１リットルにし、クロロホ
ルム２〜3mlを添加し、室温で貯蔵する。
次の薬品の添加の前に良く溶解する。MgSO4・7H2O 25
g、チアミン・HCl 100mg、微量元素原液5ml、カルシウ
ム原液10ml。容積を蒸留水で１リットルにし、クロロホ
ルム２〜3mlを添加し、室温で貯蔵する。
微量元素原液
蒸留水100mlに、以下の順序で夫々の薬品を添加し、
次の薬品の添加の前に良く溶解する。クエン酸2g、Fe
（NO3）３・9H2O 1.5g、ZnSO4・7H2O 1g、MnSO4・H2O
0.3g、CuSO4・5H2O 0.05g、Na2MoO4・2H2O 0.05g。クロ
ロホルム１〜2mlを添加し、室温で貯蔵する。
次の薬品の添加の前に良く溶解する。クエン酸2g、Fe
（NO3）３・9H2O 1.5g、ZnSO4・7H2O 1g、MnSO4・H2O
0.3g、CuSO4・5H2O 0.05g、Na2MoO4・2H2O 0.05g。クロ
ロホルム１〜2mlを添加し、室温で貯蔵する。
カルシウム原液
CaCl2・2H2O 28g、蒸留水172ml。クロロホルム１〜2m
lを添加し、室温で貯蔵する。
lを添加し、室温で貯蔵する。
培養
プラスチックペトリ皿（直径8.5cm）を上記の生育兼
生産培地25mlで満たした。接種を約１〜25mm2の栄養菌
糸マットの片または約10.000の熱活性化された胞子で行
った。
生産培地25mlで満たした。接種を約１〜25mm2の栄養菌
糸マットの片または約10.000の熱活性化された胞子で行
った。
胞子を、蒸留水中の胞子の懸濁液の温度を10分間で48
℃まで上昇させることにより熱活性化する。接種後に、
プレートを暗所で22℃で５〜８日インキュベートした。
℃まで上昇させることにより熱活性化する。接種後に、
プレートを暗所で22℃で５〜８日インキュベートした。
菌糸の回収
菌糸を、以下のようにして回収し、それからβ−カロ
チンを抽出する。
チンを抽出する。
プレート中の寒天−菌糸ケーキをさかさまにしてアル
ミニウム箔の上に取り出し、寒天をプレート・リドまた
はスパチュラで掻き落とし、菌糸を濾紙で軽く押しつけ
る。これを通常の室内灯の下で行うが、菌糸をできるだ
けアルミニウム箔中に包んで保ち、抽出を小さい部屋中
で柔らかい光の下で行う。
ミニウム箔の上に取り出し、寒天をプレート・リドまた
はスパチュラで掻き落とし、菌糸を濾紙で軽く押しつけ
る。これを通常の室内灯の下で行うが、菌糸をできるだ
けアルミニウム箔中に包んで保ち、抽出を小さい部屋中
で柔らかい光の下で行う。
β−カロチン抽出
菌糸を−20℃で１〜２時間凍結し、16〜20時間凍結乾
燥する。次いで乾燥重量を測定し、菌糸が微粉末になる
までそれをきれいな乳鉢中で乳棒で海砂で均質にする。
粉末が無色になるまで、β−カロチンを石油エーテル
（40〜60℃）で反復抽出により回収する。抽出物を氷バ
ケツ中に保たれたガラス管中に回収し、低速で遠心分離
する。透明なβ−カロチン抽出物をビュッチ（Buchi）R
E−111回転蒸発器中で45℃で蒸発させ、ｎ−ヘキサン10
mlに再度溶解する。必要により希釈液をつくり、250〜5
50nmの吸収スペクトルを記録する。β−カロチン含量
を、Ｅ（1cm、１％）＝2500（450nmの波長における）と
仮定してピーク吸光係数から計算する。
燥する。次いで乾燥重量を測定し、菌糸が微粉末になる
までそれをきれいな乳鉢中で乳棒で海砂で均質にする。
粉末が無色になるまで、β−カロチンを石油エーテル
（40〜60℃）で反復抽出により回収する。抽出物を氷バ
ケツ中に保たれたガラス管中に回収し、低速で遠心分離
する。透明なβ−カロチン抽出物をビュッチ（Buchi）R
E−111回転蒸発器中で45℃で蒸発させ、ｎ−ヘキサン10
mlに再度溶解する。必要により希釈液をつくり、250〜5
50nmの吸収スペクトルを記録する。β−カロチン含量
を、Ｅ（1cm、１％）＝2500（450nmの波長における）と
仮定してピーク吸光係数から計算する。
株
下記の株をバーン（オランダ）にあるセントラル・ビ
ューロウ・ボール・デ・シメルカルチャーズ（the Cent
raal Bureau voor de Schimmelcultures）に寄託した。
ューロウ・ボール・デ・シメルカルチャーズ（the Cent
raal Bureau voor de Schimmelcultures）に寄託した。
下記の受託番号で1992年４月28日にフィコマイセス・ブ
ラケスレアヌスS563,S571−S573,S596−S600: S563,CBS 225.92;S571,CBS 226.92;S572,CBS 227.92; S573,CBS 228.92;S596,CBS 229.92;S597,CBS 230.92; S598,CBS 231.92;S599,CBS 232.92;S600,CBS 233.92。
ラケスレアヌスS563,S571−S573,S596−S600: S563,CBS 225.92;S571,CBS 226.92;S572,CBS 227.92; S573,CBS 228.92;S596,CBS 229.92;S597,CBS 230.92; S598,CBS 231.92;S599,CBS 232.92;S600,CBS 233.92。
実施例
実施例１
間性ヘテロ接合フィコマイセス株の構成
car F突然変異及び（＋）交配型を有するフィコマイ
セス・ブラケスレアヌスである濃い黄色のβ−カロチン
過剰生産株S563を当業界で知られている方法（セルダ−
オルメド及びリプソン編集,Phycomyces,361ff.Cold Spr
ing Harbor Laboratory 1987）に従ってcar A突然変異
を有する白色の（−）株C2と交配した。交配の子孫の中
で、菌糸がシュードフォアを形成する交配型を欠いてお
り、構成性の性相互作用を示す一様に濃いオレンジ色の
コロニーを単離できた。濃いオレンジ色のコロニーを胞
子形成させ、グルコース−アスパラギン寒天に塗布して
それらの核安定性を調べた。これらの株は間性ヘテロ接
合体（S571−S 573及びS596−S598）であった。
セス・ブラケスレアヌスである濃い黄色のβ−カロチン
過剰生産株S563を当業界で知られている方法（セルダ−
オルメド及びリプソン編集,Phycomyces,361ff.Cold Spr
ing Harbor Laboratory 1987）に従ってcar A突然変異
を有する白色の（−）株C2と交配した。交配の子孫の中
で、菌糸がシュードフォアを形成する交配型を欠いてお
り、構成性の性相互作用を示す一様に濃いオレンジ色の
コロニーを単離できた。濃いオレンジ色のコロニーを胞
子形成させ、グルコース−アスパラギン寒天に塗布して
それらの核安定性を調べた。これらの株は間性ヘテロ接
合体（S571−S 573及びS596−S598）であった。
これらの間性ヘテロ接合体は正常に成長し、しかもそ
れらが色パッチで分離を示さない点で安定であることが
明らかである。それらは正常な野生型よりも少ない胞子
を生産し、全ての状況の正常な特徴は性的刺激を伴う。
それらは過剰生産性の間性異核共存体（ムリロ・アラウ
ジョら,Appl.Environ.Microbiol.36（1978）,639−642;
ムリロ・アラウジョら（1982）の米国特許第4,318,987
号明細書）よりも生育及び胞子形成の点ではるかに良好
である。
れらが色パッチで分離を示さない点で安定であることが
明らかである。それらは正常な野生型よりも少ない胞子
を生産し、全ての状況の正常な特徴は性的刺激を伴う。
それらは過剰生産性の間性異核共存体（ムリロ・アラウ
ジョら,Appl.Environ.Microbiol.36（1978）,639−642;
ムリロ・アラウジョら（1982）の米国特許第4,318,987
号明細書）よりも生育及び胞子形成の点ではるかに良好
である。
性相互作用の良好な指標は、ムコラレスの性ホルモン
であるトリスポリン酸の生産である。1ml当たり１〜1.4
μｇの濃度のトリスポリン酸が、窒素源としてアスパラ
ギン及びグルタミン酸一ナトリウム（夫々0.2g/l及び2.
0g/l）を含む最少培地（性相互作用のための培地（スッ
ター（R.P.Sutter）著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72（19
75）,127−130）中で８日間生育した３種の間性異核共
存体の培地中で見られた。これらの値は、培養液中の菌
糸の乾燥重量1g当たり200〜300μｇのトリスポリン酸に
相当する。トリスポリン酸を化学的に抽出し、分光光度
計により分析した（スッター著,Science168（1970）,15
90−1592）。
であるトリスポリン酸の生産である。1ml当たり１〜1.4
μｇの濃度のトリスポリン酸が、窒素源としてアスパラ
ギン及びグルタミン酸一ナトリウム（夫々0.2g/l及び2.
0g/l）を含む最少培地（性相互作用のための培地（スッ
ター（R.P.Sutter）著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72（19
75）,127−130）中で８日間生育した３種の間性異核共
存体の培地中で見られた。これらの値は、培養液中の菌
糸の乾燥重量1g当たり200〜300μｇのトリスポリン酸に
相当する。トリスポリン酸を化学的に抽出し、分光光度
計により分析した（スッター著,Science168（1970）,15
90−1592）。
一様に濃いオレンジ色の菌糸を形成する胞子を生産す
る良く成長しているコロニーを生産目的で選択した。
る良く成長しているコロニーを生産目的で選択した。
表１は種々の対照と比較した新規な間性ヘテロ接合体
のβ−カロチン生産を示す。
のβ−カロチン生産を示す。
実施例２
間性ヘテロ接合フィコマイセス株の構成
別法で、交配型遺伝子を反対の交配型を有する受容株
に形質転換することにより両方の交配型を単一の核中で
合体させた。この目的のために、受容株の20の若い胞子
嚢にオオタキら（Japanese J.of Genetics 66，（199
1）,189−195）により記載された方法に従って供与株の
λ遺伝子バンクからのDNA 300〜400ngを注入した。受容
株として、（＋）交配型を有するβ−カロチン生産株を
使用した。ここで本発明者らは受容株としてβ−カロチ
ン生産株NRRL1554を使用した。供与DNAとして、反対の
交配型を有する株NRRL1555のDNAを含むλ遺伝子バンク
から単離したDNAを使用した。λバンクをつくるため
に、NRRL1555 DNAをSau3Aで部分消化し、12〜20kbの範
囲のDNA断片を当業界で知られている方法に従ってファ
ージλ2761（アバロス（Avalos,J.）、コロチャノ（L.
M.Corrochano）及びブレナー（S.Brenner）著、FEBS Le
tt.286（1991）,176−180）のBamH1部位でクローン化し
た。
に形質転換することにより両方の交配型を単一の核中で
合体させた。この目的のために、受容株の20の若い胞子
嚢にオオタキら（Japanese J.of Genetics 66，（199
1）,189−195）により記載された方法に従って供与株の
λ遺伝子バンクからのDNA 300〜400ngを注入した。受容
株として、（＋）交配型を有するβ−カロチン生産株を
使用した。ここで本発明者らは受容株としてβ−カロチ
ン生産株NRRL1554を使用した。供与DNAとして、反対の
交配型を有する株NRRL1555のDNAを含むλ遺伝子バンク
から単離したDNAを使用した。λバンクをつくるため
に、NRRL1555 DNAをSau3Aで部分消化し、12〜20kbの範
囲のDNA断片を当業界で知られている方法に従ってファ
ージλ2761（アバロス（Avalos,J.）、コロチャノ（L.
M.Corrochano）及びブレナー（S.Brenner）著、FEBS Le
tt.286（1991）,176−180）のBamH1部位でクローン化し
た。
形質転換度数は10％程度であったので、両方の交配型
遺伝子座を有するコロニーをそれらの変わった形態によ
り直接スクリーニングでき、しかも選択マーカーを必要
としないでβ−カロチン含量を増加できた。
遺伝子座を有するコロニーをそれらの変わった形態によ
り直接スクリーニングでき、しかも選択マーカーを必要
としないでβ−カロチン含量を増加できた。
１％までの得られるコロニーの多くは、バックグラウ
ンド株に比較して更に濃い色を示した。このようなコロ
ニーの幾つかを精製し、それらの親と比較して10倍まで
多いβ−カロチンを含むことが示された。これらの変異
体は安定であり、かつ正常に胞子を形成する。
ンド株に比較して更に濃い色を示した。このようなコロ
ニーの幾つかを精製し、それらの親と比較して10倍まで
多いβ−カロチンを含むことが示された。これらの変異
体は安定であり、かつ正常に胞子を形成する。
表２は、幾つかの選択されたフィコマイセス株のβ−
カロチン生産レベルを示す。
カロチン生産レベルを示す。
実施例３
浸漬条件下の選択されたフィコマイセス株の生育
株S571及びS572を以下のようにしてシェークラフスコ
培養液で生育した。醗酵培地を、寒天を溶液Ｂから排除
した以外は実験の部に記載したようにして調製した。50
0mlのエーレンマイヤーシェークフラスコに培地25mlま
たは100mlを満たし、当業界で知られている方法に従っ
て滅菌し、続いて培地1ml当たり0.5x105個の胞子の濃度
まで熱活性化された胞子で接種するか、または完全生育
寒天プレートから得られた10〜25mm2の菌糸マットの片
で接種した。
培養液で生育した。醗酵培地を、寒天を溶液Ｂから排除
した以外は実験の部に記載したようにして調製した。50
0mlのエーレンマイヤーシェークフラスコに培地25mlま
たは100mlを満たし、当業界で知られている方法に従っ
て滅菌し、続いて培地1ml当たり0.5x105個の胞子の濃度
まで熱活性化された胞子で接種するか、または完全生育
寒天プレートから得られた10〜25mm2の菌糸マットの片
で接種した。
生育及びβ−カロチンの生産は暗所で22℃で起こっ
た。
た。
100mlの培養液を回転シェーカー（250rpm）中で３日
間培養し（Ａ）、時々このインキュベーションの後に４
日間の攪拌しない期間が続いた（Ｂ）。
間培養し（Ａ）、時々このインキュベーションの後に４
日間の攪拌しない期間が続いた（Ｂ）。
培養液25mlを攪拌しないで12〜16日間インキュベート
した（Ｃ）。
した（Ｃ）。
得られた結果を表３に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 23/00
Ｃ１２Ｒ 1:645）
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２２６．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２２７．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２２８．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２２９．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２３０．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２３１．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２３２．９２
微生物の受託番号 ＣＢＳ ２３３．９２
(72)発明者 ファン デイク ペトルス ウィルヘル
ムス マリア
オランダ エヌエル−3523 イックスエ
ー ユトレヒト ユリアナウェッヒ
407
(72)発明者 クークマン ベルテュス ピーテル
オランダ エルエル−2636 ベーヘー
シップライデン プルーヌスストラート
８
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/15
C12N 15/09
C12P 23/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】間性ヘテロ接合体であることを特徴とする
フィコマイセス株。 - 【請求項２】最小固形培地を含むプレートで６〜８日間
生育された場合に乾燥重量1g当たり10mgより多い量のβ
−カロチンを生産することを特徴とする請求の範囲第１
項に記載のフィコマイセス株。 - 【請求項３】フィコマイセス・ブラケスレアヌス株であ
ることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記
載のフィコマイセス株。 - 【請求項４】下記の工程； −（＋）交配型または（−）交配型を有するフィコマイ
セス株のDNAを単離する工程、 −このDNAを選択マーカーを必要としない適当なベクタ
ー中でクローン化する工程、 −得られたベクターをマイクロインジェクションにより
反対の交配型のフィコマイセス株に導入する工程、 を特徴とする、間性ヘテロ接合体であるフィコマイセス
形質転換体の製造方法。 - 【請求項５】（＋）交配型または（−）交配型を有する
フィコマイセス株のDNAを単離し、 このDNAを選択マーカーを必要としない適当なベクター
中でクローン化し、 得られたベクターをマイクロインジェクションにより反
対の交配型のフィコマイセス株に導入し、 間性ヘテロ接合株をスクリーニングすることを特徴とす
る間性ヘテロ接合フィコマイセスの生産方法。 - 【請求項６】間性ヘテロ接合株をスクリーニングするこ
とを特徴とするβ−カロチンの生産方法。 - 【請求項７】間性ヘテロ接合フィコマイセスを深部培養
で生育し、β−カロチンを菌糸から抽出することを特徴
とする請求の範囲第６項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT92200958.4 | 1992-04-03 | ||
| EP92200958 | 1992-04-03 | ||
| AT92201313.1 | 1992-05-08 | ||
| EP92201313 | 1992-05-08 | ||
| PCT/EP1993/000850 WO1993020198A1 (en) | 1992-04-03 | 1993-04-05 | INTERSEXUAL HETEROZYGOUS $i(PHYCOMYCES) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06507789A JPH06507789A (ja) | 1994-09-08 |
| JP3443605B2 true JP3443605B2 (ja) | 2003-09-08 |
Family
ID=26131324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50879793A Expired - Lifetime JP3443605B2 (ja) | 1992-04-03 | 1993-04-05 | 間性ヘテロ接合フィコマイセス |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5643719A (ja) |
| JP (1) | JP3443605B2 (ja) |
| CN (1) | CN1079001A (ja) |
| AT (1) | ATE193552T1 (ja) |
| AU (1) | AU659004B2 (ja) |
| CA (1) | CA2110516C (ja) |
| DE (1) | DE69328757T2 (ja) |
| NZ (1) | NZ251701A (ja) |
| WO (1) | WO1993020198A1 (ja) |
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| NO972556D0 (no) * | 1997-06-05 | 1997-06-05 | Forskningsparken I Aas As | Metode for merking av væsker og objekter |
| CN1060217C (zh) * | 1997-12-31 | 2001-01-03 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 三孢布拉氏霉菌中胡萝卜素的提取方法 |
| ES2195766B1 (es) * | 2002-01-29 | 2005-04-01 | Antibioticos, S.A.U. | Procedimiento de produccion de beta-caroteno por fermentacion en cultivo mixto utilizando cepas (+) 4 (-) de blakeslea trispora. |
| CN101218352B (zh) | 2005-03-18 | 2013-09-04 | 米克罗比亚公司 | 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 |
| US8691555B2 (en) | 2006-09-28 | 2014-04-08 | Dsm Ip Assests B.V. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US2890989A (en) * | 1957-07-01 | 1959-06-16 | Ralph F Anderson | Method for the production of carotenes |
| US4318987A (en) * | 1979-11-16 | 1982-03-09 | Murillo Araujo Francisco J | β-Carotene producing strains of the fungus phycomyces blakesleenus |
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1993
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