JPH0678629A - 食用きのこの栽培方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 マッシュルームのように１個の胞子の発芽に
よって直接二次菌糸を形成する食用きのこについて、効
率好く品種改良を行い、その収量および品質を改善す
る。 【構成】 １個の胞子の発芽によって直接二次菌糸を形
成する食用きのこの菌糸を処理してプロトプラストを
得、このプロトプラストを培養して菌糸を再生すること
により複数の菌株を得、これらの菌株の中から所望の菌
株を選別し、選別された菌株を培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は食用きのこの栽培方法に
関し、特にマッシュルームのように１個の胞子の発芽に
よって直接二次菌糸を形成する食用きのこを簡単な操作
で品種改良することによりきのこの収量および品質を改
善する栽培方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在食用きのこの品種改良は選抜育種と
交雑育種を中心に進められている。その目的は子実体の
収量や形態形質の向上、栽培上の特性改良などである。

【０００３】きのこの子実体の組織は二次菌糸（または
二核菌糸）と呼ばれるヘテロカリオンの菌糸からできて
いる。そのためきのこの栽培に用いる種菌も二次菌糸で
作られ、きのこの性質も二次菌糸の遺伝的性質で決定さ
れる。

【０００４】きのこの傘のヒダにある担子器で核の合体
とそれに続く減数分裂が進行し担子胞子を生ずる。担子
胞子が発芽して菌糸を生ずるが、これは一次菌糸と呼ば
れる。きのこの交配では、この一次菌糸同士が融合して
新しいタイプの二次菌糸とを形成する。各一次菌糸には
不和合性因子と呼ばれる遺伝的に支配される因子があ
り、その許される組み合わせの間でのみ交配が可能であ
る。

【０００５】交配によってできた新しい菌糸の形質が偶
然に優れている場合に、これを選抜し、遺伝的に安定で
あることを確認し、新品種の育成が終了する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】自然界では、大多数
（９０％）のきのこが、上述のように、二核化は相補的
な交配型をもつ２株の一次菌糸間の細胞融合によって行
われている。いいかえると、二核化が起こるためには適
当な相手になる一次菌糸が必要である。このような交配
様式は“ヘテロタリズム”と呼ばれている。ところがフ
クロタケやマッシュルームなど少数（１０％）のきのこ
では、担子胞子の発芽によって生じた菌糸は、相手菌糸
を待つまでもなく、それ独自ですでに二核化している。
この場合はホモタリズムと呼ばれている。

【０００７】マッシュルームのように１個の胞子の発芽
によって直接二次菌糸を形成する場合には、交雑育種は
難しく、単胞子培養によって遺伝的に優勢な品種を選抜
するしかない。しかしこの方法は非常に時間がかかって
効率が悪く、品種改良のネックになっている。

【０００８】よって、本発明は、マッシュルームのよう
に１個の胞子の発芽によって直接二次菌糸を形成するホ
モタリズム型の食用きのこを従来の単胞子培養にかわる
より効率の良い方法で品種改良することにより、その収
量および品質を改善することができる食用きのこの栽培
方法を提供しようとするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らは鋭意実験と研究を重ねた結果、マッシ
ュルームの菌糸を酵素処理してプロトプラストを得、こ
のプロトプラストを培養することにより菌糸を再生させ
ると、意外なことに、同一菌糸から得たプロトプラスト
から再生された菌糸による複数の菌株は、細胞融合、遺
伝子組替え等の人為的操作をいっさい加えていないにも
かかわらず、それぞれ異る遺伝的形質を示し、これら遺
伝形質の異る複数の菌株の中には、きのこの収量および
品質において親株よりも優れているものが存在してお
り、これら優れた菌株は容易に選別することができるこ
とを発見し、本発明に到達した。

【００１０】すなわち、上記目的を達成する本発明の食
用きのこの栽培方法は１個の胞子の発芽によって直接二
次菌糸を形成する食用きのこの菌糸を処理してプロトプ
ラストを得、このプロトプラストを培養して菌糸を再生
することにより複数の菌株を得、これらの菌株の中から
所望の菌株を選別し、選別された菌株を培養することを
特徴とするものである。

【００１１】マッシュルームの菌糸からのプロトプラス
トの調製および菌糸の再生の過程において、遺伝形質に
関する人為的操作をいっさい加えていないにもかかわら
ずこのように遺伝形質において優れた菌株が得られる理
由は正確には不明であるが、苛酷な処理によるプロトプ
ラスト化と再生の過程を経ることで材料の細胞の中から
より活性の高い強靱な系統が生き残るため、あるいは自
然突然変異を起こしていながらコロニー中に埋没して形
質が発現していなかった細胞がプロトプラスト化によっ
て分離されてその形質を現わしたものとも考えられる。

【００１２】本発明は、特に食用きのことして需要の多
いマッシュルームに適用する場合に極めて有用である
が、ヒトヨタケ、フクロタケ等他のホモタリズム型の食
用きのこにも適用することが可能である。

【００１３】次ぎに本発明の方法について詳細に説明す
る。 １）プロトプラストの作成 菌糸の培養：液体培養した菌糸をホモゲナイザーで
適当に磨酔して菌糸断片を得て、これを液体培地に再接
種して、数日間２５℃で静置培養する。

【００１４】培地にはシュクロース１％、麦芽エキス１
％、酵母エキス０．４％（ＳＭＹ）の培地または、ポリ
ペプトン１％、カザミノ酸０．２％、麦芽エキス１％、
酵母エキス０．４％（ＰＣＭＹ）の培地などを用いる。

【００１５】 酵素処理：培養育成した菌糸は細胞壁
溶解酵素で処理する。細胞壁溶解酵素としては、たとえ
ばセルラーゼオノズカＲ−１０、同ＲＳ、キチナーゼ、
ドリセラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ヘリカーゼ、メ
イセラーゼ、ノボザイム２３４、ウスキザイム、ザイモ
リアーゼ−２０Ｔなどを使用することができる。これら
の酵素反応は単独処理でもよいが２〜３種類混合すれば
能率が上がる。酵素はマンニットなどの糖アルコールや
硫酸マグネシウムなどの無機塩類を浸透圧調節剤として
０．５〜０．６Ｍ含むマレイン酸・ＮａＯＨ，０．０５
Ｍ，ｐＨ５．５などの緩衝液に溶解する。菌糸を試験管
中で酵素液に分散し、反応は２０〜３０℃で０〜６０回
／分程度で振とうしながら行う。反応時間は１．５〜５
時間位でよい。

【００１６】 精製：反応が終われば、ナイロンメッ
シュやメンブランフィルターなどを用いて残存する菌糸
を除いたろ液から６００×ｇ，５分間−１時間の遠心操
作によってプロトプラストの沈殿を得る。

【００１７】これを酵素を含まない緩衝液に懸濁し同じ
条件で再び遠心を行って洗浄する。２〜３回の洗浄を行
った後に菌糸断片の多い場合には、浸透圧調節剤として
０．７Ｍシュクロースを含む緩衝液の上にプロトプラス
ト懸濁液を静かに層をなすように乗せ、６００×ｇ，５
分間の遠心分離を行って層の境界にくる白色の層をしず
かに分取する。

【００１８】２）プロトプラストの再生 適当に希釈した後、１０ｍｌ程度のＳＭＹまたはＰＣＭ
Ｙ寒天培地（０．５Ｍシュクロースなどの浸透圧調節剤
と１．５％の寒天を含む９ｃｍペトリ皿中）の上に０．
１ｍｌとり（約１０⁴ 〜１０⁶ 個のプロトプラストを含
む）上から溶解後４３〜４４℃に保った１０ｍｌの同じ
培地（ただし寒天濃度０．７％、固化温度の低い寒天を
使用）を流し込んで攪拌し、固化後２５℃で培養する。
再生した菌糸はクリーンベンチ中で肉眼または実体顕微
鏡で見ながら、菌糸の成長速度、形態、コロニーの形状
などを基準として選別して所望の菌株を得る。

【００１９】３）種菌の調製および食用きのこの栽培 常法に従って穀粒（小麦、ライ麦など）またはコンポス
トを滅菌した固体培地に、プロトプラスト再生菌を液体
培養し磨酔したものを接種源として用いる。菌糸は容器
全体に分散し、２５℃で培養すれば均等に成長し、２０
〜４０日で蔓延する。栽培は常法に従って行えばよい。

【００２０】

【実施例】プロトプラストの調製 プロトプラスト調製用培地としてＭＰＦＹＥ培地を使用
した。この培地は果糖２０ｇ、麦芽エキス２０ｇ、酵母
エキス２ｇ、ペプトン２ｇ、硫酸マグネシウム・７水
０．５ｇ、リン酸カリウム１ｇ、リン酸水素２カリウム
０．４６ｇ、フォーゲル微量要素溶液０．２ｍｌ、およ
び蒸留水を混合して１ｌにすることにより調製した。フ
ォーゲル微量要素溶液は、クエン酸１水和物５ｇ、硫酸
亜鉛・７水５ｇ、硫酸鉄（II）アンモニウム・６水１
ｇ、硫酸銅・５水０．２５ｇ、硫酸マンガン・１水０．
０５ｇ、ホウ酸０．０５ｇ、モリブデン酸ナトリウム・
２水０．０５ｇ、および蒸留水を混合し１００ｍｌに
し、クロロフォルム１ｍｌを防腐剤として加えることに
より調製した。

【００２１】ＭＰＦＹＥ培地２０ｍｌを、綿栓をした１
００ｍｌエーレンマイヤーフラスコに分注した。マッシ
ュルーム市販菌株Somycel Ｕ３の菌糸を寒天培地で培養
した後ＭＰＦＹＥ培地に移植し、３〜４週間２５℃で静
置培養した。培養後、充分生長した菌糸体を培地ごとブ
レンダーで破砕（マセレート）した。新しい培地にマセ
レート菌糸体を駒込ピペットなどで移植し、２〜４日間
同じ条件で培養した。

【００２２】培養した菌糸体を遠心分離（１０，０００
ｘｇ，１０ｍｉｎ）にかけて補集し、補集した菌糸体ペ
レットを滅菌した０．０１Ｍリン酸−カリウム緩衝液
（ｐＨ６．９）で洗浄し、再び遠心分離で補集した。こ
れを２度繰り返し、培地成分を除いた。ペレットの重量
を測定し、メンブランフィルター（孔径０．２μ）でろ
過除菌した酵素液中に、菌糸体１ｇ当たり酵素５０〜６
０ｍｇとなるように懸濁した。酵素液としてはノボザイ
ム２３４（市販酵素）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、プロ
トプラスト懸濁用等張液に溶解し、メンブランフィルタ
ー（孔径０．２μ）でろ過除菌したものを用いた。プロ
トプラスト懸濁用等張液としては、０．０１Ｍリン酸−
カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に０．６Ｍ硫酸マグネシ
ウム−１０ｍＭクエン酸ナトリウムを溶解し、プロトプ
ラスト懸濁時に滅菌したものを用いた。

【００２３】この懸濁液をウォーターバスインキュベー
ター（２５℃−６０ｒｐｍ）で４時間反応させる。１時
間ごとに試験管ミキサーで２秒間強く攪拌した（細胞壁
の分解）。

【００２４】２０ｍｌ容量の注射器に滅菌したナイロン
メッシュ（１４ １／２−ＸＸ）２枚、脱脂綿、もう１
枚のナイロンメッシュを層にして詰めたフィルターで、
分解されなかった菌糸断片をろ別した。ろ液を遠心分離
（７５０ｘｇ，１ｈｏｕｒ）にかけ、プロトプラストを
補集し、補集したプロトプラストを滅菌した等張液に懸
濁した。血球計算盤でプロトプラスト濃度を測定した。

【００２５】プロトプラストの再生 再生用固体培地として上記ＭＰＦＹＥ培地の組成に寒天
１０ｇと浸透圧調節剤として０．６Ｍマンニトールを加
えたものを用意した。また浸透圧感受性テスト培地とし
て上記ＭＰＦＹＥ培地に寒天１０ｇのみを加えたものを
用意した。

【００２６】プロトプラスト懸濁液を２等分し、プロト
プラスト再生培地と浸透圧感受性テスト培地に接種し
た。２５℃で２〜４週間培養し、再生してきたコロニー
を観察して新たな平板培地に移植した。

【００２７】プロトプラスト再生株のスクリーニング 上記操作の結果合計で９２系統のプロトプラスト再生株
を得た。この内未反応菌糸の混入が疑われる実験区のも
のは除外し、合計６０系統をプロトプラスト再生株とし
た。

【００２８】これら６０系統のプロトプラスト再生株か
ら、コロニー形態が円形で菌糸の形態が均一であるこ
と、気中菌糸の異常増殖（フラッフィ）の見られないこ
と、生長速度の速いことを基準に８系統の再生株（ＰＰ
−０６，−１９，−２１，−２９，−３１，−４４，−
５３，−５４）を選抜し（第１次スクリーニング）、こ
れら８系統の再生株から種菌を調製した。

【００２９】これら８系統のプロトプラスト再生株種菌
について収穫量と子実体の品質について、プロトプラス
ト調製の材料としたSomycel Ｕ３（対照）と再生株およ
び再生株相互を比較し、次の方法により第二次スクリー
ニングを行なった。

【００３０】使用菌株 市販菌株（Somycel Ｕ３）より調製したプロトプラスト
再生株から選抜された上記８系統（ＰＰ−０６，−１
９，−２１，−２９，−３１，−４４，−５３，−５
４）を使用した。

【００３１】１）種菌の調製 培地は、小麦を１５分間煮沸し焼き石こう１．５％と炭
酸カルシウム０．５％を添加した後、高圧滅菌（１２１
℃、２ｈ）したものを用いた。小麦培地に平板培地上で
充分に生長した菌糸体を接種・培養して種菌とした。

【００３２】２）栽培（箱栽培） マッシュルームの栽培は、プロトプラストの素材として
使用したSomycel Ｕ３を対照に、常法により箱栽培を行
った。

【００３３】３）栽培（収穫） 発生した子実体は、一般的な栽培での収穫適期「ボタ
ン」（菌膜が破れず、菌褶の見えていない時期）で収穫
し、石突きの部分を切除する「根切り処理」を行なっ
た。収穫が遅れたため、菌傘が開き始め菌褶が露出した
ものは「カップ」として区別した。収穫後、ボタンは菌
傘径を基準にＳ（φ２１〜２８ｍｍ）Ｍ（φ２８〜３５
ｍｍ）Ｌ（φ３５ｍｍ〜）サイズに分別した、各系統毎
に個数と重量を測定した。これを最初に収穫してから約
３週間（３フラッシュ）行なった。なお、生鮮市場では
「ボタン」は１級品であり、カップは級外であって市場
価値のないものである。

【００３４】上記栽培の結果対照との比較および再生株
相互間の比較において収量のもっとも多いＰＰ−４４と
カップのもっとも少いＰＰ−３１の２系統を選抜した。

【００３５】これら２系統の種菌を栽培室において常法
にしたがい１系統ごとに２箱ずつ６週間栽培した。栽培
に使用した容器は三甲（株）製サンボックス＃３６−２
Ｍであった。その結果再生菌株による収量は次表１に示
すとおりであり、対照（親株）に比較して著しく高いボ
タン収量が得られた。

【００３６】

【表１】 またボタン中の傘径を比較して見ると、次表２のとおり
であり、Ｓに比べて市場価値の高いＭ，Ｌの比率は再生
菌株の方が対象に比較して高いことが判る。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、菌
糸を処理して得たプロトプラストを培養して菌糸を再生
することにより複数の菌株を得ることにより、親株より
も優れた所望の遺伝形質を備えた品種改良株を選別する
ことができるので、この選別された菌株を栽培すること
により、きのこの収量および品質を改善することができ
る。したがって従来品種改良が著しく困難であったマッ
シュルーム等のホモタリズム型の食用きのこにおいても
品種改良を容易に行うことができ、その収量および品質
を改善することができるという顕著な効果を奏する。

【００３９】また、プロトプラストは細胞壁を欠くため
に物理的に弱いだけでなく、化学的にも反応しやすく、
外部からの刺激によって核やミトコンドリアなどが影響
を受けやすいので二次菌糸から調製しても一核のプロト
プラストが相当数生じ、これを培養すれば一次菌糸を得
ることができる。したがって本発明を応用すればマッシ
ュルームの交配が可能となる

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【手続補正書】

【提出日】平成５年３月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３６】

【表１】 またボタン中の傘径を比較して見ると、次表２のとおり
であり、Ｓに比べて市場価値の高いＭ，Ｌの比率は再生
菌株の方が対象に比較して高いことが判る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】

【表２】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １個の胞子の発芽によって直接二次菌糸
   を形成する食用きのこの菌糸を処理してプロトプラスト
   を得、このプロトプラストを培養して菌糸を再生するこ
   とにより複数の菌株を得、これらの菌株の中から所望の
   菌株を選別し、選別された菌株を培養することを特徴と
   する食用きのこの栽培方法。
2. 【請求項２】 該食用きのこはマッシュルームであるこ
   とを特徴とする請求項１記載の栽培方法。