CN109220377A - 一种抗叶斑类病害的玉米育种方法 - Google Patents

一种抗叶斑类病害的玉米育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗叶斑类病害的玉米育种方法，该育种方法的步骤包括：(1)培养大小斑病菌；(2)提取粗毒素；(3)筛选玉米大小斑病菌高抗资源和育种主干亲本；(4)获取杂交F1代种；(5)培养单倍体幼苗；(6)染色体加倍后，培育抗叶斑类病害植株。本发明的玉米抗叶斑类病害育种方法培育出了具有显著抗玉米大小斑病害的玉米品种，同时极大地加快了玉米抗大小斑病育种速度，显著缩短了玉米抗大小斑病育种周期，具有极高的产业利用价值。

Description

一种抗叶斑类病害的玉米育种方法
技术领域
本发明属于作物抗病遗传育种技术领域，特别是涉及一种抗叶斑类病害的玉米育种方法。
背景技术
玉米是重要的粮食作物，其全球总产量仅次于小麦，位居第二。玉米已上升为我国第一大粮食作物，2017年我国的玉米播种面积超过35445千公顷。可以说，玉米在国家粮食安全中具有重要的战略地位。引领和支撑我国现代玉米产业发展，是国家玉米产业技术体系科技进步的根本任务。
当前，我国现有的玉米品种不能满足生产需要，主要包括品种抗逆性不强、品种性状不适应、种子质量不适应，难以满足当前玉米生产机械化的要求。玉米种业发展相对落后，面临的形势特别严峻，虽然国内玉米品种数量较多，但是原创自交系水平低，与国外一些优势品种相比，国内大部分玉米品种不适宜密植和机械化作业，玉米种子发芽势偏低，洋种子逼退国产种子，挤占国内种子市场，削弱我国育种优势，严重威胁粮食安全。
玉米杂交种在生产上的应用是提高玉米产量的重要手段之一，我国97％以上的玉米播种面积使用杂交玉米。自East和Shul在1908～1909年发现玉米自交衰退、杂交优势现象后，引起了科学家的极大兴趣。上世纪20年中期首个玉米杂交种(三交种)商业化并在生产上得到利用。自此，掀起了玉米杂交种研究和利用的热潮。首个玉米单交种于1963年在美国得到应用。当前，在玉米杂交种的选育和利用上，除注重产量外，极为重视抗逆性。2011年，墨西哥国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)为了提高全球发展中国家的玉米产量，向CGIAR(国际农业磋商组织)提出的MAIZE项目中将耐胁迫玉米品种的选育及示范、推广作为其重要的研究内容之一。
玉米叶斑类病害是玉米的主要病害之一，主要包括玉米大斑病和玉米小斑病，其致病菌分别为玉米大斑病菌(Helminthosprium turcicum)和玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)，二者同属半知菌类，丛梗孢目，暗色孢科，长蠕孢属。玉米大斑病，目前国内各玉米产区均有发生，以东北、华北北部及南方山区发病较重。大发生年份一般减产15—20％，严重者减产50％左右。大斑病在整个生育期均可发生，但苗期很少发生，后期逐渐加重，发病叶片上形成梭形大斑，病斑黄褐色或青灰色，中部色浅，边缘色深，长5—10厘米、宽1.2—1.5厘米，严重时几个病斑互相连接，叶片提早枯死。玉米小斑病，在我国黄河流域和长江流域发生较重，一般减产20％左右，严重时减产70％左右。小斑病在整个生育期都可发生，后期发生较重。此病主要危害叶片偶而也危害叶鞘、包叶和子粒。病斑小，表现为3种类型：第一种类型，病斑为椭圆形，中央黄褐色、边缘紫色或深褐色，空气湿度高时，病斑表面生灰褐色稀疏霉层，后病叶变黄枯死。第二种类型，病斑椭圆形或纺锤形，病斑较大，中央灰褐色或浅黄色，一般无明显边缘，后期稍显轮纹，高温高湿条件下病斑表面生灰褐色霉层。叶片病斑数量多时，很快萎蔫枯死。第三种类型，叶片上形成黄褐色坏死小斑，病斑周围有黄色晕圈，表面霉层极少，叶鞘和包叶病斑较大，呈纺锤形，表面密生灰黑色霉层。果穗受害生灰黑色霉层，严重时果穗腐烂。
玉米大小叶斑病的发生与流行，与气候条件、品种抗性、管理水平及立地条件关系密切。空气湿度高、温度适宜时发病重，品种抗性差者发病重，连作、地势低洼、排水不良、土质粘重、施肥不足都会加重发病。提高品种的抗病菌性能，是预防玉米叶斑类病害发生的重要途径，现有技术中用于提高品种抗病菌性的方法有：专利CN201010254509.0公开了一种杂交玉米的制种方法，具体涉及一种杂交玉米鲁单9032的制种方法，它由母本lx00-1与父本lx03-2杂交后获得。母本的制备时先自交6-8代，再杂交4-6代；父本的制备则是先自交4-6代，再杂交4-6代。该品种虽然具有抗小斑病和大斑病，抗弯孢菌叶斑病，高感茎腐病，抗瘤黑粉病，中抗矮花叶病的优良性状，但是育种方法耗时时间太长，培育成功需要11-15代的时间，人力物力成本高；专利CN200510048763.4公开了一种玉米与甘薯多样性种植控制玉米大小斑病的方法，该方法采用玉米和甘薯套种，对玉米与玉米之间，甘薯与甘薯之间的株距、行距和密度都有要求，但是适用于玉米生长的土地未必适用于甘薯生长，因此该种植方法尽管具有预防大小斑病的作用，但是不适于大规模推广。因此培育一种优质、高产、抗叶斑病类病害性能良好的玉米新品种具有十分重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，所述抗叶斑类病害的玉米育种方法包括如下步骤：
(1)培养大小斑病菌：采集感染大斑病和小斑病的普通品种玉米叶片，将叶片病斑分别接种于改良PDA培养基上，25℃下黑暗培养10-15天；
(2)提取粗毒素：将步骤(1)培养10-15天的大小斑病菌培养物分别进行如下处理：
将大斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用环己烷浸提20小时，抽滤浸提物，滤液常温挥干，挥干物用80％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性溶剂，得到大斑病菌粗提毒素；
将小斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用石油醚浸提25小时，抽滤浸提物，常温挥干，挥干物用85％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性醚，得到小斑病菌粗提毒素；
(3)筛选玉米大小斑病菌高抗资源和育种主干亲本；
(4)获取杂交F1代种：以抗大斑病的植株作父本，以抗小斑病的植株作母本，或以抗大斑病的植株作母本，以抗小斑病的植株作父本，杂交获得F1代种子；杂交方法按照常规操作；
(5)培养单倍体幼苗：取杂种F1代花粉细胞发育到单核靠边期的玉米幼穗，经75％乙醇表面消毒后，剥取花药组织接种到添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基上，于25℃条件下遮光条件下诱导抗性小孢子雄核发育；待培养的花药组织中抗性小孢子雄核脱分化产生小米粒大小的愈伤组织时，将其转入到花药愈伤组织分化培养基中，置3000Lx～4000Lx光照强度下诱导愈伤组织的分化，培养温度为25℃；待花粉愈伤组织诱导的小苗长到2-3片小叶时，及时切去小苗转入到生根壮苗培养基中诱导生根；
(6)培育抗叶斑类病害植株：将生根壮苗后的单倍体植株及时移栽到营养钵中，于15℃、1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长15天后，用含0.1％的秋水仙素和1.5％的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍，注射在清晨8～9时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株经染色体加倍后得到抗叶斑类病害植株；加倍单倍体个体进行抗叶斑类病害特性鉴定即可筛选到稳定的抗叶斑类株系。
进一步地，步骤(1)中大斑病菌的培养方法为：在田间随机选择大斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成3-4cm长段，用自来水冲洗后，放入70％的酒精中30s，用灭菌水连续冲洗数次；再置于培养皿中潮湿的滤纸上，于室温培养2～3d后，在显微镜下镜检病斑上的分生孢子情况，并置于培养皿中的干滤纸上8～12h后，轻轻地将孢子振落到较薄的清水琼脂培养基上，清水琼脂培养基的配比为16～18g琼脂比l 000mL的水，在显微镜下(10×10)镜检，若1个视野只有1个孢子，则用蘸有蓝墨水的竹签正对着孢子作标记，在无菌条件下采用改造的移植环将含单个分上孢子的小胶块切下转移至斜面试管改良PDA培养基上于25℃温箱中，黑暗培养10-15天；
进一步地，步骤(1)中小斑病菌的培养方法为：在田间随机选择小斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成2mm左右，用75％乙醇浸泡30秒，再用1％升汞消毒1～2分钟，最后用无菌水清洗3遍，将病叶上的水用灭过菌的滤纸吸干，移至PDA平板上于25℃黑暗条件下，培养4～5天后选取一个菌落进行菌丝和分生孢子鉴定、纯化，最后移到PDA斜面上在25℃下，黑暗培养10-15天。
进一步地，步骤(1)中改良PDA培养基每升中含有以下原料组分：去皮马铃薯180～300g、葡萄糖8～15g、蛋白胨3～5g、玉米粒30～50g、琼脂粉10～30g。
进一步地，步骤(3)中大小斑病高抗资源和育种主干亲本植株的培育方法为：
取活化好的玉米大斑病菌，用直径5mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至玉米大斑病菌产孢培养基表面，25℃黑暗培养10～15d，用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72h，用灭菌毛笔和无菌水将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，过滤后配制成每毫升1～5×105个孢子的分生孢子悬浮液，进行玉米植株喷雾接种，病情稳定后观察发病情况，选取抗病菌性能较好、病害程度较轻的植株作为抗大斑病的父本植株；同样的方法用于筛选培育抗小斑病的母本植株。
优选地，所述玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：蔗糖20～25g、蛋白胨3～5g、新鲜玉米叶40～60g、高粱粒30～50g、琼脂粉14～16g。
优选地，所述玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：甘露醇23g、蛋白胨4g、新鲜玉米叶50g、高粱粒40g、琼脂粉15g。
进一步地，步骤(5)中添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基获得方法如下：在通用培养基W14基础上，添加以下组分：
步骤(2)获得的粗提毒素混合物加入量：0.8-1.2ml/L，其中粗提毒素中大斑病菌粗毒素与小斑病粗毒素质量比为1:1；甘氨酸：1.8-2.2mg/L；盐酸硫胺素加入量：7-9mg/L；酪蛋白加入量：490-510mg/L；生物素加入量：0.4-0.6mg/L；苯丙氨酸加入量：45-52mg/L；维生素B1加入量：55-65mg/L；麦芽糖加入量：25000-35000mg/L；琼脂粉加入量：4500-5500mg/L；调整诱导培养基pH值为5.5-6.5。
所述通用培养基W14的配方如下所示：硝酸钾：2000mg/L，磷酸二氢氨：380mg/L，氯化钙：140mg/L，硫酸镁：200mg/L，硫酸钾：700mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：8mg/L，硫酸锌：3.0mg/L，硼酸：3.0mg/L，碘化钾：0.5mg/L，钼酸钠：0.005mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
进一步地，步骤(5)中花药愈伤组织分化培养基的获得方法如下：以通用培养基Ms为基础，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：50mg/L，蔗糖：30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整分化培养基pH值为5.6-6.0；
所述的通用培养基Ms配方如下：硝酸钾：1900mg/L，硝酸氨：1650mg/L，氯化钙：440mg/L，硫酸镁：370mg/L，磷酸二氢钾：170mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：22.3mg/L，硫酸锌：8.6mg/L，硼酸：6.2mg/L，碘化钾：0.83mg/L，钼酸钠：0.25mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L。
进一步地，步骤(5)所述诱导生根壮苗培养基的获得方法为：以1/3通用培养基MS为基础，即Ms各原料的1/3用量，添加以下物质：α-萘乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，蔗糖30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整生根壮苗培养基pH值为5.6；所述的通用培养基Ms配方如权利要求8所述。
进一步地，步骤(6)所述营养钵的配料包含：尿素、磷酸氢二铵、硫酸钾、硫酸锌、生根粉、阳离子交换树脂，营养钵形状为圆柱形，直径6～10cm，高8～12cm，重50～60g，用模具压制成型。
本发明提供的抗叶斑病类病害的玉米育种方法发明点在于：筛选出了叶斑类病害高抗性的亲本植株，并通过抗性基因型亲本之间的杂交，利用基因重组获得基因型广泛变异的杂种F1代，用粗提的大斑病菌和小斑病菌胁迫F1代离体花药组织，杀死或抑制花药组织中毒素敏感基因型小孢子发育，使抗毒素基因型小孢子雄核发育成再生植株，染色体加倍后，定向获得抗大小斑病基因型后代的定向选择方法。该方法克服了玉米抗性育种筛选中，筛选群体有限、抗性基因型个体出现概率小、鉴定技术复杂、抗性基因型选择难的缺陷，利用毒素筛选花药愈伤组织是定向的，选择效率高。相比杂交十几代的繁琐方法，更为节省时间，节约人力物力，极大的缩短了育种周期，提高了育种效率。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
(1)培养大小斑病菌：采集感染大斑病和小斑病的普通品种玉米叶片，将叶片病斑分别接种于改良PDA培养基上，25℃下黑暗培养10-15天；
具体为：在田间随机选择大斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成3-4cm长段，用自来水冲洗后，放入70％的酒精中30s，用灭菌水连续冲洗数次；再置于培养皿中潮湿的滤纸上，于室温培养2～3d后，在显微镜下镜检病斑上的分生孢子情况，并置于培养皿中的干滤纸上8～12h后，轻轻地将孢子振落到较薄的清水琼脂培养基上，清水琼脂培养基的配比为16～18g琼脂比l000mL的水，在显微镜下(10×10)镜检，若1个视野只有1个孢子，则用蘸有蓝墨水的竹签正对着孢子作标记，在无菌条件下采用改造的移植环将含单个分上孢子的小胶块切下转移至斜面试管改良PDA培养基上于25℃温箱中，黑暗培养10-15天；小斑病菌的培养方法为：在田间随机选择小斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成2mm左右，用75％乙醇浸泡30秒，再用1％升汞消毒1～2分钟，最后用无菌水清洗3遍，将病叶上的水用灭过菌的滤纸吸干，移至PDA平板上于25℃黑暗条件下，培养4～5天后选取一个菌落进行菌丝和分生孢子鉴定、纯化，最后移到PDA斜面上在25℃下，黑暗培养10-15天。
步骤(1)中改良PDA培养基每升中含有以下原料组分：去皮马铃薯180g、葡萄糖8g、蛋白胨3g、玉米粒30g、琼脂粉10g。
玉米大小斑病菌的分离鉴定方法采用本领域常用的柯赫氏法则验证，即观察分离纯化后的病原菌形态特征，并用PDA培养基培养所得的分生孢子接种玉米植株，观察其发病症状，镜检分离病原菌。经鉴定，从发病玉米叶片上分离到的病原菌，其形态特征和生物学特性均符合大小斑病原菌的特征。
(2)提取粗毒素：将步骤(1)培养10-15天的大小斑病菌培养物分别进行如下处理：
将大斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用环己烷浸提20小时，抽滤浸提物，滤液常温挥干，挥干物用80％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性溶剂，得到大斑病菌粗提毒素；
将小斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用石油醚浸提25小时，抽滤浸提物，常温挥干，挥干物用85％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性醚，得到小斑病菌粗提毒素；
(3)筛选玉米大小斑病菌高抗资源和育种主干亲本；
大小斑病高抗资源和育种主干亲本植株的培育方法为：
取活化好的玉米大斑病菌，用直径5mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至玉米大斑病菌产孢培养基表面，25℃黑暗培养10～15d，用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72h，用灭菌毛笔和无菌水将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，过滤后配制成每毫升1～5×105个孢子的分生孢子悬浮液，进行玉米植株喷雾接种，病情稳定后观察发病情况，选取抗病菌性能较好、病害程度较轻的植株作为抗大斑病的父本植株；同样的方法用于筛选培育抗小斑病的母本植株。
玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：蔗糖20g、蛋白胨3g、新鲜玉米叶40g、高粱粒30g、琼脂粉14g。
(4)获取杂交F1代种：以抗大斑病的植株作父本，以抗小斑病的植株作母本，杂交获得F1代种子；杂交方法按照常规操作；
(5)培养单倍体幼苗：取杂种F1代花粉细胞发育到单核靠边期的玉米幼穗，经75％乙醇表面消毒后，剥取花药组织接种到添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基上，于25℃条件下遮光条件下诱导抗性小孢子雄核发育；待培养的花药组织中抗性小孢子雄核脱分化产生小米粒大小的愈伤组织时，将其转入到花药愈伤组织分化培养基中，置3000Lx～4000Lx光照强度下诱导愈伤组织的分化，培养温度为25℃；待花粉愈伤组织诱导的小苗长到2-3片小叶时，及时切去小苗转入到生根壮苗培养基中诱导生根；
添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基获得方法如下：在通用培养基W14基础上，添加以下组分：
步骤(2)获得的粗提毒素混合物加入量：0.8ml/L，其中粗提毒素中大斑病菌粗毒素与小斑病粗毒素质量比为1:1；甘氨酸：1.8mg/L；盐酸硫胺素加入量：7mg/L；酪蛋白加入量：490mg/L；生物素加入量：0.4mg/L；苯丙氨酸加入量：45mg/L；维生素B1加入量：55mg/L；麦芽糖加入量：25000mg/L；琼脂粉加入量：4500mg/L；调整诱导培养基pH值为5.5。
所述通用培养基W14的配方如下所示：硝酸钾：2000mg/L，磷酸二氢氨：380mg/L，氯化钙：140mg/L，硫酸镁：200mg/L，硫酸钾：700mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：8mg/L，硫酸锌：3.0mg/L，硼酸：3.0mg/L，碘化钾：0.5mg/L，钼酸钠：0.005mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
花药愈伤组织分化培养基的获得方法如下：以通用培养基Ms为基础，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：50mg/L，蔗糖：30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整分化培养基pH值为5.6；
通用培养基Ms配方如下：硝酸钾：1900mg/L，硝酸氨：1650mg/L，氯化钙：440mg/L，硫酸镁：370mg/L，磷酸二氢钾：170mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：22.3mg/L，硫酸锌：8.6mg/L，硼酸：6.2mg/L，碘化钾：0.83mg/L，钼酸钠：0.25mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L。
步骤(5)所述诱导生根壮苗培养基的获得方法为：以1/3通用培养基MS为基础，即Ms各原料的1/3用量，添加以下物质：α-萘乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，蔗糖30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整生根壮苗培养基pH值为5.6；所述的通用培养基Ms配方如上述所述。
(6)培育抗叶斑类病害植株：将生根壮苗后的单倍体植株及时移栽到营养钵中，于15℃、1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长15天后，用含0.1％的秋水仙素和1.5％的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍，注射在清晨8～9时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株经染色体加倍后得到抗叶斑类病害植株；加倍单倍体个体进行抗叶斑类病害特性鉴定即可筛选到稳定的抗赤霉株系。
所述营养钵的配料包含：尿素、磷酸氢二铵、硫酸钾、硫酸锌、生根粉、阳离子交换树脂，营养钵形状为圆柱形，直径6～10cm，高8～12cm，重50～60g，用模具压制成型。
实施例2
操作步骤按照实施例1，以抗大斑病的植株作母本，以抗小斑病的植株作父本，杂交获得F1代种子，各步骤中所用的培养基的配料如下：
步骤(1)中改良PDA培养基每升中含有以下原料组分：去皮马铃薯250g、葡萄糖10g、蛋白胨4g、玉米粒40g、琼脂粉20g。
步骤(3)中玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：蔗糖23g、蛋白胨4g、新鲜玉米叶50g、高粱粒40g、琼脂粉13g。
步骤(5)中添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基获得方法如下：在通用培养基W14基础上，添加以下组分：步骤(2)获得的粗提毒素混合物加入量：0.8ml/L，其中粗提毒素中大斑病菌粗毒素与小斑病粗毒素质量比为1:1；甘氨酸：2.0mg/L；盐酸硫胺素加入量：8mg/L；酪蛋白加入量：500mg/L；生物素加入量：0.5mg/L；苯丙氨酸加入量：50mg/L；维生素B1加入量：60mg/L；麦芽糖加入量：30000mg/L；琼脂粉加入量：5000mg/L；调整诱导培养基pH值为6.0。
所述通用培养基W14的配方如下所示：硝酸钾：2000mg/L，磷酸二氢氨：380mg/L，氯化钙：140mg/L，硫酸镁：200mg/L，硫酸钾：700mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：8mg/L，硫酸锌：3.0mg/L，硼酸：3.0mg/L，碘化钾：0.5mg/L，钼酸钠：0.005mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
花药愈伤组织分化培养基的获得方法如下：以通用培养基Ms为基础，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：50mg/L，蔗糖：30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整分化培养基pH值为5.8；
通用培养基Ms配方如下：硝酸钾：1900mg/L，硝酸氨：1650mg/L，氯化钙：440mg/L，硫酸镁：370mg/L，磷酸二氢钾：170mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：22.3mg/L，硫酸锌：8.6mg/L，硼酸：6.2mg/L，碘化钾：0.83mg/L，钼酸钠：0.25mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L。
步骤(5)所述诱导生根壮苗培养基的获得方法为：以1/3通用培养基MS为基础，即Ms各原料的1/3用量，添加以下物质：α-萘乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，蔗糖30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整生根壮苗培养基pH值为5.6；所述通用培养基Ms配方如上述所述。
实施例3
操作步骤按照实施例1，以抗大斑病的植株作母本，以抗小斑病的植株作父本，杂交获得F1代种子，各步骤中所用的培养基的配料如下：
步骤(1)中改良PDA培养基每升中含有以下原料组分：去皮马铃薯300g、葡萄糖15g、蛋白胨5g、玉米粒50g、琼脂粉30g。
步骤(3)中玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：蔗糖25g、蛋白胨5g、新鲜玉米叶60g、高粱粒50g、琼脂粉16g。
步骤(5)中添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基获得方法如下：在通用培养基W14基础上，添加以下组分：步骤(2)获得的粗提毒素混合物加入量：1.2ml/L，其中粗提毒素中大斑病菌粗毒素与小斑病粗毒素质量比为1:1；甘氨酸：2.2mg/L；盐酸硫胺素加入量：9mg/L；酪蛋白加入量：510mg/L；生物素加入量：0.6mg/L；苯丙氨酸加入量：52mg/L；维生素B1加入量：65mg/L；麦芽糖加入量：35000mg/L；琼脂粉加入量：5500mg/L；调整诱导培养基pH值为6.5。
所述通用培养基W14的配方如下所示：硝酸钾：2000mg/L，磷酸二氢氨：380mg/L，氯化钙：140mg/L，硫酸镁：200mg/L，硫酸钾：700mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：8mg/L，硫酸锌：3.0mg/L，硼酸：3.0mg/L，碘化钾：0.5mg/L，钼酸钠：0.005mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
花药愈伤组织分化培养基的获得方法如下：以通用培养基Ms为基础，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：50mg/L，蔗糖：30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整分化培养基pH值为5.6-6.0；
通用培养基Ms配方如下：硝酸钾：1900mg/L，硝酸氨：1650mg/L，氯化钙：440mg/L，硫酸镁：370mg/L，磷酸二氢钾：170mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：22.3mg/L，硫酸锌：8.6mg/L，硼酸：6.2mg/L，碘化钾：0.83mg/L，钼酸钠：0.25mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L。
步骤(5)所述诱导生根壮苗培养基的获得方法为：以1/3通用培养基MS为基础，即Ms各原料的1/3用量，添加以下物质：α-萘乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，蔗糖30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整生根壮苗培养基pH值为5.6；所述通用培养基Ms配方如上述所述。
实施例4
本实施例为针对普通玉米品种经过本发明的育种方法培育出的新品种，进行的抗病性鉴定试验：
供试普通玉米品种选自鑫瑞25，由北京市农林科学院玉米研究中心提供。
在玉米生长到40-60cm高时，进行叶面喷雾试验。浓度1×105个孢子/mL。
玉米大小斑病抗性测定方法采用如下标准：
表1玉米大小斑病的分级标准
表2玉米大小斑病抗性评价标准
表3鑫瑞25经过本发明的育种方法培育出的新品种的抗病性鉴定
注：实施例1至实施例3的品种为：用实施例1-3的方法步骤处理普通玉米品种鑫瑞25。
对照例为普通玉米品种鑫瑞25。
由上表可见，普通玉米品种鑫瑞25经本发明提供的育种方法处理后，能筛选出具有高抗病性的实施例1-3的新品种，新品种相对于普通玉米品种鑫瑞25，对于大小斑病原菌的侵染更具有抵抗力，可以更好的防治大小斑病的发生，有效的提高玉米产量。
实施例5
本实施例为针对普通玉米品种经过本发明的育种方法培育出的新品种，进行的抗病性鉴定试验：
供试普通玉米品种选自北青380，由郑州北青种业有限公司提供。
在玉米生长到40-60cm高时，进行叶面喷雾试验。浓度1×105个孢子/mL。
玉米大小斑病的分级标准和玉米大小斑病抗性评价标准同实施例4。
表4北青380经过本发明的育种方法培育出的新品种的抗病性鉴定
注：实施例1至实施例3的品种为：用实施例1-3的方法步骤处理普通玉米品种北青380。
对照例为普通玉米品种北青380。
由上表可见，普通玉米品种北青380经本发明提供的育种方法处理后，能筛选出具有高抗病性的实施例1-3的新品种，新品种相对于普通玉米品种北青380，其对于大小斑病原菌的侵染更具有抵抗力，可以更好的防治大小斑病的发生，有效的提高玉米产量。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，所述抗叶斑类病害的玉米育种方法包括如下步骤：
(1)培养大小斑病菌：采集感染大斑病和小斑病的普通品种玉米叶片，将叶片病斑分别接种于改良PDA培养基上，25℃下黑暗培养10-15天；
(2)提取粗毒素：将步骤(1)培养10-15天的大小斑病菌培养物分别进行如下处理：
将大斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用环己烷浸提20小时，抽滤浸提物，滤液常温挥干，挥干物用80％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性溶剂，得到大斑病菌粗提毒素；
将小斑病菌培养物置于50-60℃下恒温烘干，将烘干物用石油醚浸提25小时，抽滤浸提物，常温挥干，挥干物用85％乙醇溶解，静置过夜后，除去非极性醚，得到小斑病菌粗提毒素；
(3)筛选玉米大小斑病菌高抗资源和育种主干亲本；
(4)获取杂交F1代种：以抗大斑病的植株作父本，以抗小斑病的植株作母本，或以抗大斑病的植株作母本，以抗小斑病的植株作父本，杂交获得F1代种子；杂交方法按照常规操作；
(5)培养单倍体幼苗：取杂种F1代花粉细胞发育到单核靠边期的玉米幼穗，经75％乙醇表面消毒后，剥取花药组织接种到添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基上，于25℃条件下遮光条件下诱导抗性小孢子雄核发育；待培养的花药组织中抗性小孢子雄核脱分化产生小米粒大小的愈伤组织时，将其转入到花药愈伤组织分化培养基中，置3000Lx～4000Lx光照强度下诱导愈伤组织的分化，培养温度为25℃；待花粉愈伤组织诱导的小苗长到2-3片小叶时，及时切去小苗转入到生根壮苗培养基中诱导生根；
(6)培育抗叶斑类病害植株：将生根壮苗后的单倍体植株及时移栽到营养钵中，于15℃、1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长15天后，用含0.1％的秋水仙素和1.5％的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍，注射在清晨8～9时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株经染色体加倍后得到抗叶斑类病害植株；加倍单倍体个体进行抗叶斑类病害特性鉴定即可筛选到稳定的抗赤霉株系。
2.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(1)中大斑病菌的培养方法为：在田间随机选择大斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成3-4mm段，用自来水冲洗后，放入70％的酒精中30s，用灭菌水连续冲洗数次；再置于培养皿中潮湿的滤纸上，于室温培养2～3d后，在显微镜下镜检病斑上的分生孢子情况，并置于培养皿中的干滤纸上8～12h后，轻轻地将孢子振落到较薄的清水琼脂培养基上，清水琼脂培养基的配比为16～18g琼脂比l 000mL的水，在显微镜下(10×10)镜检，若1个视野只有1个孢子，则用蘸有蓝墨水的竹签正对着孢子作标记，在无菌条件下采用改造的移植环将含单个分上孢子的小胶块切下转移至斜面试管改良PDA培养基上于25℃温箱中，黑暗培养10-15天；
步骤(1)中小斑病菌的培养方法为：在田间随机选择小斑病病株，每个病株采几片典型的病叶，将叶片病斑剪成2mm左右，用75％乙醇浸泡30秒，再用1％升汞消毒1～2分钟，最后用无菌水清洗3遍，将病叶上的水用灭过菌的滤纸吸干，移至PDA平板上于25℃黑暗条件下，培养4～5天后选取一个菌落进行菌丝和分生孢子鉴定、纯化，最后移到PDA斜面上在25℃下，黑暗培养10-15天。
3.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(1)中改良PDA培养基每升中含有以下原料组分：去皮马铃薯180～300g、葡萄糖8～15g、蛋白胨3～5g、玉米粒30～50g、琼脂粉10～30g。
4.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(3)中大小斑病高抗资源和育种主干亲本植株的培育方法为：
取活化好的玉米大斑病菌，用直径5mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至玉米大斑病菌产孢培养基表面，25℃黑暗培养10～15d，用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72h，用灭菌毛笔和无菌水将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，过滤后配制成每毫升1～5×105个孢子的分生孢子悬浮液，进行玉米植株喷雾接种，病情稳定后观察发病情况，选取抗病菌性能较好、病害程度较轻的植株作为抗大斑病的父本植株；同样的方法用于筛选培育抗小斑病的母本植株。
5.根据权利要求4所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，所述玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：蔗糖20～25g、蛋白胨3～5g、新鲜玉米叶40～60g、高粱粒30～50g、琼脂粉14～16g。
6.根据权利要求5所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，所述玉米大小斑病菌产孢培养基的配方如下：每升中含有以下原料组分：甘露醇23g、蛋白胨4g、新鲜玉米叶50g、高粱粒40g、琼脂粉15g。
7.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(5)中添加粗毒素的玉米花药愈伤组织诱导培养基获得方法如下：在通用培养基W14基础上，添加以下组分：
步骤(2)获得的粗提毒素混合物加入量：0.8-1.2ml/L，其中粗提毒素中大斑病菌粗毒素与小斑病粗毒素质量比为1:1；甘氨酸：1.8-2.2mg/L；盐酸硫胺素加入量：7-9mg/L；酪蛋白加入量：490-510mg/L；生物素加入量：0.4-0.6mg/L；苯丙氨酸加入量：45-52mg/L；维生素B1加入量：55-65mg/L；麦芽糖加入量：25000-35000mg/L；琼脂粉加入量：4500-5500mg/L；调整诱导培养基pH值为5.5-6.5。
所述通用培养基W14的配方如下所示：硝酸钾：2000mg/L，磷酸二氢氨：380mg/L，氯化钙：140mg/L，硫酸镁：200mg/L，硫酸钾：700mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：8mg/L，硫酸锌：3.0mg/L，硼酸：3.0mg/L，碘化钾：0.5mg/L，钼酸钠：0.005mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。
8.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(5)中花药愈伤组织分化培养基的获得方法如下：以通用培养基Ms为基础，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：50mg/L，蔗糖：30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整分化培养基pH值为5.6-6.0；
所述的通用培养基Ms配方如下：硝酸钾：1900mg/L，硝酸氨：1650mg/L，氯化钙：440mg/L，硫酸镁：370mg/L，磷酸二氢钾：170mg/L，硫酸亚铁：27.8mg/L，乙二酸四乙钠：37.3mg/L，硫酸锰：22.3mg/L，硫酸锌：8.6mg/L，硼酸：6.2mg/L，碘化钾：0.83mg/L，钼酸钠：0.25mg/L，硫酸铜：0.025mg/L，氯化钴：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L。
9.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(5)所述诱导生根壮苗培养基的获得方法为：以1/3通用培养基MS为基础，即Ms各原料的1/3用量，添加以下物质：α-萘乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，蔗糖30000mg/L；琼脂粉：5000mg/L；调整生根壮苗培养基pH值为5.6；所述的通用培养基Ms配方如权利要求8所述。
10.根据权利要求1所述的抗叶斑类病害的玉米育种方法，其特征在于，步骤(6)所述营养钵的配料包含：尿素、磷酸氢二铵、硫酸钾、硫酸锌、生根粉、阳离子交换树脂，营养钵形状为圆柱形，直径6～10cm，高8～12cm，重50～60g，用模具压制成型。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117461557A (zh) * 2022-07-21 2024-01-30 北京市农林科学院 一种玉米单倍体高效加倍的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101558735A (zh) * 2009-06-03 2009-10-21 西北农林科技大学 小麦抗条锈多基因聚合的花培育种新方法
CN104969856A (zh) * 2015-07-10 2015-10-14 乔保建 一种小麦抗赤霉离体定向选择育种方法
CN105925522A (zh) * 2016-07-19 2016-09-07 福建省农业科学院植物保护研究所 一种玉米大斑病菌产孢培养基及其应用
CN106171958A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 江苏强农农业技术服务有限公司 一种小麦赤霉病抗病育种方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101558735A (zh) * 2009-06-03 2009-10-21 西北农林科技大学 小麦抗条锈多基因聚合的花培育种新方法
CN104969856A (zh) * 2015-07-10 2015-10-14 乔保建 一种小麦抗赤霉离体定向选择育种方法
CN106171958A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 江苏强农农业技术服务有限公司 一种小麦赤霉病抗病育种方法
CN105925522A (zh) * 2016-07-19 2016-09-07 福建省农业科学院植物保护研究所 一种玉米大斑病菌产孢培养基及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
河北省保定农业学校: "《植物病理学》", 31 October 1993, 农业出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117461557A (zh) * 2022-07-21 2024-01-30 北京市农林科学院 一种玉米单倍体高效加倍的方法

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