JPH08149934A - シイタケ新品種の育種法およびシイタケ新品種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】シイタケ親株の優良な形質を損なうことなく、
新たに優良な形質を獲得したシイタケ新品種、特に胞子
形成能の少ないシイタケ新品種を得る。 【構成】シイタケの組織を細胞壁溶解酵素を用いてプロ
トプラスト化し、無核プロトプラスト画分Ａと有核プロ
トプラスト画分Ｂを得、該Ａを人工変異処理した後該Ｂ
とプロトプラスト融合処理し、該融合株から優良品種を
選抜する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シイタケ新品種の育種
法並びにその育種法により得られたシイタケ新品種、特
に胞子形成能の少ないシイタケ新品種に関する。

【０００２】

【従来の技術】キノコ栽培において、キノコ子実体は成
熟に伴い胞子が生成され、やがて地上に落下したり、空
気中に飛散して、その一部は隣接するホダ木や菌床等の
培養基や周囲の培養施設等に付着するが、胞子は栄養に
富んでいるので、これが付着した培養基や培養施設は汚
染菌が着き易く、汚染の原因となり、また他の一部は空
気中に飛散するため栽培者にとって「キノコ栽培者肺」
のアレルゲンとして嫌われている。

【０００３】エノキタケ、ヒラタケ、ナメコ栽培におい
ては、子実体が成熟前に収穫することが多いため胞子の
飛散はそれほど問題にはならないが、シイタケ栽培にお
いては、子実体がある程度成熟してから、例えば被膜が
切れる前後ないし切れた後に収穫されるので胞子の飛散
を防止することが非常に難しい問題を有している。

【０００４】従来、キノコの菌糸体、分裂子、胞子、ま
たはプロトプラストをジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤
で処理した後、培養および栽培し子実体を形成させ、胞
子形成のない又は少ないキノコを育種する方法（特開平
４−１０４７４４）あるいは放射線照射、紫外線照射等
の物理的変異処理や、化学的変異処理剤の使用により胞
子形成能の少ないウシグソヒトヨタケ（菌蕈研究所研究
報告 ９、２１〜３５、１９７１））やヒラタケ（マッ
シュル−ムサイエンス１３、５５５〜５５９、１９９
１）を育種する方法が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、子実体
の形成には非常に多くの遺伝子が深く関与し、それらの
全ての遺伝子が正常に作用するこが必要であり、従って
幾つかの遺伝子に傷害があると正常な子実体が形成され
にくいことが知られている。従来の人工変異処理は胞子
形成を担う遺伝子ばかりでなく他の多くの遺伝子にもダ
メ−ジを与えてしまうため、胞子形成能のない又は少な
いキノコを育種することは可能であっても、正常な子実
体は得にくい欠点を有する。特に日本の市場において
は、形状、大きさ、色合、香り等を尊重する傾向が強い
ため、少しでも異常のある子実体は商品価値が低く、敬
遠されがちである。一方、ヤナギマツタケやシイタケの
形態変異株より胞子形成能の少ないものを選抜する方法
（マッシュル−ム・バイオロジ−・アンド・マッシュル
−ム・プロダクツ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１９
９３、Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ ＨｏｎｇＫｏｎｇ、６３〜６９ペ−ジ参
照）、（特産情報 農村文化社発行、１９９４年８月
号、５６〜５７ペ−ジ参照）も知られているが、形態変
異を克服し、正常な形態の子実体が収穫できる品種に改
変しなければ、産業上優良品種として使用することはで
きない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は形態
変異を伴うことなく、胞子形成能の少ないシイタケ新品
種を育種することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、キノコの
細胞には核に大部分の遺伝子をもつ染色体があるが、細
胞質のミトコンドリア等にも一部の遺伝子が存在し、種
々の細胞機能の調節に関与しているものと推定し、シイ
タケ親株の組織を細胞壁溶解酵素を用いてプロトプラス
ト化し、無核プロトプラスト画分Ａと有核プロトプラス
ト画分Ｂを得、無核プロトプラスト画分Ａを人工変異処
理して、細胞質の遺伝子のみを特異的に変異させた後、
有核プロトプラスト画分Ｂとプロトプラスト融合処理
し、それにより得られた融合株の子実体形成能と胞子形
成能を調べたところ、前記親株の優れた形質をそのまま
保持し、しかも胞子形成能の非常に少ないシイタケ新品
種が得られることを発見し、この知見に基づいて本発明
を完成した。

【０００８】即ち本発明は、シイタケの組織を細胞壁溶
解酵素を用いてプロトプラスト化し、無核プロトプラス
ト画分Ａと有核プロトプラスト画分Ｂを得、該Ａを人工
変異処理した後該Ｂとプロトプラスト融合処理し、該融
合株から優良品種を選抜することを特徴とするシイタケ
新品種の育種法であり、また本発明はこのようにして得
られたシイタケ新品種であり、また本発明は本文で規定
した「胞子数３×１０⁷以下／ｃｍ²胞子紋」を示す胞子
形成能の少ないシイタケ新品種である。

【０００９】以下本発明を詳細に説明する。本発明で用
いるシイタケの組織としては、野性シイタケ品種および
在来の栽培シイタケ品種の、菌糸体、胞子、あるいは子
実体組織の一部等が挙げられる。そして、本発明では、
親株の形質は殆どそのまま受け継ぎ、さらに新しい優良
形質を獲得したシイタケ新品種が育種されるので、初発
のシイタケ親株として優良品種を選定するとさらに好ま
しい形質を獲得したシイタケ新品種を育種できるので好
ましい。

【００１０】本発明においてシイタケの菌糸体を得る方
法としては、シイタケ菌が必要とする栄養源を含む液体
栄養培地、固体栄養培地にシイタケ菌を接種培養し、該
培養物より菌糸体を分離することにより行われる。

【００１１】その液体栄養培地としては、例えば麦芽エ
キス１％、酵母エキス０．４％、グルコ−ス０．４％を
含む培地、この他ツアペツク培地、ポテト−ブドウ糖培
地などが挙げられる。また炭素源として可溶性澱粉、シ
ュークロース、デキストリン、セルロース、グリセリ
ン、醤油油など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵
母エキス、大豆粉、ヌカ、フスマ、カゼイン、ポリペプ
トン、グルテンなど、無機塩として各種リン酸塩、硫酸
塩、塩酸塩など、さらに必要によりビタミン類、核酸な
どを適宜加えた、合成培地、半合成培地を用いてもよ
い。

【００１２】また固体栄養培地としては、樹脂分が少な
くシイタケにより分解され易いクヌギ、コナラ、シイ、
ブナ、シラカバ、マカバ、ダテカンバなどの広葉樹由来
の原木（ホダ木）、あるいはその原木から得られたオガ
コに、米糠、フスマ、コ−ンコブ、コーンブラン、ビー
ル酵母、ビートパルプ等の栄養剤、あるいは市販の培地
栄養剤などを単独あるいは二種以上を混合し、これに加
水しシイタケ菌糸の生育に好適な水分に調整した人工培
養基、あるいは小麦、トウモロコシ、粟、稗等の穀類を
粉砕した後に加水し水分を調整した天然培地が挙げられ
る。

【００１３】液体培養は、１５〜３０℃、好ましくは２
２〜２６℃で、２〜７日間静置培養、振盪培養、または
通気培養等の好気的培養を行う。固体培養は、１５〜３
０℃好ましくは２２〜２６℃で１０〜３０日間培養す
る。

【００１４】そして、液体培養物から菌糸体を得るに
は、該培養物をガ−ゼ、綿等のメッシュで濾過するかま
たは遠心分離して、培養菌糸体を集める。固体培養物か
ら菌糸体を得るには、該培養基の表面に形成された菌糸
塊をナイフ等で切取り採取する。

【００１５】また胞子、あるいは子実体組織の一部を得
る方法としては、子実体の表面を火炎で軽く炙って殺菌
をした後、柄、傘の一部をナイフで切り取り、また胞子
を無菌的に採取する。

【００１６】次にシイタケ組織からプロトプラストを得
るには、上記組織に予め無菌処理した細胞壁溶解酵素を
添加し、処理する。

【００１７】細胞壁溶解酵素としては、シイタケの細胞
壁を溶解する活性を有するものであればいずれを用いて
もよい。例えばβ−１，３−グルカナ−ゼおよびキチナ
−ゼが挙げられる。また二つの酵素活性を同時に有する
市販酵素を用いてもよい。これらは単独で使用してもよ
いが、二つの酵素を併用するときは、シイタケのプロト
プラストの形成率を著しく高めることができるので好ま
しい。

【００１８】β−１，３−グルカナ−ゼとしては、同活
性を有する酵素剤、例えばキリンビール社製ザイモリア
−ゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）、ノボノルディスク社製ノ
ボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）２３４、近畿ヤクルト社
製セルラ−ゼオノズカＲ１０、同ＲＳ、同Ｐ１５００、
同３Ｓ、協和醗酵工業社製ドリセラ−ゼ、明治製菓社製
メイセラ−ゼ、協和化成社製ウスキザイム及びシグマ社
製グルクロニダ−ゼ等が挙げられる。

【００１９】キチナ−ゼとしては同活性を有する酵素
剤、例えばシグマ社製キチナ−ゼＣ１５２５、同Ｃ１６
５０、同Ｃ６１３７、米国ＩＣＮ社製キチナ−ゼ、生化
学工業社販売キチナ−ゼ、ノボノルディスク社製ノボザ
イム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）２３４、近畿ヤクルト社製セ
ルラ−ゼオノズカＲ１０、同ＲＳ、同Ｐ１５００、同３
Ｓ、協和醗酵工業社製ドリセラ−ゼ、明治製菓製メイセ
ラ−ゼ、協和化成社製ウスキザイム及びシグマ社製グル
クロニダ−ゼ等が挙げられる。またトリコデルマ属微生
物例えばトリコデルマハルチアナムＣＢＳ３５４．３３
を乾燥シイタケ粉末を含む液体栄養培地で培養し、培養
濾液から調製した粗酵素剤を用いることもできる。この
粗酵素剤はβ−１，３−グルカナ−ゼ活性と共にキチナ
−ゼ活性を含有しているので好ましい。

【００２０】細胞壁溶解酵素を用いて、シイタケの細胞
壁を溶解するには、公知の手段により行なうことができ
る（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１６４
９〜１６５６，１９８７及び遺伝 ４２（９）３０〜３
５，１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７
３，１３〜２２，１９７２参照）。そして、細胞壁溶解
酵素の使用濃度は、シイタケの組織を溶解し、完全なプ
ロトプラストを得るのに十分な濃度とすることが好まし
い。β−１，３−グルカナ−ゼとしてセルラ−ゼオノズ
カＲ−１０を使用する場合その濃度は１０〜５０ｍｇ／
ｍｌ、特に２０〜３０ｍｇ／ｍｌが好ましい。またキチ
ナ−ゼとしてシグマ社製キチナ−ゼｃ６１３７を使用す
る場合、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、特に２〜６ｍｇ／ｍｌが
好ましい。

【００２１】酵素処理の時間は、シイタケの細胞壁を溶
解しプロトプラストを得るのに十分な時間とすることが
必要で、静置または非常にゆるい攪拌または振盪条件下
で通常３０分〜６時間が好ましい。

【００２２】またｐＨは５．０〜６．５、特に５．５〜
６．０が好ましい。

【００２３】なお、上記溶解反応は、等張液内において
行なう必要がある。等張液としては、塩化ナトリウム、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、マンニト−ル、ソル
ビト−ル、イノシト−ル、硫酸アンモニウム、塩化カル
シウム、ソルボ−ス等の単独または併用で０．２Ｍ〜
１．２Ｍ溶液が用いられる。

【００２４】酵素処理が終了したら、プロトプラストを
保護する洗浄液、即ち上記等張液で、プロトプロストを
洗浄し、シイタケの細胞壁が溶解除去されたプトロプラ
ストを得る。上記プロトプラスト化の処理により、二核
と細胞質全部を含む完全なプロトプラスト（イ）、細胞
質の一部を欠失した二核のプロトプラスト（ロ）、細胞
質の一部と一つの核を欠失した一核性のプロトプラスト
（ハ）、或いは二核とも欠失した細胞質のみを含むプロ
トプラスト（ニ）が得られる。これらの４種類のプロト
プラストは混合状態で存在する。本発明では上記イ〜ハ
をまとめて有核プロトプラスト画分Ｂ、またニを無核プ
ロトプラススト画分Ａという。

【００２５】次に、プロトプラスト化されたものから、
プロトプラストを集菌するには、プロトプラスト化処理
液をガ−ゼ、サラシ布、メッシュ布、ガラスフィルタ−
（Ｇ１またはＧ２）等で濾過し、濾液そのままか、好ま
しくはこれに上記等張液のうち比較的低比重の等張液
（塩化ナトリウム、塩化カリウム溶液等）を加え、遠心
分離して集菌し、沈殿としてプロトプラストを得る。あ
るいはプロトプラスト化処理液を予め目の粗いメッシュ
で菌糸片、夾雑物を除去し、次いで目の細かいメッシュ
またはグラスフィルタ−でプロトプラストを集菌する方
法も挙げられる。

【００２６】次に集菌されたプロトプラストから、無核
プロトプラスト画分Ａと有核プロトプラスト画分Ｂを分
離するには、プロトプラストの比重差を利用し、シュ−
クロ−ス、パ−コ−ル、フィ−コ−ル、塩化セシウム等
の比重調整化合物の溶液を用いる密度勾配遠心分離法、
特に非連続密度勾配遠心分離法で行なう。非連続密度勾
配遠心分離法では、上記化合物を種々の割合で添加溶解
して比重の異なる液を少なくとも二種類調製し、これら
を層状に遠心管に分注して密度勾配を作成し、上記プロ
トプラストをのせた上で１００，０００ｇ以下、好まし
くは５，０００〜２０，０００ｇの遠心力を５〜６０分
間かけて比重差による分離を行なう。具体的には、少な
くとも二つの比重差の溶液を用意し、下層は比重が１．
０３以上の溶液を用い、上層にはそれより軽い比重のも
のを用いる。遠心分離操作により分離した軽比重領域
（上層）の画分を回収すると無核プロトプラスト画分Ａ
が効率よく選択分離され、重比重領域（下層）及び該中
間比重領域（両層の境界領域）の画分を回収すると、有
核（一核および二核）プロトプラスト画分Ｂを効率よく
選択分離することができる。

【００２７】無核プロトプラスト画分Ａの変異処理は、
周知の突然変異処理、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、放
射線照射などの物理的変異処理、エチルメタンスルフォ
ン酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン等の突然変異誘起剤との接触処理（化学的変異処
理）を行なう。そして、この処理は通常の変異処理より
も弱め（即ち、有核プロトプラストを用いたときの致死
率１０％以下となるような条件）に行い、変異を最小限
に止めるようにすることが好ましい。

【００２８】次に上記で調製された無核プロトプラスト
画分Ａを人工変異処理した後有核プロトプラスト画分Ｂ
とプロトプラスト融合処理する。該融合処理は、ポリエ
チレングリコ−ル、デキストラン等の化学的融合促進剤
と共にカルシウムまたはマグネシウムの存在下で、無核
プロトプラスト画分Ａと有核プロトプラスト画分Ｂとを
懸濁（接触）し、２０〜３０℃で５分以上、好ましくは
１０〜４０分保持してプロトプラスト融合処理を行な
う。あるいは、等張液中において、人工変異処理した無
核プロトプラスト画分Ａと有核プロトプラスト画分Ｂを
懸濁し、常法により電気的プロトプラスト融合処理を行
なう。

【００２９】こうして得られた融合株の再生は、プロト
プラストを保護しつつ細胞壁を再生することが可能な等
張再生アガロース培地（例えば０．７〜１．５Ｍのソル
ビト−ルまたはマンニト−ルを含む等張再生培地に低融
点アガロ−ス０．５〜２．０％含有させた培地（ｐＨ
６．５））を用いて該融合プロトプラストを適宜の濃度
に希釈し、これをプロトプラストを保護しつつ細胞壁を
再生することが可能な等張再生寒天培地（例えば０．７
〜１．５Ｍのソルビト−ルまたはマンニト−ルを含む等
張再培地に寒天１．０〜２．０％含有させた培地）上に
重層し、２０〜２５℃で、５〜１５日培養し、再生して
くるコロニ−を分離する。

【００３０】該融合株は、二核を有するものと一核を有
するものが混在しているが、一般に二核菌糸は一核菌糸
に比べて生育が早いので、その性質を利用しておおよそ
の二核菌糸の見分けが可能であるが、正確には顕微鏡で
菌糸を観察し、クランプコネクション（Ｃｌａｍｐ Ｃ
ｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）の有る二核菌糸と、それが無い一
核菌糸とに分別する。二核菌糸は、このまま、または必
要により等張再生寒天培地で生育の良いものを選別した
後、オガコでの栽培試験を行い、形態学性質（子実体の
形状、色相、胞子着生度、大きさ等）及び生理学的性質
（生育速度、耐寒性、発生時季、栽培特性）等の特徴を
把握し、親株とは異なる優良形質を獲得した株を分離す
る。一核菌糸については、このまま、または必要により
等張再生寒天培地で生育の良いものを選別した後、栄養
寒天培地に対峙培養（二菌株を相互に対峙して培養す
る）して交配する。この結果、当初顕微鏡下で一核菌糸
であったものから、交配後クランプコネクションを有す
る二核菌糸のものが分離されるようになる。この二核菌
糸は、上記と同様に栽培試験を行い親株とは異なる優良
形質を獲得した株を分離する。

【００３１】本発明によれば親株の優良形質を殆どその
まま受け継ぎ、しかも新しい優良な形質を獲得したシイ
タケ新品種を育種することができる。例えば、胞子形成
能の非常に低いシイタケ新品種を育種することができ
る。本発明により育種されたシイタケ新品種Ｌ１１６３
株はレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄ
ｏｄｅｓ）Ｌ１１６３と表示し、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４６５９として、また
育種されたシイタケ新品種Ｌ１２５５株はレンチヌラ・
エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）Ｌ１２
５５と表示し、同研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４６６０と
して寄託されている。またそのシイタケ親株であるＬ５
０６株は、レンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ
ｅｄｏｄｅｓ）Ｌ５０６と表示し、同研究所にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４６５８としてそれぞれ寄託されている。

【００３２】次に、本発明で育種された二つのシイタケ
新品種およびそのシイタケ親株の菌学的性質について述
べる。まずＰＤＡ培地における形態学的性質を表１に示
す。

【００３３】

【表１】

【００３４】次に麦芽汁寒天培地における形態学的性質
を表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】次にツアペツクにおける形態学的性質を表
３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】次に生理学的性質を表４に示す。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【本発明の効果】本発明によれば、シイタケ親株の有す
る優良な形質は損なうことなく、新たに優良な形質を獲
得したシイタケ新品種を育種することができる。胞子形
成能の非常に低下したシイタケ新菌株が全体の３％の確
立で育種することそして特に、通常のシイタケ菌株に比
べて胞子形成能が十分の一以下と非常に低下したシイタ
ケ新品種を育種することができる。そして本発明により
得られた胞子形成能の低下した新品種は、膜の切れる前
後の適期に収穫した子実体の膜切れが遅く、親株に比べ
て色沢、形状が良好で肉厚なものの割合が非常に高い特
徴を有している。即ち、本発明により育種されたレンチ
ヌラ・エドデスＬ１１６３およびレンチヌラ・エドデス
Ｌ１２５５は、ヒダを覆う膜が切れても数日間は胞子を
形成せずその後若干の胞子を形成するが、膜が切れる前
後で子実体を収穫する通常の栽培においては、良い管理
さえすれば胞子の害は全くない。レンチヌラ・エドデス
Ｌ１１６３およびレンチヌラ・エドデスＬ１２５５は、
対峙培養法、アイソザイム分析、不和合性因子、遺伝子
指紋法などにより特定できる特徴を有する。

【００４１】

【実施例１】（親株の分離法）野性シイタケ（子実体）
を日本各地より採集し、新鮮なうちにその表面を軽く火
炎に当てて殺菌し、これより無菌処理したナイフにて傘
肉組織を分離し、平板栄養寒天培地（ＰＤＡ培地）上に
載せ、室温にて５〜１０日培養し、コロニ−を得、無菌
的に分離されたことを確認する。次いでこのコロニ−の
周縁部より一部の菌体を寒天と共に切り出し、斜面栄養
寒天培地（ＰＤＡ培地）に載せ、室温にて５日以上培養
して、純粋分離親株を得た。次に、この菌株を予め本培
養オガコ培地と同組成の培地５０ｇに接種し、無菌的条
件下で２３℃で２５日間前培養した。次に、この前培養
物全量を本培養オガコ培地（１００ｇ当たり、オガコ３
０ｇ（乾物重量）、米糠４ｇ（同）、小麦ふすま４ｇ
（同）、水分６２％（重量）を混合、殺菌、放令した培
地）（以下、菌床ということがある）１．８５ｋｇに混
和し、次いでこれを通気性処理を施したポリエチレン製
フィルムの袋に詰め、初期培養（室温２０℃、湿度６０
％、１５日間）次いで熟成培養（室温２３℃、湿度８０
％、２．５か月）を行なった。次に、熟成した菌床を袋
から取出し、１０〜１５℃の水に１２時間浸漬して芽出
し操作を行なう。次いで、これを発生室（１７℃、湿度
９０％）に移し２５日間発生と収穫を行なった。この芽
出し操作と発生と収穫の操作を合計７回繰り返した。以
上の栽培試験の結果、品質及び収量とも非常に優れたシ
イタケ菌親株Ｌ５０６を得た。

【００４２】（プロトプラスト化処理）（本処理及びこ
れに続く全ての操作は無菌的条件下において行った）シ
イタケ菌親株Ｌ５０６を液体栄養培地１００ｍｌ（麦芽
エキス１ｗ／ｖ％（以下％はｗ／ｖによる）、酵母エキ
ス０．４％、グルコ−ス０．４％からなる液体栄養培
地）に接種し、２５℃で４日間振盪培養し、ガ−ゼで濾
過し、等張液ａ（０．５Ｍの硫酸マグネシウムを含有す
る０．０５Ｍのマレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５））で洗浄し、ガ−ゼ上に菌糸体を得る。
該菌糸体を細胞壁溶解酵素溶液（２．５％セルラ−ゼオ
ノズカＲ１０（近畿ヤクルト社）、０．２％キチナ−ゼ
Ｃ６１３７（シグマ社）、等張液ａ）中で、３０℃で４
時間、ゆっくり振盪してプロトプラストを遊離させた。
これをガ−ゼで濾過して、プロトプラストを濾液中に回
収し、これに３倍量の等張液ｂ（０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する０．０５Ｍマレイン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．５））を加え、２００ｇで１０分間遠
心分離し、プロトプラストを高濃度で含有する沈殿区分
を得た。

【００４３】（プロトプラストの分画）上記プロトプラ
スト区分を等張液ｃ（０．３Ｍシュ−クロ−スを含有す
る、０．０５Ｍマレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５））に懸濁する。また、等張液ｄ（０．５
Ｍシュ−クロ−スを含有する、０．０５Ｍマレイン酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））を調製する。
次いで、この等張液ｄを半分満たした遠心チュ−ブの上
に、上記プロトプラストの懸濁液を重層し、１０，００
０ｇで１０分間遠心分離する。この結果、プロトプラス
トが遠心により、より比重の重いプロトプラスト（有核
プロトプラスト）はより下層に移動するが、反対に比重
の軽いそれ（無核プロトプラスト）はそのまま上層に停
滞する。即ち、上層（０．３Ｍシュ−クロ−ス区分：等
張液ｃの区分）に停滞する無核プロトプラスト画分と、
中下層（等張液ｃ区分とｄ区分の境界領域＋０．５Ｍシ
ュ−クロ−ス区分：等張液ｄ区分）に移動した有核プロ
トプラスト画分とが得られる。そして、別々にピペット
で回収し、２つの区分を得、各区分に５倍量の等張液ｂ
を加え、２００ｇで１０分間遠心分離し、それぞれ沈殿
物として無核プロトプラスト画分Ａと、プロトプラスト
画分Ｂを得た。これらの画分の一部を取り顕微鏡観察の
結果、Ａは大部分が核をもたないが、細胞質と細胞膜よ
りなるプロトプラスト様の構造体、Ｂは大部分が一つま
たは二つの核を持つプロトプラストであることが確認さ
れた。

【００４４】（プロトプラスト画分Ａの変異処理）プロ
トプラスト画分Ａを等張液ｂに懸濁し、１５ワット紫外
線殺菌灯下４５ｃｍ、１０分間照射処理した後２００ｇ
で１０分間遠心分離し、沈殿を得、変異処理プロトプラ
スト画分Ａを得た。

【００４５】（変異処理プロトプラスト画分Ａとプロト
プラスト画分Ｂのプロトプラスト融合）変異処理無核プ
ロトプラストが約１０⁷個、有核プロトプラストが約１
０⁶個となるように、血球計にて濃度を測定しつつ、そ
れぞれのプロトプラストを等張液ｂに懸濁した。次い
で、２００ｇで１０分間遠心分離して、プロトプラスト
の沈殿を得、これに１ｍｌの３０％ポリエチレングリコ
−ル６０００・３０ｍＭ塩化カルシウムを加え、ゆるや
かに混合後室温で２０分間放置して融合して、融合処理
プロトプラストを得た。

【００４６】（二核菌糸の分離と選定）溶解後３７〜４
０℃の範囲まで冷却した７ｍｌ等張再生アガロ−ス培地
（麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％、グルコ−ス
０．４％、リン酸一カリウム０．５％、マンニト−ル
９．１％、アガロ−ス（シグマタイプ７）０．７％）を
用いて、融合処理プロトプラストを適宜希釈して、融合
処理プロトプラスト濃度のそれぞれ異なる希釈液を調製
した。一方、予め直径９ｃｍのシャ−レの上に等張再生
寒天培地１０ｍｌ（上記アガロ−ス栄養培地に於いて、
アガロ−ス０．７％の代わりに１．５％の寒天を用いる
以外は同様に調製したもの）を調製し、室温まで冷却し
た。この等張再生寒天培地に上記で得られた融合処理プ
ロトプラスト調製液をできる限り速やかに注入して重層
し、固まらせた。これを２５℃で培養し、生育してきた
コロニ−のうち、隣のコロニ−と重ならないものを選択
して分離した。上記分離菌を顕微鏡観察し、クランプの
ある二核菌糸と、クランプの無い一核菌糸に分けた。二
核菌糸は、ＰＤＡ培地において生育の良い順に１００株
選定した（以下選定株という）。クランプの無い一核菌
糸はＰＤＡ培地において生育の良い順に３０株選定し、
相互交配を行い、交配で形成された二核菌糸を得、その
ＰＤＡ培地での生育の良い順に選定株、１００株を得
た。

【００４７】（本培養オガコ培地での栽培試験）本培養
オガコ培地１００ｇ中オガコ３０ｇ（乾物重量）、米糠
４ｇ（同）、小麦ふすま４ｇ（同）、水分６２％（重
量）を混合、殺菌放冷後同培地で前培養した上記選定株
を無菌的に混合接種した。次いでその１．９ｋｇづつを
通気性処理を施したポリエチレン製の袋に詰め、初期培
養（室温２０℃、湿度６０％、１５日間）、さらに熟成
培養（室温２３℃、湿度８０％、２．５か月間）を行っ
た。次に、熟成した菌床を袋から取出し菌床を芽出し
（浸水１０〜１５℃、１２時間）と、発生操作（１７
℃、湿度９０％、２５日間）を７回繰返し、収穫した子
実体を全国統一規格による規格別に記録した（総収穫期
間６か月）。そして、膜切れの前後の適期に収穫した子
実体のうち、色沢、形状が良好で、肉厚なもの、即ちＡ
品の割合（％）について調べた。この結果を表５に示
す。但し、収量は７００ｇ／菌床以上でしかも品質はＡ
品率が８０％以上である品種を「優良」とした。

【００４８】

【比較例１】また比較のため、シイタケ菌親株Ｌ５０６
の胞子を無菌的に採取して、蒸留水に懸濁希釈して、Ｐ
ＤＡ培地に塗布（接種）し、室温で５〜１０日間培養
し、生じたコロニ−を分離し、顕微鏡でクランプコネク
ションの無い一核菌糸を確認し、これを分離することに
より、一核を有する菌糸体を得る。次いで、この一核菌
糸体を他の一核菌糸体と対峙培養することにより、交配
し、顕微鏡下で観察し、二核を有する菌糸体を分離し、
ＰＤＡ培地で生育の良い順に２００株選定した。この二
核を有する菌糸体についても同様に栽培試験を行なっ
た。その結果を併せて表５に示した。

【００４９】

【表５】 育種法の違いと、そのシイタ
ケ栽培結果

【００５０】（胞子数の測定）本文いう「胞子形成能」
とは、被膜が切れ始めてから１日以内の子実体を、１試
験区当り２０個採取し、各子実体の被膜と柄を取り除
き、ガラスシャ−レ上に子実層托を下向きにして置き、
蓋をし、５℃で４日間放置して該ガラスシャ−レ上に胞
子紋を形成させた。次いで胞子紋の面積を測定した後該
シャ−レの胞子を水で懸濁し、血球計にて胞子数を数
え、胞子紋の面積で除して胞子紋１ｃｍ²当りの胞子数
を算出し、２０試験区のうち最大値をその子実体の胞子
形成能として示した。

【００５１】表５の結果から、品質と収量の共に優良な
品種は本発明法及び比較例において得られるが、胞子形
成能が低下した株は、比較例では得ることができないこ
とが判る。本発明法においては、胞子形成能が低下した
株が一定の頻度で得られ、また品質と収量の共に優良
で、しかも胞子形成能の低下した株が得られることが判
る。上記で得られた２株を、それぞれレンチヌラ・エド
デス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）Ｌ１１６３
及びレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄ
ｏｄｅｓ）Ｌ１２５５と命名した。

【００５２】

【実施例２】（シイタケの本培養オガコ培地での栽培試
験）上記実施例１において分離したシイタケ親株Ｌ５０
６、育種されたＬ１１６３及びＬ１２５５を上記実施例
１における本培養オガコ培地での栽培試験と全く同様に
して栽培試験を実施した。但し、一試験区分当たり２０
の菌床を用いた。そして、一菌床当りの平均収量、２０
菌床から収穫された子実体のＡ品率及び標準的な子実体
２０個のそれぞれについての胞子形性能を調査した。な
お、胞子形成能の結果は、各シイタケ子実体の最大値を
示した。その結果を表６に示す。

【００５３】

【表６】

【００５４】表６の結果から、育種菌Ｌ１０５２と育種
菌Ｌ１０５３は平均収量が、親株Ｌ５０６よりも優れて
おり且つＡ品率も格段に優れ、しかも胞子形成能が非常
に低下しており、ハウス栽培に非常に適していることが
判る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シイタケの組織を細胞壁溶解酵素を用い
   てプロトプラスト化し、無核プロトプラスト画分Ａと有
   核プロトプラスト画分Ｂを得、該Ａを人工変異処理した
   後該Ｂとプロトプラスト融合処理し、該融合株から優良
   品種を選抜することを特徴とするシイタケ新品種の育種
   法。
2. 【請求項２】 シイタケの組織を細胞壁溶解酵素を用い
   てプロトプラスト化し、無核プロトプラスト画分Ａと有
   核プロトプラスト画分Ｂを得、該Ａを人工変異処理した
   後該Ｂとプロトプラスト融合処理し、該融合株から優良
   品種を選抜してなるシイタケ新品種。
3. 【請求項３】 シイタケ新品種が、本文で規定した「胞
   子数３×１０⁷以下／ｃｍ²胞子紋」を示す胞子形成能の
   少ない請求項２に記載のシイタケ新品種。
4. 【請求項４】 シイタケ新品種が、レンチヌラ・エドデ
   スＬ１１６３である請求項３に記載のシイタケ新品種。
5. 【請求項５】 シイタケ新品種が、レンチヌラ・エドデ
   スＬ１２５５である請求項３に記載のシイタケ新品種。