JPH0434395B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は培地にアガロースを使用して原形質か
ら形成した植物細胞を培養または増殖するための
下記に述べる方法に関する。 世界人口の急激な増加により、有用な植物の繁
殖は生物学研究の主要な焦点である。一方では、
食料、エネルギー及び原材料の代替再生可能源に
対する研究がある。例えば、新しい植物種、とく
に病原菌（例えば植物病原昆虫、真菌、細菌、ビ
ールスなど）、環境の影響または位置の条件（例
えば熱暑、寒冷、風、土壌条件、湿気、乾燥な
ど）に対する抵抗が増加したような有用な性質を
有するまたは葉、種子、塊茎、根、柄などでの保
存または貯蔵物質の形成が増加したハイブリツド
（hybrid）種である。他方、有用なバイオマス
（biomass）に対する必要性の増大に加えて、製
薬的に許容しうる植物起源の有効成分及びその誘
導体、例えばアルカロイド、ステロイドなどに対
しての必要性も増加している。そして天然原料か
らの収量が低いため、それらは代替方法たとえば
遺伝子操作された植物種からの抽出によりしだい
に入手可能になつてきている。 したがつて、多数の植物種を選択的に操作する
ことの実務上の可能性に対する関心が増してい
る。 高等植物の分離した分化全能細胞はポリマーを
含む培地中または培地上で胚細胞集合体そしてあ
る場合には生育できる（Viable）植物及び繁殖
できる植物を生産することを誘起できることは公
知である。しかしながら、比較的堅い細胞壁は通
常、細胞融合または遺伝子移植のような操作でほ
とんど打ち勝てない障壁を構成しているので、こ
れらの場合、裸の原形質を使用することが有利で
ある。そしてその原形質は酵素（ペクチナーゼ、
セルラーゼなど）の助けにより公知の方法で細胞
壁を除去することにより相当する分化全能の完全
な細胞から得られる。 今まで、植物細胞及び特殊な場合、原形質も培
養するために凝固剤として寒天が一般的に使用さ
れていた。しかしながら、寒天は大部分の原形質
タイプに対して有毒である。そしてとくに強健な
原形質が寒天中でうまく培養可能な少しの例外的
なケースのみが知られている。 この理由のため、他の有用な培地を見つけるた
めの研究が最近始まつた。他の物質の中でアルギ
ネート及び寒天が等しく良好な平板培養の性質を
有していることが見つけられた〔アダオハームバ
ナソ イー エヌ、ロスコー、デイーエツチ
（1982）、植物科学レター25：61−66（Adaoha−
Mbanaso E.N.，Roscoe，D.H.（1982），Plant
Sci.Let.25：61−66）〕。 アガロースは今まで動物細胞及び微生物を培養
するためだけに使われていた。しかしながら、植
物細胞を培養することはまつたく異なつた生理学
のために大変異なつた一群の問題を提出する。動
物細胞の培養の技術は必然的に植物細胞の増殖ま
たは植物原形質からの細胞集合体の形成に適用で
きない。 そのため、本発明の目的は、植物原形質から形
成した細胞培養物の成育のために寒天または精製
した寒天の使用から生じる困難を避けること、及
び培地の植物毒効果を避けるとともに、細胞集合
体または胚植物を培養することが可能な方法によ
り、とくに強健なタイプだけでなく、すべての原
形質タイプにも適用できる一般的な方法を提供す
ることである。この目的を本発明の方法による驚
くべき方法で達成する。 アガロースは寒天の構成成分の一つである。入
手可能な市販の寒天は、主に、中性アガロースと
多数の側基を有するイオン性アガロペクチンの混
合物からなつている。市販のアガロースは業界慣
用の方法により寒天から得られる。通常、多くの
側鎖はそのまま残しそしてゲル生成及び融点のよ
うな物理化学的性質を定める。 低い温度で融解及びゲル化するアガロースは例
えばアガロース分子にヒドロキシエチル基を導入
した後に得られる。この方法により変性したアガ
ロースをこの明細書全体を通してLMT（低温融
解）アガロースとして表わす。 驚くべきことに、寒天中の原形質から形成した
植物細胞の増殖から生じる困難、とくに原形質の
高い死滅率は寒天の代りにアガロースを使用する
ことにより実質上非常に減少または完全に除かれ
ることが現在見出された。アガロース、とくに
LMTアガロースで凝固された培地を使用するこ
とによるだけでなく、つけ加えて原形質を平板培
養した凝固培地をさらに小さい小片に切断し、そ
して所望の大きさの細胞集合体が形成するまで上
記の小片を個々にまたはグループで栄養溶液中で
培養することにより原形質から形成した細胞の増
殖を一層さらに刺激することができる。 アガロースの使用が異なつた原形質のタイプ、
とくに敏感な原形質から細胞培養物を形成する能
力を著しく増進させることができるだろうという
こと、その結果今まで培養することが可能でなか
つた原形質タイプをもまた今、細胞集合体から完
全な植物まで形成するように刺激することができ
るということは全く予期しないことであつた。 したがつて、本発明は、ａ 分離した原形質ま
たは原形質から再生させ、分離した細胞をアガロ
ース−凝固培地中または上で均一に平板培養する
こと、所望によりｂ 予備処理及び凝固されたこ
の培地を小片に切断し、そして上記の小片を液体
栄養溶液中に移すこと、そしてその細胞の集合体
が所望の大きさになるまで培養を続けることから
なる植物細胞の増殖集合体を培養する方法に関す
るものである。 この明細書を通して使われている「細胞集合
体」という語は測定できる数の植物細胞から完全
な植物までからなる培養物を意味すると理解され
たい。 本発明のとくに好ましい実施態様はａ 分離し
た原形質をアガロース−凝固培地中または上で均
一に平板培養すること、所望によりｂ 予備処理
され、凝固された培地を小片に切断し、該小片の
体積の１ないし10000倍量、好ましくは５ないし
10000倍量そして最も好ましくは20ないし100倍量
の、植物細胞を培養するのに適する液体栄養溶液
中で上記の小片を培養し、そして細胞培養物が所
望の大きさに達するまで、０ないし40℃の温度範
囲で培養を続けることからなる植物細胞の増殖す
る集合体を培養する方法である。 細胞集合体を培養するためにとくに有利な温度
範囲は12ないし30℃である。 原形質から植物を技術的及び商業的に繁殖させ
ることは非常に興味あることである。 本発明の新規な方法は次のように、微生物を再
生するために慣用的に用いられる平板培養の方法
を修整する便利な方法からなつている。即ち、公
知の方法で分離し、殺菌しそして精製した原形質
を寒天の代りにアガロースで凝固した培地中にと
り、そして前述の培地でその原形質を平板培養す
る方法を行い、その原形質を埋めたアガロース凝
固培地をさらに小さく、好ましくは同じ大きさの
小片に切断し、上記の小片を適する栄養溶液で部
分的に満した容器に単独にまたはいつしよに移植
し、所望の大きさの細胞集合体または萌芽的な生
育できる植物が形成するまで、上記の容器を所定
の温度範囲で暗所または明所の条件において一定
に振とうすることからなるものである。 細胞集合体が埋められているアガロースの小片
は、有用な天然生産物を得るために生物反応器中
での大規模培養にもつとも適している。 胚植物はとくに有用な性質を有する成熟した植
物、例えばハイブリツド植物、に生育することが
でき、そしてさらに慣用の生物学的方法により繁
殖させることができる。 本発明の、明細書において「小片」という語
は、平均断面が１ないし約100mm、好ましくは２
ないし60mm、そしてもつとも好ましくは２ないし
10mmである三次元の不規則な、または好ましくは
規則的な構造、例えば円盤、球、立方体、角柱、
円錐などを意味する。平均直径を有する球形小片
は発酵器で細胞集合体を大規模培養するためにと
くに好ましい。 本発明の方法は、とくに、手に負えないまたは
問題の原形質から、細胞集落及びその後培養物を
作るためにすべての公知の方法より効果的であ
る。それは簡単さが特徴であり、そして異なつた
系統の原形質を培養するために、及び融合及び遺
伝子操作した原形質のために使用することができ
る。この方法は、前述の有益な性質の一つまたは
それ以上を有する植物細胞を選択的に培養するの
に適している。さらに、また腫瘍組織から得られ
た原形質からの植物細胞を培養するために使用す
ることもできる。 したがつて、植物細胞または植物集落を培養す
るためのアガロースの使用が本発明の主要な特徴
である。さらに、異なつたアガロースは本発明の
方法においてそれらの使用に関する程度において
だけ異なり、そして原形質から植物細胞集落を培
養するためにはすべて寒天よりまつたくすぐれて
いるので、どのタイプのアガロースを使用するか
は重要でない。 実施例１ないし６の実験結果は、アガロースが
原形質からの植物細胞を培養するために寒天より
さらにすぐれていることを明白に表わしているけ
れども、アガロースを使用するときある種の問題
も実務上生じる。ゆえに形成の過程で細胞の集合
体は成長の進んだ段階で成長の停止を起しまたは
死さえも経験することがある。成長の停止の原因
は一種の栄養溶液の消耗といつてもよく、一方細
胞の死は細胞集合体の成長により放出された有毒
物質の増加の結果であろう。しかしながら、驚く
べきことに両方の望ましくない影響を簡単な方法
により除くことができる。原形質を平板培養した
一次アガロース−凝固培地を望ましくは同じ大き
さまたは同じ形のさらに小さい小片に切断、そし
て次いでこれらの小片を例えば、好ましくは十分
な量の適当な液体栄養溶液を含む振とう容器に移
すならば、細胞集合体が妨げられずに成長するこ
とが観察される。原形質のタイプに依存して、原
形質の平板培養後０ないし７日、通常３ないし４
日にアガロース−凝固培地を小片に切断するなら
ば、それは有利であることができる。つくばねあ
さがおのために最も良い時間は平板培養後４日目
で、タバコ及びクレピス カピラリス
（Crepiscapillaris）は３日目である。かぶの原形
質を平板培養するとき、小片にするのは最も好ま
しくはアガロースの凝固後だちに行う。 培地のための凝固剤としてのアガロースの使用
に加えて、原形質を埋めたアガロース−凝固培地
を適当な小片に切断することもまた本発明の重要
な目的を構成している。さらに本発明の目的はま
た前述の方法により作られた細胞集合体及び／ま
たは植物でもある。 細胞の成長を加速するためには、本発明の方法
で用いられる栄養溶液はまた微量の有機化合物を
含んでもよい。例えばビタミン甘蔗糖及びグルコ
ースのような炭素供給体、オーキシン及びシトキ
ニン（cytokinins）のような植物ホルモン、及び
麦芽エキスまたはやしの実の果汁のような天然抽
出物そしてもし必要なら他の有用な成分である。
培養条件例えば栄養物の温度、光の作用及び培養
の持続期間は植物種及び原形質のタイプまたは実
験の規模のようなそれぞれの条件に合わせること
ができる。 有用な原形質の培養を下記の製造例ａないしｃ
に示す。これらの例において最初の細胞培養を植
物のどんな器官または組織、例えば根、柄、葉、
花、種、花粉などからでも、また例えばカルス培
養物からも始めることができる。原形質を培養す
る技術は公知であり、そして実施例ａないしｃに
示される種に制限されるものではない。 純原形質の培養のための製造例 実施例ａ：原形質を培養するためにヒヨスチアム
ムチクス（Hyoscyamus muticus）種の補助
的栄養変異細胞系統（line）の細胞懸濁培養物を
0.25モル ソルビトール、0.0025モル 塩化カル
シウム２水塩及び0.5w／ｖ％２−（ｎ−モノホリ
ノ）エタンスルホン酸（MES）（PH5.2）中4w／
ｖ％セルラーゼ オノズカ R.10（日本国ヤクル
ト株式会社から入手可能）、及び2w／ｖ％ドリセ
ラーゼ（Driselase）〔スイス国のヘミツシユ フ
アブリツク シユバイツアーハーレ（Chemische
Fabrik Schweizerhalle）から入手可能〕の溶液
で処理する。その混合物を26℃で一晩中培養し、
次いで100μｍの金網でろ過する。そしてろ液を
同量の0.6モルのシヨ糖溶液で希釈する。希釈し
たろ液を0.16モル塩化カルシウム２水塩及び
0.5w／ｖ％MES（PH5.6）の上掛け溶液でおおう。
原形質を層の界面から集め、上掛け溶液で２回洗
浄し、そしてゲブハルト（Gebhardt）ら
〔（1981）プランタ（Planta）153：81−89〕の完
全培地B1で培養する。培地B1は栄養培地Ａとし
て下記に示される。 実施例ｂ： タバコ（Nicotiana tabacum）、系
統VR2の原形質をシリト（Shillito）ら（1981）
によりMutat.Res.81：165−175に記載されたよ
うに分離する。これらの原形質を精製するための
操作を次のように修正する。酵素溶液中での培養
に続いて半量の0.6モル シヨ糖溶液を加え、そ
してその希釈混合液を実施例ａのように塩化カル
シウムの上掛け溶液でおおう。その原形質を界面
で集めそして同じ塩化カルシウム溶液で洗浄す
る。さらに実施例ａで述べたように操作を繰り返
えしそしてその原形質を培地K3（培地Ｂとして下
記に示す）中で培養する。 実施例ｃ： アメリカ合衆国バージニア洲シヤー
ロツツビレ（Charlottesville）のエム ハンソン
（M.Hanson）から得られた半数体“ミツチエル
（Mitchell）”〔ピーエムビー ニユースレター
（PMB Newsletter），1980〕及び突然変異誘発
遺伝子つくばねあさがお〔ポトリクス アイ
（Potrykus Ｉ）（1970）ツエツト プフランツエ
ンチユヒトウング（Z.Pflanzen−zuchtuug）
63：24−40〕の２種のつくばねあさがおハイプリ
ダ（hybrida）の系統の原形質の分離。若く、十
分に広がつた葉を0.01w／ｖ％の二塩化水銀溶液
及び100ml中にトウイーン80（Tween80）を３滴
含む溶液で殺菌しそして水で希釈した殺菌剤で５
回洗浄する。中葉肋のない半葉を６枚積み重ねそ
して浸透液（Osmoticum）（アニトール0.375モ
ル、二塩化カルシウム0.05モル、MES0.5w／ｖ
％PH5.8）で湿めらせそして５mm幅の薄い切片に
切断する。その切片を酵素溶液（前記浸透液中の
0.2w／ｖ％セルラーゼ オノズカR.10及び
0.2w／ｖ％マセロチーム（Macerozyme）溶液、
PH5.6）で減圧浸透させる。暗所にて12℃で一晩
中培養したのち、上記の浸透液１容積を加えそし
てその混合物を100μｍの網目を通しろ過する。
原形質を透過液で２回洗浄し、砕片を除去するた
めに0.6モルのシヨ糖で上掛けする。界面からの
原形質を浸透液でもう一度洗浄し、培地〔デイー
ピーデイー：ドウラント（Durant）ら（1973）、
ツエト プフランツエンヒシオール（Z.
Pflanzenphysiol）69：26−34〕26℃、暗所で１
日に12時間培養する。 下記の比較試験で報告された結果は原形質から
植物細胞集合体を培養するとき、ａ 寒天をアガ
ロースに置換することによりそしてｂ アガロー
ス−凝固培地を切断しそして振とうした液体培地
に入れることにより観察された驚くべき有利な効
果を納得させるように説明する。 培地として寒天及びアガロースの比較試験例 ａ すべての栄養溶液を0.22μｍのナルゲンフイ
ルターを通して限外ろ過することにより殺菌す
る。凝固した培地は２倍にの濃縮した栄養溶液を
２倍に濃縮しそしてオートクレーブで滅菌したゲ
ル化剤と等量混合することにより作る。 適する液体栄養液は例えば下記のＡ，Ｂ，Ｃ，
Ｄ及びＥに挙げられた培地である： Ａ 完全培地B1：ゲブハルト（Gebhardt）ら、
プランタ（Planta）、153，81〜89（1981） Ｂ K3培地：ナギー（Nagy）及びマリガ
（Malig）、ツエツト プフランツエンフイジオ
ロギー（Z.Pflanzenphysiologie）78，453〜
455（1976） Ｃ DPD培地：ドウラント（Durand）ら、ツエ
ツト プフランツエンフイジオロギー（Z.
Pflanzenphysiologie）69，26〜34（1973） Ｄ リンツマイアー、イーエム（Lindsmaier，
E.M.）及びスコーグ、エフ（Skoog，F.）の
培地、フイジオロギア プランタイム（Phy−
aiologia Plantarum）18，100〜127（1965） Ｅ ニツチ、ジエーピー（Nitsch，J.P.）及びニ
ツチ、シー（Nitsch，Ｃ）の培地、科学
（Science）163，85〜87（1969）。 使用するゲル化剤は： １ アガロース：すべての試験においてシープラ
ク エルエムテイー（Sea Plaque LMT）〔マ
リン コロイズ（Marine Colloids）〕。 〔実施例５で報告する試験においてのみ、使用
した他のアガロースをそこに特定する〕 ２ 寒天：すべての試験においてジフコ バクト
−寒天（Difco Bacto−agar）。 ３ 精製寒天：454ｇの寒天（上記２）のものと
同じ）を続けて10の水、５のアセトン及び
５のエタノールで洗浄しそして減圧下40℃で
乾燥する。白色無臭の粉末を得る。 実施例ａないしｃで得られた原形質を凝固及び
精製した培地上に薄い層でペトリ皿での慣用の平
板培養方法により平板培養する。寒天及びアガロ
ースを、特に指定した場合を除き、0.4w／ｖ％
の濃度で使用する。全量３mlまたは10mlの培地を
それぞれ６cmまたは10cmのペトリ皿に対して用い
る。 寒天またはアガロースの小片を使用する実験の
ために、培地を小片に分ける前に原形質をその培
地に均一に平板培養する。次いでその小片を直径
10cmの容器に入つた30mlの栄養溶液に入れ、そし
て回転振とう機上26℃で暗所または明所で培養す
る。液体培地は規則的な間隔でまたは絶えず取り
かえる。原形質からの細胞集落の形成についてそ
の方法の有用性及び有利な影響の顕微鏡的評価は
４ないし６週間培養したのち代表的な数のわくに
おいて細胞集合体を計数及び検査することにより
行う。小片に分ける実験において、栄養溶液に浮
いている小片を入れている皿を14日間の間隔で撮
影しそして小片中に見える細胞集合体の数及び大
きさを評価する。 β 試験結果 実施例 １：10mlの凝固培地Ｂでヒヨスチアムス
ムチクス種、系統B9（trip^-）の10⁵の細胞ま
たは原形質の平板培養から再生した細胞集合体の
数。

【表】 実施例１の結果は、細胞の培養及び原形質から
の細胞の培養の両方のために寒天よりもアガロー
スがより適していること、そして寒天がこの実験
で用いた原形質及び細胞に対して毒であることを
表わしている。この実験及び下記の実験例におい
て密度／mlは培地１ml当りの原形質または細胞の
数を意味するものと理解される。 実施例 ２：培地Ｂにおいて希釈度の増加にとも
なうタバコVR2原形質の平板培養の効率（％）

【表】 ＊＝計数に密すぎるほどの細胞の芝生

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ 分離した原形質または原形質から再生さ
   せ、分離した細胞をアガロース凝固培地中または
   上で均一に平板培養すること、所望により ｂ
   予備処理及び凝固した培地を小片に切断しそして
   上記の小片を液体栄養溶液中に移すこと、そして
   その細胞の集合体が所望の大きさになるまで培養
   を続けることからなる増殖植物細胞集合体を培養
   するための方法。 ２ ａ 分離した原形質または原形質から再生さ
   せ、分離した細胞をアガロース凝固培地中または
   上で均一に平板培養すること、所望により ｂ
   予備処理及び凝固した培地を小片に切断し、小片
   の体積の１ないし10000倍量の、植物細胞を培養
   するのに適当な液体栄養溶液中に上記の小片を入
   れること、そしてその細胞の集合体が所望の大き
   さになるまで０ないし40℃の温度範囲で培養を続
   けることからなる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 操作した原形質またはすでに再生した細胞壁
   を有する操作した原形質を使用することからなる
   特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
   記載の方法。 ４ 操作が遺伝子または小器官の移植または細胞
   融合である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 培養温度が12ないし30℃の範囲にある特許請
   求の範囲第１項ないし第４項のいずれか一項に記
   載の方法。 ６ 小片の体積の５ないし10000倍量の、植物細
   胞を培養するのに適当な栄養溶液に小片を入れる
   ことからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７ 小片の体積の20ないし100倍量の、植物細胞
   を培養するのに適する栄養溶液に小片を入れるこ
   とからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 原形質で平板培養した後、アガロース−凝固
   一次培地を０ないし７日の間隔で小片に切断する
   ことからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 平板培養の後、３ないし４日の間隔で小片に
   切断することからなる特許請求の範囲第８項記載
   の方法。 １０ 等しい大きさ及び規則的な形で１ないし
   100mmの平均直径を有する小片を使用することか
   らなる特許請求の範囲第１項ないし第９項のいず
   れか一項に記載の方法。 １１ ２ないし60mmの平均直径を有する小片の使
   用からなる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 小片が２ないし10mmの平均直径を有する円
   盤、球体、立方体、角柱または円錐である特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 植物の種（species）のタバコ
   （Nicotianatabacum）、ヒヨスチアムス ムチク
   ス（Hyo−scyamus muticus）、とまと
   （Lycopersicon esculentum）、クレピス カピラ
   リス（Cre−pis capillaris）、かぶ（Brassica
   rapa）またはつくばねあさがお（Petunia
   hybrida）から分離した原形質の使用からなる特
   許請求の範囲第１項ないし第１２項記載のいずれ
   か一項に記載の方法。 １４ シー プラク（Sea Plaque）LMT，
   LMP、タイプ ，HGT，HGTP，LE スタ
   ンダード LMTまたはシー プレプ（Sea
   Prep）のタイプのアガロースを使用することか
   らなる特許請求の範囲第１項ないし第１３項記載
   のいずれか一項に記載の方法。 １５ 原形質または再生した細胞壁を有する原形
   質を含有するアガロース−凝固小片を生物反応器
   中で大規模培養するために使用することからなる
   特許請求の範囲第１項ないし第１４項のいずれか
   １項に記載の方法。 １６ 生育できる植物（Viable plants）が発生
   するまで、培養を行うことからなる特許請求の範
   囲第１項ないし第１１項のいずれか１項に記載の
   方法。