CN111705033B

CN111705033B - 一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法

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Publication number: CN111705033B
Application number: CN202010651889.5A
Authority: CN
Inventors: 肖诗鑫; 叶天文; 李素芳; 徐新
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN111705033A

Abstract

本发明公开了一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法，属于植物组织培养领域。本发明油茶愈伤悬浮培养的方法，以材料数量巨大的茎段作为外植体，将诱导得到的致密愈伤组织在含NAA、2,4‑D、6‑BA的培养基上继代培养得到了容易建立悬浮细胞系的疏松颗粒状愈伤组织；该方法解决了现有技术诱导的油茶茎段愈伤组织较为致密、不适合进行悬浮细胞培养的问题。本发明油茶原生质体分离的方法，将油茶愈伤原生质体悬浮于密度较大的蔗糖溶液中，通过离心使密度较大的碎片等杂质下沉、油茶原生质体上浮，从而实现其分离纯化；该方法解决了油茶愈伤原生质体无法通过离心收集纯化的问题，其纯化效率高，获得的原生质体清晰可见、纯度高。

Description

一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，特别是涉及一种油茶愈伤组织悬浮培养及原生质体分离的方法。

背景技术

油茶为我国重要的木本油料树种，有1000多年的栽培历史，主要分布在长江流域及其以南地区，在维护国家粮油安全、发展农村经济和改善生态环境中发挥着重要作用。油茶有较好的经济价值，其种仁提取的茶油营养价值极高，富含不饱和脂肪酸、维生素，而种仁提取油脂之后剩下的茶粕，其提取物中包含茶皂苷、黄酮、单宁等生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌等功能。

但是，当前我国油茶产业发展面临很多问题：(1)油茶品种良莠不齐，导致产量低；(2) 缺乏对油茶主要病害如炭疽病的抗性品种；(3)栽培管理水平粗放。这就要求在加强栽培管理水平的同时，培育出更加高产、优质、抗病、含油率高、适应性强的新品种。良种是油茶产业发展的有力保障，而高效的育种方法是品种选育的关键。目前油茶育种方法主要是优良无性系选育与杂交育种。尽管这些传统育种手段取得了一定的成绩，但由于油茶童期长且基因组高度杂合，导致传统油茶育种方法的效率都不高。而现代生物技术手段的应用，将有助于突破传统育种方法的局限。近年来，国内多个单位相继开展了油茶生物技术研究，在油茶组织培养、转基因育种等方面都取得了一定的进展，而油茶原生质体分离和细胞融合研究还未见报道。

细胞融合又称为原生质体融合、体细胞杂交，是指不同来源的原生质体不经过有性杂交，在一定外界条件诱导下融合并再生杂种植株的过程。细胞融合能有效克服有性杂交不亲和以及远缘杂交障碍等困难，近年来，细胞融合在柑橘、马铃薯等植物品种改良和创造中发挥了重要作用，取得一系列重大进展与突破。而原生质体的成功制备是细胞融合技术的关键所在。原生质体是指去除细胞壁以后植物细胞剩下的具有活力的、被质膜包围的部分，在体细胞融合培育新种质、细胞壁再生机理、转基因植物创制等科学研究中具有重要作用。

选择合适的外植体是高效分离原生质体的基础，常用的外植体有叶片、愈伤组织、悬浮细胞系等。其中，通过愈伤组织悬浮培养获得的悬浮细胞系具有来源统一、遗传背景一致、细胞团细胞数量少、结构疏松等特点，其生长条件容易控制，生理状态基本相同，发生各种反应更为迅速一致，具有较好的细胞全能性，因此悬浮细胞系是用于原生质体分离、培养的理想材料。

目前油茶基础研究薄弱，油茶原生质体的制备工作虽有少量报道，但进展缓慢、技术远不够成熟。一般制备原生质体的方法有机械法和酶法。申请号201610559094.5，专利名称为 “一种油茶原生质体的制备和纯化方法”中，公开了一种油茶原生质体的制备和纯化方法，发明人采用机械法分离油茶叶片原生质体，产量为5.1×10⁵个/g·FW，但这样的产量相比于其他植物用酶解法分离原生质体的产量而言很低。而酶解法操作简单，在合适酶解条件下可迅速获得大量高质量的原生质体，广泛应用于原生质体的培养、融合和基因转化等原生质体下游实验。如2011年白姗姗等用酶解法处理新疆杨愈伤组织可获得8.5×10⁶个/g·FW的原生质体产量，活力达83.6％；2012年羿德磊等用酶解法处理桑树胚性悬浮培养细胞可获得7.8×10⁶个/g的原生质体产量，原生质体活力达91.4％。相比机械法而言，酶解法操作简单，获得的细胞数目多，目前植物原生质体分离、细胞融合等研究大多数均采用酶解法制备原生质体。而油茶愈伤组织悬浮培养、原生质体分离的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种油茶愈伤组织悬浮培养的方法，以及一种油茶原生质体分离的方法。本发明以油茶茎段诱导获得疏松愈伤组织并建立悬浮细胞系，以悬浮细胞系为材料用酶解法进行原生质体分离，建立油茶原生质体高效分离的方法，为油茶原生质体培养、细胞融合及基因转化等奠定基础。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种油茶愈伤组织悬浮培养的方法，包括以下步骤：

(1)致密愈伤组织诱导：采集油茶当年生半木质化5～7cm长的茎段，去掉叶片后用水冲洗干净，分别用酒精和HgCl₂溶液进行消毒，用无菌水洗涤后，将茎段切成2～3cm长的单芽茎段，接种到诱导培养基上，在温度26～30℃、黑暗条件下培养4～7d后转入光照条件下 (光强为1400～2200lx，光照时间12～16h)培养30～40天，茎段基部诱导出致密愈伤组织。所述的诱导培养基为含有30～40g/L蔗糖、7～7.5g/L琼脂、1.5～2.5mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)、0.1～0.2mg/L IAA(吲哚乙酸)的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8。

(2)疏松愈伤组织诱导：将步骤(1)中得到的致密愈伤组织接种到继代培养基上，在温度26～30℃、光照条件(光强为1400～2200lx，光照时间12～16h)下进行继代培养，继代培养3～4次后得到疏松颗粒状愈伤组织。所述的继代培养基为含有30～40g/L蔗糖、7～7.5g/L琼脂、40～60mL/L椰汁、1.5～2.5mg/L NAA(萘乙酸)、0.5～1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5～1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的MS培养基，用HCl和NaOH调pH 至5.7～5.8。

(3)悬浮培养：将步骤(2)得到的油茶疏松颗粒状愈伤组织转接入液体培养基中，在黑暗条件、温度26～28℃、转速110～120rpm下继代培养，获得油茶悬浮细胞系。所述的液体培养基为含有30～40g/L蔗糖、40～60mL/L椰汁、1.5～2.5mg/L NAA(萘乙酸)、0.5～1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5～1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8。

进一步地，所述的油茶愈伤组织悬浮培养的方法中：步骤(1)中，所述的酒精浓度为 75％(v/v)，消毒时间30～60s；所述的HgCl₂溶液浓度为0.1％(m/v)，消毒时间10～15min。步骤(2)中，所述的继代培养的继代周期为20～25天。步骤(3)中，愈伤组织转接入液体培养基的比例为1g：30mL；所述的继代培养的继代周期为7～14天。

一种油茶原生质体分离的方法，包括以下步骤：

(1)将油茶悬浮细胞系继代培养后，过滤分装入无菌培养皿中，加入酶液混合液，封口膜封好盖子，在26～28℃、30～50rpm、黑暗条件下酶解8～16h。所述的酶液混合液由酶液与EME培养基等体积混合得到，pH为5.8。其中，酶液：20～30g/L纤维素酶R-10(YAKULT， Japan)、20～30g/L离析酶R-10(YAKULT，Japan)、1.2g/L MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)、3.6g/L二水合氯化钙、0.11g/L磷酸二氢钠、72.87g/L甘露醇(摩尔浓度0.4M)；EME 培养基：MS培养基+500mg/L ME(麦芽提取物)+136.92g/L蔗糖(摩尔浓度0.4M)。

(2)将酶解好的体系用无菌钢筛过滤，将滤液分装至离心管，加入等体积的CPW14溶液，再在混合液上层滴加入1/3体积的CPW7溶液，接着40～50g(离心力)离心3～4min，最后用胶头滴管吸取中间的原生质体带；将吸取的原生质体带转入离心管中，重复上述操作 (加CPW14溶液、CPW7溶液、离心)1～2次，即得到纯化的原生质体。CPW14溶液组成：0.0272g/L KH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/L KI、0.000003g/LCuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、136.92g/L蔗糖；CPW7溶液：0.0272g/L KH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/L KI、0.000003g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、72.87g/L甘露醇。该步骤中，在混合液上层滴加CPW7溶液，要轻缓使CPW7溶液与底层混合液分层明显，使原生质体富集在上下两层溶液之间。

进一步地，所述的油茶原生质体分离的方法中：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系继代3～4次较好，继代后第3～5d，称取0.5～2.0g分装入培养皿中；称取1.0g酶解效果最佳。酶液中的纤维素酶R-10浓度20g/L、离析酶R-10浓度20g/L，甘露醇浓度72.87g/L(摩尔浓度0.4M)；EME培养基中的蔗糖浓度136.92g/L(摩尔浓度0.4M)；酶解时间14h。步骤(2)中，所述的钢筛为200目孔径。

如无特别说明，本发明中所用溶液的溶剂为水。

与现有技术相比，本发明的方法具备以下有益效果：

(1)本发明所采用的外植体材料是茎段，外植体材料数量巨大，获得油茶愈伤诱导率高。

(2)现有技术诱导的油茶茎段愈伤组织较为致密，不适合进行悬浮细胞培养，而采用本发明的方法可将油茶茎段诱导的致密愈伤组织转化为疏松颗粒状愈伤组织，容易建立悬浮细胞系，并且悬浮液不褐化，增殖效率高；悬浮细胞系中细胞密度大，近圆形细胞比例达80％以上，活细胞率达70％以上。

(3)本发明简单易行，获得的原生质体形态完整、稳定，产量高，数量可达1.17×10⁷个/g·FW，原生质体活力高达90％以上。

(4)本发明针对油茶愈伤原生质体无法通过离心收集纯化的困难，设计了一种新的纯化方法，纯化效率高，获得的原生质体清晰可见、纯度高，为后续的原生质体培养、细胞融合、建立基因瞬时转化体系等奠定基础。

附图说明

图1：油茶茎段愈伤组织诱导过程。A：茎段接种在MS培养基0天；B：茎段接种30 天，茎段基部形成绿色致密愈伤组织；C：致密愈伤组织接种到继代培养基0天；D：致密愈伤组织继代培养1次后出现少量白色疏松愈伤组织；E：致密愈伤组织继代培养2次后，白色疏松愈伤组织增多；F：致密愈伤组织继代培养3次后，得到大量白色疏松愈伤组织。

图2：筛选油茶不同类型愈伤建立悬浮细胞系。A：含水量多的疏松团状愈伤组织；B：疏松易碎的小颗粒愈伤组织；C：致密块状愈伤组织；D：A类愈伤组织放进液体继代培养基中立即散开；E：B类愈伤组织放进液体继代培养基后状态；F：C类愈伤组织放进液体继代培养基后状态；G：A类愈伤悬浮培养10天之后，悬浮液中多为中空的长条形细胞(内含物很少)，只有少量由圆球形细胞(内含物较多)聚集在一起的细胞团；H：B类愈伤悬浮培养 10天之后，悬浮液中存在大量由多个圆球形细胞(内含物较多)组成的细胞团；I：C类愈伤悬浮培养10天之后，悬浮液中也主要为圆球形细胞组成的细胞团，但数量比B类愈伤少。

图3：不同初始接种质量对悬浮系细胞密实体积的影响。

图4：继代3次后的悬浮细胞系。A：培养瓶中的悬浮系状态；B：显微镜下观察，悬浮细胞系中细胞密度大，近圆形细胞比例高。

图5：不同渗透压下酶解对原生质体产量和形态的影响。A：0.3M渗透压下原生质体分离效果；B：0.4M渗透压下原生质体分离效果；C：0.5M渗透压下原生质体分离效果；D：0.6M渗透压下原生质体分离效果。

图6：不同条件离心后原生质体状态。A：50g离心3min后上层液体中细胞；B：50g离心3min后中层液体中细胞；C：50g离心3min后下层液体中细胞；D：70g离心3min后沉淀中细胞；E：90g离心3min后沉淀中细胞；F：本发明设计的纯化方法的纯化效果。

图7：纯化后的原生质体(见图7-A)，发绿色荧光的有活力的原生质体(见图7-B)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

(1)3～5月间的晴朗上午采集‘华硕’油茶当年生半木质化5～7cm长的茎段，去掉叶片后用自来水冲洗20min后沥干。在超净工作台中，用无菌水清洗2次，再用75％(v/v)酒精消毒30s，接着用0.1％(m/v)的HgCl₂溶液消毒15min，最后用无菌水洗涤4～5次后，滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌刀片切成2～3cm长的单芽茎段，接种到诱导培养基中进行诱导。在温度28℃、黑暗条件下培养5d后转入光照条件(光强为2000lx，光照时间16h) 下培养，经过30～40天，茎段基部诱导出致密愈伤组织(见图1-B)。所述的诱导培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)、0.1mg/L IAA(吲哚乙酸)的 MS培养基，用1mol/L的HCl和NaOH调pH至5.8。

(2)将步骤(1)得到的致密愈伤组织接种到继代培养基中进行继代培养(见图1-C)，继代培养条件为16小时光照(光强为2000lx)/8小时黑暗，温度28℃，继代周期为20～25 天。其中，继代培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL/L的椰汁、2mg/L NAA(萘乙酸)、0.5mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的MS培养基，用1mol/L 的HCl和NaOH调pH至5.8；或者继代培养基为步骤(1)中的诱导培养基。根据继代培养所得愈伤组织的状态，将其分为3类，一类是粘连在一起含水量多的疏松团状的愈伤组织(A 类，见图2-A)，使用上述含NAA、2,4-D、6-BA的继代培养基第3次继代培养后10天左右得到，数量较少；第2类为疏松易碎的小颗粒愈伤组织(B类，见图2-B，文中称为疏松颗粒状愈伤组织)，使用上述含NAA、2,4-D、6-BA的继代培养基第3次继代培养后10天左右得到，数量较多；第3类为增殖很快的较紧密的块状愈伤组织(C类，见图2-C)，在以步骤(1)中的诱导培养基进行继代时愈伤组织一直维持这种紧密的质地。

(3)悬浮培养

一、愈伤组织筛选

将步骤(2)得到的3类愈伤组织分别悬浮培养，筛选适合建立悬浮细胞系的油茶愈伤组织。悬浮培养具体为：将愈伤组织转接入装有液体培养基的摇瓶中在摇床上培养，培养7～ 10天继代分瓶培养，继代周期为7～14天，培养条件为黑暗，培养温度为28℃，摇床转速为 110rpm，获得油茶悬浮细胞系。其中，液体培养基为含有30g/L蔗糖、50mL/L的椰汁、2mg/L NAA(萘乙酸)、0.5mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的 MS培养基，用1mol/L的HCl和NaOH调pH至5.8。

A类愈伤组织悬浮培养10天之后，悬浮液中多为中空的长条形细胞(内含物很少)，只有少量由圆球形细胞(内含物较多)聚集在一起的细胞团(见图2-G)；B类愈伤组织悬浮培养10天之后，悬浮液中存在大量由多个圆球形细胞(内含物较多)组成的细胞团，中空的长条形细胞很少(见图2-H)；C类愈伤组织悬浮培养10天之后，悬浮液中也主要为圆球形细胞组成的细胞团，但细胞团的数量比B类愈伤少(见图2-I)。因此，三类愈伤组织中B 类(疏松颗粒状)愈伤组织即步骤(2)中继代3-4次后得到愈伤组织最适合用于悬浮系培养，用该类愈伤组织悬浮培养继代3次之后可以得到单细胞较多的悬浮系，并且悬浮液不褐化，增殖效率高；悬浮细胞系中细胞密度大，近圆形细胞比例达80％以上，活细胞率达70％以上(见图4)。

二、愈伤组织悬浮培养初始接种质量的选择

将0.5g、1.0g、1.5g、2.0g疏松颗粒状愈伤组织分别转接入装有30mL液体培养基的摇瓶中在摇床上培养，培养条件为黑暗，培养温度为28℃，摇床转速为110rpm，测量随着培养时间的增加悬浮体系中细胞系密实体积(mL)的变化(见图3)，不同接种质量的疏松愈伤组织在悬浮体系的培养基中生长情况类似，即开始的1～3天细胞密实体积没有很大的变化，说明这阶段增殖很慢或停滞，处在适应阶段，之后体系进入高速增殖阶段，持续数天，直到体系达到流质态，随后随着营养物质、激素的消耗完，体系细胞密实体积开始下降。特别的是可以从中看出，无论初始接种质量是多少克愈伤组织，各处理最后都能达到16mL的最大细胞密实体积，这说明了愈伤组织的初始接种量的多少对悬浮系增殖所能达到的水平没有影响，但是其中0.5g初始接种质量达到最大细胞密实体积的时间过长，这将不利于后期进行原生质体分离的实验，故选择1.0g/瓶(30mL)的初始接种质量。

根据上述内容，确定悬浮培养的方法为：将步骤(2)继代3～4次后得的疏松颗粒状愈伤组织转接入装有液体培养基的摇瓶中在摇床上培养，接种愈伤比例为1g:30mL(愈伤组织：培养基)，培养7～10天后继代分瓶培养，继代周期为7～14天，培养条件为黑暗，培养温度为28℃，摇床转速为110rpm，获得油茶悬浮细胞系。其中，液体培养基为含有30g/L蔗糖、 50mL/L的椰汁、2mg/L NAA(萘乙酸)、0.5mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/L 6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)的MS培养基，用1mol/L的HCl和NaOH调pH至5.8。

(4)油茶悬浮细胞系继代3～4次后，在继代后的第3～5d，选取良好稳定的油茶愈伤悬浮细胞系，在超净工作台中，用100目无菌钢筛过滤得到悬浮愈伤组织，称取1.0g愈伤装入无菌培养皿中，加入10mL酶液混合液，封口膜封好盖子，在28℃，黑暗条件下，摇床转速40rpm，酶解8～18h。酶液混合液由酶液与EME培养基等体积混合得到，pH为5.8。其中，酶液：20～30g/L纤维素酶R-10(YAKULT，Japan)、10～30g/L离析酶R-10(YAKULT， Japan)、1.2g/L MES、3.6g/L二水合氯化钙、0.11g/L二水合磷酸二氢钠、0.3～0.6M甘露醇 (0.3M、0.4M、0.5M、0.6M甘露醇对应的浓度分别为54.65g/L、72.87g/L、91.09g/L、109.30g/L)；EME培养基：MS+500mg/L ME(麦芽提取物)+0.3～0.6M蔗糖(0.3M、0.4M、0.5M、0.6M 蔗糖对应的浓度分别为102.69g/L、136.92g/L、171.15g/L、205.38g/L)。

一、针对酶液混合液中的渗透压(即酶液中甘露醇摩尔浓度、EME培养基中蔗糖摩尔浓度)分别设置了0.3M、0.4M、0.5M、0.6M共4个处理，在20g/L纤维素酶+10g/L离析酶和酶解14h条件下，观察各处理的酶解情况(见图5)，其中0.3M渗透压下，原生质体产量较高，原生质体边缘清晰、形态较好(见图5-A)；0.4M渗透压下，原生质体产量极高，原生质体边缘清晰、形态完整稳定，内含物多，(见图5-B)；0.5M渗透压下，原生质体产量一般，原生质体边缘清晰、部分原生质体形态发生变形，碎片多(见图5-C)；0.6M渗透压下，原生质体产量极低，原生质体边缘变形严重(见图5-D)，故选择0.4M渗透压(见图5-B)。

二、针对酶解时间，设置了8h、10h、12h、14h、16h、18h共6个处理，在0.4M渗透压和20g/L纤维素酶+10g/L离析酶条件下，酶解分离原生质体，测定各处理下原生质体的产量和活性，确定最适的酶解时间。结果表明，综合原生质体产量和活力来看(见表1)，酶解 14h效果最好。

表1不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响

三、针对酶液中酶浓度组合，设置了20g/L纤维素酶+10g/L离析酶、20g/L纤维素酶+ 20g/L离析酶、30g/L纤维素酶+30g/L离析酶3个处理，在最适宜的渗透压0.4M条件下酶解14h，测定各处理下原生质体的产量和活性(见表2)，确定最适的酶浓度组合为2％纤维素酶+2％离析酶。

表2不同酶浓度组合对原生质体产量和活力的影响

(5)在超净工作台中，将步骤(4)在最佳条件(酶浓度组合20g/L纤维素酶+20g/L离析酶，渗透压0.4M，酶解时间14h)下酶解好的体系用200目无菌钢筛过滤，滤液分装至离心管里，进行原生质体的收集、纯化。

一、采用现有技术常用的离心沉淀法收集原生质体、用梯度离心法进行纯化。将过滤后的滤液分装至离心管里，加入等体积的CPW7溶液，室温下以50g离心力低速离心3min，无法收集到沉淀，将不同层面的液体镜检发现，下层几乎没有原生质体(图6C)，中层有少量原生质体(图6B)，大部分原生质体仍然位于上层(图6A)，而将离心时间增加到5min、7min、9min也并没有改善，说明50g的离心力无法实现原生质体收集；而将离心力增加到70g、 90g后，离心可以获得沉淀，但是沉淀中原生质体基本都破裂变形(图6D、图6E)，说明通过离心沉淀的方式无法实现油茶愈伤原生质体的收集。通过密度梯度离心(原生质体悬浮于CPW7溶液中，轻缓地滴加在CPW14溶液上，即上层溶液为CPW7溶液和原生质体的混合液、下层溶液为CPW14溶液，CPW7与CPW14溶液的体积比为1：3)，分别以50g离心力离心3min、50g离心力离心5min、70g离心力离心3min、70g离心力离心5min、90g离心力离心3min、90g离心力离心5min，均无法获得纯化的原生质体条带，未能实现原生质体纯化。其中，CPW14溶液组成：0.0272g/L KH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/L KI、0.000003g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、136.92g/L蔗糖；CPW7溶液组成：0.0272g/LKH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/L KI、0.000003g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、72.87g/L甘露醇。

二、进一步研究发现，油茶愈伤原生质体的密度较小，在等渗溶液中无法下沉，因此无法采用现有技术已知的离心沉淀法收集原生质体、用密度梯度离心法进行纯化。面对这一技术障碍，根据油茶愈伤原生质体的密度较小这一特点，本发明设计了一种新的纯化方法：将油茶愈伤原生质体悬浮于密度较大的蔗糖溶液中，在低速离心时，密度较大的碎片等杂质下沉、而原生质体则会上浮，从而实现原生质体的收集纯化。具体步骤如下：将过滤后的滤液分装至离心管里，加入等体积的CPW14溶液，再在混合液上层滴加入混合液1/3体积的CPW7 溶液，特别是在混合液上层轻缓地滴加CPW7溶液，使CPW7溶液与底层混合液分层明显，室温下低速离心3min(离心力50g)，最后用胶头滴管吸取富集在上下两层溶液之间的原生质体带，重复前面操作2次，得到纯化的原生质体(图6F、图7)。CPW14溶液、CPW7溶液的组成同上。

将纯化的原生质体用EME培养基重新悬浮，用胶头滴管吹打均匀，吸取滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值。根据加入酶溶液中愈伤的多少计算出每克愈伤得到的原生质体产量，结果得到原生质体产量为1.17×10⁷个/g·FW。

将纯化的原生质体用EME培养基重新悬浮，用胶头滴管吹打均匀，用FDA(双醋酸乙酸酯)染色法统计原生质体活力。将5mg双醋酸乙酸酯溶于1mL二甲基亚砜作为双醋酸乙酸酯母液(0℃保存)，然后向1mL悬浮的原生质体中加25μL双醋酸乙酸酯母液，避光室温反应3min后，取少量溶液置于载玻片用荧光显微镜观察，发绿色荧光的为有活力原生质体，原生质体活力以一个视野中有活力的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数来表示(图7)，选取10个有代表性的视野进行统计，原生质体活力达95.1％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种油茶原生质体分离的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将油茶悬浮细胞系继代培养3～4次，继代后第3～5d，过滤称取0.5～2.0g悬浮愈伤组织分装入无菌培养皿中，加入酶液混合液，封口膜封好盖子，在26～28℃、30～50rpm、黑暗条件下酶解8～16h；其中，继代培养的继代培养基为含有30～40g/L蔗糖、7～7.5g/L琼脂、40～60mL/L椰汁、1.5～2.5mg/L NAA、0.5～1.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8；

所述的酶液混合液由酶液与EME培养基等体积混合得到，pH为5.8；其中，酶液：20～30g/L纤维素酶R-10、20～30g/L离析酶R-10、1.2g/L MES、3.6g/L二水合氯化钙、0.11g/L二水合磷酸二氢钠、72.87g/L甘露醇；EME培养基：MS培养基+500mg/L ME+136.92g/L蔗糖；

所述的油茶悬浮细胞系的制备方法，包括如下步骤：

1)致密愈伤组织诱导：采集油茶当年生半木质化5～7cm长的茎段，去掉叶片后用水冲洗干净，分别用酒精和HgCl₂溶液进行消毒，用无菌水洗涤后，将茎段切成2～3cm长的单芽茎段，接种到诱导培养基上，在温度26～30℃、黑暗条件下培养4～7d后转入光照条件下培养30～40天，茎段基部诱导出致密愈伤组织；

所述的诱导培养基为含有30g～40/L蔗糖、7g～7.5/L琼脂、1.5～2.5mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L IAA的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8；

2)疏松愈伤组织诱导：将步骤1)中得到的致密愈伤组织接种到继代培养基上，在温度26～30℃、光照条件下进行继代培养，继代培养3～4次后得到疏松颗粒状愈伤组织；

所述的继代培养基为含有30～40g/L蔗糖、7～7.5g/L琼脂、40～60mL/L椰汁、1.5～2.5mg/L NAA、0.5～1.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8；

3)悬浮培养：将步骤2)得到的油茶疏松颗粒状愈伤组织转接入液体培养基中，在黑暗条件、温度26～28℃、转速110～120rpm下继代培养，获得油茶悬浮细胞系；

所述的液体培养基为含有30～40g/L蔗糖、40～60mL/L椰汁、1.5～2.5mg/L NAA、0.5～1.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA的MS培养基，用HCl和NaOH调pH至5.7～5.8；

(2)将酶解好的体系用无菌钢筛过滤，将滤液分装至离心管，加入等体积的CPW14溶液，再在混合液上层滴加入1/3体积的CPW7溶液，接着40～50g离心3～4min，最后用胶头滴管吸取中间的原生质体带；将吸取的原生质体带转入离心管中，重复上述操作1～2次，得到纯化的原生质体；

CPW14溶液组成：0.0272g/L KH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/LKI、0.000003g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、136.92g/L蔗糖；

CPW7溶液：0.0272g/L KH₂PO₃、0.1g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.0002g/L KI、0.000003g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L CaCl₂、72.87g/L甘露醇。

2.根据权利要求1所述的油茶原生质体分离的方法，其特征在于：步骤(1)中，酶液中的纤维素酶R-10浓度20g/L、离析酶R-10浓度20g/L，甘露醇浓度72.87g/L；EME培养基中的蔗糖浓度136.92g/L；酶解时间14h。

3.根据权利要求1所述的油茶原生质体分离的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的钢筛为200目孔径。

4.根据权利要求1所述的油茶原生质体分离的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系的制备方法中，所述的光照条件为：光强为1400～2200lx，光照时间12～16h。

5.根据权利要求1所述的油茶愈伤组织悬浮培养的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系的制备方法的步骤1)中，所述的酒精浓度为75％，消毒时间30～60s；所述的HgCl₂溶液浓度为0.1％，消毒时间10～15min。

6.根据权利要求1所述的油茶愈伤组织悬浮培养的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系的制备方法的步骤2)中，所述的继代培养的继代周期为20～25天。

7.根据权利要求1所述的油茶愈伤组织悬浮培养的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系的制备方法的步骤3)中，愈伤组织转接入液体培养基的比例为1g：30mL。

8.根据权利要求1所述的油茶愈伤组织悬浮培养的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的油茶悬浮细胞系的制备方法的步骤3)中，所述的继代培养的继代周期为7～14天。