CN113717924A - 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 - Google Patents
一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113717924A CN113717924A CN202111209718.8A CN202111209718A CN113717924A CN 113717924 A CN113717924 A CN 113717924A CN 202111209718 A CN202111209718 A CN 202111209718A CN 113717924 A CN113717924 A CN 113717924A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzymolysis
- protoplast
- culture medium
- cell
- tree
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 claims abstract description 35
- 235000008529 Ziziphus vulgaris Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 14
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 14
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 14
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 14
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Inorganic materials [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 11
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 7
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 7
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001247821 Ziziphus Species 0.000 description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013830 Calcium-Sensing Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010050543 Calcium-Sensing Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于植物原生质体培养技术领域，本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。本发明以枣树的胚性悬浮细胞系为研究材料，通过酶解得到原生质体，纯化后得到了数量多且活性高的原生质体，并利用钙离子染料对原生质体内Ca2+浓度进行了探究。本发明方法简单、成本低，获得的原生质体数量多且活性高，为利用其研究Ca2+信号途径奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物原生质体培养技术领域，尤其涉及一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。
背景技术
枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特色优势果树，在山沙碱旱贫困地区中发挥着重要作用。经过几十年的快速发展，枣产业进入了转型升级高质量发展新阶段，迫切需要培育综合性状优异的突破性新品种。枣树为多年生木本果树，利用转基因手段对其进行遗传改良十分困难，而利用枣原生质体进行遗传转化或细胞融合创建枣新种质可为枣树遗传育种开辟新的方向。
植物原生质体是指通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分物质，包括细胞质、细胞膜和细胞核。原生质体不仅具有活细胞的性质，而且可以融合形成杂种细胞。原生质体没有了细胞壁障碍，可通过吞噬或融合作用直接摄取 DNA、质粒、病毒或细胞器等外源物质，它们是遗传转化的理想受体，在植物遗传改良等方面有着广阔的应用前景。
离体的原生质体具有细胞全能性，在适宜的无菌条件下可以生长、分化、再生成完整植株。可借助于原生质体方便地开展枣树基因的亚细胞定位、蛋白互作等研究。另外，利用原生质体融合进行体细胞杂交，可以打破枣树杂交育种困难等方面的问题。而获得高制备率且高活性的原生质体是利用原生质体的前提。目前，从高等植物中分离得到的原生质体大多数为草本植物，从木本植物分离得到原生质体非常困难。枣树原生质体制备研究的报道很少，且存在产量低、完整性低的严重问题，不能满足研究和利用的要求。
钙离子(Ca2+)作为一个信号离子，在植物生长发育和响应逆境胁迫信号转导中发挥重要的作用。钙离子信号向细胞质中的快速流入首先被钙离子感受器或钙受体蛋白感知，从而启动一系列蛋白质磷酸化反应并最终激活下游相关转录因子调节相关基因的表达来完成信号转导过程。而由于植物细胞壁的存在，给钙离子信号测定带来了挑战。目前常用的膜片钳、钙离子染色等技术都只能应用于原生质体，而钙离子信号在枣原生质体中的作用还未见有报告。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。本发明以枣树的胚性悬浮细胞系为研究材料，通过酶解得到原生质体，纯化后得到了数量多且活性高的原生质体，利用钙离子染料对原生质体内Ca2+浓度进行了探究，为利用其进行钙离子信号检测等研究奠定了新的技术基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法，包括如下步骤：
(1)将枣树愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基中，进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在黑暗条件下进行酶解，得到酶解细胞液；
(3)用细胞筛过滤所述酶解细胞液，对滤液进行离心，得到枣树原生质体。
优选的，步骤(1)中所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基4～5g/L，麦芽糖18～22g，琼脂5～6g，NAA0.4～0.6mg/L和TDZ 2～4mg/L，所述黑暗培养的转速为110～130r/min，所述黑暗培养的温度为24～26℃。
优选的，步骤(2)中所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基4～5g/L，蔗糖235～245g/L和麦芽糖提取物 0.4～0.6g/L；
所述酶解液包括为纤维素酶R10 1.4～1.6％，离析酶R10 0.8～1.2％，甘露醇0.6～0.8M和酶解母液40～60％，所述酶解母液包括NaH2PO4 0.02～0.04％，MES 0.2～0.4％和CaCl2·2H2O 0.6～0.8％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比为1～2mL:1～2mL:2～3g；
所述酶解的温度为24～26℃，所述酶解的转速为20～50r/min，所述酶解的时间为15～18h。
优选的，步骤(3)中所述细胞筛的孔径为35～45μM；
所述离心的转速为90～110g/min，所述离心的时间为4～6min。
优选的，还包括步骤(4)：对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤的步骤，所述洗涤为将枣树原生质体与洗涤缓冲液混合，离心，弃上清，所述洗涤的次数为2～4次；
所述洗涤缓冲液以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO4 0.02～0.03g/L，KNO3 0.08～0.12g/L，MgSO4 0.2～0.3g/L，KI 0.00015～0.00025g/L，CuSO4·5H2O 0.0000025～0.0000035g/L，甘露醇125～135g；
所述洗涤缓冲液与枣树原生质体的用量比为1～2mL:0.4～0.6g；
所述离心的转速为90～110g/min，所述离心的时间为4～6min。
本发明还提供了一种枣树原生质体。
本发明还提供了一种枣树原生质体在钙离子信号检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明方法简单、成本低，获得的原生质体数量多且活性高，为获得枣原生质体提供了一种高效的分离方法，且提供了一种枣树原生质体在Ca2+信号检测中的应用，为利用其研究Ca2+信号途径奠定了基础。
附图说明
图1为实施例2所得纯化后的枣树原生质体；
图2为实施例2所得纯化后的枣树原生质体活力检测图；
图3为枣树原生质体Ca2+浓度Fluo-4/AM荧光检测图(注：A：明视野下原生质体；B：5min时荧光检测图；C：10min时荧光检测图；D：15min时荧光检测图；E：20min时荧光检测图)；
图4为钙离子激活剂A23187处理枣树原生质体Ca2+浓度Fluo-4/AM荧光检测图(注：A：明视野下原生质体；B：5min时荧光检测图；C：10min时荧光检测图；D：15min时荧光检测图；E：20min时荧光检测图)。
具体实施方式
本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法，包括如下步骤：
(1)将枣树愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基中，进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在黑暗条件下进行酶解，得到酶解细胞液；
(3)用细胞筛过滤所述酶解细胞液，对滤液进行离心，得到枣树原生质体。
在本发明中，步骤(1)中所述细胞悬浮液体培养基优选包括MS培养基4～5 g/L，麦芽糖18～22g，琼脂5～6g，NAA0.4～0.6mg/L和TDZ 2～4mg/L，进一步优选包括MS培养基4.42g/L，麦芽糖20g，琼脂5.5g，NAA0.5 mg/L和TDZ 3mg/L，所述黑暗培养的转速优选为110～130r/min，进一步优选为120r/min，所述黑暗培养的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，步骤(2)中所述酶解体系优选包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基优选包括MS培养基4～5g/L，蔗糖235～245g/L和麦芽糖提取物0.4～0.6g/L，进一步优选包括MS培养基4.42g/L，蔗糖239.61g/L 和麦芽糖提取物0.5g/L；
所述酶解液优选包括纤维素酶R10 1.4～1.6％，离析酶R10 0.8～1.2％，甘露醇0.6～0.8M和酶解母液40～60％，进一步优选包括纤维素酶R10 1.5％，离析酶R10 1.0％，甘露醇0.7M和酶解母液50％，所述酶解母液优选包括NaH2PO4 0.02～0.04％，MES 0.2～0.4％和CaCl2·2H2O 0.6～0.8％，进一步优选包括NaH2PO4 0.022％，MES 0.24％和CaCl2·2H2O 0.72％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比优选为1～2mL:1～2mL:2～3g，进一步优选为1.5mL:1.5mL:2g；
所述酶解的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃，所述酶解的转速优选为20～50r/min，进一步优选为38～42r/min，更进一步优选为40r/min，所述酶解的时间优选为15～18h，进一步优选为17h。
在本发明中，步骤(3)中所述细胞筛的孔径优选为35～45μM，进一步优选为40μM；
所述离心的转速优选为90～110g/min，进一步优选为100g/min，所述离心的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，还优选包括步骤(4)：对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤的步骤，所述洗涤优选为将枣树原生质体与洗涤缓冲液混合，离心，弃上清，所述洗涤的次数优选为2～4次，进一步优选为3次；
所述洗涤缓冲液优选以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO4 0.02～0.03g/L， KNO30.08～0.12g/L，MgSO4 0.2～0.3g/L，KI 0.00015～0.00025g/L，CuSO4·5H2O 0.0000025～0.0000035g/L，甘露醇125～135g，进一步优选包括KH2PO4 0.0272 g/L，KNO3 0.1g/L，MgSO40.25g/L，KI 0.0002g/L，CuSO4·5H2O 0.000003g/L，甘露醇130g；
所述洗涤缓冲液与枣树原生质体的用量比优选为1～2mL:0.4～0.6g，进一步优选为1.5mL:0.5g；
所述离心的转速优选为90～110g/min，进一步优选为100g/min，所述离心的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
本发明还提供了一种利用上述方法制备获得的枣树原生质体。
本发明还提供了一种枣树原生质体在钙离子信号检测中的应用，所述应用具体是指：取100μL纯化后的原生质体，加入Fluo-4/AM使其终浓度为5μM，37℃水浴30min，加入600μL洗涤缓冲液，离心去上清，重复3次，吸取40μL 在倒置荧光显微镜下观察荧光信号，荧光观察模式为激发光波长460-495nm；在上述溶液中加入A23187，使其终浓度为5μM，在倒置荧光显微镜下观察荧光信号，荧光观察模式为激发光波长460-495nm。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例和实验例中的酶解液、洗涤缓冲液和EME培养基均利用NaOH 调节pH值至5.6-6.0，酶解液通过0.22μM醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌，EME 培养基、洗涤缓冲液采用高压灭菌。
实施例1
(1)将枣树黄色松软愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基(所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基4g/L，麦芽糖18g，琼脂5g，NAA0.4mg/L 和TDZ 2mg/L)中，于110r/min，24℃的条件下进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在24℃，20r/min的黑暗条件下酶解15 h，得到酶解细胞液，所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基4g/L，蔗糖235g/L和麦芽糖提取物0.4g/L；
所述酶解液包括纤维素酶R10 1.4％，离析酶R10 0.8％，甘露醇0.6M和酶解母液40％，所述酶解母液包括NaH2PO4 0.02％，MES 0.2％和CaCl2·2H2O 0.6％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比为1mL:1mL:2g；
(3)用孔径为35μM的细胞筛过滤所述酶解细胞液，将滤液在90g/min的条件下离心4min，得到枣树原生质体。
(4)对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤，所述洗涤为将枣树原生质体与洗涤缓冲液(所述洗涤缓冲液以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO4 0.02g/L， KNO3 0.08g/L，MgSO40.2g/L，KI 0.00015g/L，CuSO4·5H2O 0.0000025g/L，甘露醇125g)以0.4g:1mL的用量比混合，在90g/min的条件下离心4min，弃上清，重复1次(即洗涤2次)，得到纯化后的枣树原生质体。
实施例2
(1)将枣树黄色松软愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基(所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基4.42g/L，麦芽糖20g，琼脂5.5g，NAA0.5 mg/L和TDZ 3mg/L)中，于120r/min，25℃的条件下进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在25℃，40r/min的黑暗条件下酶解17 h，得到酶解细胞液，所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基4.42g/L，蔗糖239.61g/L和麦芽糖提取物0.5g/L；
所述酶解液包括纤维素酶R10 1.5％，离析酶R10 1.0％，甘露醇0.7M和酶解母液50％，所述酶解母液包括NaH2PO4 0.022％，MES 0.24％和CaCl2·2H2O 0.72％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比为1.5mL:1.5mL:2g；
(3)用孔径为40μM的细胞筛过滤所述酶解细胞液，将滤液在100g/min 的条件下离心5min，得到枣树原生质体。
(4)对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤，所述洗涤为将枣树原生质体与洗涤缓冲液(所述洗涤缓冲液以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO4 0.0272 g/L，KNO3 0.1g/L，MgSO40.25g/L，KI 0.0002g/L，CuSO4·5H2O 0.000003g/L，甘露醇130g)以0.5g:1.5mL的用量比混合，在100g/min的条件下离心5min，弃上清，重复2次(即洗涤3次)，得到纯化后的枣树原生质体。
实施例3
(1)将枣树黄色松软愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基(所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基5g/L，麦芽糖22g，琼脂6g，NAA0.6mg/L 和TDZ 4mg/L)中，于130r/min，26℃的条件下进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在26℃，50r/min的黑暗条件下酶解18 h，得到酶解细胞液，所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基5g/L，蔗糖245g/L和麦芽糖提取物0.6g/L；
所述酶解液包括纤维素酶R10 1.6％，离析酶R10 1.2％，甘露醇0.8M和酶解母液60％，所述酶解母液包括NaH2PO4 0.04％，MES 0.4％和CaCl2·2H2O 0.8％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比为2mL:2mL:3g；
(3)用孔径为45μM的细胞筛过滤所述酶解细胞液，将滤液在110g/min 的条件下离心6min，得到枣树原生质体。
(4)对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤，所述洗涤为将枣树原生质体与洗涤缓冲液(所述洗涤缓冲液以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO4 0.03g/L， KNO3 0.12g/L，MgSO40.3g/L，KI 0.00025g/L，CuSO4·5H2O 0.0000035g/L，甘露醇135g)以0.6g:2mL的用量比混合，在110g/min的条件下离心6min，弃上清，重复3次(即洗涤4次)，得到纯化后的枣树原生质体。
实验例1
以实施例2中所得纯化后的枣树原生质体为例，利用钙离子染料研究枣树原生质体内Ca2+浓度。
原生质体密度统计：用血球计数板统计原生质体的密度，在光学显微镜下完成，具体计数方法如下：
原生质体密度＝(A1+A2+A3+A4+A5)/5×25×104个/mL
每个处理三次重复，取平均值。
原生质体活力检测：采用二乙酸荧光素(3,6-Diacetoxyfluoran，FDA)检测原生质体的活力，吸取100μL原生质体于1.5mL离心管内，然后添加2.4μL的FDA试剂，室温黑暗静置5min后，吸取原生质体于载玻片上，在倒置荧光显微镜上完成活力检测，荧光观察模式为激发光波长460-495nm，发射光波长为 510-550nm，黑暗条件下，产生绿色荧光的原生质体即代表有活性，反之即无。检测原理为：FDA本身并无荧光，但在细胞的非特异性脂酶的催化下，FDA能生成荧光素，在480nm激光下激发出波长530nm左右的绿色荧光。死细胞的细胞膜不完整，生成的荧光素很快扩散出细胞，并不能检测到带有绿色荧光的细胞。
原生质体的活性(％)＝(黄绿色荧光原生质体的数量/同一视野内原生质体的总数量)×100％
每个处理三次重复，每张载破片观察10个视野，取其平均数。
(1)在实施例2所得纯化后的枣树原生质体中加入1mL洗涤缓冲液，用于后续原生质体产量计算和活力鉴定。
(2)在光学显微镜下利用血球计数板按照上述原生质体密度统计方法统计步骤(1)中原生质体的密度。每个样品计数测定3次，最后取其平均值(4mL 悬浮培养液分离的原生质体共2.20×106个)。
(3)取步骤(2)中的原生质体100μL置于1.5mL的离心管中，加入FDA 染色剂(5mgFDA(二乙酸荧光素)溶于1mL丙酮内)，染色5min，取样制片于倒置显微镜下观察(结果如图2所示)，每个样品重复三次，计算得到原生质体的活力为74％。
(4)取步骤(3)中的原生质体，加入1μL Fluo-4/AM工作液(1μL储存液+1μL母液+10μL洗涤缓冲液，现配现用，所述储存液为5mL Fluo-4/AM储存液：50μg Fluo-4/AM溶于9.11μL二甲基亚砜，所述母液为20％F-127母液：100mg F-127溶于500μL二甲基亚砜)，使其终浓度为5μM，在37℃下水浴30 min，用600μL洗涤缓冲液清洗三次去除多余的染料，吸取40μL原生质体在荧光显微镜下分别在5min、10min、15min、20min时观察原生质体内的绿色荧光强度变化(荧光观察模式为激发光波长460-495nm)，结果如图3所示。由图3可知，实施例2所得纯化后的枣树原生质体内能检测到绿色荧光信号，且在四个时间段内荧光强度没有明显的变化。
(5)取步骤(4)中洗涤后的原生质体，将其稀释到1mL，加入5.24μL A23187 溶液(1mg A23187溶于2mL水)使其终浓度为5μM，吸取40μL原生质体在荧光显微镜下分别在5min、10min、15min、20min时观察原生质体内的绿色荧光强度变化，结果如图4所示。由图4可知，A23187能增强原生质体内的荧光强度，且在四个时间段内荧光强度没有明显的变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种枣树原生质体的高效分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将枣树愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基中，进行黑暗培养，得到悬浮细胞；
(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在黑暗条件下进行酶解，得到酶解细胞液；
(3)用细胞筛过滤所述酶解细胞液，对滤液进行离心，得到枣树原生质体。
2.根据权利要求1所述的一种枣树原生质体的高效分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基4～5g/L，麦芽糖18～22g，琼脂5～6g，NAA0.4～0.6mg/L和TDZ 2～4mg/L，所述黑暗培养的转速为110～130r/min，所述黑暗培养的温度为24～26℃。
3.根据权利要求1或2所述的一种枣树原生质体的高效分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基4～5g/L，蔗糖235～245g/L和麦芽糖提取物0.4～0.6g/L；
所述酶解液包括纤维素酶R101.4～1.6％，离析酶R100.8～1.2％，甘露醇0.6～0.8M和酶解母液40～60％，所述酶解母液包括NaH2PO40.02～0.04％，MES 0.2～0.4％和CaCl2·2H2O 0.6～0.8％；
所述EME培养基、酶解液与悬浮细胞的用量比为1～2mL:1～2mL:2～3g；
所述酶解的温度为24～26℃，所述酶解的转速为20～50r/min，所述酶解的时间为15～18h。
4.根据权利要求3所述的一种枣树原生质体的高效分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞筛的孔径为35～45μM；
所述离心的转速为90～110g/min，所述离心的时间为4～6min。
5.根据权利要求4所述的一种枣树原生质体的高效分离方法，其特征在于，还包括步骤(4)：对步骤(3)所得枣树原生质体进行洗涤的步骤，所述洗涤为将枣树原生质体与洗涤缓冲液混合，离心，弃上清，所述洗涤的次数为2～4次；
所述洗涤缓冲液以水为溶剂，包括以下组成：KH2PO40.02～0.03g/L，KNO30.08～0.12g/L，MgSO40.2～0.3g/L，KI 0.00015～0.00025g/L，CuSO4·5H2O 0.0000025～0.0000035g/L，甘露醇125～135g；
所述洗涤缓冲液与枣树原生质体的用量比为1～2mL:0.4～0.6g；
所述离心的转速为90～110g/min，所述离心的时间为4～6min。
6.权利要求1～5任意一项所述高效分离方法得到的枣树原生质体。
7.权利要求6所述的枣树原生质体在钙离子信号检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111209718.8A CN113717924A (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111209718.8A CN113717924A (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113717924A true CN113717924A (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=78686007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111209718.8A Pending CN113717924A (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113717924A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04360633A (ja) * | 1991-06-04 | 1992-12-14 | Norin Suisan Gijutsu Joho Kyokai | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 |
| JPH08172955A (ja) * | 1994-12-26 | 1996-07-09 | Sapporo Breweries Ltd | オオムギ植物体の再生方法 |
| CN103834611A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-06-04 | 西北农林科技大学 | 一种丹参原生质体的分离纯化方法 |
| WO2018192961A1 (en) * | 2017-04-18 | 2018-10-25 | Markus Sack | Improved genome editing in differentiated cells |
| CN111705033A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-09-25 | 中南林业科技大学 | 一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法 |
-
2021
- 2021-10-18 CN CN202111209718.8A patent/CN113717924A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04360633A (ja) * | 1991-06-04 | 1992-12-14 | Norin Suisan Gijutsu Joho Kyokai | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 |
| JPH08172955A (ja) * | 1994-12-26 | 1996-07-09 | Sapporo Breweries Ltd | オオムギ植物体の再生方法 |
| CN103834611A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-06-04 | 西北农林科技大学 | 一种丹参原生质体的分离纯化方法 |
| WO2018192961A1 (en) * | 2017-04-18 | 2018-10-25 | Markus Sack | Improved genome editing in differentiated cells |
| CN111705033A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-09-25 | 中南林业科技大学 | 一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 何业华,胡芳名,谢碧霞,何钢,胡中沂: "枣树原生质体培养及其植株再生", 中南林学院学报 * |
| 何业华,胡芳名,谢碧霞,胡中沂,何钢: "枣树原生质体分离条件的研究", 中南林学院学报 * |
| 刘晓光;刘孟军;宁强;彭艳芳;苗利军;秦子禹;: "冬枣花药愈伤组织的诱导及原生质体分离", 中国农学通报 * |
| 王红梅,续九如: "枣树离体培养研究进展", 河北林果研究 * |
| 郭烨: "枣树优良品种叶片离体再生体系构建与多倍体诱导初探", 中国 优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑 * |
| 齐向英;陈宗礼;薛皓;刘航娟;行文珍;谢路;: "狗头枣叶片原生质体分离研究", 中国野生植物资源 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Larkin | Purification and viability determinations of plant protoplasts | |
| CN103667176B (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN102517384A (zh) | 一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法 | |
| CN106167787B (zh) | 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法 | |
| CN109628374A (zh) | 猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法 | |
| CN105754927B (zh) | 缢江蓠原生质体的制备方法 | |
| CN106967670A (zh) | 一种杜梨原生质体的制备方法 | |
| CN104388380B (zh) | 一种提取梨花粉管液泡的方法 | |
| CN103374545A (zh) | 一种游离苹果果肉原生质体的方法及其专用试剂盒 | |
| CN101475933A (zh) | 一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法 | |
| CN113717924A (zh) | 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 | |
| CN113897330A (zh) | 一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用 | |
| CN104403988B (zh) | 一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法 | |
| CN109370976A (zh) | 马蔺叶肉原生质体及其制备方法 | |
| CN105941148A (zh) | 矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法 | |
| CN105993929B (zh) | 一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法 | |
| JP7025524B2 (ja) | 非動員末梢血を利用した不均一性造血幹細胞・前駆細胞の製造方法 | |
| Müller et al. | Transfer of a marine DNA virus from Ectocarpus to Feldmannia (Ectocarpales, Phaeophyceae): aberrant symptoms and restitution of the host | |
| CN113249296B (zh) | 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法 | |
| Meziane et al. | Regeneration of Algerian | |
| Tret’yakova et al. | Callusogenesis and somatic embryogenesis induction in hybrid embryos from the seeds of Pinus sibirica | |
| US20190100726A1 (en) | Method to obtain vegetable fibers from the isolation and cultivation of meristematic cells | |
| CN104212878B (zh) | 一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法 | |
| CN115615785B (zh) | 一种利用预换液技术提高梨花粉管细胞壁甲酯化果胶染色效果的方法 | |
| CN103087980A (zh) | 凝集素用于识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及应用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211130 |