CN109880788A

CN109880788A - 不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系

Info

Publication number: CN109880788A
Application number: CN201910275835.0A
Authority: CN
Inventors: 冉毅东; 高崑; 张康
Original assignee: Ji Nuowo Bio Tech Ltd Tianjin
Current assignee: Ji Nuowo Bio Tech Ltd Tianjin
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；本发明以油菜无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R‑10和离析酶R‑10，对油菜叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入油菜原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出大量油菜转基因植株。

Description

不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系

技术领域

本发明涉及转基因工程领域，具体涉及不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L)是重要的油料作物，不仅可用于人类消费，其饼粕还可用于动物饲料等食品业和工业加工。而今，传统育种手段越来越无法满足日益变化的品种需求。油菜品种的进一步改良很大程度上取决于功能基因的拓展广度和深度。体外诱导、细胞融合和遗传转化等原生质体操作手段为遗传变异提供了新的来源(Vamling andGlimelius,1990)，同时体细胞杂交也为远缘物种间的遗传物质交换和重组提供了新的可能(Jourdan and Salazar,1993；Heath and Earle,1997)。时下，基因组编辑技术为功能基因组学研究打开了一个新的领域，与其结合的原生质体转化体系将成为作物改良的有力工具(Voytas and Gao,2104；Jones,2015)。原生质体转化体系的关键在于诱导组织的再生能力，所以甘蓝型油菜的下胚轴和叶片是原生质体分离和培养重要来源。之前的报道主要是利用三个甘蓝型油菜品种的下胚轴获得原生质体再生植株(Glimelius,1984；Kirti,1988；Kirti and Chopra,1988；Pua,1990；Pauk,1991；Olin-Fatih,1996)，基因型依赖性大，转化效率高低不一，试验操作重演性差，而叶肉原生质体再生植株存在极少成功范例(Glimelius,1984；Müller and Sonntag,1998,Sahab et al,2018)。

发明内容

为了提高甘蓝型油菜原生质体转化效率，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：

1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；

2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；

所述C:B固体培养基为将C液体培养基和B液体培养基等体积混合，再加入凝固剂，得到C:B固体培养基；

所述C液体培养基包括2-3g/L KNO₃、0.2-0.3g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.2-0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.2-0.3g/L(NH₄)₂SO₄、0.1-0.2g/L NaH₂PO₄·H₂O、0.01-0.1g/LCaHPO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、40-50g/L山梨醇、40-50g/L甘露醇、1-2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L 1MKOH水溶液；

所述B液体培养基包括1.5-2g/L KNO₃、0.5-1g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1-0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、1-10mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L 1M KOH水溶液；

3)将所述细胞团在含有潮霉素的A液体培养基中诱导培养，得到愈伤组织；

所述含有潮霉素的A液体培养基由潮霉素和A液体培养基组成；

所述A液体培养基包括0.5-1.5g/L KNO₃、0.5-1g/LNH₄NO₃、0.2-0.5g/L CaCl₂·2H₂O、0.5-1g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、0.01-0.1g/L琥珀酸铵、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/LVB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、1-3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L 1M KOH水溶液；

4)将所述愈伤组织在MS固体再生培养基上分化培养，得到分化出丛生芽的愈伤组织；

所述MS固体再生培养基包括2-3g/L KNO₃、1-2g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1-0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.05-0.2mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.05-0.2mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、20-40g/L蔗糖、0.1-0.3mg/L激动素、5-6mg/L 1M KOH水溶液；

5)将所述分化出丛生芽的愈伤组织进行生根培养，得到幼苗，实现甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子。

上述中，MS微量100×母液的配方见实施例表1，铁盐1000×母液的配方见实施例表2。

上述方法中，

所述C液体培养基包括2.5g/L KNO₃、0.25g/LNH₄NO₃、0.9g/L CaCl₂·2H₂O、0.25g/LMgSO₄·7H₂O、0.25g/L(NH₄)₂SO₄、0.15g/L NaH₂PO₄·H₂O、0.05g/L CaHPO₄、10mL/L MS微量100×母液、1mL/L铁盐1000×母液、100mg/L肌醇、0.1mg/L VB₁、0.5mg/L VB₆、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、400mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和5.7mg/L 1M KOH水溶液；

或，所述B液体培养基包括1.9g/L KNO₃、0.6g/LNH₄NO₃、0.6g/L CaCl₂·2H₂O、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.17g/L KH₂PO₄、10mL/L MS微量100×母液、1mL/L铁盐1000×母液、100mg/L肌醇、0.1mg/L VB₁、0.5mg/L VB₆、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、400mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和5.7mg/L 1M KOH水溶液；

或，所述MS固体再生培养基包括1.9g/L KNO₃、1.65g/LNH₄NO₃、0.73g/L CaCl₂·2H₂O、0.37g/L MgSO₄·7H₂O、0.17g/L KH₂PO₄、10mL/L MS微量100×母液、1mL/L铁盐1000×母液、100mg/L肌醇、0.1mg/L VB₁、0.5mg/L VB₆、0.1mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、20g/L蔗糖、0.2mg/L激动素、5.7mg/L 1M KOH水溶液；

或，所述含有潮霉素的A液体培养基中的潮霉素浓度为10-40mg/L；

或，所述含有潮霉素的A液体培养基中的潮霉素浓度为25mg/L；

或，所述MS固体再生培养基还包括凝固剂；

或，所述各个培养基的余量均为水。

上述生根培养采用的培养基为1/2MS B5，具体配方见实施例的表3。

上述方法中，

所述分裂培养的条件为24-26℃黑暗培养7天；

或，所述诱导培养的条件为24-26℃黑暗摇动诱导培养3-4周；

或，所述分化培养的条件24-26℃弱光条件分化培养6-8周；

或，步骤3)和4)之间还包括将所述愈伤组织在所述含有潮霉素的A液体培养基中24-26℃弱光条件下摇动诱导培养6-8周。

上述方法中，

所述弱光条件的光照强度为1500lux，光照周期为24h；

或，所述弱光条件的光照强度为1000-2000lux，光照周期为24h；

或，所述摇动诱导培养的转速为50-120rpm。

上述方法中，

步骤1)包括如下步骤：

1-a)用纤维素酶R-10和离析酶R-10消化，得到消化产物；

2-b)第一次过滤所述消化产物，收集第一次过滤的滤液；

再将第一次过滤的滤渣用所述C液体培养基清洗，洗涤后产物进行二次过滤，收集二次过滤的滤液；

再合所述并第一次过滤的滤液和所述二次过滤的滤液，得到原生质体。

所述过滤的孔径大小为20-100um；

或，所述过滤的孔径大小为70μm。

上述方法中，

所述用纤维素酶R-10和离析酶R-10消化甘蓝型油菜叶片包括如下步骤：将所述甘蓝型油菜叶片浸泡在含有纤维素酶R-10和离析酶R-10的酶解液中，

所述酶解液中纤维素酶R-10的浓度为0-0.05g/ml，且不为0；

所述酶解液中离析酶R10的浓度为0-0.01g/ml，且不为0；

或，所述酶解液中纤维素酶R-10的浓度为0.01g/ml；

所述酶解液中离析酶R10的浓度为0.004g/ml；

或，所述酶解液由所述纤维素酶R-10、所述离析酶R-10和D液体培养基组成；

所述酶解液配方每100mLD液体培养基(C液体培养基中终浓度为30g/L的蔗糖更换为40g/L，其他组分不变)中添加纤维素酶R10(Sigma 22178-25G)1g，离析酶R10(北京华越洋WX034)0.4g，用1M KOH调pH至5.6，过滤灭菌，分装后保存于-20℃条件下。

所述D液体培养基为将所述C液体培养基中的蔗糖浓度替换为40g/L，其余组分不变；

或，所述酶解液的pH值为5.2-5.8；

或，所述酶解液的pH值为5.6。

上述方法中，

所述浸泡时间为25-28℃静置16-18小时。

上述方法中，

步骤2-b)后，还包括洗涤原生质体的步骤，具体用密度梯度沉降和W5洗液洗涤。

本发明另一个目的是提供一种制备甘蓝型油菜原生质体的方法。

本发明提供的方法，包括上述方法的步骤1)。

由上述方法制备的原生质体在获得再生甘蓝型油菜植株中的应用也是本发明保护的范围；

或，由上述方法制备的原生质体在甘蓝型油菜遗传转化中的应用也是本发明保护的范围。

本发明以油菜无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R-10和离析酶R-10，对油菜叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入油菜原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出了大量油菜转基因植株。

本发明一方面可分离出大量高纯度的原生质体，另一方面能将质粒DNA成功高效地转入原生质体中，同时原生质体可成功被培养成又能获得大量高表达的转基因植株。为后续油菜良种培育的批量生产奠定了基础。本发明可为亚细胞定位、启动子表达等功能基因组学研究以及植物体细胞融合、遗传转化、基因组编辑等品种改良提供了可能。本发明成功了应用在了中国主栽油菜品种上，为油菜品种的改良和遗传学研究做了初步探索。

附图说明

图1为原生质体Evans blue染色后的图。

图2为原生质体PEG转化时的示意图。

图3为原生质体细胞分裂的图。

图4为原生质体诱导成愈伤组织后悬浮培养图。

图5为愈伤组织诱导丛生芽图。

图6为生根幼苗生长图。

图7为PCR鉴定转基因植株结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的制备原生质体分离、转化和再生的母液和培养基如下：

表1 MS微量100×母液配方

成份	终浓度mg/L	500mL母液(g)
			CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	2.5	0.00125
KI	83	0.0415
			MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	1690	0.845
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	620	0.31
			CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	2.5	0.00125
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	25	0.0125
			ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	860	0.43

表2铁盐1000×母液配方(溶剂为水，溶质为FeNaEDTA)

成份	终浓度mg/L	500mL母液(g)
			FeNaEDTA	36700	18.35

表3培养基配方

表3中每种培养基的液体形态和固体形态差别仅在于是否加入凝固剂。

1M KOH水溶液为自然pH值。

酶解液：每100mLD液体培养基(C培养基中终浓度为30g/L的蔗糖更换为40g/L，其余组分不变)中添加纤维素酶R10(Sigma 22178-25G)1g，离析酶R10(北京华越洋WX034)0.4g，用1M KOH调pH至5.6，过滤灭菌，分装后保存于-20℃条件下。

W5洗液：取氯化钠8.9g，氯化钙18.4g，氯化钾0.37g，葡萄糖0.9g，加水定容至1L，用1M KOH调pH至5.8-6.0，121℃高压灭菌20min。

Evans Blue染液：将0.25g的Evans Blue粉末溶解于100mL W5洗液中，过滤灭菌。

转化液：取甘露醇9.1g，氯化镁1.425g，乙磺酸0.1g，加水定容至100mL，用1M KOH调pH至5.6，过滤灭菌。

含有聚乙二醇(PEG)的溶液：将40gPEG溶解到100mL添加了7.29g甘露醇、1.64g硝酸钙的液体(溶剂为水)中，用1M KOH调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，分装后保存于-20℃条件下。

C:B培养基：将0.6g的海斑琼脂糖加入至100mL C液体培养基和B液体培养基按1：1(体积比)比例的混合溶液中，微波炉高火加热5s，至琼脂糖溶解完全。

实施例1、油菜原生质体的分离、纯化和转化

一、油菜原生质体的分离、纯化

1、无菌苗的培养

1)秤取1g左右的油菜种子(扬油7号)放入15mL离心管中。

2)加入5mL 75％的乙醇水溶液轻摇5min后丢弃废液，并用无菌水冲洗1次。

3)用体积百分比0.05％Tween20和10％过氧化氢的混合溶液表面消毒15min，再用无菌水冲洗5次。

4)点播于盛有1/2MS B5培养基的90mm×15mm的培养皿中(每皿30粒)，放置于24℃、光周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为84μmol/m²/s条件的生长室中。

5)1.5-2周后，种子长出第一片真叶时切取叶片移栽至盛有1/2MS B5培养基的10cm(上口)×7cm(下口)×10cm的方形培养盒中(每盒两株)，24℃、光周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为84μmol/m²/s条件下培养4周。

6)依照相同的方法每4周取叶片进行原生质体分离和提取，可持续4个月之久。

2、原生质体的分离和纯化

1)3-4周后，无菌条件下切取2-4片完全展开的幼嫩叶片，浸于酶解液(9cm培养皿中大约12mL)中，去除主叶脉，切成8-12mm²方形，继续添加3mL酶解液，培养皿用封口膜封口并用铝箔包裹，于25℃静置过夜(16小时)。

2)轻柔晃动培养皿使原生质体充分释放出来，用70μm的滤膜过滤酶解后的混合物，收集滤液，用巴斯德吸管将滤膜上的残留物小心吸入到培养皿中，添加5mL C培养基，再次晃动培养皿以清洗酶解物，再次通过滤膜过滤直至不再有原生质体析出，并将所得滤液混合，得到分离原生质体溶液。

3)将混合滤液分装到14mL圆底离心管中并缓缓加入1mL的W5洗液，于400r/min离心5min，待溶液分层后，用巴斯德吸管将中间绿色的原生质体层吸出并转移至新的14ml离心管中。

4)在离心管中加入7mL W5洗液，轻柔来回倾斜离心管使原生质体混匀，于400r/min离心5min。

5)移除上清液，加入2-5mL W5洗液，相同方式混匀并放置在冰上待用，得到纯化后原生质体溶液。

3、检测原生质体

将上述2的5)得到的纯化后原生质体溶液或上述2)得到的分离原生质体溶液分别稀释10倍后，取5μL原生质体溶液滴加至血细胞计数板上，同时滴加5μL0.25％Evans Blue染液，室温下静置5min后，于显微镜下计数未染色的活细胞率超过90％，以及原生质体的产量为7.1×10⁶(如图1)。

原生质体的产量＝X/9×5000×原生质体溶液的体积×稀释倍数；

X为显微镜下计数细胞计数板中9个大正方形中的细胞数。

显微镜下观察纯度,清晰稳定的完整细胞在90％以上，且不被Evans Blue染色,证明得到高纯度的原生质体。

统计纯化率，纯化率＝(纯化后原生质体的产量/分离原生质体的产量)*100％，为93％。

二、原生质体的转化

A、瞬时表达实验

1、质粒DNA(pCambia1305.2：hp+gfp；优宝生物VT2113，表达GFP)在无水乙醇中析出并消毒后，用无菌超纯水溶解至终浓度最低为0.7μg/μL，得到质粒DNA溶液。

2、纯化后原生质体溶液计数完成后，于400r/min离心5min，去除上清液，按比例加入转化液，使重悬原生质体的浓度达到1.6×10⁶个/mL，得到原生质体悬浮液。

3、向新的14mL离心管中加入300μL(原生质体数为5×10⁵)原生质体悬浮液，加入30μL质粒DNA溶液(质粒和原生质体的配比20-30ug：5×10⁵个)，边旋转离心管边缓慢从管壁四周加入300μL含有PEG的溶液(如图2)，测向轻柔来回晃动离心管使之充分混匀，室温条件下静止15min，每隔3min晃动一次。

4、按照1mL、2mL、3mL的次序分别向离心管中W5溶液，每次间隔2min并充分混匀，于400r/min离心5min。

5、最后加入6mL W5溶液充分混匀，于400r/min离心5min。

6、瞬时表达实验中，移除上清液，加入2.5mL C培养基重悬后，得到已经转化质粒的原生质体悬浮液，于25℃黑暗条件下培养24h后，于荧光显微镜下观察。

结果，超过80％的原生质体呈现绿色，表明遗传转化效率为80％。

遗传转化率％＝荧光显微镜下绿色荧光细胞占总细胞数量的百分比。

B、原生质体的培养、转化系的筛选及再生

1、原生质体分裂

向60mm×8mm的培养皿中加入0.5mL上述A的步骤6得到的已经转化质粒的原生质体悬浮液(原生质体数为5×10⁵)，再加入4.5mL提前预热、45℃左右的C:B培养基(用于原生质体分裂)，充分混匀使之恰好平铺于培养皿中。待培养基冷却固化后，将培养皿封口并置于24℃黑暗条件下分裂培养7天，得到细胞团(由原生质体分裂得到)。

培养过程中可以观察到第一次和随后多次细胞分裂(如图3)。

2、诱导形成愈伤组织

将上述1得到的带有细胞团的琼脂块(含有312个细胞团)，转移到250mL培养皿中，加入20mL添加了25mg/L潮霉素的A液体培养基(A液体培养基配方见表1)，24℃黑暗条件下80rpm(JANKE&KUNKEL KS250)摇动诱导培养(如图4)，3-4周后，得到由原生质体诱导形成的愈伤组织，共102粒。

计算植板率＝由原生质体诱导形成的愈伤组织数量/细胞团数量的百分比。

即植板率为(102/312)*100％＝33％。

3、分化丛生芽

将上述2得到的愈伤组织在添加了25mg/L潮霉素的A液体培养基24℃24h弱光条件(1500lux)下80rpm培养6周后，得到培养后抗性愈伤组织；

再将培养后抗性愈伤组织转移到MS再生培养基上，24℃24h弱光条件(1500lux)分化培养6周，得到分化出丛生芽的愈伤组织(丛生芽的幼芽长度为3-4cm)(如图5)。

统计再生率为13％。

再生率％＝分化出丛生芽的愈伤组织的数量/由原生质体诱导形成的愈伤组织数量的百分率

4、生根培育

待上述3得到分化出丛生芽的愈伤组织转移到1/2MS B5培养基上，24℃暗光条件下生根培养，3周后，得到生根幼苗(如图6)。

5、壮苗扩繁

继续生根培养，待生根幼苗地上部分长至10cm左右且诱导出2条以上强壮根系时，移栽至12×12cm的花盆中，于光照强度140μmol/m²/s、光周期光照14h/黑暗10h、苗期昼夜温度为20/15℃、孕穗及灌浆期昼夜温度为30/20℃的生长室中壮苗扩繁，长成健壮植株，得到T0代转基因扬油7号植株。

本次试验采用5×10⁵个转化质粒后的原生质体进行组培，获得了102个培养后抗性愈伤组织，最终再生出13株T0代转基因植株。

6、PCR鉴定转基因植株

利用TIANGEN快速型植物基因组DNA提取系统试剂盒提取T0代转基因扬油7号植株的基因组DNA，用如下hpt基因引物序列：引物Ⅰ的核苷酸序列是：5′gtgtcacgttgcaagacctg3′；引物Ⅱ的核苷酸序列是：5′TTCTACACAGCCATCGGTC 3′进行PCR扩增。hpt基因扩增片段大小为680bp

结果如图7所示，得到680bp的为阳性转化植株。

13株T0代转基因扬油7号植株全部为阳性转化植株。

实施例2、油菜原生质体的分离、纯化和转化

一、油菜原生质体的分离、纯化

与实施例1的一的方法相同，仅将扬油7号分别随机替换为甘蓝型油菜(Brassicanapus L)中得到中双10号原生质体、南阳41原生质体、云油49号原生质体、宁杂11号原生质体、9603原生质体、秦优11号原生质体。

二、原生质体的转化

按实施例1的二的方法进行培养，均获得了中双10号转基因植株、南阳41转基因植株、云油49号转基因植株、宁杂11号转基因植株、9603转基因植株、秦优11号转基因植株。

统计转化过程中各个结果如表4所示。

表4

上述表中各个指标计算公式如下：

原生质体的产量＝X/9×5000×原生质体溶液的体积×稀释倍数；

X为显微镜下计数细胞计数板中9个大正方形中的细胞数。

纯化率％＝(纯化后原生质体的产量/分离原生质体的产量)*100％

植板率％＝由原生质体诱导形成的愈伤组织数量/细胞团数量的百分比

结果中双10号转基因植株、南阳41转基因植株、云油49号转基因植株、宁杂11号转基因植株、9603转基因植株、秦优11号转基因植株的再生率分别为81％，75％，79％，69％,72％,89％和80％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：

1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；

所述C液体培养基包括2-3g/L KNO₃、0.2-0.3g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.2-0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.2-0.3g/L(NH₄)₂SO₄、0.1-0.2g/L NaH₂PO₄·H₂O、0.01-0.1g/LCaHPO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、40-50g/L山梨醇、40-50g/L甘露醇、1-2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L1MKOH水溶液；

所述B液体培养基包括1.5-2g/L KNO₃、0.5-1g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1-0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、1-10mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L1MKOH水溶液；

所述A液体培养基包括0.5-1.5g/L KNO₃、0.5-1g/LNH₄NO₃、0.2-0.5g/L CaCl₂·2H₂O、0.5-1g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、0.01-0.1g/L琥珀酸铵、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.5-0.15mg/L VB₁、0.1-1mg/LVB₆、0.1-1mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、300-500mg/L水解酪蛋白、20-40g/L蔗糖、1-3mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、5-6mg/L1M KOH水溶液；

所述MS固体再生培养基包括2-3g/L KNO₃、1-2g/LNH₄NO₃、0.5-1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1-0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1-0.2g/L KH₂PO₄、5-15mL/L MS微量100×母液、0.5-1.5mL/L铁盐1000×母液、50-150mg/L肌醇、0.05-0.2mg/L VB₁、0.1-1mg/L VB₆、0.05-0.2mg/L烟酸、1-3mg/L甘氨酸、20-40g/L蔗糖、0.1-0.3mg/L激动素、5-6mg/L1M KOH水溶液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述C液体培养基包括2.5g/L KNO₃、0.25g/LNH₄NO₃、0.9g/L CaCl₂·2H₂O、0.25g/LMgSO₄·7H₂O、0.25g/L(NH₄)₂SO₄、0.15g/L NaH₂PO₄·H₂O、0.05g/L CaHPO₄、10mL/L MS微量100×母液、1mL/L铁盐1000×母液、100mg/L肌醇、0.1mg/L VB₁、0.5mg/L VB₆、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、400mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和5.7mg/L1M KOH水溶液；

或，所述B液体培养基包括1.9g/L KNO₃、0.6g/LNH₄NO₃、0.6g/L CaCl₂·2H₂O、0.3g/LMgSO₄·7H₂O、0.17g/L KH₂PO₄、10mL/L MS微量100×母液、1mL/L铁盐1000×母液、100mg/L肌醇、0.1mg/L VB₁、0.5mg/L VB₆、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、400mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和5.7mg/L1M KOH水溶液；

或，所述含有潮霉素的A液体培养基中的潮霉素浓度为25mg/L；

或，所述MS固体再生培养基还包括凝固剂；

或，所述各个培养基的余量均为水。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述分裂培养的条件为24-26℃黑暗培养7天；

或，所述诱导培养的条件为24-26℃黑暗摇动诱导培养3-4周；

或，所述分化培养的条件24-26℃弱光条件分化培养6-8周；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述弱光条件的光照强度为1500lux，光照周期为24h；

或，所述弱光条件的光照强度为1000-2000lux，光照周期为24h；

或，所述摇动诱导培养的转速为50-120rpm。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1)包括如下步骤：

1-a)用纤维素酶R-10和离析酶R-10消化，得到消化产物；

2-b)第一次过滤所述消化产物，收集第一次过滤的滤液；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述酶解液中纤维素酶R-10的浓度为0-0.05g/ml，且不为0；

所述酶解液中离析酶R10的浓度为0-0.01g/ml，且不为0；

或，所述酶解液中纤维素酶R-10的浓度为0.01g/ml；

所述酶解液中离析酶R10的浓度为0.004g/ml；

或，所述酶解液的pH值为5.2-5.8；

或，所述酶解液的pH值为5.6。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述浸泡时间为25-28℃静置16-18小时。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤2-b)后，还包括洗涤原生质体的步骤。

9.一种制备甘蓝型油菜原生质体的方法，包括权利要求5-8中任一所述方法的步骤1)。

10.由权利要求9所述方法制备的原生质体在获得再生甘蓝型油菜植株中的应用；

或，由权利要求9所述方法制备的原生质体在甘蓝型油菜遗传转化中的应用。