CS244812B2 - Production method of propiferating plant cell agglomerates - Google Patents
Production method of propiferating plant cell agglomerates Download PDFInfo
- Publication number
- CS244812B2 CS244812B2 CS843072A CS307284A CS244812B2 CS 244812 B2 CS244812 B2 CS 244812B2 CS 843072 A CS843072 A CS 843072A CS 307284 A CS307284 A CS 307284A CS 244812 B2 CS244812 B2 CS 244812B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- protoplasts
- agarose
- particles
- broth
- agar
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 53
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 46
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 46
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 37
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 30
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 7
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 7
- 241000208278 Hyoscyamus Species 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000207748 Petunia Species 0.000 description 3
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 2
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIBOGIYPPWLDTI-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylacetic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(CC(=O)O)=CC=C21 VIBOGIYPPWLDTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 241000723221 Crepis Species 0.000 description 1
- 241000723218 Crepis capillaris Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001495123 Hyoscyamus muticus Species 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 101150044568 PRNP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- -1 hydroxyethyl groups Chemical group 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N nitrous oxide Inorganic materials [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S47/00—Plant husbandry
- Y10S47/11—The application of protective coatings to plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Způsob výroby proliferujících rostlinných buněčných shluků, přičemž se isolované protoplasty rovnoměrně rozdělí v živné půdě nebo na živné půdě, gelované pomocí agarosy získané z agaru, a/nebo tato předem upravená a galovaná živná půda se rozdělí na částice, tyto částice se přenesou do 1- až 10 ЗДЮ-nnsobku svého objemu živného roztoku vhodného k rozmnožování rostlinných buněk, a v kultivaci>se v obou případech pokračuje při teplotách 0 až 40 °C až do požadované velikosti buněčných shluků.
Předložený vynález se týká dále popsaného způsobu výroby popřípadě rozmnožování rostlinných buněk tvořených z protoplastů v kultivačnm prootředí.
Vzhledem k rychimu růstu obyvaelstva na zeměkooli tvoří kultivace zužitkovatelných rostlin jedno z těžlsek biologického výzkumu.
•
Na jedné straně se hledají alternativní, reprodukovatelné zdroje výživy, energie a surovin, jako například nové druhy rostlin, zejména hybridů s výhodnými vlastnostmi, například se . zvýSenou odolnootí vůči původcům chorob /jako fytopathogerrnímu hmyzu, houbám, bakteriím, viiůta atd./, vůči povětrnostní vivvim a vůči vlinuta okolí /jako teplu, chladu, větru, charakteru půdy, vlhkoosi, suchu atd./ nebo se zvýSenou schopnoosí tvorby zásobních látek v listech, semenech, hlízách, kořenech, stoncích atd.
Na druhé straně existuje vedle poptávky po cenné biomase také potřeba - farmaceuticky použitelných, rostinirných účinných látek a jejich derivátů, jako jsou například alkaloidy, steroidy atd., které vzhledem ke svým nepatrným výtěžkům z přírodních zdrojů, se v rostoucí míře činí dostupnými alternativní cestou, například extrakcí genově usměrněných druhů rostlin. ‘
Ecistuje tudíž rostoucí zájem na praktické mmonnesi záměrné mrnnpulace četnými druhy rostlin. Jak je dostatečně známo, mohou být isolované, t^oti^potentní buňky vyšších rostlin v živných nebo na živných půdách obsahujících polymery, příčinou vzniku embryonálních buněčných shluků a v některých případech vzniku rostlin schopných Života a rozmiožovvní.
Vzhledem k tomu, že relativně pevné buněčné stěny však obecně tvoří téměř nepřeklenutelnou bariéru pro madpulace, jako jsou fuse buněk nebo genové transplantace, používá se v těchto případech pouhých protoplastů, které se získaaí odstraněním buněčných stěn o sobě známými mtodami, pomocí enzymů /pektináz, celuláz atd./ z odJюoiddnících totipotentních, ^taktních buněk.
Jako gelovacího činidla pro živnou půdu pro rostlinné buňky a zejména také pro protoplasty se dosud používá agaru. Přitom však bylo zjištěno, že ag^ir působí na většinu protoplastů toxicky a je známo jen málo výjimečných případů, při kterých se zvláště odolné protoplasty dajlí úspěšně kultivovat také v agaru·
V poslední době se tudíž začínaaí hledat další, výhodné živné půdy. Kromě jiného bylo zjištěno, že alglnát a agar maaí rovnocenné vlastno!^, pokud jde o vytváření vrstev . /arov. Adaoha-Moanaso EN, Roscoe DH /1982/ Plant Sci. Let. 25: 61—66/.
Agarosa se dosud používala výlučně ke kultivaci živočišných buněk a k rozmnožování mikroorganismů. Při kultivaci rostinnných buněk se však vzhledem k odlišné fysiologii setkáváme se zcela jiným okruhem problémů.
tetody rozmnožování živočišných buněk nelze nepochybně přemést na rozmnožování rostlinných buněk, stejně tak málo jako na výrobu rostinirných buněčných shluků z protoplastů.
Úkolem vynálezu bylo tudíž zabránnt těžkostem, které se vyskyyují při kultivaci buněčných kultur získaných z rostininiých protoplastů za poiužtí agaru nebo čištěného agaru jako živné půdy, a vypracovat postup použitelný obecně na všechny, nejen na zvláště robustní, druhy protoplastů, který by u^c^žr^!.l kultivaci buněčných shluků, popřípadě embryo! áních rostlin za zabránění fytotoxcekým vivvm živné půdy, způsobem použitenným v praxi. Tento úkol řeší překvapující způsobem vynález.
Agarosa je jednou ze složek agaru. Aggr, který se vyskytuje na trhu, sestává - totiž hlavně ze smmsi n^u^rální agarosy a ionického agaro^^im s velkým počtem vázaných postranních * · skupin. Na trhu obvyklá agarosa se připravuje z agaru obecně obvyklými, kommrčními metodami.
Obecně zůstávají přitom zachovány některé postranní skupiny a určují v podstatě fyzikálně-chornické vlastnosti, jako je tvorba gelu a teplota gelování a teplota tání.
Agarosa tající a gelující při nízkých teplotách se vyrábí například dodatečným zavedením hydroxyethylových skupin do molekuly agarosy. Tato takovýmto způsobem modifikovaná agarosa bude dále označována jako LMT-agarosa /low melting agarose, tj. agarosa tající při nízké teplotě/.
Nyní bylo s překvapením zjištěno, že potíže vyskytující se při množení rostlinných buněk tvořených z protoplastů v agaru, zejména vysoká úmrtnost protoplastů, se dají velmi podstatně snížit nebo dokonce úplně odstranit náhradou agaru agarosou.
Rozmnožování buněk získaných z protoplastů lze dále zvýšit ještě tím, že se používá nejen živné půdy zpevněné agarosou, zejména LMT-agarosou, nýbrž tak, že se navíc tato Živná půda naočkovaná protoplasty rozdělí na malé částice /segmenty/ a tyto segmenty se jednotlivě nebo ve skupinách inkubují v živném roztoku až к vytvoření buněčných shluků žádané velikosti.
Nebylo možno v žádném případě předpokládat, že použitím agarosy libovolného původu bude možno rozhodujícím způsobem zvýšit schopnost к tvorbě buněčných kultur z různých druhů protoplastů, zejména z těch druhů protoplastů, které jsou citlivé vůči agaru tak, aby se dosud nekultivovatelné druhy protoplastů mohly nyní používat rovněž pro tvorbu buněčných shluků až celých rostlin.
Vynález se tudíž týká způsobu výroby proliferujících rostlinných buněčných shluků, který spočívá v tom, že se isolované protoplasty rovnoměrně rozdělí v živné půdě nebo na živé půdě, gelované pomocí agarosy získané z agaru, a/nebo tato předem upravená a gelovaná živná půda se rozdělí na částice, tyto částice se přenesou do 1- až 10 ООО-násobku svého objemu živného roztoku vhodného к rozmnožování rostlinných buněk, a v kutlivacl se v obou případech pokračuje při teplotách 0 až 40 °c až do požadované velikosti buněčných shluků.
Buněčným shlukem se rozumí takové kultury, které sestávají z přehledného /počitatelného/ počtu rostlinných buněk až к hotovým rostlinám.
Zvláště výhodné teploty pro kultivaci buněčných shluků se pohybují v rozmezí 12 až .30 °C. V popředí zájmu je technicko-průmyšlová kultivace rostlin z protoplastů. Při tomto novém postupu se účelně postupuje tak, že se metoda kultivace na deskách, která je obvyklá pro rozmnožování mikroorganismů modifikuje tak, že se známým způsobem isolované, sterilisované a čištěné protoplasty místo do agaru přidávají do /živné/ půdy zpevněné agarosou, v této půdě se rovnoměrně dispergují, a tímto způsobem protoplasty naočkovaná a agarosou gelovaná půda se rozdělí na menší, výhodně na stejné segmenty, tyto segmenty se pak jednotlivě nebo společně přidají do nádoby částečně naplněné vhodným živným roztokem a tato nádoba se při uvedených teplotách a popřípadě v temnu vystaví rovnoměrným třepavým pohybům tak dlouho, až vzniknou buněčné shluky nebo embryonální, životaschopné rostlinky požadované velikosti.
Segmenty agarosy prostoupené buněčnými shluky se hodí vynikajícím způsobem к další kultivaci ve velkoprovozním měřítku v bioreaktorech pro izolaci cenných zásobních látek.
Embryonální rostlinky se dají dále pěstovat až na dospělé rostliny, například na hybridní rostliny se zvláště výhodnými vlastnostmi a dále rozmnožovat biologicky normálním způsobem.
Výraz eegmit znamená v tomto případě trojrozměrný útvar obvykle stejné velikosti s nepravidenýfa nebo výhodně s pravidelným prostooovjm rozměrem, jako jsou například kotouče, kuličky, krychle, prismata, sloupce, kužele atd. se středem průřezim od 1 asi > do 100 mm, výhodně od 2 do 60 mm, zejména od 2 do 10 mm.
Pro velkoprovozní další kultivace buněčných shluků ve ferme! torech jsou vhodné zejména kuličkovité segmenty se středním průměrem.
Postup podle vynálezu je účinnnjSÍ než věechny známé způsoby, zejména při výrobě buněčných kultur z odolných, popřípadě citlivých probímových protoplastů. Tento postup se ' * · · . vyznačuje jednoduchými opatřeními a může se aplikovat na protoplasty různého původu a na na konjugované, jakož i na genově gransfoímované protoplasty.
Uvedený postup je vhodný k selektivní kultivaci rostlinných buněčných kultur s jednou nebo s několika shora popsanými výhodnými vlastnostmi. Kromě toho se může používat také v případě protoplastů získaných z nádorové tkáně.
Poořití agarosy ke kultivaci rostinirných buněk, popřípadě kolonní buněk je tudíž podstatnou složkou vynálezu, přičemž není rozhodující jakého druhu agarosy se používá, vzhledem k tomu, že různé typy agarosyse vzhledem k p^užtí podle vynálezu liší jen nepatrně a ve srovnání s agarem se dají principiálně lépe používat ke kultivaci rostiniuiých buněčných shluků tvořených z protoplastů.
I když ji-ž výsledky pokusů z dále uvedených příkladů 1 až 5 bezpochyby prokazi^í, že agarosa převyšuje při kultivaci rostinirných buněk z protoplastů ve všech případech zdaleka :
agar, dochází v praxi také při použií agarosy k určléému problému.
V některých případech je totiž možno že buněčné shluky vzniklé na počátku procesu zůstanou v pokraačuící vývojové fázi ve stavu klidu /dále nerostou/ nebo dokonce odwníraaí. ‘
Důvodem prvé skutečnooti je pravděpodobně vyčerpávání nebo vylouhování ’ živné půdy a důvodem druhého jevu jsou nejspíše přibývající toxické vyloučené produkty narostlých buněčných shluků. Oba nežádoucí jevy se však mohou překvapivě odstranit jednoduchým opatřenita.
Rozdílí!! se totiž primární živná půda zpevněná agarosou a naočkovaná .protoplMty, na menší segmenty, výhodně stejné velikosti a stejného tvaru, a přidá-li se k těmto segmentům, například v třepací nádobě výhodně s velkým objemem, vhodný kapalný živný roztok, pak je možno pozorovat ničím neomezovaný růst buněčných shluků.
Přitom je podle okolnootí výhodné, jestliže se vždy podle - druhů protoplastů provádí segmentace živné půdy zpevněné agarosou 0 až 7 dnů, ve většině případů 3 až 4 dny, po naočkování protopla^y. ’ ‘
Jako nejvýhc^e^r^něl^ií okamžik pro protoplasty druhu Petunia se ukázal 4. den, - pro tabák a Crepis caplllaris 3. den po naočkování. Pro protoplasty druhu Brassica rapa se segmentování provádí nejlépe ihned po gelování agarosy. . .
Vedle p^i^užiií agarosy jako zpevňovacího prostředku živné půdy představuje rozdělení živné půdy zpevněné agarosou a naočkované protopla^y na vhodné seg^nty důležitou součást vynálezu. K vynálezu náleží také buněčné shluky, popřípadě rostliny vyrobené tímto postupem.
živné roztoky používané v rámci popisovaného postupu, mohou k urychlení růstu buněk obsahovat také stopy organických sloučenin, jako jsou· například vitaminy, zdroje uhlíku, jako třtnoový cukr a glukózu, fytohomony, jako auxin a cytrkinin, a přírodní extrakty, jako sladový extrakt nebo mléko kokosových ořechů a popřípadě další jinak účelné přísady.
.244812
Podmínky kultivace, popřípadě podmínky inkubace, jako je například teplota živné půdy, účinek světla a trvání inkubace, popřípadě další kultivace, se dají přizpůsobit vždy daným okolnostem, jako je druh rostliny, popřípadě protoplastů nebo rozsah pokusu.
Získávání použitelných protoplastů se dále podrobně popisuje v předpisech a/ až c/, přičemž základní buněčná kultura může z libovolného orgánu nebo tkáně rostliny, například z kořenů, stonků, listů, květů, semen, pylu atd., například také z kalusové tkáně.
Mtoda výroby protoplastů jsou obecně známé a.nejsou omezeny na předpisy uvedené v předpisech a/ až c/.
Výrobní předpisy pro získávání čistých protoplastů: ,
Předpis a/:
Na suspenzi buněčných kultur auxotropní linie druhu Hyoscyamus muticus, získanou o sobě známým způsobem, se za účelem získání protoplastů působí roztokem obsahující 4 % /hmoonoot/ /objem/ celulázy Onozuka R. 10, 2 % /hmoonoot/objem/ driselázy v 0,25 mol sorbitolu, 0,025 mol CaC^ · 2 HjO, 0,5 % /hmotaioot/objem/ 2-/n-moofolin/ethemsuioonové kyseliny /sMSS/ o hodnotě . pH 5,2.
Inkubace probíhá v temnu přes noc při teplotě 26 °C. Směs se potom filtruje přes ocelové síto /průměr otvorů 100/im/ a filtrát se zředí sterým objemem 0,6 M roztoku sacharózy. Zředěný filtrát se převrství roztokem 0,16 M CaCR . 2 HjO a 0,5 % /hmotnost/objem/ MES /pH 5,6/ a vzniklé protoplasty se sbírají na rozmezí obou vrstev, dvakrát se promyjí roztokem používaným k převrstvení a uchovvwaí se v prostředí B1 vyrobeném podle Gebhhrdta a dalších [/1981/ Planta 153: 81-89] . [PPoosředí B1 se dále označuje jako živná půdafA^ .
Předpis b/:
Protoplasty tabáku /Nicotiana tabacum/ linie VR2 se izolují podle Shiilita a dalších /1981/ Muat. Res. 81: 165 - 175. čištění těchto protoplastů se však moodfikuje tm způsobem, že se protoplasty po inkubaci v enzymatickém roztoku zředí polovinou objemu 0,6 M roztoku sacharózy, zředěná směs se převrství roztokem chloridu vápenatého, který je uveden v předpisu a/, na rozhraní vrstev odeberou protoplasty, promyyí se sterým roztokem chloridu vápenatého jako shora a dále se postupuje ' sterým způsobem jako v předpisu a/*
Protoplasty se kultivuj v prostředí K3 /prostředí K3 se označuje dále jako živná půda B/.
Předpis c/:
Isolace protoplastů dvou linií Petunia hybrida a to haploidu Michali /РMB Neesleeter, 1980/, a muuátor-genu Petunia /Potrykus I /1970/ Z. Pfijnzenzuchaung 63: 24-40/.
Přitom se mladé, plně vyvinuté listy steTiUs^í po dobu 10 minut ve 100 ml roztoku, který obsahuje 0,01 % /hmtnoot/obj^/ chloridu rtuEnatého a 3 kapky smáčedla /Tween 80/, a pětkrát se prommyí de8aitovjmtu vodou. *
Vždy 6 polovin listu bez střední žilky se položí na sebe a smáčí se osmotickým roztokem /0,375 mol imanntolu, 0,05 mol chloridu vápenatého, 0,5 ΐ /hmotnoot/tbjem/ MES» pH 5,8/ a liety se rozřežou na tenké, 0,5 mm široké proužky.
Do těchto proužků infiltruje va vakuu roztok enzymu /0,2 % /hmotnost/objem/ celulázy Onozuka Ř. 10, 0,2 % /hmonoot/objem/ raacerpzymuj pH v osmotickém roztoku 5,6/.
б
Inkubace probíhá přes noc při teplotě 12 °C v temnu. Potom se přidá 1 objem shora uvedeného osmotického roztoku a směs se filtruje sítem s velikostí otvorů lÓO/um. Protoplasty se dvakrát promyjí osmotickým roztokem а к odstranění nežádoucích odpadních produktů .se přidá 0,6M roztok sacharózy.
Protoplasty odebírané na rozmezí vrstev se ještě jednou Čistí osmotickým roztokem a inkubují se v kultivačním prostředí /podle: Duranda a dalších /1973/, Z. Pflanzenphysiol. 69: 26-34/ 12 hodin v temnu a při teplotě 26 °C.
Dále uvedené výsledky srovnávacích pokusů přesvědčivě ilustrují překvapivé, výhodné účinky, které byly pozorovány při a/ náhradě agaru agarosou а Ь/ při segmentaci živných půd gelovaných agarosou při kultivaci rostlinných buněčných nhluků z protoplastů.
Příklady srovnávacích pokusů s agarem a agarosou jako živnou půdou:
alfa/ Pokusné podmínky:
Všechny živné roztoky se sterilisují ultrafiltrací /filtr o průřezu pórů 0,22^/^/. К získání gelovaných živných půd se smísí stejné objemy dvojnásobně koncentrovaného živného roztoku s dvojnásobně koncentrovaným a autoklavovaným gelovacím prostředkem.
Jako kapalné živné roztoky jsou vhodné například kultivační půdy, popřípadě živné roztoky označené dále písmeny А, В, C, D, a E:
А/ kompletní půda Bl: Gebhardt a další Planta, 153, 81 - 89 /1981/.
В/ půda K3: Nagy a Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78, 453 - 455 /1976/.
С/ půda DPD: Durand a další: Z. Pflanzenphysiologie 69, 26 - 34 /1973/.
D/ podle: Lindsmaier, E. M. a Skoog, F. Physiologia Plantarum 18, 100 - 127 /1965/.
Е/ podle: Nitsch, J. P. a Nitsch, C., Science 163, 85 - 87 /1969/.
Jako gelovacích prostředků nebo zahušřovacích prostředků se používá:
1/ agarosa> ve všech případech typ Sea Plaque LMT.fjen při pokusech, které se popisují v dále uvedeném příkladu 5, bylo použito tam uvedených druhů agarosy^j
2/ agar> ve všech případech typ Difco-Bacto-Agar.
3/ čištěný agarj 454 g agaru podle odst. 2/ se postupně promyje 10 litry vody, 5 litry acetonu a 5 litry ethanolu a vysuší se ve vakuu při teplotě 40 °C. Získá se bílý, pachu prostý prášek.
Protoplasty, které byly získány podle předpisů a/ až с/, se obvyklou metodou kultivace na deskách přenesou do Petriho misek v tenkých vrstvách do gelující a čisté živné půdy. Agar, popřípadě agarosa se, pokud není zvláště uvedeno jinak, používá v koncentraci 0,4 % /hmotnost/obj em/.
V Petriho miskách o průměru 6 cm se používá vždy 3 ml půdy a v Petriho miskách o průměru 9 cm se používá vždy 10 ml živné půdy.
Při testech, při kterých se používá segmentů agaru nebo segmentů agarosy, se protoplasty rovnoměrně rozdělí v živné půdě před její segmentací. Segmenty se potom přenesou do 30 ml živného roztoku v nádobách o průměru 10 cm a inkubují se v rotační třepačce při teplotě 26 °C v temnu nebo za světla, přičemž se kapalná živná půda vyměňuje v pravidelných intervalech nebo kontinuálně.
Ho^r^^oc^r^ií upotřebitelnosti metody, popřípadě příznivých vlivů na vznik buněčných kolonií z protoplastů se provádí pod mikroskopem vždy po 4 až 6 týdnech inkubace spočítánta a posouzením vytvořených buněčných shluků na representativním počtu políček rastru.
V případě pokusů za použití segmentů se misky se segmenty plovoucími v živném roztoku ve 14 denních intervalech fotografuj a buněčné shluky patrné na segmentech se vyhodnoouuí co do počtu a velikosti.
beta/ Výsledky testů:
Pfíkla d 1
Počet vytvořeným buněČných kolonní, vznikl.ých po kultivaci na deskách Ю® buněk nebo 105 protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus, linie VITI B9 /trp / v 10 ml zpevněné živné půty A/ zpevněná živná půda B
0,4 % agaru
0,4% agarosy
0,8% agarosy bez gelovacího prostředku buňky netestováno
024
000 protoplasty
O
102
472
120
Výsledky příkladu 1 že agarosa je jak při kultivaci buněk, tak i při kultivaci buněk z protoplastů vhodnnjší než agar, a že agar působí toxicky na protoplasty a buňky používané v tomto příkladu.
Dále používaným údajem hustota/ml se rozumí poSet protoplastů, popřípadě počet buněk v 1 ml živné půdy.
Příklad 2
Účinnost kultivace na deskách /%/ protoplastů tabáku /VR2/ při rostoucím ředění v živné půdě B
| hustota/ml | 6 000 | 3 000 | 1 000 | 300 |
| zpevněná živná půda B/ | ||||
| agarosa | shluk* | 4,3 | 2,2 | 0,22 |
| agar | shluk* | 1,9 | 0 | 0 |
| bez gelovacího prostředku | shluk* | 1,3 | 0 | 0 |
- buněčný shluk, jehož hustotu nebylo možno spoítat
Jak je patrno z výsledků příkladu 2, tvoří protoplasty tabáku /VR2/ buněčné shluky při vysoké hustotě již v agaru. Při rostoucta zřeďování převažuje poitivní vliv agarosy na vývoj buněčných kolonní.
Urychlený růst při nízkých koncentracích protoplastů potvrzují také výsledky třetího příkladu za p^t^užití protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus /VA5, his”/, a to jak ve srovnání s čišěěným agarem, tak i ve srovnání s kapalnou fází /živný roztok A/ bez gelovacího prostředku.
Příklad 3
Účinnost kultivace na deskách /%/ protoplastů Hyoscyamus muuicus /VA5, his-/ při rostoucím ředění v půdě A
| Huutota/ml | 11 000 | 3 700 | 1 300 | 600 |
| zpevněná živná půda A/ | ||||
| agarosa | shluk* | 9,5 | 3,2 | 0,25 |
| čištěný agar | 0,25 | 0,2 | 0 | 0 |
| bez gelovacího | ||||
| prosti řádku | 0,06 | 0 | 0 | 0 |
- buněčný shluk, jehož hustotu nebylo možno spooítat
Jak ukazuje následující příklad 4 na základě protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus /VIII, B9 trp-/, je toxický účinek agaru alespoň částečně způsobován difusnltai pochody v živné půdě, vzhledim k tomu že jak agar, tak i čištěný agar ve vrstvě nad vrstvou agarosy ihnibuje růst buněk.
Příklad 4
Počet vytvořených buněčných koXonXiíf vzniklých po kultivaci na deskách protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus /VIII B9 trp-/ v tenké vrstvě živné půdy A zpevněné agarosou jako gelovaclm prostředku, pod kterou je vrstva agarosy nebo čištěného agaru nebo agaru nebo v negelovaném živném roztoku /celkový objem 3 tój/.
| počet protoplastů/ml | 50 000 | 10 | 000 | |
| horní vrstva: | shodná | agarosa | shodná | agarosa |
| zpevněná živná | ||||
| půda A/ | ||||
| agarosa | 215 | 221 | 66 | 68 |
| čišUěný agar | 0 | 0 | 1 | 2 |
| agar | 0 | 0 | 0 | 0 |
| bez gelovacího | ||||
| prostředku | 48* | 3,3* |
- kontrola ve fojmě kapaliny
Násseddující. příklad 5 ukazuje na principiální způsobblost různých druhů agarosy při kultivaci protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus a tabáku /VR^/, která se projevuje při vysoké i nízké hustotě protoplastů.
Přitom figuruje čištěný agar a agar na konc± seznamu, zatímco Sea Plaque, BRL-LMT-garosy maaí podobné charakteristiky a podstatně převfšuuí všechny ostatní testované druhy agarosy.
čištěný agar a agar vykazuuí ve srovnání se všemi ' druhy agarosy a ve všech pokusech podstatně hořSíí výsledky a obecně maaí spíše inhibiční účinek na vývoj protoplastů.
Příklad 5
Pořadí zkoumarných druhů agaru a agarosy pro kvaaitativní t]x>t.řebitelnost při kultivaci buněčných kultur z protoplastů druhu Hyoscyamus muuicus a tabáku ^R/.
| pořadí | typ agarosy | výrobce |
| 1 | /Sea Plaque LMT | Mrině CollocTs^X |
| Bethesda RRsearch \ | ||
| 'jMP | Latooraories /BRL/ | | |
| 3 | typ VII | Sigma 1 |
| 4 | HGT | ÍSig™ > vhodn* |
| 6 | HGTP, HGT, LE | Maaině Ccoioids / |
| 8 | Standard ' LMT | BioRoad / |
| 9 | Sea-Prep /0,8 %/* | Marině CoM^ds J |
| 10 | čištěný agar | Ί pro praxi nevhodný, |
| 11 | Bacto-Agar | DifcoJ protože bývá často toxický |
S Všechny testy se provádějí při koncentraci 0,8 % a 0,4 % /hmotnost/objem/, vzledem k tomu, Že . již při těchto koncentracích se tvoří gel. Typ Sea Prnp tvoří gel teprve při koncentraci 0,8 % /hmotnott/objem/.
Vliv na tvorbu buněčných kultur po segmentaci zpevněné živné půdy naočkované protoplasty, která se nachází v tekutém živném roztoku, se zkoumá na protoplastech druhu Petunia a sice haploidu Miitceei.
Jako gelovacího prostředku se používá agaru, čištěného agaru a agarosy. Přitom se srovnává růst buněčných shluků na segmentech a na deskách podle obvyklé metody kultivace na deskách v Petriho miskách. Jak ukazují výsledky testu v dále uvedeném příkladu 6, je počet buněčných kolonií vytvořených z protoplastů na segmentech vždy vyžší než na obvyklých deskách, které nejsou obklopeny živným roztokem. Ze všech zkoumaných půd vedou segmenty z agarosy k nejvitálnějímu růstu buněčných shluků.
Příklad 6
Srovnávací pokus s vývojem buněčných shluků v gelovaných půdách podle obyfklé techniky kultivace na deskách a v segmentované formě v živném roztoku.
Procentuální podíl buněčných kolonií druhu Petunia hybrida, haploidu MlicltoH*, které vzniknou po 2 týdnech z protoplastů ve zpevněné půdě a přiom se bud rozdělí na segmenty a uchovváají se za třepání v živrném roztoku nebo se poi^<^c^t^a^aÍí nerozděleny v Petriho miskách.
же živný roztok C/
| hustota/ml | 8 x 104 | 4 x 104 | 2 X 10* | |||
| mtoda: | deska | segméent | deska | segment | deska | segment |
| agarosa | 14,8 | 22,8 | 26,0 | 31,2 | 27,2 | 52,4 |
| čištěný agar | 3,2 | 14,2 | 6,2 | 8,4 | 7,4 | 10,6 /»/ |
| agar | 2,6 | 5,4 | 2,2 | 3,2 | 0,12 | 0,81 |
Tento pokus velmi dobře demonstruje přednooti pouUžtí segmentované agarosy v kapalné živné půdě ve srovnání s použitím čištěného agaru a agaru, a to jak ve formě desek, tak i v segmentovaném stavu.
An logických výsledků se dosáhne například s protoplasty druhu Crepis caplilaris, protoplasty mutátor-genů Petunia hybrida Potrykus, protoplasty druhu Brassica rapa, druhu Lycooen8ieon esculenutim, jakož i druhu'Nicotlana tabacum.
Příklad 7
Regenerace rostlin z protoplastů druhu Nicotlana tabacum
A»i 5 x 104 protoplastů/ml druhu Nicotiana tahacím se disperguje v živné půdě B/ gelované pomooí 1 » /hmoOnoot/objem/ agarosy /půda КЗ/ a disperze se kutlivuje 10 dnů v uzavřených Petriho -miskách v klimatizované komoře /osvětlení 3 000 luxů, teplota 24 °C, vlhkost vzduchu asi 100 4/.
Potom se takto gelovaná živná půda rozdělí na stejně veliké segmenty /průměr 1 cm/ a tyto segmenty se přenesou do lOnásobku svého objemu ratifikovaného živného roztoku B/ s obsahem 0,25 mol sacharosy, 0,05 mg/litr 2,4-dichloffenoxyoctové kyseliny, 2 вд/litr 2-naftylocotové kyseliny, 0,1 mg^l-tr ó-bezylaminopurinu a 0,1 mg^l-tr kinetinu a v tomto roztoku se rovnoměrně protřepávají. ‘
Po jednom týdnu se živný roztok B/ obnoví, přičemž se obsah sacharosy sníží na 0,2 mol. Směs živného roztoku a segmentů se protřepává další 4 týdny a živný roztok se každý týden obnoví. Potom se vytvořené buněčné kolonie přenesou do živné půdy 0/ zpevněné agarosou s obsahem 0,2 mol sacharosy, 0,05 mgglltr 2,4-iichloffnnoxyoctoaé kyseliny, 2 mgAltr 2-naftyloctové kyseliny, 0,1 rogglltr ó-benzylaminopurinu a 0,1 г/ИЛо .kinetinu.
Tato statická kultura vytvoří během 4 týdnů kalusovou tkáň, která se přenese na živnou půdu D/ zpevněnou agarosou s obsahem 0,2 г/И^о ó-benzylaminopurinu, a na které se tvoří jednotlivé výhonky.
Tyto výhonky se přenesou na živnou půdu E/, která je zpevněna agarosou, a po vytvoření kořenů se zasází do země a pěstují se až do stádia zralých rostlin.
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (10)
1. Způsob výroby prooiferujících rostMnných buněčných shluků, vyznnččjjcí se tím, Že se isolované protoplasty rovnoměrně rozdělí v živné půdě nebo na živné půdě, gelované pomocí agarosy získané z agaru, a/nebo tato předem upravená a galovaná živná půda se rozdělí na částice, tyto částice se přenesou do 1- až 10 ttOOnnsobku svého objemu živného roztoku vhodného k rozmnožování rostlinných buněk, a v kujtiaaci se v obou případech pokračuje při teplotách O až 40 °C až do požadované ' velikosti buněčných shluků.
nebo
2. Způsob podle bodu 1, vyzn^č^ící se tím, že se používá transoomovaných protoplastů tranfoormovaných protoplastů s již opět regenerovanými buněčnými stěnami.
vají vané
3. Způsob podle bodu 2, vyzn^č^ící protoplasty s genovou transformací, fusí buněk.
se tím, že se jako tranfoomiované protoplasty použítransfoi^ací organel nebo protoplasty transfomio-
4. Způsob podle jednoho z bodů 1 až teplotě 12 až 30 °C.
3, vyznnččjící se tím, že se inkubace provádí při se tím, že svého objímu živného roztoku vhodného pro
5. Způsob podle bodu 1, vyznnččíuící -násobku se částice přidávsaí do 5rostlinných buněk.
až 10 0006. Způsob podle bodu 5, vyzn^č^ící se tm, že se částice přidávaai do 20- až 1C00-násobku svého objímu živného roztoku vhodného pro rozmnožování rostMnných - buněk.
244612
7. ZpŮeob podle jednoho z bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se rozdělení agarosou zpevněné primární živné půdy s protoplasty na částice provádí ihned po naočkování nebo v době až do 7 dnů po naočkování.
8. Způsob podle bodu 7, vyznačující se tím, že se rozdělení na částice provádí 3 až 4 dny po naočkovaní.
9. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 8, vyznačující se tím, že se používá částic stejné velikosti pravidelného prostorového rozměru se středním průřezem 1 až 1OO mm.
10. Způsob podle bodu 9, vyznačující se tím. Že se používá částic o středním průměru 2 až 60 mm.
11. Způsob podle bodu 10, vyznačující se tím, že se používá jako částic kotoučů, kuliček, krychlí, prismat, válců nebo kuželů o středním průměru 2 až 10 mm.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH231783 | 1983-04-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS307284A2 CS307284A2 (en) | 1985-09-17 |
| CS244812B2 true CS244812B2 (en) | 1986-08-14 |
Family
ID=4230979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS843072A CS244812B2 (en) | 1983-04-29 | 1984-04-25 | Production method of propiferating plant cell agglomerates |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4999299A (cs) |
| EP (1) | EP0129668B1 (cs) |
| JP (1) | JPS59224688A (cs) |
| AT (1) | ATE45766T1 (cs) |
| AU (1) | AU570954B2 (cs) |
| CA (1) | CA1262239A (cs) |
| CS (1) | CS244812B2 (cs) |
| DD (1) | DD223165A5 (cs) |
| DE (1) | DE3479518D1 (cs) |
| HU (1) | HU189407B (cs) |
| IE (1) | IE57267B1 (cs) |
| IL (1) | IL71678A (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE74162T1 (de) * | 1983-08-04 | 1992-04-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur erhaltung und vermehrung von defekten, nicht-infektioesen virusgenomen. |
| JPS60168381A (ja) * | 1984-02-09 | 1985-08-31 | Koasa Shoji Kk | ノリ葉体のプロトプラストの調製法 |
| US4960703A (en) * | 1986-04-23 | 1990-10-02 | Personnalite Juridique De La Station Des Cultures Fruitieres Et Maraicheres | Composition for in vitro micropropagation of plants |
| GB2195656B (en) * | 1986-06-26 | 1991-04-24 | Oji Paper Co | Mass propagation through short primordia |
| US5350689A (en) * | 1987-05-20 | 1994-09-27 | Ciba-Geigy Corporation | Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells |
| ES2074509T3 (es) * | 1989-10-27 | 1995-09-16 | Sakata Seed Corp | Metodo para cultivar protoplastos de tomate. |
| US5554530A (en) * | 1993-08-06 | 1996-09-10 | Universite De Montreal | Aseptic in vitro endomycorrhizal spore mass production |
| FR2738003B1 (fr) * | 1995-08-21 | 1997-11-07 | Pernod Ricard | Conditionnement pour boisson a base d'anethole |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1417505A (fr) * | 1963-12-06 | 1965-11-12 | Procédé pour la reproduction d'organismes vivants | |
| US4217730A (en) * | 1979-05-07 | 1980-08-19 | Weyerhaeuser Company | Embryogenesis of gymnosperm forest trees |
| SE445116B (sv) * | 1979-09-12 | 1986-06-02 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Sett att odla celler pa mikroberare med fibronektinytskikt |
| US4338745A (en) * | 1980-03-05 | 1982-07-13 | Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for mass propagation of plantlets |
| JPS5716692A (en) * | 1980-07-01 | 1982-01-28 | Nippon Paint Co Ltd | Cultivating method of plant cell |
| JPS57181693A (en) * | 1981-05-06 | 1982-11-09 | Microbial Chem Res Found | Regeneration of protoplast of actinomycetes |
| US4473648A (en) * | 1982-05-14 | 1984-09-25 | International Plant Research Institute | Process and nutrient medium for micropropagation of cassava |
| US4562663A (en) * | 1982-10-12 | 1986-01-07 | Plant Genetics, Inc. | Analogs of botanic seed |
-
1984
- 1984-04-25 CS CS843072A patent/CS244812B2/cs unknown
- 1984-04-25 DD DD84262311A patent/DD223165A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 EP EP84104706A patent/EP0129668B1/de not_active Expired
- 1984-04-26 AT AT84104706T patent/ATE45766T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 DE DE8484104706T patent/DE3479518D1/de not_active Expired
- 1984-04-27 IL IL71678A patent/IL71678A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-04-27 HU HU841664A patent/HU189407B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-04-27 IE IE1045/84A patent/IE57267B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-27 CA CA000452955A patent/CA1262239A/en not_active Expired
- 1984-04-27 AU AU27426/84A patent/AU570954B2/en not_active Ceased
- 1984-04-28 JP JP59087664A patent/JPS59224688A/ja active Granted
-
1988
- 1988-06-03 US US07/205,025 patent/US4999299A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU570954B2 (en) | 1988-03-31 |
| DE3479518D1 (en) | 1989-09-28 |
| JPS59224688A (ja) | 1984-12-17 |
| JPH0434395B2 (cs) | 1992-06-05 |
| IE841045L (en) | 1984-10-29 |
| CA1262239A (en) | 1989-10-10 |
| IL71678A0 (en) | 1984-07-31 |
| IE57267B1 (en) | 1992-07-01 |
| HU189407B (en) | 1986-07-28 |
| ATE45766T1 (de) | 1989-09-15 |
| EP0129668A2 (de) | 1985-01-02 |
| DD223165A5 (de) | 1985-06-05 |
| IL71678A (en) | 1987-02-27 |
| AU2742684A (en) | 1984-11-01 |
| CS307284A2 (en) | 1985-09-17 |
| EP0129668A3 (en) | 1985-12-27 |
| US4999299A (en) | 1991-03-12 |
| EP0129668B1 (de) | 1989-08-23 |
| HUT35277A (en) | 1985-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0332581B1 (de) | Regeneration von fertilen Gramineen-Pflanzen aus der Unterfamilie Pooideae ausgehend von Protoplasten | |
| Attree et al. | Regeneration of somatic embryos from protoplasts isolated from an embryogenic suspension culture of white spruce (Picea glauca) | |
| Gangopadhyay et al. | Enhanced rate of multiplication and rooting through the use of coir in aseptic liquid culture media | |
| KR890004025B1 (ko) | 원형질체의 배양방법 | |
| KR890004024B1 (ko) | 원형질체로 부터 벼 식물체의 재생방법 | |
| EP0380692B1 (en) | Plant tissue culture process | |
| CS244812B2 (en) | Production method of propiferating plant cell agglomerates | |
| Straub et al. | Tissue culture and long-term regeneration of Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud. | |
| Chen et al. | Development of protoplasts from Grateloupia sparsa and G. filicina (Halymeniaceae, Rhodophyta) | |
| Rusig et al. | Plant regeneration from protoplasts of Enteromorpha intestinalis (Chlorophyta, Ulvophyceae) as seedstock for macroagal culture | |
| EP0134536B1 (de) | Verfahren zur Erhaltung und Vermehrung von defekten, nicht-infektiösen Virusgenomen | |
| US5300128A (en) | Method of plant tissue culture | |
| Balestri et al. | Isolation and cell wall regeneration of protoplasts from Posidonia oceanica and Cymodocea nodosa | |
| Cocking et al. | The isolation of protoplasts | |
| Nadel et al. | Regulation of large scale embryogenesis in celery | |
| Maeda | Isolation and culture of protoplasts from moss protonemata | |
| Sita et al. | Preliminary studies on isolation and culture of protoplasts from sandalwood (Santalum album) | |
| KR890004026B1 (ko) | 원형질체의 배양방법 | |
| US5217892A (en) | Method of plant tissue culture | |
| Kitamura | Regeneration of plants from protoplasts of Duboisia | |
| Sarwar | The effect of different media and culture techniques on plating efficiency of strawberry mesophyll cells in culture | |
| Nuutila et al. | Somatic embryogenesis in birches (Betula spp.) | |
| Ruffoni et al. | Bioreactor culture trials of Lisianthus russellianus Hook protoplasts | |
| Honkanen et al. | 10. Towards Somatic Hybridization of Clovers | |
| Mitchell et al. | Haploid suspension and protoplast culture from isolated microspores of maize |