JPS60168381A - ノリ葉体のプロトプラストの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ノリ葉体のプロドブ２ストを調製する方法、
更に詳しくは、＃ｌ胞融合に有効に適用し得る、ノリ葉
体のプロトプラストを短時間で調製する方法に関する。

元来、ノリ葉体は、ａｍｏｎｇ成多楯類が多糖してセル
ロースから成っている陸上植物とは異なり、その細胞壁
は主としてキシラン及びマンナンから成る峻消化性多ｍ
類から構成されているため、ノリ葉体のプロトプラスト
の調製は困難とされていた。

本発明者は、さきに、ノリ業体ｔ、峻消化注多糖類の加
水分解能を有する微生物を、ノリ又はノリ由来の多ｗＡ
類を誘導物質として含む培地中で培養して得られる。マ
ンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素とを含有す
る酵素液で処理することによｐ、ノリ葉体のプロトプラ
ストを調製する方法に係る発明をなした（特−餡５８−
１４９３７１３号）。

しかし、本＠明者はその後更に研究を続けた結果、ノリ
葉体を予めプロテアーゼで処増し次後。

特定なマンナン加水分解＃累とキシラン加水分解＃累で
処理すると、−そう健全なノリ葉体のプロトプラストｔ
、ｔ、かも短時間で調製し侍ることの知見を得て本発明
ｔなすに至った。

すなわち、本発明は、細胞融合に有効に適用し得る健全
なノリ葉体のプロトプラストを短時間で１ｔＩｌ製でき
る方法を提供することを目的とする。

以ｆ本発明の詳細な説明する。

本発明は、ノリ葉体をプロテアーゼで処理したのち、β
−１，３キシラナーゼ及びβ−１，４マンナナーゼで処
理するか、もしくはβ−１，３キシラナーゼとβ−１，
４マンナナーゼ及びポルフィ２テーゼとで処理すること
を４＋＆＋黴とする。

ノリ葉体の細胞壁を構成する骨格多糖類は、前述した工
９に、キシラン及びマンナンでおるが、細胞間多糖類は
ポルフィ２ンから成り、又細胞壁の表層には成る櫨のメ
ンバク質及び脂質が存在しているといわ扛ている。しか
し、これら物質の化学的性状については殆んど解明され
ていないのが現状である。

木兄明番は、ノリ葉体よりキシラン、マンナン及びボル
フイランを分離、１ｆｌＲＬ、てそれの構造を過ヨウ素
酸酸化法、またそれらの単糖組成を加水分解物について
の液体クロマトグラフィー分析法に１９検討した結果、
キシランはキシロースのβ−１，ａ結合のモノポリマー
で６９、マンナンはマンノースのβ−１，４Ｉ＃Ｎ合の
モノポリマーであり。

また、ボルフイランはガラクトースのポリマーであるこ
とがわかった。更に、ノリ葉体のうちでも幼［１（１〜
２胃）ではポルフィ２ンの含量が僅少であるのに対し成
業（５α程度）ではポルフィ２ンの含量が比較的多いこ
ともわかつ友。

因に、陸生植物の中には／＃Ｂ胞壷傅成多械顎としてセ
ルロースのほかに稀にキシランを少量含むものもみらｎ
るがその殆んどはβ−１，４結合のものであり、また、
コンニャクのようにマンナンを主成な構成成分とするも
のではその単糖組成分はβＬ　４　ｔｉ　＆のクルコー
スとマンノースでめる。

本開明では上述した知見に１つｔｉ５　ツリ一体を予め
プロテアーゼで処理して細胞壁の表層に存在するメンバ
ク質の一８ｔ−加水分解したのち、幼葉の場合はβ〜１
．３キシラナーゼと／　−１，４マンナナーゼを併用し
て作用させ、成業の場合は上記両酵本に加えてポルフィ
２テーゼを併用して作用させることにより、細胞−の損
傷がない健全なプロドブ２ストを短時間で調製すること
に成功した。

すなわち、キシ２ン加水分解酵素は、β−１，３キシ２
ナーゼ及びβ−１，４キシラナーゼに、マンナン加水分
解酵素はβ−１，１７ンナナーゼ及びβ−１，４７ンナ
ナーゼにそれぞれ大別されるが、ｌ−１，４キシラナー
ゼとβ−１，８７ンナナーゼをノリ葉体に作用させても
その細胞壁を構成してい委多ｔａを加水分解することは
不可能でろって、β−１，３中シラナーゼとβ−１，４
７ンナナーゼヲ併用して作用させることによって上記多
糖類を加水分解し得るのでめる。しかし、ノリ葉体に直
接β−１，３キシ２ナーゼとβ−１，４マンナナーゼを
作用させた場合、ノリ葉体の縁辺ｆｆ１ｌｊＤ徐々に分
解が行わ扛、恰かも個々の細胞がポロリポロリと分離さ
れるようになって酵素処理に長時間′を要し、その次め
に細胞膜自体が損傷を受けるようになり。

場合によっては細胞内容物が流出することもめって、必
ずしも健全なプロトゲラストが得られなくなる。ｉた、
上述したようにボルフイラン含量の比較的多い成葉の場
合には上記両酵素を作用させ　。

てもｍ胸壁の完全な分解は不可能である。

斜上の理由から、本発明では、まず、ノリ葉体をプロテ
アーゼで処理するものであるが、該処理は常温（２５℃
根Ｆｉｔ）でｌＯ分程度行なうと工く、プロテアーゼと
してパパインを用いるのが好ましい。

このようにしてプロテアーゼ処理した葉体は、ついで洗
浄後、幼葉のと龜にはβ−１，３キシラナーゼとβ−１
８４７ンナナーゼの混合＃集液で常温ＦＶｃ２０分機健
処墳し、成業のときには上記両酵索に加えてポルフィ２
ナーゼを混合しｆｃ酵素液で同様に処理する。

本発明に従って、ノリ葉体を上述のように酵素処理する
と、葉体の縁辺部からではなく、葉体全体に亘って分解
が行なわれて葉体がバラバラに分離され、しかも短時間
（約３０分根度９で健全なプロトプラストが得られる。

因に−Ｓｔ＋述しｆｃ難消化性多多糖の加水分解能を有
する微生物を培養して得られる、キシラン加水分解酵素
とマンナン加水分解酵素とを含有する酵素液で処理する
ときは葉体のプロドブ２スト化に３〜４時間の長時間を
要する。　・ なお、本発明の方法に工って調製さｎ友ノリ葉体のプロ
トプラス）＆ベトリ皿内で人工海水（藻類用Ａａｐ、１
２　）に懸濁させ、ベトリ皿の底部に着生し次プロトプ
ラストの生育状況を観察したところ、生育状況は非常に
良好でめった。

以上述べたように、本発明によると、ａ施融會に適した
健全なノリ葉体のプロトプラストが極めて短時間で調製
し得るので、今後のノリ葉体の細胞融合技術の進展に寄
与し得るものと考える。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ ノリ葉体の幼葉（長さ１〜２ｍ）の約０．１ｇ（種型）
ｋＬ型試験管に収容し、これに０．５　Ｘパハイン液（
Ｍ／１５　）リス塩酸バッファー、…７、４　）　１０
−を加えて２５℃の温度で振盪下（１００ストローク／
分）に１０分間処理を行なった。ついで得られｆｃｌＲ
体を海水で十分洗浄し、更にＭ／１５リン酸バッファー
（ｐＨ７，０）で洗浄した後、別のＬ型試験管に収容し
、これにβ−１，３キシラナーゼ液５ｉｄ及びβ−１，
４マンナナーゼ液５−を添加し、２５℃の温度で振盪下
（１００ストローク／分ンで２０分間処理した。

このようドして得られ几処理液を顕微鏡下に観察したと
ころ、５．９　Ｘ　１０’個の細胞のプロトプラストが
確Ｍされた。

なお、本例で用いたβ−１，３キシラナーゼ及びβ−１
，４マンナナーゼは下記のようにして調製した。

β−１，３キシラナーゼ； 養殖中のノリ葉体に付層している細菌のうちで寒天分解
能を有するｍを釣菌して純粋分離したものを、海水にペ
プトン、酵母エキス等を加え、更にβ−１，３キシラン
を１％になるように添加した培地中で培養し、得らＣた
培養物を遠心分離して上精液を採取し、この上精液を硫
安に工り積装したのち、Ｍ／１５リン酸バッファー（１
）Ｈ７，０）で透析した。得られたβ−１，１キシラナ
ーゼは２ｓｕｎｉ　ｔｓ　／−であった。

β−１，４マンナナーゼ； 上記培地においてβ−１，３キシランに代えてβ−１，
４マンナンｔｌＸになるＬうに硝加したものを用いるほ
かは上記同様にして行なった。

得られたβ−１，４マンナナーゼは１８　ｕｎｉｔｓ／
　ｒｄであった。

ま友、パパインは和光紬薬工業に、にの製品（１０ｕｎ
ｉｔｓ／ｄＱ　）を用いた。

実施例２ 実施例１において、ノリ葉体の幼葉の代りに成葉（長さ
約５　ｃｔｔｔ　）を用い、β−１，３キシラナーゼ液
５−及びβ−１，４マンナナーゼ液５−に更にボルフイ
ラナーゼ液５−を添加するほかは実施例１に記載と同様
の手順でプロトプラスト化を行なった。

得らｎた処理液を顕微鏡下に観察したところ、４、　Ｏ
Ｘ　１０’個の細胞のプロトプラストが確−され′ｆＩ
−Ｏ なお、本例で用いたボルフイラナーゼは、上記β−１，
３キシラナーゼの一褒においてβ−１，３キシ２ンのＩ
Ｘに代えてボルフイランｔｌＸＫなるように添加し几培
地を用いるほかは同様にして調製した。

出願人　小汗商事株式会社 代理入営田広豊 １１−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ノリ葉体をプロテアーゼで処理したのち、β−１
   ，３キシラナーゼ及びβ−１，４７ンナナーゼで処理す
   るか、もしくはβ−１，３キシラナーゼとβ−１，４７
   ンナナーゼ及びボルフィシナーゼとで処理することを特
   徴とするノリ葉体のプロトプラストをｉ！１４製する方
   法。 （２１プロテアーゼがパパインである特許請求の職咄第
   １項に記載の方法。