JPS6041485A - 海苔のプロトプラストの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、海苔の健全なプロトプラストを調製する方法
、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し得る海苔のプ
ロトプラストを調製する方法に関する。・ 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細胞間の融
合、いわゆる細胞融合についての研究が非常に盛んとな
り、陸上植物においては既に実用化の段階にまで成功し
たものもみられるに至っている。

しかしながら、海藻類、特にアラノーリ頬に関１゜ての
細胞融合の研究報告は少なく、その成功例についても未
だのられていない。

因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物では市販
の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチーム等）を用い
て容易にそれらのプロトプラストを既製し得るけれども
、アマノリ類をプロトプラスト化できる酵素が現在のと
ころ入手し得ないため、アマノリ類の細胞融合の技術が
陸上植物に比べて遅れている一因と考えられる。

而して、アマノリ類をプロトプラスト化するための試み
としては今までのところ、藤田等による１酵素処理によ
るノリ、チオノリ類のプロトプラストの分離とその発生
」についての報告（日本水産学会、昭和５７年秋季講演
要旨集、第２３頁、２１３）がみられるのみである。こ
の墾田等による方法は、ｌｌ＋ｊ苔葉体を物理的手段で
細断して得られる葉片にンユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　）　ＳＰの菌株（Ｐ−１株）の培養液から
得た粗酵素液を約４時間程度作用させてプロトプラスト
を調製するものであるが、この方法ではプロトプラスト
を得るための酵素処理に゛長時間を要し、しかも海苔を
物理的に切断したものに酵素を作用させるので得られる
プロ］・プラス１〜が不健全になる可能性が高く、した
がってこのプロトプラストを用いての細胞融合に支障を
きたすおそれがある。蓋し、細胞融合の手法においては
それに用いるプロトプラス１〜の健全度が非常に主要な
要因であって、プロトプラストが不健全であると細胞融
合に当っての融合率が低くなって以後の培養による生育
も劣るようになると考えられるからである。

また、上記方法で海苔葉体を切断するのは、シュードモ
ナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表層部分には作用
せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊してプ
ロトプラストとなるとの認識に基づいているものと考え
られる。

Ｐｒｅｓ　ｔｏｎ等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミクロフ
ィブリル形態のキシランから構成されており、細胞光間
物質としてボルフイランが存在しているとされる。また
、Ｌ、、Ａ、ｌ１ａｎｉｃ等によると、海苔の表層には
蛋白質から成る薄い被覆が存在しているとされる。すな
わち、このような海苔の組織上の観点から、海苔は切断
しなければプロ１へプラスト化できないと考えられてい
たものと思われる。

本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプロトプラ
ス１−を得るには、海苔を物理的に切断することなくそ
の表層から崩壊させることが必要であるとの見地から海
苔のプロトプラスト化について検討した結果、海苔を少
なくともマンナン加水分解６ゲ素およびキシラン加水分
解酵素を含有する酵素液で処理するか、更にはポリフィ
ラン加水分解酵素も含有する酵素液で処理することによ
り、海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得るこ
との知見を得て本発明をなすに至った。

すなわち、本発明の目的は、細胞融合に有効に適用し得
る海苔の健全なプロトプラストを１Ｍ［する方法を提供
することにある。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明の構成上の主要な特徴は、海苔葉体をシュードモ
ナス属に属する難消化性多糖類の加水分解能を有する微
生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類を誘導物質とし
て含む培地中で培養して得られる培養液から調製される
少なくともマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵
素を含有する酵素液で処理することにある。なお、本発
明の其他の構成は以下の説明から明らかになるであろう
。

本発明で海苔のプロトプラスト 液の調製に利用される難消化性多糖類の加水分解能を′
有する微生物は、海水中から分離されたものであって、
上記多糖類であるマンナン、キシランおよびボルフイラ
ンの加水分解能を有し、下記のとおりの菌学的性質を有
する。

菌学的性質： ｉ）形態 ＺｏＢＥＬＬ　２２１６Ｅ培地に生育した細胞について
、（イ）細胞の形態は桿菌で大きさは０．５〜１μｍ×
１．５　〜２．５　μｍ （口）運動性を有し、鞭毛は単極温性 （ハ）ダラム染色性は陰性 ｉｉ）生育状態 ＺｏＢＥＬＬ　２２１６Ｅ斜面培地における生育状態、
（、イ）２０℃〜２７°Ｃの温度で良好に生育する（口
）淡黄色の色素を沈着 （ハ）毛状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）の集落を形成；：１）
生理学的性質 （イ）カタラーゼテスト　陽性 （口）オキシダーゼテスト　陽性 （ハ）グルコースよりの酸の生成　陽性（二）○ーＦテ
スト０ （ｌｌｕ８ｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法による）（ボ）　Ｖｉ
ｂｒｏ−Ｓｔａｔｉｃ　Ａｇｅｎｔ　（０　／　１２９
　＞陰性（へ）寒天液化能　＋ （ト）キシラン分解能　＋ （チ）マンナン分解能　＋ （す）好気性 上記菌学的性質に鑑み、本発明で利用する上記微生物は
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属す
る菌株であると同定し得る。なお、この菌株シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　ＳＰＩｌ＆ｌＰ　
Ｔ　−　５は微工研条寄Ｎｏ．　Ｂ　Ｐ−３３０の受託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

本発明では上記微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖
類を誘導物質として含む培地中で培養してマンナン加水
分解酵素、キシラン加水分解酵素更にはボルフイラン加
水分解酵素を培地中に生産する。

ここで用いる“海苔由来の多糖類”とは海苔を熱水抽出
して可溶性成分を除去して得られる、主として多糖類か
ら成る残渣、又は該残渣を更に精製処理して多糖類含量
を高めたものを意味する。

例えば、海苔を１０倍量の水に浸漬し、オートクレーブ
中で１２０°Ｃで３０分間加熱したのち、濾布を用いて
可溶性区分を除去し、得られる残渣について上記と同様
の手順で加熱して可溶性区分を除去する操作を繰返し行
い（５回程度）、ついで得られる残渣を１００％エタ，
ノールに浸漬し、室温にて一夜放置したのち、可溶性区
分を除去し、乾燥したものを多糖類から成る残渣として
用いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰返し
行って冴ら、れる残渣（エタノール浸漬を行っていない
もの）をＩＮ−ＮａＯＩＩ　ｉ’Ｊ液に浸漬し、室温に
て一夜放置したのら、可溶性区分を除去した残渣をＮａ
Ｏｌｌの２０％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液を遠
心分Ａｌｔし、その上澄液にフェーリング溶液を加えて
沈録を生成させ、この沈澱物を水６１；シてＣｕイオン
を除去して得られる多糖類（マンナン）もしくは上記フ
ェーリング溶液を加えて沈澱を生成させたときの上澄液
にＩＩＣＩを加えてｐＨを３に調整して得られる沈澱物
から成る多糖類（キシラン）をそれぞれ精製処理した多
糖類として用いる。

上記誘導物質としての海苔もしくは海苔由来の多糖類の
培地に対する添加量ばｌ乃至２重量％が適当である。

本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培地は、炭
素源として上記誘導物質を、窒素源としてペプトンおよ
び酵母エキスを、更には無機質としてＫＧ　１（ＰＯ，
＋、ＦｅＣｌヨなどを海水又は人工海水に溶解し、緩衝
液（例えばトリスバッファ−）でｐＨを７．５前後に調
整したものが好ましい。培地組成を例示すると下記のと
おりである。

培地組成： 海苔又は海苔由来の多糖類　１．０　（重量％）ペプト
ン　１．０ 酵母エキス　０．１ に２　ＨＰ　ＯＩ＋Ｏ−旧 ＦｅＣ１ｇ　０．６ｍｇ　／１ トリス緩衝液　０．１　（、ｉ景％） 上記割合で海水に溶解してｐｌ＋を７．５に調整する。

本発明で利用する上記微生物の上記培地における培養条
件は、２５℃の温度で４日間通気、攪拌通気下（通気１
１１０００〜２０００ｍ１／ｍｉｎ　、攪拌数１ｏｏ〜
３００　ｒ、ｐ、ｍ、）に行う。

上述のようにして培養して得られた培養液から酵素液を
調製するには、該培養液を４℃の温度で３０分間遠心分
離（１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、　）　シ、その上澄液を
酵素液とする。

このようにして得られる酵素液はマンナン加水分解酵素
、キシラン加水分箭祐￥素およびボルフイラン加水分Ｐ
！ｌ酵素を含有する。

本発明では上記培養に当たり、海苔由来の多糖ｋｉｔと
して主にマンナンもしくはキシランから成るものを誘導
物質として培地に含有させて主としてマンナン加水分解
酵素もしくはキシラン加水分解酵素をそれぞれ培地中に
生産させ、ｉηられる培養液からこれらの各酵素を主と
して含む酵素液を調製し、両者の酵素液を組合せて海苔
葉体のプロトプラスト化に用いることも可能である。

なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化にマンナン
加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を主に用いるのは
、前者が海苔の表層に存在する顆粒状のマンナンに作用
して葉体に大きく切断部を形成して細胞壁を形成してい
るミクロフィブリル形感の一キシランに対する後者の作
用をし易り干ることに基づくものであり、したがって、
キシラン加水分解酵素が海苔葉体のプ０．１・プラスト
化に最も重要な作用をしているものと言える。なお、ボ
ルフイラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞光間物質とし
てのボルフイランに作用しＣ分解するｐで該酵素を含む
酵素液を用いるとプロトプラスト化が−そう促進される
。

海苔葉体に作用させる上記酵素液の量は、海苔葉体を５
ｃｍ程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素液を５〜ＩＯ
倍に〃縮したもののＩＯｎ＋１程度が適当であり、３〜
４時間の作用で海苔のプロトプラストを１ｌＩｉｌ製し
得る。

また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用させるに
当って、該葉体にプロテアーゼを作用させると海苔の表
層を被覆している蛋白質の薄い層を分解し得るのでプロ
トプラストをａ製するうえで一層効果的である。プロテ
アーゼとしてはパパインが特に好ましり、１０％のパパ
イン液として葉体に１５〜３０分程度作用させると上記
蛋白質の薄層を有効に分解、除去し得る。

な゛お、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用は、上記
プロトプラスト化のための酵素液による処理に先立って
行ってもよく、又、該酵素液による処理と平行的に行っ
てもよい。

上述のようにして得られる海苔のプロトプラストによっ
てのみ調製されるものであるから健全な状態であって、
細胞融合に利用するのに適している。

例えば、本発明の方法で調製されたＹ）η苔のプロトプ
ラストをべ１・り皿内で人工海水（藻類用＾ｓｐ。

１２）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着生したプロトプ
ラストの生育状況を観察した結果によると生育状況は非
常に良好である。

叙上のように、本発明によると、海苔のプロトプラスト
が酵素的処理のみで健全な状態で得られるので、今後の
海苔の細胞融合技術の進展に益するものと言える。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ 蛋廻勿嵐整 ペプトン　１．０（重量％） 酵母エキス　０．１　（〃） Ｋｔｌ（Ｐｏ、　０．０１　（１ｔ） ＦｅＣＩＨ０，６ｍｇ　／］ トリス緩衝液　０．１（重量％） （トリスアミノメタン） 海苔の熱水抽出残渣　１．０（重量％）上記組成のもの
を海水に添加してｐＨ７，５に調整したものを培地に用
いた。

圃末ム皇肥製 上記培地にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
）　ｓｐ微工研条寄Ｎ［ＬＢＰ−３３０を接種し、３０
０ｒ、ｐ、ｍ、の攪拌下に通気しながら（通気量２００
０ｍ１　／ｍｉｎ　）２５℃で４日間培養を行った。

得られた培養液を４℃の温度で３０分間遠ノ已・分離（
１０，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、’）　シ、その上澄液を１０
イ音に９ｍＪ縮して酵素液とした。

このようにして調製した酵素液の焚１肖イし１生多１′
爪類に対する酵素活性を調べた結果番よ、下も己表Ｇこ
示ずと、おりである。

なお、参考として前述した藤田等の方θ５で用し）だ酵
素液の調製法を下記に示すとともに、その６￥素活性を
調べた結果も併せて表Ｇこ示した。

ｆ＋’ｌ素液の調製法： 培地組成 ＮＩｌ、ＮＯ３０，１（重量％） Ｋ２１（＋１０．＋０．ＯＬ　（、〃）ＦｅＣ１ａ　０
．６ｍｇ　／１ トリスアミノメタン　０．１（重量％）アサクサノリ粉
末　０．２（重量％） 上記組成を海水に添加してｐｌ＋を７．５に君周整。

アサクサノリわ）末は別に滅菌して）活力ｌした。

上記培地に、あらかじめ２日間培養したＰｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ　ｓｐの菌株を接種し、２５°Ｃで５日間通
気下に培養を行ない、ついで２日間静置培養を行ったの
ち、得られた培養液をセライト（スタンダードスーパー
セル〉で濾過、除菌したものを酵素液とした。

表 （注）　十＋　＋−・−活性が非常に強い十＋−−−・
−活性が強い ＋−−−−一活性が稍々強い ±・−−−−−一活性が弱い 表にみられるように、本発明で用いる酵素液はマンナン
およびキシランに対する活性が藤田等の方法で用いた酵
素液に比し優れている。

プロトプラストの− 海苔葉体を５ｃｍ程度のもの４〜５枚をＬ型試験管に入
れ、これに上記酵素液１０ｍ１を加えて海苔葉体を該酵
素液に浸漬しながら、２０°Ｃの温度でモノー型振盪器
を用いて４時間振盪（７０ストロー２７分）、させて海
苔のプロトプラス１〜を得た。

実施例２ 本例は海苔葉体のプロトプラスト 葉体にパパインを作用させた例を示したものである。な
お、パパインを葉体に作用させるほかは、実施例１と同
様な手順でプロトプラスト行った。

パパインによる几− Ｉ７型試験管に５ｃｍ程度の海苔葉体の４〜５枚を収容
し、これに１０％パパイン溶液（酢酸塩バ・ノツプ−に
溶解してｐｌ＋　６．０にしたもの）　１０ｍｌを添加
して海苔葉体を該パパイン溶液に浸漬しながら、２５℃
の温度で２０分間振盪（モノー型振盪器７０ストローク
／分）させた。

プロトプラストの８ 上述のようにしてパパインを作用させた海苔葉体を、実
施例１に記載した手順に従って酵素液で６０分間処理し
てプロトプラストを調整した。

出願人　小漫商事株式会社 代理人　宮　１）広　豊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、海苔葉体を、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｓ　）に属する難消化性多糖類の加水分解能を有す
   る微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類を誘導物質
   として含む培地中で培養して得られる培養液から調製し
   た少なくともマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解
   酵素とを含有する酵素液で処理することを特徴とする海
   苔のプロトプラストを調製する方法。 ２、プロテアーゼを作用させた海苔葉体を、シュード秀
   ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属する難消化性
   多糖類の加水分解能を有する微生物を、海苔又は海苔由
   来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して得ら
   れる培養液から調製した少なくともマンナン加水分解酵
   素とキシラン加水分機とする海苔のプロトプラストを調
   製する方法。 ３８海苔葉体を、プロテアーゼと、シュードモナス属（
   Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属する難消化性多糖類の
   加水分解能を有する微生物を、海苔または海苔由来の多
   環類を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培
   養液から調製した少なくともマンナン加水分解酵素とキ
   シラン加水分解酵素とを含有する酵素液で処理すること
   を特徴とする海苔のプロトプラストをｉｌｌｉｌ　ｍす
   る方法。 ４、海藻由来の多糖類は海苔を熱水抽出して得られる多
   糖類含有残渣である特許請求の範囲第１項乃至第３項の
   いずれかに記載の方法。 ５、海苔由来の多糖類は海苔を熱水抽出して得られる残
   渣を精製処理したものである特許請求の範囲第１項乃至
   第３項のいずれかに記載の方法。 ６、酵素液はボルフイラン加水分解酵素も含有するもの
   である特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記
   載の方法。 液とキシラン加水分解酵素を含有する酵素液とを組合す
   たものである特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
   かに記載の方法。 ８、培地は窒素源としてペプトンおよび酵母エキスを含
   有するものである特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
   ずれかに記載の方法。 ９、プロテアーゼがパパインである特許請求の範囲第２
   項又は第３項記載の方法。