JPH04501206A

JPH04501206A - 新規藻類細胞分解酵素

Info

Publication number: JPH04501206A
Application number: JP1510285A
Authority: JP
Inventors: リウ，チーリ
Original assignee: ノボ―ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1989-09-15
Publication date: 1992-03-05
Also published as: AU4335189A; EP0434752B1; DE68908183D1; WO1990002794A1; CA1333574C; EP0434752A1; DE68908183T2; US5139945A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規藻類細胞分解酵素本発明は、アルガルサイドおよび粘液抑制剤として有用な酵素に関し、更に詳しくは藻類細胞を分解し更に粘度の増加を抑制するために使用できる新規アルギネートリアーゼに関する。

発明の背景以下の内容は周知である。すなわち、冷却水システム（水を再循環する）において微生物の未制御増殖は、群系の堆積をもたらし、これは付着、腐食およびスケールの原因となる。

粘液は、パイプを詰まらせ、熱移動を防げ、あるいは冷却水系の適当な機能を妨害する。藻類、冷却水中のクロオココカス１並皿四匹些蛙、オスシートリア　０ｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ　およびクロロコカス　Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ　の存在は、付着を引きおこすものとして考えられている。加えて、藻類の粘液は、腐食性細菌更に恐ら（病原性細菌に対して生育地になるであろう。

多糖類であるアルギン酸（アルギネート）は、藻類細胞壁の主要素を構成する。

例えばフカス　ジスティカス　Ｆｕｃｕｓｄｉｓｔｉｃｈｕｓ）の如きある種の藻類において、アルギネートは全細胞壁の６０％を構成する。藻類に加えて、冷却水中の普通の細菌、例えばプソイドモナス　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓ　、は、細胞外の多糖類ポリマー（粘液）を生成し、これは付着、ガス発生および冷却水システム中の腐食性細菌の保護をもたらす。成る種のプソイドモナス　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓ　、によって生成される細胞外多Ｉ！類ポリマー（粘液）は、アルギネートとして同定されている（Ｌ、Ｒ，エバンス等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９７３．１１６　：９１５〜９２４）。

アルギネートは、三種の主構造ブロック、ポリーβ−Ｄ−アンヌロン酸（ポリ− Ｍ）、ポリーα−Ｌ−グルクロン酸（ポリ−〇）および双方のウロン酸が択一的配列であると考えられているブロック（ポリ−ＭＧ）のコポリマーである（　Ｈａｕｇ等、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、１９６７、２１　：　６９１〜７０４）。かくして、プソイドモナス　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ４由来の藻類細胞壁および粘液内のアルギネートを解重合し得るアルギネートリアーゼの如き酵素の作用はこれらの生物の溶解をもらすことができおよび／又は通常冷却水システム内に存する化学的殺生剤に対するこれらの生物の感受性を増加させる。いずれの結果も、これらのやっかいな微生物を生育不能とするであろうし、この結果は、冷却水の最良の操作にとって最も好ましい。

本発明の目的は、冷却水システムにおいて有効なアルギネートリアーゼを提供することにある。

本発明の別の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。

発明の論議非細胞源由来の酵素を含む、本発明の出願前の特徴ある全てのアルギネートリアーゼ酵素は、ユリミナーゼ反応を触媒するように思われ、この反応において非還元性Δ４．５−不飽和結合は、ウロン酸ポリマーの分解中に生成する（１．Ｗ、スーザーランド、Ｉｎ　１．５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ（［者）　、５ｕｒｆａｃｅ　Ｃａｒｂｏｈｙｄ−ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｅ１１．１９７７年、２０９〜２４５頁、アカデミツクブレス社、ロンドン）。

種々のアルギネートリアーゼは、アルギネートポリマー中のグルコネートもしくはマンヌロネートブロックに対して優先性を示し；従って、それらはグルロニダーゼもしくはアンヌロニダーゼとして区別され得る（１．Ｗ、ダビドソン等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７７、９８　＝２２３−２２９）。

アルギネートを分解する酵素を産生ずる多数の細菌が知られているが、これらの報告されたアルギネートリアーゼ生産菌の大部分は、海産の単離物である（Ｒ，Ｓ、Ｄｏｕｂｅｔ等、Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、１９Ｂ２．４４　：　７５４〜７５６およびＶ、Ｌ、ｕｏｎＲｉｅｓｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８（Ｌ　３９　：　９２〜９６）　、二、三の特徴づけられたアルギネートリアーゼが、陸地源の細菌Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、１９７７、５７　：　１６３−１７１）およびバシラス　サーキｓ　−７ＸＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｆｒｃｕｌａｎｓ　（Ｊ、Ｂ、Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８４．４７　：　７０４−７０９）由来のリアーゼである。本発明者が知る限りにおいて、高温性のプラム陽性アルギネートリアーゼ生産体はこれまで報告されていない。本発明のアルギネートリアーゼは、高温性バシラスｓｐ、から細菌外に生産される。

本発明のアルギネートリアーゼに対する本発明者らの最良の生産菌（Ｗ　３６− ７−４）は、分類学上（ＮＣＩＭＢによる）ｐＨ５，７で増殖する非定型バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ　の菌株として分類されている。しかし、本発明者らによって試験された相当数の他のＢ、ステアロサーモフィラス　Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ　菌株は、アルギネートリアーゼを生産しない。試験は、菌株、すなわち、ＮＲＲＬＢ５４０７．ＡＴＣＣ１２９８０−タイプの菌株；ＡＴＣＣ７９５３，１０１４９，３１？８３゜３１１９５．３１１９６．３１１９７．３１１９８および３１１９９の１０種であった。

試験した他のバシース　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓ　、菌株、すなわちＢ　コアギューンス　Ｃ０ａｕｌａｎＳＡＴＣＣ７０５０；　Ｂ、’　１三ｙｈ）Ｌｔ’：ｚ　７％ユ旦ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｎｉｓ　ＡＴＣＣ１４５８０；　Ｂ、ズプチ１ス　５ｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ６６３３；およびＢ、セレウス　ｃｅｒｅａｓ）　ＡＴＣＣ１１７７Ｂはアルギネートリアーゼを生産しない。従って、アルギネートリアーゼが生来の細胞外誘発性酵素であるような本発明者によって見出された非定型Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｓｔｅａｒｏ−ｐｈｅｒｏ＋ｏｐｈｉｌｕｓ）菌株はまた酵素の生産に対して非定型的である。

発明の詳細な説明便宜のため、本発明のアルギネートリアーゼの詳細な論議は、冷却水システム（ここにおいて水は再循環する）中でアルジサイドおよび粘液抑制剤としてのリアーゼの使用に向けられている。本発明者は、これらのアルギネートリアーゼ、例えば藻類由来の抽出細胞成分に対する他の用途を認識しておりかつそれを意図している。

本発明のより良き理解のため、添付の図面を参照されたい。

第１図は、ｐＨと温度に関する非定型／Ｎｌシラス　ステアロ力ニモフイラノＡ −Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）菌株−３６−７ −４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４）由来のアルギネートリアーゼの活性を示すグラフである。

第２図は、公知のアルギネートリアーゼに対する６０°Ｃでの菌株Ｗ３６−７− ４由来のアルギネートリアーゼの熱安定性を示すグラフであるや第２図から明らかなように、本発明のアルギネートリアーゼは、バクｉｉ囚−，サークユランス　ＢａＣ」］邦ｃｉｒｗｌａｎｓ）（ＡＴＣＣ１５５１８）およびゲ！」」巳ＬＬ−二ヱ」ノコＣＦ乙Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏ　ｈｉｌｉａ）（ＡＴＣＣ１３６３７）由来のアルギネートリアーゼよりもはるかに熱安定性が秀れている。

基質の非存在下６０°Ｃでの熱処理４時間後、本発明の酵素はその当初の活性を１００％保持しているが、一方！くシラス　サ−’ｆ　と−７Ｚ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）−由来の酵素はその当初の活性を完全に失っており更にザントモナス　マノにトフイＵヱユ如…彷匹ヨ漫」晩は卯恒旦硅由来の活性はその当初の活性の８８％を失っている。

アルギネートリアーゼの熱安定性の特徴、すなわち６０°Ｃでの安定性は、主な利点である。と言うのは、６０℃は冷却水システムが操作する通常の温度範囲での高い限度での温度だからである。従って、冷却水システム内でプソイドモナスｄ匹５）ｓｐｐ、により生産される藻類細胞壁および粘液のアルギネート成分を解重合するための本発明のアルギネートリアーゼの能力は、そのようなシステムにおける好ましい高レベルの（熱）安定性によって実証される。

藻類細胞懸濁液（冷却塔より得る）を本発明のアルギネートリアーゼで処理する場合、不飽和ウロン酸残部の定量的放出が得られるＣ表Ｉ参照）。この結果は、次の内容を実証している。すなわち、藻類細胞壁のアルギネート成分は、アルギネートリアーゼによって分解される。顕微鏡学には、微小穴を有する藻類細胞壁が、６０分の酵素処理後に観察される。

従って、本発明はまた、冷却水の処理方法にも関し、この方法は藻類の増殖を抑制するのに有効なアルギネート濃度を再循環中で保持することを含んでなる。

アルギネートリアーゼによって影響されるのは藻類のみではない。以下の内容は明らかである（第■表参照）。すなわち、アルギネートリアーゼは、冷却水システム中存在するやっかいな微生物でもあるブソイドモ　ス　エルギノザＰｓｅｕｄｏｍｏ　ａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ）　（ＴＡＣＣ９０２７）によって生産されたアルギネートポリマーも解重合することができる。殺生剤での冷却水の処理に対するＰ、エルギノザの抵抗性は、アルギネート含有エンベロープに帰因すると考えられている。本発明のアルギネートリアーゼでプソイドモナス　エルギノザを処理するとポリマー層を移行させ更に殺生剤に対する生物体の感受性を高めると考えられている。

アルギネートの他に、藻類細胞壁はまたラミナリン、すなわちβ−グルカナーゼにより解重合され得る多糖類をも含有する。

藻類細胞壁の分解に関する組合わせおよび恐らくは双乗効果は、第■表に示すように、本発明のアルギネートリアーゼおよび商業的に入手可能なβ−グルカナーゼ（例えばセレミックス（ｃｅｒｅｍｉｘ）　（登録商標）２ＸＬ）の双方を添加することによって達成され得る。実際、セレミックス（（ｃｅｒｅｍｉｘ）（登録商標）２ＸＬ）は、酵素活性、顕著にはβ−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、およびプロテアーゼ活性の混合物であるが更に商業的に入手可能な酵素製品は、しばしば実質的な副活性の酵素を有する。

従って、本発明はまた冷却水システムを、藻類の成長を抑制するために有効なレベルおよび割合のアルギネートリアーゼおよびβ−グルカナーゼで処理する方法を含んでなる。好ましいβ−グルカナーゼは、セレミックス（ｃｅｒｅｍｉｘ）　（登録商標）であり、これは他の望ましい酵素活性の存在に因り好都合に作用する。所望により、二種の酵素が存在するか又はβ−グルカナーゼの代りに、酵素の非抑制である化学的殺生剤（例えばグルタルアルデヒド、ヒドラジン）が存在し得る。

好都合には、本発明のアルギネートリアーゼは冷却水システムを処理するため通常使用される種々の試剤、例えばＥＤＴＡ、グルグルアルデヒドに匹敵する。第 ■表に示すように、アルギネートリアーゼは、キレート剤、種々の酸化体および典型的腐食防止剤と共に１６時間インキュベーション後、１００％の酵素活性を保持した。試験した試剤は、冷却水処理（１００ＰＰＭ）中で使用される通常の用量よりも約１０倍高い１０ｎ＋Ｈの最終濃度であった。従って、本発明の酵素を水処理試剤と組合わせて、特に冷却水システム中微生物の問題を制御するためこれまで通常用いられる化学試剤と組合わせて適用することも可能である。

更に本発明の別の面によれば、本発明のアルギネートリアーゼの製造方法が提供され、この方法はＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４により例示される非定型Ｂ、ステアロサーモフ４−　Ｘ　（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒａｍｏ−７のアルギネートリアーゼ生産菌株を好気性条件下、炭素、窒素および隣の同化源中で培養し、次いで発酵ブロスからアルギネートリアーゼ調製品を回収することを含んでなる。

使用方法前述のように、本発明のアルギネートリアーゼは、水システム、特に再循環水システム、例えば紙およびパルブ工業における冷却水又は再循環水（例えば「白液」又は「黒液」）中の微生物汚染を減少するため良好に適合する。酵素は室温ないし７０℃、特に４０〜６０°ＣでかつｐＨ４〜９、特にｐＨ５〜８で使用できる。アルギネートリアーゼの固体もしくは液体（コンセントレート）形が循環水にその有効量で添加される。最少有効量に関して余り助言はない。と言うのは、各水システムは独得である。例えば清浄な又は重度に汚染された水、水中での低もしくは高含量（塩化亜塩もしくは塩化ナトリウムは酵素を部分的に抑制すると思われる）、酵素の使用頻度、例えば連続的、缶周、毎月、殺生剤（もし有る場合）の量およびβ−グルカナーゼ、例えばセレミックス（ｃｅｒｅｍｉｘ）　２　ＸＬがまた水システム内に存在するか否かによるからである。

少なくとも有効な酵素用量を確定するため手探り法が堆償される。通常、以下に例示するよりも幾分少ない濃度で十分である。

本発明のアルギネートリアーゼの有効量、例えば水１２当たり２５００単位および恐らくは処理すべき量以下の量を湛水に添加できる。勿論、２５００／　ｆよりもより高レベルのアルギネートリアーゼも、もしコスト的に有効なら適用できる。２．５ｄ〜２５ｄのセレミックス（ｃｅｒｅｍｉｘ）　２　Ｘ　Ｌを２５００　ｕ　／　ｌのアルギネートリアーゼと組合わせても十分有効である。通常使用される殺生剤も又、通常堆償されるレベルである１０１００ＰＰ水処理化学に対する１９８９年のガイド）の濃度でアルギネートリアーゼと共に適用できる（と言うのは、酵素は大抵の殺生剤では抑制されないからである）。

微生物本発明の微生物は非定型バシラス　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｔｌｕｓ）の好気性バシラス単離的である。最良の生産体菌株目６−７−３（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４）は、ブダペスト条約に従い、アグリカルチエアル　リサーチ　カルチュア　コレクション（ＮＲＲＬ）　（ペオリア、イリノイス州、米国）に寄託された。

この菌株、Ｗ３６−７−４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４）の突然変異体および変異体並びに公知方法によって得られる−５８−７−１２によって例示される非定型バクｊノエニ（Ｌ乙三孟二ｊフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）の同様の菌株はまた、本発明の範囲内である。非定型バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）の他のリアーゼ生産菌株は、本発明者によって見出され更にある程度研究された例示したアルギネートリアーゼは、好ましい形態を構成する。形質転換された宿主細胞によるアルギネートリアーゼの生産も企図される。

生来のアルギネートリアーゼは誘発酵素であるが、しかし本質的に突然変異体又は形質転換細胞内で良好に造ることができる。

菌株−３６−７−４の増殖温度は、５０″Ｃ〜６０’Ｃであるが、６０”Ｃ以上では増殖は劣る。菌株−３６−７−４の増殖に対する至適ｐＨは７である。ｐＨ８，０以上では増殖はおこらない。

普通寒天斜面上で、菌株Ｗ３６−７−４の成熟コロニーは平滑表を有して透明である。

アルギネート　リアーゼ活性の分析アルギネート　リアーゼ活性の基礎的指標は、０．５％のアルギン酸ナトリウム溶液の粘度減少である。アルギネートリアーゼ反応の定量的評価は次の方法でなされた：（ａ　）　２３０ｎｗでのｔＪＶ吸光度の増加（Ｊ、Ｂｏｙｄ等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。

Ｒｅｓ、１９７７、５７　：　１６３−１７１）。２ｄのアルギン酸ナトリウム溶液（０，１％、０．２５％又は０．５％）（コれは１０ｍＭ（７）　！Ｊ　ン酸ナトリウム緩衝液中で作成される、ｐＨ７，０，１０ｎ＋Ｍ（７）ＭｇＣ１ｚ含有）に、適当に希釈された酵素ブロス０．１　ｄを添加し、反応混合物を、撹しく振とうしながら５５℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの終りに、２３０ｎｍでの吸光度の増加が分光光度計で観察された。特定の温度、通常５５°Ｃで毎分０．００１光学濃度単位（２３０ｎｏ＋）の増加をもたらすアルギネートリアーゼの量を１単位と定義した。

（ｂ）還元力基質溶液は前記の溶液と同一である。基質溶液（２−）および酵素溶液（ｌＩｌＩｌ、）を５５°Ｃで２時間インキュベートとし、ジニトロサリシネート試剤（２１ｄ）を添加した。マンヌロン酸として還元力をＧ、Ｎｏｅｔｉｎｇ等による方法に従って測定した（Ｇ、Ｎｏｅｔｉｎｇ等、Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｅｔａ、１９４Ｂ、　３１　：　２８６〜２９０）。

一定の消化条件の下、０．１２３■のマンヌロン酸に相当する還元力を発生する酵素の量として１単位の活性と定義した。

（Ｃ）チオバルビッール酸試験基質溶液は前記の溶液と同じである。基質溶液（２ｄ）および酵素溶液（ｌｄ）を、５５°Ｃで２時間インキュベートとした。不飽和ウロン酸の収率を、ワイスバッハおよびヘルウィッツ（Ａ、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、１９５９．２３４　：　７０５〜７０９）のベリオデント／チオバルビッール酸法によって測定した。

酵素活性の１単位を、分析において毎分光たりホルミルピルビン酸１　μｍｏｌ　；　０Ｄｓｎ＊の０．２９を発生させる０、０１６　ｍｏｌの当量を放出するに必要な酵素の量として定義した。

第１図（Ａ）において示されるように、バシラス　ステアｏｆ−モフ仁文ス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅ　ｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）菌株Ｗ３６−７−４由来のアルギネートリアーゼの最適活性は、ｐＨ７付近で認められた。本発明のアルギネートリアーゼ酵素が、第１（Ｂ）図に示す５０°Ｃ付近で至適温度を示すことは驚くべきことと考えられる。と言うのは、酵素を産生ずる微生物は高熱性だからである。

菌株−３６−７−４由来のアルギネートリアーゼは、高い至適温度を示すばかりでなく、第２図に示されるように６０″Ｃで良好な熱安定性を有するからである。籐四企フクヨ　サーキュランスＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　（ＡＴＣＣ１５５１Ｂ）およびザントモナスマルトフィリア　Ｘａｎｔｈｏｎ＋ｏｎａｓ　ｍａｌｔｏ　ｈｉｌｉａ）（ＡＴＣＣ（３６３７）由来のアルギネートリアーゼは、６０°での１時間の熱処理により当初活性の５５％および２９％をそれぞれ失った。本発明の酵素は、４時間の熱処理にわたってその酵素活性の１００％を保持した。

アルギネートリアーゼ　コンセントレートの調製バシース　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−μ咀ｒｐｇ２ｊ２月旦Ｏ−菌株−３６ −７−４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４）は、炭素および窒素並びに他の必須栄養源を含有する栄養培地中好気性条件下で培養できる。培地自体は、本発明の一部ではなく、バ之−ス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）菌株に対し当業者に公知の原則に従って調製できる。

もしもそのようなことが望まれる場合、アルギン酸ナトリウムが炭素源および酵素インデューサーとして使用できる。

培地に混入されるアルギネートの濃度は、広く変えることができ、例えば培地溶液濃度０．１〜１％が通常適当である。

栄養培地中の窒素源は、を機又は無機物質である。可能な有機窒素源の内、発酵プロセス（桿菌の培養を含む）で通常用いられるものは、例えば大豆粉、綿実粉、ピーナツ粉、コーンステイープリカー、および酵母エキスである。加えて、栄養培地はまた通常の微量物質をも含む。

餅ｕ至１は、高温性であり、培養は比較的に高温度（例えば５５°Ｃ）で行われる。タンク発酵器内での菌株−３６−７−４又はその突然変異体もしくは変異体の培養に対し人工的通気が堆償される。通気速度は、通常のタンク（浸漬）発酵内で用いられるものであってよい。

発酵後、産物アルギネートリアーゼ（これは菌体外に産生される）は、発酵ブロスから粗大物質の除去し、次いで常法、例えば低温蒸発又は限界口過によりブロスを濃縮して液体形で得られる。最後に、コンセントレートに保存剤を添加する。

本発明によれば、アルギネートリアーゼは又、本発明のバーンラノエΩ３ａｃｉｌｌｕｓ）菌株由来のアルギネートリアーゼをコードしかつ発現する遺伝子を含有する形質転換微生物細胞を培養し、次いで培養ブロスから酵素を回収することによって調製できる。該形質転換宿主微生物は、宿主細胞を含んでなりここにおいて、アルギネートリアーゼおよび発現ＤＮＡのための遺伝子を組換体ＤＮＡ手法により挿入する。このような手法は公知であり通常次の工程を含んでなる：ａ）遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ−配列およびバシラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルギネートリアーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる適当な組換体ＤＮＡクローニングベクターを得る工程；ｂ）工程ａ）のクローニングベクターで適当な宿主生物を形質転換する工程；およびＣ）適当な培地中で形質転換宿主を培養し次いで培地からアルギネートリアーゼを回収する工程。

好ましい宿主生物は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、特にバシラノ　ズブチリス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株である。

固体の酵素調製（これが望ましい場合）は、精製されおよび／又は濃縮発酵ブロスからＮａ、ＳＯ，の如き塩又はエタノールもしくはアセトンの如き水混和性溶剤を用いて沈殿させることにより調製できる。発酵ブロス中の全ての水を適当な乾燥方法例えばスプレー乾燥により除去する方法も採用できる。

ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４の培養により得られた粗製アルギネートリアーゼ調製品の活性は、通常１ｇの粉末光たり約５０００単位である。

本発明の好ましいアルギネートリアーゼ調製品は、勿論、冷却水処理剤、例えば無粉塵性粒質物、安定化液体もしくは保護酵素として商業上流通に適した形態である。

無粉塵性酵素粒質物は、周知であり、例えばオランダ特許１６７９９３　（ノボ社）、米国特許４，１０６．９９１（ノボ社）又は米国特許４，６６１．４５２（ノボ社）に従って調製でき、更に所望により粒質物は周知方法でコートできる。

液体アルギネートリアーゼは例えばプロピレングリコール、他のポリオール、糖、糖アルコールおよびホウ酸を添加することにより安定化される。

次の実施例は酵素の調製、その特徴およびその例示的使用に関する。

実施例１バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｎ＋ｏｐｈｉ　Ｉｕｓ）菌株−３６−７−４（ＮＲＲＬ　Ｂ−３０１８３９４）を、以下の組成の培地５０戚を有する２５０ｔｌ！の三重バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中で回転振動テーブル（２５０ｒｐｍ）で５５°Ｃで培養した：１１当たりの培地の組成（ｇ）ニドリブトン　１．０（Ｎ）１．）　ＺＳＯ４２，０Ｋ）１．ＰＯ，１，３Ｎａ、ＨＰｏ、　３．５ＭｇＣ１□〜２Ｈ２００，２ＣａＣ１ｚ−２Ｈｚ０　０．２アルギン酸ナトリウム　５．０培地のｐＨ調整は必要でなかった。３０時間インキュベーション後、ブロスのアルギネートリアーゼ活性を前記の如きＵＶ吸光度分析を用いて行う。−３６−７ −４ブロスのアルギネートリアーゼ活性は、基質として０．１％アルギン酸ナトリウムを用い２１ｕ／ｄであった。

実施例２バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｏ＋ｏｐｈｉｌｕｓ）菌株−３６−７−４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４）由来の粗製アルギネートリアーゼのｐＨ−活性および温度−活性曲線基質としてアルギン酸ナトリウムを用い５５°Ｃでのアルギネートリアーゼ活性（２３０ｎｍで光学密度の増加）を、観察した。一定量の基質、酵素およびＭｇＣ１ｚ　（１０ｉＭ　）を全ての反応において存在させた。シトレート−ホスフェート緩衝液をｐｎｓ、ｏ〜６．５間で使用し更にホスフェート緩衝液をｐＨ６，０〜８．０で用いた。最大活性はｐＨ７，０付近で観察された（第１図（Ａ）参照）。

温度−活性曲線は、１０ｍＭ（７）ＭｇＣＬｚを有し、ｐＨ７，０（７）！７！、７エート緩衝液中３０°Ｃ〜７０°Ｃの温度で本発明のアルギネートリアーゼ活性を観察することにより作成した。最大活性は５０″Ｃ付近で観察した（第１図（Ｂ）参照）。

実施例３バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株Ｗ３６−７−４　（−）　、バシラス　サーキュランス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｕｓ　（ＡＴＣＣ１５５１８）　（０）およびｑｙトモナス　マルトフィリア　Ｘａｎｔｈｏｎ＋ｏｎａｓ　Ｈａｌｔｏ　ｈｉｌｉａ）（ＡＴＣＣ１３６３７）　（Ｘ）由来のアルギネートリアーゼの熱安定性の比較各々２．０ｄの粗製酵素溶液を、本発明で用いたと同様の緩衝液を用い６０°Ｃで熱処理した。熱処理は、４時間継続した。

次いで、溶液を直ちに冷水浴中で室温に冷却し次いで基質としてアルギン酸ナトリウムを用い残留酵素活性を測定した。

４時間インキュベーション後、菌株−３６−７−４由来のアルギネートリアーゼは、その当初活性の１００％を保持したが、一方バシラス　サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｕｓ）およびザントモナス　マルトフィリア（ χａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　＋＊ａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）由来の酵素はそれぞれその当初の活性の１００％および８８％を失った（第２図参照）。

実施例４バシース　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−ｙ徂」旦吐上胆り一菌株−３６−７−４由来のアルギネートリアーゼによる藻類細胞壁のアルギネート成分から不飽和ウロン酸の放出最終濃度１０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）に緩衝した工場の冷却水塔から得られた２、　０　ｄの藻類懸濁液を、菌株−３６−７−４由来のアルギネートリアーゼの種々のレベルを用い３７°Ｃで処理した。４−デオキシ−１−エリトロ−ヘタ−５−ウロスロン酸の放出を、２３０ｎｎ＋のＵＶ吸光度を測定することにより観察した；得られた結果を第１表に示す。

＊酵素は約５０００　ｕ　／　ｇの粗製酵素凍結乾燥物として添加した。

実施例５藻類細胞壁内のアルギネート成分の消化に関するβ−グルカナーゼ、すなわちセレミックス（Ｃｅｒｅｍｉｘ）　（商標登録）２×Ｌおよびバシラス　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈＮｕｓ　菌株Ｗ３６−７−４由来のアルギネートリアーゼの組合せ効果藻類懸濁液は、例４で用いたものと同じであった。アルギネートリアーゼは、藻類細胞懸濁液２−当たり粗製酵素凍結乾燥５■のレベルで用い、次いでノボ社の商品セレミックス（Ｃｅｒｅａ＋ｆｘ）　（商標登録）２×Ｌをテストサンプル当たり５０ｕｌで添加した。

藻類細胞壁に対するセレミックス（Ｃｅｒｅｍｉｘ）　２　Ｘ　Ｌおよびアルギネートリアーゼの相乗効果は、明らかであると考えら実施例６プソイ　′モ　ス　エルギノ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ（ＡＴＣＣ９０２７）より産生されたアルギネートポリマーに対するがシース　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ−μ」１Ｕ１Ω−菌株−３６−７−４由来のアルギネートリアーゼの分解能６６０ｎｍでＯＤ　０．４３を有する新たに増殖した１ヱ土工至±ス　エルギノザ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ　（ＡＴＣＣ９０２７）　１−を、アルギネートリアーゼ凍結乾燥的５■および１０■と混合し次いで３７ °Ｃで３０分間、１時間および２時間インキュベートした。不飽和ウロン酸部分の放出を前記の如＜　２３０ｎｍでの吸光度を測定して観察した。酵素を添加をせず他は同一条件のもとで比較を行った。結果を第■表に示す。

実施例７バシラス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）由来のアルギネートリアーゼの活性に関する冷却水システム内で通常用いられる化学試剤の効果ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラアセテート）　、ＮａＣ１、ＦｅＳＯ４＋ＮａＡｌ０ｚ　、　ＮａｔＭｏＯａ　、　Ｚｎ　、グルタルアルデヒドヒドラジンおよび亜硝酸ナトリウムを、最終濃度１０ｍＭでテストした。例２に記載した如くアルギネートリアーゼ活性を１６時間のインキュベーションにわたって観察した。結果を第■表に示す。バシラス　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−７由来のアルギネートリアーゼは、冷却水システム中、防汚剤、殺生剤、凝固剤／凝集剤、腐食抑制剤等として通常用いられる種々のオキシダント、金属キレート剤および塩の存在下で相当に安定であることが実証されている。

芽」１起グルタルアルデヒド　０ＮａＮＯ□　０相対活性（％）相対活性（％）残留活性（％）補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年３月１４１日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１　特許出願の表示ＰＣＴ／ＤＫ８９１００２１４２　発明の名称新規藻類細胞分解酵素３　特許出願人住　所　デンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ　（番地なし）名　称　ノボ−ノルディスク　アクティーゼルスカブ４代理人補正書の翻訳文　１通請求の範囲１．　郭定型バクラノユ」鷺と乙−ｉ二天フィラ五■１弘月１邦ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｗｏ　ｈｉｌｕｓ　菌株、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４突然変異体およびその変異体の生物学的に純粋な培養株であって、アルギネートリアーゼ生産能およびｐＨ５，７での増殖を特徴とし、更に最λ　アルギネートリアーゼの調製方法であって、ｍバシラス　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｖｏ−４のアルギネートリアーゼ生産菌株、その突然変異体もしくは変異体を、適当な炭素および窒素源を含有する培地中、液内条件のもと好気的に培養し、次いでしかる後培養ブロスから酵素を回収することを特徴とする、前記方法。

３、　非典型、バｊヨＬ五−ノ己ヒアｊ謬辷二」フィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４、その突然変異体もしくは変異体を培養することを含んでなる、請求の範囲第２項記載の方法。

４、非典型バシース　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉ　１１ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｗ＋ｏ　ｈｉｌｕｓ　菌株に生来のアルギネートリアーゼであって、藻類細胞壁およびプソイドモナス　エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって生産される藻類重合体を分解する能力を有し、更に６０°Ｃで４時間熱処理後１００％の活性を保持していることを特徴とする、前記藻類リアーゼ。

５、　３　バシース　ステアロサーモフィース　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋＋＋ｏ　ｈｉｌｕｓ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４に生来である、請求の範囲第４項記載の藻類リアーゼ。

６、冷却水システム用の酵素添加剤であって、非定型バ之−ス　ステアロサーモフィース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｒａｏ　ｈｉｌｕｓ菌株に生来の藻類リアーゼを含んでなり、該藻類リアーゼが６０°Ｃで４時間熱処理後１００％の活性を保持し、該添加剤が無粉塵性粒質物又は安定化流体の形態にある、前記酵素添加剤。

７、非定型バシラス　ステアロサーモフィラス　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｉｕｓ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４に生来の藻類リアーゼを含んでなる、請求の範囲第６項記載の酵素添加剤。

８ゆ　藻類およびプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｎｓ）　ｓｐｐ、により水システムの汚染を減少する方法であって、郭定型バシラススーアロサーモフィース　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ−ｏ　ｈｉｌｕｓ）に生来のアルギネートリアーゼの有効量を、冷却水に添加することを含んでなり、該アルギネートリアーゼが６０℃で４時間熱処理後に１００％の活性を保持している、前記方法。

９゜　非典型バシラス　ステアロサーモフィラス　ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒＩｌｏ　ｂｉｌｕｓ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４に生来のアルギネートリアーゼを添加することを含んでなる、請求の範囲第８項記載の方法。

１０、更に有効量のβ−グルカナーゼを水に添加することを含んでなる、請求の範囲第８項又は第９項記載の方法。

１１、更に有効量の殺生剤を水に添加することを含んでなる、請求の範囲第８〜９項のいずれかに記載の方法。

国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．非定型バシススステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３９４突然変異体およびその変異体の生物学的に純粋な培養株であって、アルギネートリアーゼ生産能およびｐＨ５．７での増殖を特徴とし、更に最適増殖温度５５〜６０℃を有し、本質的に３０°Ｃ未満で増殖しないことを特徴とする、前記培養株。
２．アルギネートリアーゼの調製方法であって、非定型バシラス　ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）のアルギネートリアーゼ生産菌株、その突然変異体もしくは変異体又はアルギネートリアーゼをコードしかつ発現する遺伝子を含有する形質転換体微生物細胞を、適当な炭素および窒素源を含有する培地中、該内条件のもと好気的に培養し、次いでしかる後培養ブロスから酵素を回収することを特徴とする、前記方法。
３．非典型バシラス　ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株に生来のアルギネートリアーゼであって、藻類細胞壁およびプソイドモナス　エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって生産される藻類重合体を分解する能力を有し、更に６０ ℃で４時間熱処理後１００％の活性を保持していることを特徴とする、前記藻類リアーゼ。
４．冷却水システム用の酵素添加剤であって、非定型バシラス　ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）菌株に生来の藻類リアーゼを含んでなり、該藻類リアーゼが６０℃で４時間熱処理後１００％の活性を保持し、該添加剤が無粉塵性粒質物又は安定化流体の形態にある、前記酵素添加剤。
５．藻類およびプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｎｓ）ｓｐｐ．により水システムの汚染を減少する方法であって、非定型バシラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉＩｕｓ）に生来のアルギネートリアーゼの有効量を、冷却水に添加することを含んでなり、該アルギネートリアーゼが６０℃で４時間熱処理後に１００％の活性を保持している、前記方法。
６．更に有効量のβ−グルカナーゼを水に添加することを含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。
７．更に有効量の殺生剤を水に添加することを含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。
８．更に有効量の殺生剤およびβ−グルカナーゼを水に添加することを含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。