JPS611386A - 海苔の細胞融合による形質転換方法 - Google Patents
海苔の細胞融合による形質転換方法Info
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- JPS611386A JPS611386A JP59122740A JP12274084A JPS611386A JP S611386 A JPS611386 A JP S611386A JP 59122740 A JP59122740 A JP 59122740A JP 12274084 A JP12274084 A JP 12274084A JP S611386 A JPS611386 A JP S611386A
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- fusion
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
皮粟上辺尉朋分！
本発明は海苔の細胞融合による形質転換方法、更に詳し
くは、アマノリ属に属する２ｐｉの海苔のプロトプラス
トを細胞融合して、いわゆるバイブリド細胞を形成する
ことにより、優れた所望の形質を保有する海苔を得るた
めの形質転換方法に関する。
くは、アマノリ属に属する２ｐｉの海苔のプロトプラス
トを細胞融合して、いわゆるバイブリド細胞を形成する
ことにより、優れた所望の形質を保有する海苔を得るた
めの形質転換方法に関する。
従米皮韮土
近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細胞間の融
合、いわゆる細胞融合についての研究が非常に盛んとな
り、陸上植物においては既に実用化の段階にまで成功し
たものもみられるに至っている。
合、いわゆる細胞融合についての研究が非常に盛んとな
り、陸上植物においては既に実用化の段階にまで成功し
たものもみられるに至っている。
しかしなから、海藻類、特にアマノリ類に関しての細胞
融合の研究報告は少なく、その成功例についても未だみ
られていない。
融合の研究報告は少なく、その成功例についても未だみ
られていない。
因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物では市販
の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチーム等）を用い
て容易にそれらのプロトプラストを調製し得るけれども
、アマノリ類をプロトプラスト化できる酵素が現在のと
ころ入手し得ないため、アマノリ類の細胞融合の技術が
陸上植物に比べて遅れている一因と考えられる。
の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチーム等）を用い
て容易にそれらのプロトプラストを調製し得るけれども
、アマノリ類をプロトプラスト化できる酵素が現在のと
ころ入手し得ないため、アマノリ類の細胞融合の技術が
陸上植物に比べて遅れている一因と考えられる。
面し一〇、アマノリ類をプロトプラスト化するための試
みとしては今までのところ、藤田等による［酵素処理に
よるノリ、チオノリ類のプロトプラストの分離とその発
生］についての報告（日本水産学会、昭和５７年秋季講
演要旨集、第２３頁、２１３）がみられるのみである。
みとしては今までのところ、藤田等による［酵素処理に
よるノリ、チオノリ類のプロトプラストの分離とその発
生］についての報告（日本水産学会、昭和５７年秋季講
演要旨集、第２３頁、２１３）がみられるのみである。
この藤田等による方法は、海苔葉体を物理的手段で細断
して得られる葉片にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）ＳＰの菌株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗
酵素液を約４時間程度作用させてプロトプラストを調製
するものであるが、この方法ではプロトプラストを得る
ための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物理的に
切断したものに酵素を作用させるので得られるプロトプ
ラストが不健全になる可能性が高く、したがってこのプ
ロトプラストを用いての細胞融合に支障をきたすおそれ
がある。蓋し、細胞融合の手法においてはそれに用いる
プロトプラストの健全度が非常に主要な要因であって、
プロトプラストが不健全であると細胞融合に当っての融
合率が低くなって以後の培養による成育も劣るようにな
ると考えられるからである。
して得られる葉片にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）ＳＰの菌株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗
酵素液を約４時間程度作用させてプロトプラストを調製
するものであるが、この方法ではプロトプラストを得る
ための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物理的に
切断したものに酵素を作用させるので得られるプロトプ
ラストが不健全になる可能性が高く、したがってこのプ
ロトプラストを用いての細胞融合に支障をきたすおそれ
がある。蓋し、細胞融合の手法においてはそれに用いる
プロトプラストの健全度が非常に主要な要因であって、
プロトプラストが不健全であると細胞融合に当っての融
合率が低くなって以後の培養による成育も劣るようにな
ると考えられるからである。
また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シュードモ
ナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表層部分には作用
せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊してプ
ロトプラストとなるとの認識に基づいているものと考え
られる。
ナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表層部分には作用
せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊してプ
ロトプラストとなるとの認識に基づいているものと考え
られる。
Ｐｒｅｓ ｔｏｎ等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミクロフ
ィブリル形態のキシランから構成されており、細胞光間
物質としてボルフイランが存在しているとされる。また
、Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、？Ｆｉｈ苔の表層に
は蛋白質から成る薄い被覆が存在しているとされる。す
なわち、このようなン毎苔の組織上の観点から、海苔は
切断しなければプロトプラスト化できないと考えられて
いたものと思われる。
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミクロフ
ィブリル形態のキシランから構成されており、細胞光間
物質としてボルフイランが存在しているとされる。また
、Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、？Ｆｉｈ苔の表層に
は蛋白質から成る薄い被覆が存在しているとされる。す
なわち、このようなン毎苔の組織上の観点から、海苔は
切断しなければプロトプラスト化できないと考えられて
いたものと思われる。
本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプロトプラ
ス１−を得るには、海苔を物理的に切断することなくそ
の表層から崩壊させることが必要であるとの見地から海
苔のプロトプラスト化について検討した結果、海苔を少
なくともマンナン加水分解酵素およびキシラン加水分解
酵素を含有する酵素液で処理するか、更にはボルフイラ
ン加水分解酵素も含有する酵素液で処理することにより
、海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得ること
の知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技術を開発し
た。（特願昭５８−１４９３７８号）。
ス１−を得るには、海苔を物理的に切断することなくそ
の表層から崩壊させることが必要であるとの見地から海
苔のプロトプラスト化について検討した結果、海苔を少
なくともマンナン加水分解酵素およびキシラン加水分解
酵素を含有する酵素液で処理するか、更にはボルフイラ
ン加水分解酵素も含有する酵素液で処理することにより
、海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得ること
の知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技術を開発し
た。（特願昭５８−１４９３７８号）。
発凱左解広支走ｊ上ｊ玉澗ｌ瀘
本発明者は、上述した海苔のプロトプラスト化の成功に
伴なって、アマノリ属に属する２種の海苔のプロトプラ
ストを調製し、細胞融合の手法を適用して細胞質融合体
を作成することにより、上記２種の海苔がそれぞれ保有
する優良な形質を兼ね具えた海苔が得られることの知見
を得て、本発明をなすに至った。
伴なって、アマノリ属に属する２種の海苔のプロトプラ
ストを調製し、細胞融合の手法を適用して細胞質融合体
を作成することにより、上記２種の海苔がそれぞれ保有
する優良な形質を兼ね具えた海苔が得られることの知見
を得て、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明の目的は、アマノリ属に属する２種の
海苔のプロトプラストを細胞融合させて細胞質融合体を
作成することにより、優良な所望の形質を保有する海苔
を得るための形質転換方法を提供することにある。
海苔のプロトプラストを細胞融合させて細胞質融合体を
作成することにより、優良な所望の形質を保有する海苔
を得るための形質転換方法を提供することにある。
以下本発明の詳細な説明する。
発皿圓盪威
本発明の構成上の特徴は、アマノリ属に属する２種の海
苔のプロトプラストを調製し、それらのプロトプラスト
を細胞融合して細胞質融合体を形成し、得られた細胞質
融合体を育成することにある。
苔のプロトプラストを調製し、それらのプロトプラスト
を細胞融合して細胞質融合体を形成し、得られた細胞質
融合体を育成することにある。
現在、養殖に用いられている海苔の品種は多種類である
が、それらの中で主に用いられているのはスサビノリと
アサクサノリである。就中、スサビノリは我国で最も広
く養殖されていて、繁殖力が強く、色彩および光沢など
の外観も優れているが、その反面食味上の香気が乏しく
、かつ海水中の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗削に
なる欠点がある。一方アサクサノリは富栄養漁場では葉
体が柔かく香気も豊かで美味であるけれども、曾栄養の
漁場では、いわゆる色落ちが激しく品質が低下する欠点
を有する。
が、それらの中で主に用いられているのはスサビノリと
アサクサノリである。就中、スサビノリは我国で最も広
く養殖されていて、繁殖力が強く、色彩および光沢など
の外観も優れているが、その反面食味上の香気が乏しく
、かつ海水中の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗削に
なる欠点がある。一方アサクサノリは富栄養漁場では葉
体が柔かく香気も豊かで美味であるけれども、曾栄養の
漁場では、いわゆる色落ちが激しく品質が低下する欠点
を有する。
また、野性株であるマルバアマノリはその形態が小型で
マル葉型であり、かつ生長率が悪いため養殖には適さな
いが、貧栄養漁場でも比較的色落ちが少ないという耐性
を有する。
マル葉型であり、かつ生長率が悪いため養殖には適さな
いが、貧栄養漁場でも比較的色落ちが少ないという耐性
を有する。
したがって、本発明では主として上記スサビノリ、アサ
クサノリ、マルバアマノリの３種のうちの２種の海苔の
プロトプラストをそれぞれ組合わせて細胞融合させるこ
とにより、それらの各海苔が本来保有する優れた形質を
兼ね具えた新しい品種の海苔を育成するものである。
クサノリ、マルバアマノリの３種のうちの２種の海苔の
プロトプラストをそれぞれ組合わせて細胞融合させるこ
とにより、それらの各海苔が本来保有する優れた形質を
兼ね具えた新しい品種の海苔を育成するものである。
本発明では、まず、上記各海苔のプロトプラストを調製
するが、その調製には前述したように、本発明者がさき
に開発した方法（特願昭５８−１４９３７８号）を適用
する。このプロトプラストの調製法の概要を説明すると
、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
するが、その調製には前述したように、本発明者がさき
に開発した方法（特願昭５８−１４９３７８号）を適用
する。このプロトプラストの調製法の概要を説明すると
、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ）に属する難消化性多糖類（マンナン、キシラン
およびボルフイラン）の加水分解能を有する微生物（シ
ュードモナス５ＰＮＩＪ、ＰＴ−５，微工研条寄Ｎｏ、
ＢＰ−３３０）を、海苔もしくは海苔由来の多糖類（海
苔を熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主と
してマンナンもしくはキシランのような多糖類から成る
残渣又は該残渣を更に精製処理して多糖類含゛量を高め
たもの）を誘導物質として含む培地中で培養して得られ
る培養液を遠心分離し、その上澄液を酵素液として用い
て海苔葉体を処理することから成る。上記酵素液にはマ
ンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素が含まれて
いるので該酵素液を海苔葉体に作用させるとマンナン加
水分解酵素が海苔の表面に存在する顆粒状のマンナンに
作用して葉体に大きく切断部を形成し、それにより、キ
シラン加水分解酵素により細胞壁を形成しているミクロ
フィブリル形態のキシランが作用され易くなって、葉体
の細胞壁が分解除去されてプロトプラスト化されるよう
になる。また、上記酵素液にはポルフィラン分解酵素も
含まれているので、海苔葉体の細胞光間物質としてのボ
ルフイランにも作用して分解するのでプロトプラスト化
が−そう促進される。
およびボルフイラン）の加水分解能を有する微生物（シ
ュードモナス５ＰＮＩＪ、ＰＴ−５，微工研条寄Ｎｏ、
ＢＰ−３３０）を、海苔もしくは海苔由来の多糖類（海
苔を熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主と
してマンナンもしくはキシランのような多糖類から成る
残渣又は該残渣を更に精製処理して多糖類含゛量を高め
たもの）を誘導物質として含む培地中で培養して得られ
る培養液を遠心分離し、その上澄液を酵素液として用い
て海苔葉体を処理することから成る。上記酵素液にはマ
ンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素が含まれて
いるので該酵素液を海苔葉体に作用させるとマンナン加
水分解酵素が海苔の表面に存在する顆粒状のマンナンに
作用して葉体に大きく切断部を形成し、それにより、キ
シラン加水分解酵素により細胞壁を形成しているミクロ
フィブリル形態のキシランが作用され易くなって、葉体
の細胞壁が分解除去されてプロトプラスト化されるよう
になる。また、上記酵素液にはポルフィラン分解酵素も
含まれているので、海苔葉体の細胞光間物質としてのボ
ルフイランにも作用して分解するのでプロトプラスト化
が−そう促進される。
なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉体を予め
パパインのようなプロテアーゼで処理するか、又は上記
酵素液と並行的にプロテアーゼを作用させると、更に効
果的である。
パパインのようなプロテアーゼで処理するか、又は上記
酵素液と並行的にプロテアーゼを作用させると、更に効
果的である。
本発明においては、上述のようにしてスサビノリ、アサ
クサノリおよびマルバアマノリのプロトプラスト化を行
なって得られる各プロトプラストの２種についてそれぞ
れ細胞融合を行なう。
クサノリおよびマルバアマノリのプロトプラスト化を行
なって得られる各プロトプラストの２種についてそれぞ
れ細胞融合を行なう。
細胞融合は公知の手法を適用して行なうとよく、上記２
種のプロトプラストを混合して形成させた沈澱にポリエ
チレングリコール溶液と旧ｇｈ−ｐＨ−Ｃａ溶液を加え
てｔｊｋ置した後、これに培養ｅｉ、（人工？ｋｔ水Ａ
ＳＰ、 １２）を加えて培養を行なって細胞質融合体を
作成する。なお、培養は１５度の温度で６，０００Ｌｕ
ｘの照度で明期９時間、晴朗１５時間の条件下で行な・
うとよい。
種のプロトプラストを混合して形成させた沈澱にポリエ
チレングリコール溶液と旧ｇｈ−ｐＨ−Ｃａ溶液を加え
てｔｊｋ置した後、これに培養ｅｉ、（人工？ｋｔ水Ａ
ＳＰ、 １２）を加えて培養を行なって細胞質融合体を
作成する。なお、培養は１５度の温度で６，０００Ｌｕ
ｘの照度で明期９時間、晴朗１５時間の条件下で行な・
うとよい。
上述のようにして得られた細胞質融合体の識別は、スサ
ビノリとアサクサノリとのプロトプラストの細胞融合、
並びにスサビノリとマルバアマノリとのプロトプラスト
の細胞融合では各細胞の色が下記のように異なるので識
別可能であるか、アザフナ７７りと゛ンＪレバアマノリ
とのフ゛ロトブラストの細胞融合では細胞の色が同色で
４）るので次に述べるように予めプロトプラストを染色
することにより識別を行なう。
ビノリとアサクサノリとのプロトプラストの細胞融合、
並びにスサビノリとマルバアマノリとのプロトプラスト
の細胞融合では各細胞の色が下記のように異なるので識
別可能であるか、アザフナ７７りと゛ンＪレバアマノリ
とのフ゛ロトブラストの細胞融合では細胞の色が同色で
４）るので次に述べるように予めプロトプラストを染色
することにより識別を行なう。
各海苔の細胞の色ニ
スサビノリ（スサビグリーン）緑色
アサクサノリ 茶色
マルバアマノリ 茶色
染色による識別ニ
アサクサノリとマルバアマノリの各プロトプラストの一
方を予め下記組成のニュートラルレッドで染色したもの
を細胞融合に用いる。
方を予め下記組成のニュートラルレッドで染色したもの
を細胞融合に用いる。
ニュートラルレッド １０ ｍｇ
人工海水（Ａｓｐ １２） １００ ｍｌ−に記組
成の溶液にマンニトールを０．７５Ｍになるように添加
し溶解して調製する。
成の溶液にマンニトールを０．７５Ｍになるように添加
し溶解して調製する。
上記細胞質融合体の識別は顕微鏡下で行ない、パスツー
ルピペットのような毛細管を用いて融合体を選択して吸
い取り、前述した条件下で培養を行ない、得られた成葉
について形質の判定を行なう。
ルピペットのような毛細管を用いて融合体を選択して吸
い取り、前述した条件下で培養を行ない、得られた成葉
について形質の判定を行なう。
核融合の確認は、上述のごとくして得られた成葉の一部
をＤＡＰＩ染色し、螢光顕微鏡下で観察して行なう。
をＤＡＰＩ染色し、螢光顕微鏡下で観察して行なう。
光割℃Ｊ２−果
次に、本発明に従って細胞融合して得られた細胞質融合
体を識別したものを培養して得られた成葉についてそれ
ぞれの形質を判定した結果を表１乃至表３に示す。なお
、細胞融合に用いた各品種の海苔が本来保有する形質も
併せて表１乃至表３にそれぞれ示した。
体を識別したものを培養して得られた成葉についてそれ
ぞれの形質を判定した結果を表１乃至表３に示す。なお
、細胞融合に用いた各品種の海苔が本来保有する形質も
併せて表１乃至表３にそれぞれ示した。
表 １
表 ２
（注）上記各表によ夕ける形質の判定は、呈味性につい
ては総遊離アミノ酸含量の測定値、貧栄養耐性について
は貧栄養培地中での成育状態の観察、葉の色調について
は顕微鏡および肉眼観察と分光光度計による吸収スペク
トルの測定、あかぐされ病耐性についてはあかくされ病
菌の添加培地中での感染状態の観察、葉の形状について
は顕微鏡観察と肉眼観察および生長率については一定期
間内での葉長の増加量の測定によりそれぞれ行なった。
ては総遊離アミノ酸含量の測定値、貧栄養耐性について
は貧栄養培地中での成育状態の観察、葉の色調について
は顕微鏡および肉眼観察と分光光度計による吸収スペク
トルの測定、あかぐされ病耐性についてはあかくされ病
菌の添加培地中での感染状態の観察、葉の形状について
は顕微鏡観察と肉眼観察および生長率については一定期
間内での葉長の増加量の測定によりそれぞれ行なった。
上記表１にみられるように、アサクサノリ×マルバアマ
ノリの組合わせによる細胞質融合体ではアサクサノリ本
来の良好な呈味を保有すると共にアサクサノリに欠如し
ている貧栄養耐性を兼ね具えた形質が発現している。
ノリの組合わせによる細胞質融合体ではアサクサノリ本
来の良好な呈味を保有すると共にアサクサノリに欠如し
ている貧栄養耐性を兼ね具えた形質が発現している。
すなわち、従来、アサクサノリは、呈味の点で特に優れ
た品種とされていたものの、その養殖上貧栄養の漁場で
はいわゆる“色落ち”をするという欠点があったが、野
生種の故に養殖に適さないマルバアマノリと細胞融合す
ることにより、貧栄養耐性を有する養殖に適した品種が
得られるようになる。
た品種とされていたものの、その養殖上貧栄養の漁場で
はいわゆる“色落ち”をするという欠点があったが、野
生種の故に養殖に適さないマルバアマノリと細胞融合す
ることにより、貧栄養耐性を有する養殖に適した品種が
得られるようになる。
また、アサクサノリの養殖中には屡々あかぐされ病の発
生がみられ、その防止のための対策は現在のところない
が、表２にみられるように、アサクサノリをスサビノリ
の突然変異株であるスサビグリーンと細胞融合させて得
られる融合体ではアサクサノリが本来保有する葉の色調
を呈し、かつあかぐされ病に対する耐性を有する形質が
発現する。
生がみられ、その防止のための対策は現在のところない
が、表２にみられるように、アサクサノリをスサビノリ
の突然変異株であるスサビグリーンと細胞融合させて得
られる融合体ではアサクサノリが本来保有する葉の色調
を呈し、かつあかぐされ病に対する耐性を有する形質が
発現する。
更に、表３にみられるように、スサビノリの突然変異株
であるスサビグリーンと野生種であるマルバアマノリの
組合わせによる細胞質融合体では、葉の色として好まし
い茶色を呈すると共に好ましい葉の形状である法線形を
有する形質のものが得られる。因に、マルバアマノリは
その葉の形状が円形であって、生長率も悪いため養殖に
は通しない。
であるスサビグリーンと野生種であるマルバアマノリの
組合わせによる細胞質融合体では、葉の色として好まし
い茶色を呈すると共に好ましい葉の形状である法線形を
有する形質のものが得られる。因に、マルバアマノリは
その葉の形状が円形であって、生長率も悪いため養殖に
は通しない。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施皿上
海苔のプロトプラストの開裂：
約１ｃｍ程度の大きさのアサクサノリの葉体５枚を０．
２％パパイン液（ｐＨ７，４のトリス塩酸バッファー１
０ｍ１にパパイン２０ｍｇを熔解した熔ＷＩ）に浸漬し
、２０℃の温度で５分間振とう（７０ストロ一ク／分）
させた。ついで、上記によりパパインで処理した葉体を
、予めシュードモナス５ＰＩｌｈＰＴ−５（微工研条寄
ＮｕＢＰ−３３０）をスサビノリ粉末を基質とする培地
中で培養して得られた酵素液（０，７５Ｍマニトール添
加）に浸漬し、２０℃で６０分間振とう （７０ストロ
一ク／分）させてプロトプラスト化を行なった。得られ
た酵素処理混合物を４０μメツシユのナイロン製網で濾
過し、濾液を遠心分ｌＩＩ（１５００ｒｐｍ、５分間）
して残渣にプロトプラスｌ−（、１０７ｆｌＮ）を得た
。
２％パパイン液（ｐＨ７，４のトリス塩酸バッファー１
０ｍ１にパパイン２０ｍｇを熔解した熔ＷＩ）に浸漬し
、２０℃の温度で５分間振とう（７０ストロ一ク／分）
させた。ついで、上記によりパパインで処理した葉体を
、予めシュードモナス５ＰＩｌｈＰＴ−５（微工研条寄
ＮｕＢＰ−３３０）をスサビノリ粉末を基質とする培地
中で培養して得られた酵素液（０，７５Ｍマニトール添
加）に浸漬し、２０℃で６０分間振とう （７０ストロ
一ク／分）させてプロトプラスト化を行なった。得られ
た酵素処理混合物を４０μメツシユのナイロン製網で濾
過し、濾液を遠心分ｌＩＩ（１５００ｒｐｍ、５分間）
して残渣にプロトプラスｌ−（、１０７ｆｌＮ）を得た
。
上記と同様の手順によりスサビグリーン並びにマルバア
マノリの各プロトプラストを調製した。
マノリの各プロトプラストを調製した。
細胞融合：
上述のようにして調製したマルバアマノリとスサビグリ
ーンの２種のプロトプラストを混合したプロトプラスト
混合液の０．１ｍｎ （１０６ＩＩＩ）をパスツールピ
ペットでベトリ皿内に滴下し、５〜１０分間放置してプ
ロトプラストをガラス表面に沈澱させた。この沈澱に下
記組成のポリエチレングリコール溶液の０．２ｍｌを加
えて１０分間放置した後、さらに下記組成の旧ｇｈ ｐ
Ｈ−Ｃａ１液の０．５ｍ７！を加えて５分間放置した。
ーンの２種のプロトプラストを混合したプロトプラスト
混合液の０．１ｍｎ （１０６ＩＩＩ）をパスツールピ
ペットでベトリ皿内に滴下し、５〜１０分間放置してプ
ロトプラストをガラス表面に沈澱させた。この沈澱に下
記組成のポリエチレングリコール溶液の０．２ｍｌを加
えて１０分間放置した後、さらに下記組成の旧ｇｈ ｐ
Ｈ−Ｃａ１液の０．５ｍ７！を加えて５分間放置した。
ザＪエチレング１コールパ 妥組成
ポリエチレングリコール（ＭＷ ６，０００）の５４％
水ン容液にＣａＣｌ２２Ｈ２０１０，５ｍＭ 、Ｋ＊ｒ
’０＋＋’ｌ−１２００，７ｍＭおよびグルコース０．
ＩＭを添加する。
水ン容液にＣａＣｌ２２Ｈ２０１０，５ｍＭ 、Ｋ＊ｒ
’０＋＋’ｌ−１２００，７ｍＭおよびグルコース０．
ＩＭを添加する。
肛■」非」斬１良９肌戒
■ ＣａＣｌ２２ＪＯを１００ｍＭおよびグルコースを
０．４Ｍの各濃度に蒸留水に溶解する。
０．４Ｍの各濃度に蒸留水に溶解する。
■ １００ｍＭ ＮａＯＨ−グリシンバッファー（ｐＨ
１０，５）にグルコースを０．４Ｍの濃度に溶解する。
１０，５）にグルコースを０．４Ｍの濃度に溶解する。
上記■と■の溶液を使用前に１＝１の割合に混合する。
次に、上述のように放置したものに、下記に示ず人工海
水Ａｓｐ、 １２からなる培養液０．３ｍｊ！を加え、
５分後その０．３ｍＩ２をペトリ皿から吸い上げ、さら
にそれに上記培養液を５分後その０．３ｍｊ！を吸い上
げる操作を５回繰返して行なった後、新たに上記培養液
を加えて培養を行なった。培養は１５℃の温度で６，０
ＯＯＬＩＪＸ照度下で明朗９時間（晴朗１５時間）で行
なった。
水Ａｓｐ、 １２からなる培養液０．３ｍｊ！を加え、
５分後その０．３ｍＩ２をペトリ皿から吸い上げ、さら
にそれに上記培養液を５分後その０．３ｍｊ！を吸い上
げる操作を５回繰返して行なった後、新たに上記培養液
を加えて培養を行なった。培養は１５℃の温度で６，０
ＯＯＬＩＪＸ照度下で明朗９時間（晴朗１５時間）で行
なった。
人工海水（八ＳＰ １２）の組成：
ＮａＣｌ ２８ ｇＭｇＳＯ
キ７１）□０ ７ｇＭｇＣｌ２６Ｈ２０
４ｇ ＫＣＩ ４００１）１）ＩＣａ
Ｃ１２２Ｈ２０１，４６ｇ ＮａＮ０３ １００ ｍｇＫ、ＨＰ
Ｏｌ、１）０ ｍｇ グリセロ燐酸ナトリウム １０ ｍｇビタミンＢ１２
０．０２ μｇビオチン
０．１ ８ｇチアミン ｌ
Ｏμｇ Ｐ ＦＩ Ｍｅｔａｌ １０ ｍＡ
Ｓ ＩＴ Ｍｅｔａｌ １０ ｍ（１
トリスアミノメタン １Ｂ 蒸留水 １０００ｍｎｐＨ８，０〜８
．１ Ｐ ＩＩ ＭｅｔａｌＯ−Ｊｆｉ、 Ｓユ」
憔４ＥＤＴＡ Ｉ ｍｇ ＮａＢ
ｒ １．２ ｍｇｌＩ：１ＢＯｉ
１ ｍｇ ＡＩＣｈ ６Ｈ２
０１，２ｍｇＭｎＣＩ２ ４１）２０ ０．１４ ｍ
ｇ ５ｒＣ１２６Ｆ１２０ ０．６ ｍｇＦｅ
ＣＩ２６１）２０ ０．０５ ｍｇ ＮａＭｏ０
ｉ＋ ・２Ｈ２００，１２ｍｇＺｎＣｌ２０．０１ ｍ
ｇ ＰｂＣｌ Ｏ，０３ｍｇＣｏＣ
！２６Ｈ２０４、ｃｏｇ Ｋｌ
１．５／ｊｇＣｕＳＯ４５＋１２０ ０．５ μｇ
蒸留水 １ ｍ７！蕉留水 １ ｍｌ
！ 細胞質融合体の選抜： マルバアマノリとスサビグリーンのプロトプラストの色
は前者が茶色で後者が緑色であることから、融合体の識
別は可能であるので、顕微鏡下で融合体を識別し、バス
ツールピペットテ吸い取す選抜した。
キ７１）□０ ７ｇＭｇＣｌ２６Ｈ２０
４ｇ ＫＣＩ ４００１）１）ＩＣａ
Ｃ１２２Ｈ２０１，４６ｇ ＮａＮ０３ １００ ｍｇＫ、ＨＰ
Ｏｌ、１）０ ｍｇ グリセロ燐酸ナトリウム １０ ｍｇビタミンＢ１２
０．０２ μｇビオチン
０．１ ８ｇチアミン ｌ
Ｏμｇ Ｐ ＦＩ Ｍｅｔａｌ １０ ｍＡ
Ｓ ＩＴ Ｍｅｔａｌ １０ ｍ（１
トリスアミノメタン １Ｂ 蒸留水 １０００ｍｎｐＨ８，０〜８
．１ Ｐ ＩＩ ＭｅｔａｌＯ−Ｊｆｉ、 Ｓユ」
憔４ＥＤＴＡ Ｉ ｍｇ ＮａＢ
ｒ １．２ ｍｇｌＩ：１ＢＯｉ
１ ｍｇ ＡＩＣｈ ６Ｈ２
０１，２ｍｇＭｎＣＩ２ ４１）２０ ０．１４ ｍ
ｇ ５ｒＣ１２６Ｆ１２０ ０．６ ｍｇＦｅ
ＣＩ２６１）２０ ０．０５ ｍｇ ＮａＭｏ０
ｉ＋ ・２Ｈ２００，１２ｍｇＺｎＣｌ２０．０１ ｍ
ｇ ＰｂＣｌ Ｏ，０３ｍｇＣｏＣ
！２６Ｈ２０４、ｃｏｇ Ｋｌ
１．５／ｊｇＣｕＳＯ４５＋１２０ ０．５ μｇ
蒸留水 １ ｍ７！蕉留水 １ ｍｌ
！ 細胞質融合体の選抜： マルバアマノリとスサビグリーンのプロトプラストの色
は前者が茶色で後者が緑色であることから、融合体の識
別は可能であるので、顕微鏡下で融合体を識別し、バス
ツールピペットテ吸い取す選抜した。
このようにして選抜した細胞質融合体を上記人工海水＾
ｓｐ １２中で１５℃の温度で６＋ ０００Ｌｕｘ照度
下に明朗９時間（晴朗１５時間）で培養して育成して成
葉を得た。
ｓｐ １２中で１５℃の温度で６＋ ０００Ｌｕｘ照度
下に明朗９時間（晴朗１５時間）で培養して育成して成
葉を得た。
この成葉について形質を調べたところ、さきに示した表
３におけるマルバアマノリメスサビグリーンの諸形質を
保有していた。
３におけるマルバアマノリメスサビグリーンの諸形質を
保有していた。
実施側↓
実施例１に記載したと同様の手順で調製したマルバアマ
ノリとアサクサノリのプロトプラストは同じ茶色を呈す
るのでアサクサノリのプロトプラストを前記組成のニュ
ートラルレッドで予め染色した後、両者のプロトプラス
トを、実施例１に記載と同様の手順で細胞融合し、得ら
れた細胞質融合体の選抜を行ない、ついで培養、育成し
て成葉を得た。
ノリとアサクサノリのプロトプラストは同じ茶色を呈す
るのでアサクサノリのプロトプラストを前記組成のニュ
ートラルレッドで予め染色した後、両者のプロトプラス
トを、実施例１に記載と同様の手順で細胞融合し、得ら
れた細胞質融合体の選抜を行ない、ついで培養、育成し
て成葉を得た。
この成葉について形質を調べたところ、表１におけるマ
ルバアマノリ×アサクサノリの諸形質を保有していた。
ルバアマノリ×アサクサノリの諸形質を保有していた。
Claims (7)
- （１）アマノリ属に属する２種の海苔のプロトプラスト
を調製し、それらのプロトプラストを細胞融合して細胞
質融合体を作成し、得られた細胞質融合体を育成するこ
とを特徴とする海苔の細胞融合による形質転換方法。 - （２）２種の海苔がスサビノリとアサクサノリである特
許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （３）２種の海苔がスサビノリとマルバアマノリである
特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （４）２種の海苔がアサクサノリとマルバアマノリであ
る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （５）海苔のプロトプラストの調製は、海苔葉体をシユ
ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する難消
化性多糖類の加水分解能を有する微生物を、海苔もしく
は海苔由来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養
して得られる培養液から調製した少なくともマンナン加
水分解酵素とキシラン加水分解酵素とを含有する酵素液
で処理することにより行なうものである特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。 - （６）海苔葉体は予めプロテアーゼを作用させたもので
ある特許請求の範囲第（５）項記載の方法。 - （７）海苔葉体をマンナン加水分解酵素とキシラン加水
分解酵素とを含有する酵素液で処理する際、プロテアー
ゼを同時的に作用させるものである特許請求の範囲第（
５）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122740A JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122740A JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611386A true JPS611386A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH0229313B2 JPH0229313B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=14843415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122740A Granted JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611386A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61212279A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212280A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 貧栄養耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212281A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| US5554370A (en) * | 1994-05-27 | 1996-09-10 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the treatment of inflammatory bowel diseases |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5639790A (en) * | 1979-09-11 | 1981-04-15 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Preparation of yeast fungus body by protoplast fusion |
| JPS5729229A (en) * | 1980-07-29 | 1982-02-17 | Topy Ind | Growing of "matsutake" strain |
-
1984
- 1984-06-14 JP JP59122740A patent/JPS611386A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5639790A (en) * | 1979-09-11 | 1981-04-15 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Preparation of yeast fungus body by protoplast fusion |
| JPS5729229A (en) * | 1980-07-29 | 1982-02-17 | Topy Ind | Growing of "matsutake" strain |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61212279A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212280A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 貧栄養耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212281A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPH031953B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira | |
| JPH031955B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira | |
| JPH031954B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira | |
| US5554370A (en) * | 1994-05-27 | 1996-09-10 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the treatment of inflammatory bowel diseases |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0229313B2 (ja) | 1990-06-28 |
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