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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Gefrierschutzproteine und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
Im einzelnen betrifft sie das Gewinnen von Gefrierschutzproteinen
aus einem Organismus, der vorher nicht für diesen Zweck verwendet wurde;
die neuen, daraus gewonnenen Gefrierschutzproteine; und die Verwendung
solcher Proteine zum Kontrollieren von Gefrierverfahren, insbesondere
bei der Herstellung gefrorener Nahrungsmittel; und die dadurch erhaltenen
Nahrungsmittel.
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Hintergrund der Erfindung
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Sogenannte „Gefrierschutzproteine" (GSPs) haben die
Fähigkeit,
das Wachstum von Eiskristallen zu verändern. Sie unterscheiden sich
in ihrer Wirkung von einfacheren ionischen Gefrierschutzmitteln,
wie herkömmlichem
Salz. Wässrige
GSP-Lösungen
haben z.B. typischerweise einen Gefrierpunkt, der niedriger als ihr
Schmelzpunkt ist (Hysterese). Sie hemmen eine Rekristallisation.
Sie scheinen Organismen darin zu unterstützen, in Temperaturen um den
Gefrierpunkt von Wasser zu überleben,
und man findet sie dementsprechend in einigen verschiedenen Arten
von Organismen. Ihre Eigenschaften geben ihnen einen Bereich möglicher
Anwendungen: Insbesondere in Nahrungsmitteln, die im gefrorenen
Zustand gegessen werden, indem sie eine Rekristallisation hemmen
und eine glatte Textur aufrechterhalten. In Nahrungsmitteln, die
nur zur Konservierung gefroren werden, können GSPs eine Rekristallisation
während
des Gefrierens, der Lagerung, des Transports und des Auftauens hemmen
und erhalten somit die Nahrungsmitteltextur, indem sie Zellschäden reduzieren
und auch den Verlust an Nährstoffen
minimieren, indem sie das Tropfen reduzieren (siehe Griffith, M. und
Vanya Ewart, K. Biotechnology Advances, 13, S. 375–402).
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Verschiedene Quellen von GSPs sind
bekannt: Die am umfangreichsten veröffentlichten sind Fische und
Pflanzen. Einige Bakterien zeigen Gefrierschutzeigenschaften (siehe
Griffith et al., wie oben, S. 382): In wenigen Fällen wurde über die Isolierung von Gefrierschutzproteinen
aus Bakterien berichtet (siehe z. B. Xu N, Griffith M, Paffen CL,
et al., Can. J. Microbiol. 44: (1)64–73, Jan. 1998).
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In Anbetracht der Vorteile, die sich
für einen
Organismus aus dem Widerstand gegen Gefrieren ergeben, kann es als überraschend
angesehen werden, dass Gefrierschutzproteine nicht weiter in der
Natur verbreitet und leichter zu finden sind.
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Ein Nachteil beim Verwenden neuer
GSPs in gefrorenen Nahrungsmitteln besteht in der Notwendigkeit,
sicher zu sein, dass solche GSPs sicher und für den Verbraucher annehmbar
sind. Die Verbraucher fordern vernünftigerweise eine Zusicherung,
dass das, was sie essen, sicher ist. Sie können auch starke Vorlieben
für oder
gegen bestimmte Materialtypen zeigen: Beispielsweise für „natürliche" oder „organische
bzw. biologische" Materialien,
und gegen „Zusatzstoffe", „Chemikalien" oder „genetisch
veränderte
bzw. modifizierte Materialien – (GM)". Nahrungsmittelhersteller
ignorieren solche Vorlieben auf eigene Gefahr.
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Dementsprechend besteht eine Nachfrage
nach wirksamen GSPs, die „natürlich" sind oder als „natürlich" angesehen werden
können.
Werden solche Materialien aus Quellen gewonnen, die in der Geschichte
von Menschen konsumiert wurden, ergibt das eine begründete Vermutung,
dass sie mit größerer Wahrscheinlichkeit
sicher sind. Dies kann die Notwendigkeit einer umfangreichen und
teueren Toxizitätsprüfung reduzieren.
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Es wurde bereits berichtet, dass
einige Flechten Gefrierschutzproteine enthalten. Insbesondere sind GSPs
aus Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris,
Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinacea, Stereocaulon
glabrum, Umbilicaria antarctica und Usnea subfloridana bekannt [WO
98/04148]. Darüber
hinaus wurden solche GSPs für
eine Verwendung in gefrorenen Konditoreiwaren vorgeschlagen [WO
98/04148].
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In der WO 99/37673 ist ein GSP beschrieben,
das aus Flechten gewonnen werden kann und ein scheinbares Molekulargewicht
von 20 bis 28 kDa und eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die eine mindestens
80%ige Überlappung
mit A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L aufweist.
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Es gibt jedoch eine Anzahl von Nachteilen,
die mit der Verwendung der aus Flechten erhaltenen GSPs als Inhaltsstoffe
in Nahrungsmittelprodukten verbunden sind. Nicht alle Flechten zeigen
eine GSP-Aktivität. Von
denen, die das tun, wurden viele nicht regelmäßig von Menschen verzehrt.
Es ist üblicherweise
nicht praktizierbar, Flechten im industriellen Maßstab zu
vermehren, und viele sind nur in sehr kleinen Mengen in der Umwelt
verfügbar.
Daher ist es nicht offensichtlich, genauer bei Flechten als Quelle
für GSPs
zu suchen. Nichtsdestotrotz wurden solche Forschungen unternommen,
die zu der vorliegenden Erfindung führten.
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In der Hoffnung, geeignete neue GSPs
zu finden, wurden vier wild in Norwegen wachsende Kandidaten-Flechten für eine Prüfung ausgewählt. Diese
waren Cetraria islandica, Neophroma arcticum (Familie der Nephromatoceae
Peltigerales), Umbilicaria hyperborea (Familie der Umbilicariaceae)
und Platismatia glauca. Diese gehören zu den vielen Flechten,
von denen herausgefunden wurde, dass sie in großen Mengen in Norwegischen
Wäldern
wachsen: Jede wurde schnell in Mengen von 100 g oder mehr gesammelt.
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Cetraria islandica ist die Flechtenspezies,
die am häufigsten
als Nahrungsmittel verwendet wird. Sie wurde „Brodmose" („Brotmoos") genannt. Während des
18. und 19. Jahrhunderts ermutigte die Norwegische Regierung die
Menschen, mehr Flechten im Haushalt zu verwenden. C. islandica wurde
meistens verwendet, wenn Getreide erfroren war und während Kriegen.
Sie wurde zuletzt noch im 2. Weltkrieg verwendet. Umbilicaria sp.
wurde auch als Nahrungsmittel verwendet und hat den Namen „geitbrod" („Ziegenbrot"). Cetraria nivalis,
Cladonia sp. und Peltigera aphtosa wurden auch als Nahrungsmittel
verwendet.
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Neophroma arcticum wurde auch in
Nahrungsmitteln verwendet, wenn auch nicht so häufig wie C. islandica; sie
wurde auch traditionell als Medizin gegen Hauterkrankungen verwendet.
N. arcticum ist eine Blattflechte mit relativ großen und
dicken Thalli. Die obere Oberfläche
ist gelb-grün
oder grün,
wenn sie nass ist, und strohfarben oder graugrün, wenn sie trocken ist. Die
untere Oberfläche
ist braun und zu den Rändern
hin weiß.
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Diese Spezies wächst hauptsächlich auf schattigem Gestein
und auf dem Boden. Sie ist eine nördliche/alpine Spezies, deren
Hauptverteilung in der niedrigen alpinen Umgebung liegt. Sie ist
eine zirkumpolare Spezies, die in Nordamerika, Asien (einschließlich Japan)
und Europa angetroffen wird. In Großbritannien ist sie sehr selten.
Sie wird überall
in Norwegen angetroffen mit Ausnahme der Westküste von Südnorwegen, obgleich oft wenig
in jeder Gegend gefunden wird. Soweit bekannt ist, wurde ihre Artendichte
bislang noch nicht im einzelnen untersucht. Sie ist in Norwegen
keine geschützte
Spezies und soll wahrscheinlich auch keine werden.
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Da die Thalli von Neophroma arcticum
groß und
dick sind, sind sie relativ leicht zu spülen. Daher ist es einfach,
saubere Proben zu erhalten. In einigen Gebieten bedeckt die Flechte
auch viel Boden. Daher kann, wenn ein solches Gebiet gefunden wird,
die Flechte schnell gesammelt werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung stellt Gefrierschutzproteine
(GSPs) bereit, die von der Flechte Neophroma arcticum gewonnen werden
können,
insbesondere diejenigen, die eine Aminosäuresequenz L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T
vom N-Terminus aus aufweisen.
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Ebenfalls bereitgestellt werden GSPs,
die eine Aminosäuresequenz
aufweisen, die einen hohen Ähnlichkeitsgrad
mit der vorstehenden Sequenz aufweist, oder modifizierte Versionen
davon.
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Nukleinsäuresequenzen, die solche Proteine
kodieren, und Vektoren, die solche Sequenzen umfassen, werden auch
von der Erfindung erfasst.
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Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren
zur Herstellung von GSFs bereit, umfassend das Extrahieren eines
GSP-Proteins aus der Flechte Neophroma arcticum, deren Verwendung
bei der Nahrungsmittelverarbeitung und Nahrungsmittelzusammensetzungen,
die diese enthalten.
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Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „Gefrierschutzprotein" (GSP) ein Protein,
das ein modifiziertes Protein sein kann, das das Wachstum von Eiskristallen
hemmen kann (siehe z. B. US 5.118.792). Dementsprechend ist „GSP-Aktivität" die Fähigkeit
eines Proteins, das Wachstum von Eiskristallen zu hemmen. Dies kann z.
B. unter Verwendung eines „Splat-Assays" gezeigt werden (siehe
z. B. Smallwood et al., Biochem. J. 340, 385–391).
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Ein Protein, das von einem bestimmten
Organismus „gewonnen
werden kann" ist
ein Protein, das von einem Gen kodiert wird, das natürlicherweise
in diesem Organismus vorliegt; das Protein kann entweder durch Extrahieren
aus dem Organismus selbst oder durch eine heterologe Expression
einer das Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten
Wirt gewonnen werden.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung beruht
auf der Entdeckung eines Proteins mit einer starken GSP-Aktivität in einer
bekannten Nahrungsmittelquelle für
Menschen. Das Extrahieren dieses Proteins aus der Quelle ergibt ein
wirksames GSP, das wahrscheinlich sicher ist, weil es aus einer
Nahrungsmittelquelle stammt, und das von Verbrauchern als „natürlich" angesehen werden
kann.
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Im einzelnen umfasst die Erfindung
neue Proteine erhältlich
aus Neophroma arcticum mit Gefrierschutzeigenschaften. Ein Hauptgefrierschutzprotein
wurde bislang von den Erfindern identifiziert und seine Sequenz
wurde teilweise bestimmt. Die Erfindung umfasst auch andere Proteine,
die zu der Gefrierschutzaktivität in
dieser Flechtenspezies beitragen können.
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Das aus Neophroma arcticum isolierte
Haupt-GSP hat gemäß Beurteilung
durch SDS-Polyacrylamid-Gelchromatographie ein scheinbares Molekulargewicht
von ungefähr
29 kDa (obgleich unter Berücksichtigung
der Grenzen der Technik eine Fehlergrenze von ± 4 kDa um diesen Wert wahrscheinlich
ist). Die N-terminale Aminosäuresequenz
dieses Proteins wurde bestimmt als
L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T
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Es scheint eine Sequenzheterogenität an den
Positionen 8 (Hauptform Q mit E als Nebenvariante) und 13 (Hauptform
V mit S als Nebenvariante), wie angegeben, zu bestehen. In einer Ähnlichkeitssuche
in Peptidsequenzdatenbanken wurden keine bekannten Polypeptide mit
einer signifikanten Homologie zu dieser Sequenz gefunden.
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Die Erfindung umfasst spezifisch
dieses Protein, ganz gleich, ob es direkt aus Neophroma arcticum oder
durch Expression einer DNA-Sequenz, die es kodiert, in einem genetisch
veränderten
Organismus erhalten wird.
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Ebenfalls im Bereich der Erfindung
enthalten sind Proteine, aus welcher Quelle auch immer, die einen hohen
Grad an Sequenzähnlichkeit
mit der vorstehend aufgeführten
Sequenz aufweist. Für
die Zwecke der Erfindung sind alle Proteine in dem Beriech enthalten,
die GSP-Aktivität
zeigen und die eine Aminosäuresequenz
haben, von der ein Teil eine mindestens 80%ige Überlappung mit der vorstehenden
Sequenz zeigt. Bevorzugter ist eine mindestens 90%ige Überlappung,
am meisten bevorzugt eine mindestens 95%ige, z. B. Sequenzen, die
sich von der vorstehenden in nicht mehr als 1 oder 2 Komponenten
in dem entsprechenden Teil ihrer Sequenzen unterscheiden.
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Für
den Zweck der Erfindung kann der Grad der Überlappung zwischen zwei (Teil-)Aminosäuresequenzen
wie folgt berechnet werden: (a) die zwei Sequenzen werden aneinandergelegt
und die Anzahl an Komponenten, die identisch sind und in der gleichen
Reihenfolge erscheinen, wird gezählt
(x); (b) jede Änderung,
Auslassung oder Einfügung
einer Aminosäure
wird gezählt
(1 Punkt) und die Summe solcher Änderungen,
Auslassungen oder Einfügungen
berechnet (y); (c) der Überlappungsgrad
wird berechnet als x·100%/(x + y)
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Es ist ersichtlich, dass wenn das ähnliche
Protein eine Aminosäuresequenz
mit einer N-terminalen Verlängerung
aufweist, die Aminosäuresequenz,
die am N-terminalen Ende beginnt nicht selbst eine mindestens 80%ige Ähnlichkeit
aufweisen muss. Solche Proteine bilden trotzdem einen Teil der Erfindung,
vorausgesetzt, dass zumindest ein Teil der Aminasäuresequenz
eine mindestens 80%ige Überlappung
mit der vorstehenden Sequenz zeigt.
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Ebenfalls eingeschlossen in den Bereich
der Erfindung ist jede modifizierte Version eines beliebigen der
vorstehend beschriebene Proteine, vorausgesetzt, dass die Modifikation
die GSP-Aktivität
(wie z. B. in einem Splat-Assay beurteilt wird) des modifizierten
Proteins nicht signifikant beeinträchtigt. Beispielsweise sind glycosylierte
Proteine eingeschlossen.
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Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuresequenzen,
die die neuen erfindungsgemäßen Proteine
kodieren. Die DNA-Sequenz des Haupt-GSP, die bereits teilweise sequenziert
wurde, kann leicht kloniert und charakterisiert werden unter Verwendung
von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren; ein geeignetes Verfahren
ist in Beispiel 11 umrissen. DNA-Sequenzen, die andere GSPs kodieren,
die vorliegen können,
können ähnlich gewonnen
werden, sobald Teilproteinsequenzen erhalten werden.
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Vektoren, die eine DNA-Sequenz aufweisen,
die ein erfindungsgemäßes GSP
kodieren, sind auch im Bereich der Erfindung enthalten.
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Für
einige Anwendungen kann es möglich
sein, ausreichend Nephroma arcticum aus der Wildnis zu sammeln,
ohne die Umwelt zu schädigen.
Tatsächlich
merken die Erfinder an, dass einige Flechten bereits kommerziell
für eine
Verwendung als Rentierfutter geerntet werden. Die Erfindung schafft
daher ein Verfahren zur Herstellung eines Materials, das ein GSP
enthält,
wobei das Verfahren das Sammeln der Flechte Nephroma arcticum aus
der Wildnis und das Gewinnen eines GSP-Aktivität zeigenden Extrakts daraus
umfasst.
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Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens
in einem industriellen Maßstab
hängt deutlich
von der Verfügbarkeit
der Flechte ab und ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin,
dass die Erfinder die Berge in Zentralnorwegen inspiziert haben
und gefunden haben, dass Nephroma arcticum reichlich vorhanden ist
und daher in ausreichender Menge gesammelt werden kann, um sie als
Zusatzstoff in verarbeiteten Nahrungsmitteln zu verwenden. Die Erfinder haben
neue, reichhaltige Gebiete dieser Spezies gefunden und haben daraus geschlossen,
dass N. arcticum in diesen Bergen sehr verbreitet ist. Es ist interessant
anzumerken, dass Daten aus dem Norwegischen Kräutermuseum rar sind und den
Eindruck erwecken können,
dass diese Spezies nicht sehr verbreitet ist. Die wiederspiegelt
jedoch eher eine mangelnde Untersuchung als die tatsächliche
Verbreitung der Flechte. Ein Problem mit diesen Berggebieten besteht
jedoch darin, dass die Flechte in diesen Gebieten eine Wachstumsform
aufweist, die sie sehr schwierig zu sammeln macht. Sie wächst sehr
fest verbunden mit Erde und Moos und jeder Thallus ist kleiner als
in niedriger gelegenen Gebieten. Daher besteht die beste Sammelstrategie
wahrscheinlich darin, nach reichhaltigen Gebieten unterhalb der
Baumgrenze zu suchen.
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Verfahren zum Herstellen von Rohproteinextrakten
aus Mikroorganismen und für
die teilweise oder vollständige
Aufreinigung von Proteinen mit spezifischen Aktivitäten aus
solchen Extrakten sind im Fachgebiet sehr gut bekannt. Ein Verfahren,
das für
eine Isolierung eines sehr reinen Präparats eines Haupt-GSP aus
N. arcticum geeignet ist, bei dem eine Kombination aus Ionenaustausch,
Affinitätschromatographie
und Gelfiltration verwendet wird, ist in Beispiel 9 angegeben. Für eine Anwendung
in Nahrungsmittelzubereitungen wäre ein
so hoher Aufreinigungsgrad nicht nötig. Jedoch könnte eine
Teilaufreinigung, z. B. um Proteasen zu entfernen, die ansonsten
dazu neigen könnten,
das GSP mit der Zeit abzubauen, erwünscht sein.
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Ist es erwünscht, das GSP in einem Nahrungsmittelprodukt
zu verwenden, muss das Extraktionsverfahren so ausgelegt sein, dass
nur ungiftige Chemikalien verwendet werden. Ein solches Verfahren
ist in Beispiel 6 beschrieben, obgleich andere Extraktionsverfahren
ebenfalls verwendet werden können.
Es ist wichtig anzumerken, dass es vor einer Verwendung einer beliebigen
solchen GSP-Zubereitung in gefrorenen Nahrungsmitteln notwendig
sein kann, zu bestätigen,
dass die Zubereitung tatsächlich
ungiftig ist. Es gibt spezialisierte toxikologische Laboratorien,
die solche Arbeiten unter Verwendung von Techniken durchführen, die Fachleuten
auf dem Gebiet gut bekannt sind.
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Die Erfindung schafft auch ein Verfahren
zur Herstellung eines Materials mit GSP-Aktivität, wobei das Verfahren das
Kultivieren eines Organismus umfasst, der eine DNA-Sequenz enthält, die
ein neues erfindungsgemäßes Protein
kodiert unter der Kontrolle geeigneter genregulierender Elemente
und unter Bedingungen, unter denen das Protein synthetisiert wird,
und das Gewinnen eines GSP-Aktivität zeigenden Extrakts aus der
Kultur. Dieser Organismus kann einer der Teilorganismen von Nephroma
arcticum sein, in denen das das GSP kodierende Gen natürlich auftritt,
oder er kann ein unterschiedlicher Organismus sein, der genetisch
verändert
wurde, um das GSP herzustellen.
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Flechten bestehen aus zwei oder mehreren
Organismen, die in Symbiose leben. Der Mycobiont ist ein Pilz und
der Photobiont ist entweder eine Alge oder ein Cyanobakterium. In
manchen Fällen,
einschließlich Nephroma
arcticum, lebt der Pilz gleichzeitig sowohl mit Algen als auch mit
Cyanobakterien in Symbiose. Der Photobiont stellt Energie aus Photosynthese
zur Verfügung.
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Es ist möglich, die Teilorganismen einer
Flechte, wie Nephroma arcticum, zu kultivieren. Insbesondere ist
es möglich,
die einzelnen Teilorganismen zu kultivieren: Eine Kultur des fungalen
Partners kann hergestellt werden, eine Kultur des Algenpartners
kann hergestellt werden und eine Kultur des bakteriellen Partners
kann hergestellt werden. Die Kultur, die das meiste GSP erzeugt,
kann bestimmt werden, indem der standardmäßige GSP-Assay verwendet wird.
Solche Kulturen könnten
dann als kommerzielle GSP-Quelle verwendet werden. Dieser Ansatz
hätte den
Vorteil, dass er einerseits keine Umweltbedenken hervorrufen würde, da
N. arcticum nicht aus der Wildnis entnommen würde, und andererseits keine
Gentechnologie beteiligt wäre.
Dies ist wahrscheinlich wichtig, weil manche Verbraucher nicht wol len,
dass ihre Nahrungsmittel Zusätze
oder Inhaltsstoffe enthalten, die durch Gentechnologie hergestellt
wurden. Wie die Teilorganismen kultiviert werden, wird in Beispiel
12 gelehrt.
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Eine alternative Strategie bestünde darin,
einen genetisch veränderten
Organismus zu kultivieren, der eine DNA-Sequenz aufweist, die ein
erfindungsgemäßes Gefrierschutzprotein
kodiert, wobei die Sequenz unter Kontrolle eines Genpromotors ist,
der dazu ausgelegt ist, zu veranlassen, dass sie das Gefrierschutzprotein in
dem veränderten
Organismus produziert. Die das Gefrierschutzprotein kodierende DNA-Sequenz
kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden,
der die notwendigen Elemente enthält für eine Transkription und Translation
zu dem gewünschten
Protein unter geeigneten Bedingungen, einschließlich einer geeigneten Orientierung
der Sequenz, des richtigen Leserasters und geeigneten Ziel- und
Expressionssequenzen. Verfahren zur Herstellung geeigneter Vektoren
und zu ihrer Verwendung zum Transformieren vieler verschiedener
Arten von Organismen sind auf dem Fachgebiet gut verstanden.
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Im Prinzip kann jeder Organismus
so verändert
werden, dass er das gewünschte
Protein auf diese Weise produziert, z. B. Bakterien, Hefen, Pflanzen
oder Pflanzen-, Insekten- oder Tierzellen. Bakterien, Hefen und
Pflanzen oder Pflanzenzellsysteme sind allgemein bevorzugt. Genetisch
veränderte
Organismen, die zum Durchführen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet sind, bilden auch einen weiteren Aspekt der Erfindung.
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Vorteile der Verwendung eines genetisch
veränderten
Organismus zum Herstellen des GSP könnten eine einfachere Handhabung
und schnelleres Wachstum des Organismus sowie potentiell viel größere Ausbeuten
umfassen. Eine Extaktion und teilweise oder vollständige Aufreinigung
könnte
auch einfacher sein, insbesondere wenn sie so angelegt ist, dass
das GSP in das Kulturmedium ausgeschieden wird. Ein zusätzlicher Vorteil
der Ausscheidung besteht darin, dass zumindest bei einigen Wirtsorganismen
die Proteasemengen, die sich im Medium ansammeln, üblicherweise
gering sind, sodass die Stabilität
des GSP erhöht
werden könnte.
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Verfahren, die zum Herstellen eines
Protein enthaltenden Extrakts aus solchen kultivierten Organismen
geeignet sind, sind in dem Fachgebiet gut bekannt; geeignete Schritte
für eine
teilweise oder vollständige Aufreinigung
des GSP aus einem solchen Extrakt wären denen ähnlich, die zu dessen Extraktion
aus dem N-arcticum-Extrakt selbst, wie vorstehend beschrieben, verwendet
werden.
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Es ist auch möglich, geeignete genetisch
veränderte
Organismen zu schaffen, die dazu ausgelegt sind, die erfindungsgemäßen GSPs
zu erzeugen, die selbst aufgrund ihres erhöhten Frostwiederstands nützlich sind.
Insbesondere trifft dies auf Pflanzen zu: Diese können Cerealien
sein, wie z. B. Weizen oder Mais, oder Dikotylen, wie z. B. Soja,
Tomate oder Salat. Solche Pflanzen bilden auch einen Teil unserer
Erfindung.
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Erfindungsgemäße GSPs können zweckmäßigerweise in einigen Produkten
verwendet werden, bevorzugt in Nahrungsmittelprodukten, die gefroren
sind oder zum Einfrieren vorgesehen sind. Beispiele für solche
Nahrungsmittelprodukte sind gefrorene Nahrungsmittelprodukte, wie
z. B. Gemüse,
Soßen,
Suppen, Snacks, Milchprodukte und gefrorene Konditoreiwaren, wobei
wir unter diesem Begriff Sorbet, Wassereis, gefrorene Obstpürees und
milchhaltige gefrorene Konditoreiwaren, wie z. B. Speiseeis, gefrorener
Joghurt oder Dessertsoßen,
Fruchteis und Eismilch verstehen. Bevorzugte Nahrungsmittelprodukte
sind gefrorene Gemüse und
gefrorene Konditoreiwaren, z. B. Speiseeis, Wassereis. Werden Trockenmischungen
oder Konzentrate verwendet, kann die Konzentration höher sein,
um sicherzustellen, dass der Gehalt in dem gefrorenen Endprodukt
in dem gewünschten
Bereich liegt.
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Es ist möglich, eine geeignete Menge
einer GSP-haltigen Lösung
zu bestimmen, um sie einem Nahrungsmittel zuzugeben, indem ein die
Rekristallisation hemmender bzw. inhibierender Assay (RI-Assay)
verwendet wird, wie er z. B. in Beispiel 7 beschrieben ist. Der
RI-Assay ist quantitativ, aber er ist auch zeitaufwendig und erfordert
eine spezielle Ausrüstung.
Ein Assay zur Messung der Hemmung der Rekristallisierung von Eis
wurde bereits von Jarman et al. (WO 99/37782) beschrieben. Die Erfinder
haben herausgefunden, dass für
die meisten Anwendungen bevorzugte GSP-Gehalte 0,00005–0,3 Gew.%, insbesondere 0,0001–0,2 Gew.-%
des Endprodukts sind.
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Beim Zubereiten eines Nahrungsmittelprodukts
ist es nicht notwendig, das GSP in hoch aufgereinigter Form zuzugeben:
Es kann als das GSP enthaltende Zusammensetzung zugegeben werden,
z. B. ein Extrakt eines das GSP erzeugenden Organismus. Wie vorstehend
erläutert,
kann jedoch eine Teilaufreinigung vorteilhaft sein, um z. B. Proteasen
zu entfernen.
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Erfindungsgemäße gefrorene Konditoreiwaren
können
durch jedes geeignete, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt
werden. Bevorzugt werden alle Inhaltsstoffe der Formulierung vor
dem Gefrieren bei oder über
Umgebungstemperatur vollständig
miteinander vermischt. Der Gehalt an Feststoffen in der gefrorenen
Konditoreiware (z. B. Zucker, Fett, Aroma- bzw. Geschmacksstoffe)
wird geeignet eingestellt, sodass er bei mindestens 3 Gew.-% und
normalerweise in dem Bereich von 10 bis 70 Gew.-%, insbesondere
40 bis 70 Gew.-% des Endprodukts liegt.
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Die folgenden Beispiele sind lediglich
als Erläuterung
angegeben.
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Beispiel 1
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Sammeln von Flechten und
Transport zu den Laboratorien zur Untersuchung
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Die in den Beispielen verwendeten
Flechtenproben wurden in einer subalpinen Umgebung gesammelt.
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Ausgewählte Flechten wurden von Hand
gepflückt
und während
des Transports zum Labor in Papiertüten aufbewahrt. Im Labor wurden
die Papiertüten
zur Lagerung vor dem Waschen in einen Kühlraum bei +5°C gegeben.
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Die Flechten wurden zuerst unter
laufendem Leitungswasser gespült.
Danach wurden die Flechten gespült
und im nassen Zustand von Hand sortiert. Nach dem Spülen wurden
die Flechten mit flüssigem
Stickstoff gespült
und in einen Gefrierschrank (–80°C) überführt, wo
sie in Papiertüten
in Pappkartons bis zum Transport nach Großbritannien in Styroporschaumbehältern mit
Trockeneis aufbewahrt wurden. Alle Flechten wurden innerhalb von
36 Stunden nach dem Sammeln gespült
und in flüssigem
Stickstoffgefroren.
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Beispiel 2
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Untersuchune auf GSP-Aktivität in zwei
essbaren Flechten (Nephroma arcticum und Cetraria islandica)
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Homogenisieren von Flechtengewebe:
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Gefrorenes Gewebe, das bei –80°C gelagert
wurde, wurde in flüssigem
Stickstoff in einem Mörser
und Pistill, die bei –20°C vorgekühlt waren,
zu einem feinen Pulver gemahlen. Das Pulver wurde in einen frischen Mörser und
Pistill überführt und
weiter in einem gleichen Volumen Puffer A (0,2 M Tris; 10 mM EDTA;
20 mM Ascorbat; pH 7,8; 30% Saccharose (Gew./Gew.) homogenisiert.
Das Homogenat wurde bei 14.000 upm für 4 Minuten zentrifugiert (Jouan
14 Tischzentrifuge) und der Überstand
vor einer weiteren Verwendung in Eis aufbewahrt.
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Prüfen auf GSP-Aktivität unter
Verwendung des Splat-Assays:
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Die GSP-Aktivität wurde unter Verwendung eines
modifizierten „Splat-Assays" bestimmt (Smallwood et
al., Isolation and characterisation of a novel antifreeze protein
from canot (Daucus carota). Biochem. J. 340, 385–391). 4 μl der in der Untersuchung befindlichen
Lösung
wurden auf ein sauberes, geeignet beschriftetes, kreisförmiges 13-mm-Deckglas überführt. Ein
zweites Deckglas wurde auf den Lösungstropfen
gesetzt und die beiden wurden zwischen Fin ger und Daumen zusammengedrückt, sodass
eine Sandwichstruktur gebildet wurde. Die Sandwichstruktur wurde
in ein Heptanbad getaucht, das in einer Kiste Trockeneis bei –80°C gehalten wurde.
Als alle Sandwichstrukturen hergestellt waren, wurden sie aus dem
Heptanbad mit –80°C in die
Beobachtungskammer, die bei –6°C gehaltenes
Heptan enthielt, unter Verwendung von in dem Trockeneis vorgekühlten Pinzetten überführt. Nach
der Überführung in –6°C konnte
beobachtet werden, dass die Sandwichstrukturen von einem durchsichtigen
in ein trübes
Aussehen wechselten. Eiskristalle wurden unter Verwendung eines
20fachen Objektivs auf einem Optiphot Mikroskop (Nikon) sichtbar
gemacht und Bilder wurden nach 60 Minuten Inkubation bei –6°C unter Verwendung
einer Videokamera und eines Bildanalysesystems (LUCIA, Nikon) aufgenommen.
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Für
die semiquantitative Analyse wurden 1 : 2-Reihenverdünnungen
des Überstands
untersucht, um die niedrigste Verdünnung zu bestimmen, bei der
eine reduzierte Eiskristallgröße detektiert
werden konnte. Der Bio-Rad Proteinassay wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers mit einer BSA-Standardkurve verwendet, um den Proteingehalt
des Überstands
zu bestimmen.
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Ergebnisse:
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Die Extrakte von Nephroma arcticum
und Cetraria islandica wurden hergestellt und auf GSP-Aktivität geprüft. Nephroma
arcticum wurde mit positivem Ergebnis auf GSP-Aktivität geprüft. Cetraria
islandica wurde mit negativem Ergebnis auf GSP-Aktivität geprüft. Nephroma
arcticum zeigte eine signifikante GSP-Aktivität: 1 : 2-Reihenverdünnungen der Nephroma-arcticum-Probe
zeigten, dass die GSP-Aktivität
noch bei Gesamtproteingehalten von 0,1 mg/ml nachweisbar war.
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Beispiel 3
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Assav auf GSP-Aktivität in drei
reichlich verfügbaren
Flechten (Nephroma arcticum. Umbilicaria hyperboreo und Platismatia
1
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Proteinextraktion:
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Die drei Flechten Nephroma arcticum
(Familie der Nephromatoceae Peltigerales), Umbilicaria hyperborea
(Familie der Umbilicariaceae) und Platismatia glauca wurden während des
Winters in Norwegen geerntet und bei –80 °C gelagert.
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Die drei Flechtengewebe wurden in
flüssigen
Stickstoffgetaucht und sofort manuell in getrennten Mörsern gemahlen,
wobei regelmäßig flüssiger Stickstoff
zugegeben wurde.
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Die Rohproteinextrakte wurden durch
Rühren
der gemahlenen Flechtengewebe (250 g Nephroma arcticum, 128 g Umbilicaria
hyperborea und 100 g Platismatia glauca) mit eiskaltem 50 mM Tris/HCl „Extraktionspuffer" (750 ml, 550 ml
bzw. 550 ml) in Glasbechern für
30 Minuten bei 4°C
hergestellt. Ein Liter „Extraktionspuffer" enthielt 1 Flasche
Proteaseinhibitor-Cocktail für
den allgemeinen Gebrauch von Sigma. Der Proteaseinhibitor-Cocktail
für den
allgemeinen Gebrauch enthielt 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid
(AEBSF), Aprotinin, Bestatin, trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butan
(E-64), Leupeptin und Natrium-EDTA.
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Die Rohproteinextrakte wurden 5 min
in einem handelsüblichen
Waring-Blender homogenisiert und durch Miracloth von Calbiochem
filtriert. Die drei Flechtenrohextrakte wurden über Nacht unter Verwendung des
Virtis Freezemobile 25EL gefriergetrocknet und bei –20°C gelagert.
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Splat-Assay:
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11 mg gefriergetrockneter Rohextrakt
(Nephroma arcticum, Umbilicaria hyperborea und Platismatia glauca)
wurden in 500 μl
ultrareinem Wasser in Eppendorfröhrchen
resuspendiert und 5 min bei 13.000 upm in einer Mikrozentrifuge
(MSE Micro Centaur) zentrifugiert. Die Überstände wurden aufbewahrt und 50-μl-Aliquote
jedes Extrakts wurden für
2 min bei 95°C
in einem Eppendorf Thermomixer 5436 auf Hitzestabilität geprüft. Beide
Rohextrakte (wärmebehandelt
oder nicht) wurden sofort unter Verwendung einer Version des Splat-Assays,
wie er nachstehend erläutert
ist, auf GSP-Aktivität
untersucht. (Weitere Informationen über den verwendeten Tost sind
in Byass et al., Unilever WO 9804148 angegeben).
-
Die Proben für den Splat-Assay wurden mit
einem gleichen Volumen 60%iger Saccharose gemischt, sodass sich
eine Endkonzentration von 30% Saccharose ergab. Kleine Aliquote
(5 μl) der
zu prüfenden
Probe wurden zwischen zwei Mikroskop-Deckgläser gepresst. Diese wurden
schnell gekühlt
durch Überführen in
ein Bad aus Trockeneis/Trimethylpentan (–70°C) und wurden dann in ein Bad
mit auf –6°C gekühltem Trimethylpentan überführt. Die
GSP-Aktivität
wurde in semiquantitativen Begriffen gemäß dem nachstehend angegebenen
Bewertungssystem beurteilt.
-
Splat-Bewertung Beobachtete
Kristallmorphologien
-
- +++++
- Sehr kleine, sehr
dichte Kristalle.
- ++++
- Klein, nicht dicht
oder klein, ziemlich dicht mit einigen mittelgroßen Kristallen.
- +++
- Klein, nicht dicht
mit mittelgroßen
Kristallen oder klein bis mittelgroß, nicht dicht.
- ++
- Mittelgroße oder
große
Kristalle mit einigen kleinen Kristallen.
- +
- Große, runde,
getrennte Kristalle (z. B. 30% Saccharose-Kontrolle).
-
-
Die Ergebnisse zeigen, dass von den
drei geprüften
Flechten Nephroma arcticum bei weitem die meiste GSP-Aktivität erzeugt.
-
Beispiel 4
-
Maßstabvergrößerung der Herstellung von
GSP-haltigen Extrakten aus Nephroma arcticum
-
8,94 g gefriergetrockneter Nephroma-arcticum-Extrakt
(hergestellt wie in Beispiel 3 unter „Proteinextraktion" beschrieben) wurden
in 70 ml eiskaltem reinem Wasser resuspendiert und für 20 min
bei 4°C
gerührt. Der
Rohextrakt wurde 20 min bei 8.000 upm in einer Sorval Zentrifuge
unter Verwendung eines GSA-Rotors zentrifugiert. Der Überstand
wurde unter Verwendung einer Nalgene 0,8 μ Membranfiltrations-Sterilisationseinheit
und anschließend
einer 0,2 μ Membranfiltrations-Sterilisationseinheit
filtriert. Der braune Nephroma-arcticum-Extrakt wurde in Kunststoffröhrchen in
aliquoten Teilen abgefüllt
und bis zum Gebrauch gefroren gelagert.
-
Beispiel 5
-
Untersuchung der Hitzstabilität von aus
Nephroma arcticum extrahiertem GSP
-
Soll ein GSP als Nahrungsmittelinhaltsstoff
in einem Nahrungsmittel verwendet werden, das während seiner Herstellung pasteurisiert
wird, ist es wichtig, dass das GSP gegenüber den wahrscheinlich eingesetzten Temperaturen
stabil ist. In diesem Beispiel wird die Hitzestabilität von aus
Nephroma arcticum extrahiertem GSP untersucht.
-
Der GSP-haltige Extrakt (hergestellt
wie in Beispiel 3) wurde auf die Gesamtproteinkonzentration unter Verwendung
des BCA-Proteinassay-Reagenzienkits (geliefert von Pierce) analysiert.
Es wurde ermittelt, dass der Extrakt einen Gesamtproteingehalt von
ungefähr
5,8 mg/ml aufwies. Eine kleine Probe dieses Extrakts wurde so verdünnt, dass
sie eine Endkonzentration von 2 mg/ml Protein hatte, und dann wurden
16 μl des
verdünnten
Extrakts in jedes von 5 Eppendorfröhrchen gegeben. Vier der Röhrchen wurden
in einen Eppendorf Thermomixer bei 95 °C eingesetzt. Jedes Röhrchen wurde
der Wärmebehandlung
für einen
unterschiedlichen Zeitraum ausgesetzt: Entweder 1, 2, 5 oder 10
Minuten. Das fünfte
Röhrchen
wurde als Kontrolle verwendet und der Wärmebehandlung nicht ausgesetzt.
Nach dem Erwärmen
wurden die Proben sofort auf Eis gestellt und auf GSP-Aktivität unter
Verwendung des Splat-Assays untersucht.
-
SPLAT-Aktivitäten bei
2 mg/ml Nephroma-arcticum-Extrakt
-
Da das aus Nephroma arcticum extrahierte
GSP ein Erhitzen auf 95°C überleben
kann, ist es für
eine Verwendung in Nahrungsmitteln geeignet, die während ihrer
Herstellung pasteurisiert werden. Beispielsweise würde eine
Speiseeis-„Mischung" typischerweise pasteurisiert
werden, indem sie vor dem Kühlen
und Einfrieren für
25 Sekunden auf einer Temperatur von 82°C gehalten wird. Die Ergebnisse
zeigen, dass das aus Nephroma arcticum extrahierte GSP ein solches
Pasteurisierungsverfahren überleben
könnte.
-
Beispiel 6
-
Zubereitung von GSP aus
Nephroma arcticum durch ein Verfahren, das für eine Zugabe zu gefrorenen
Nahrungsmitteln (Gegenstand toxikologischer Untersuchung) geeignet
ist
-
Probenahme
-
Zwei getrennte Zubereitungen wurden
auf die gleiche Weise hergestellt und die Extrakte wurden zusammengegeben,
um den Endextrakt herzustellen. 29 g (Extrakt 1) bzw. 35 g (Extrakt
2) Gewebe wurden verwendet. Das verwendete Gewebe war N. arcticum,
das von einem der Erfinder (Rolv Lundheim) in Norwegen während der
Winters 1999/2000 gesammelt wurde, zu den Laboratorien in Großbritannien
(auf Trockeneis) transportiert wurde und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert
wurde.
-
Verwendete Puffer
-
Der Extraktionspuffer bestand aus
200 mM Tris-HCl (Fisher Chemicals), 20 mM Ascorbat (Natriumascorbat,
Sigma), 10 mM EDTA (Dinatriumsalz, Sigma) bei pH 7,8.
-
Der Dialysepuffer war 50 mM Tris-HCl,
3 mM EDTA bei pH 7,5.
-
Extraktion
-
Das N-arcticum-Gewebe wurde unter
Verwendung von Mörser
und Pistill in flüssigem
Stockstoff zu einem feinen Pulver gemahlen. Das gemahlene Material
wurde in ein Becherglas mit 180 ml gekühltem Extraktionspuffer gegeben
und 30 min auf Eis gerührt.
Der resultierende Extrakt wurde durch Musselin filtriert. Das feste
Material wurde unter Verwendung des Mörsers und Pistills und eines
kleinen Volumens zusätzlichen
Puffers (Extrakt 1: 40 ml, Extrakt 2: 80 ml) wieder gemahlen. Diese
zweite Extraktion wurde auch durch Musselin filtriert. Die vereinigten
Filtrate aus den zwei Schritten waren der Rohextrakt (Extrakt 1:
~140 ml, Extrakt 2: ~200 ml).
-
Aufreinigung
-
Der Rohextakt wurde in einem geschüttelten
Wasserbad bei 60°C
erwärmt.
Als die Temperatur des Extrakts 60°C erreichte, wurde er 15 min
inkubiert. Der Extrakt wurde dann auf Eis gekühlt bevor er für 10 min bei
15.000 upm in einer Sorvall RC-5B mit einem auf 4°C gekühlten SS34-Rotor
zentrifugiert wurde. Da der Überstand
danach nicht vollständig
klar war, wurde er in sauberen Röhrchen
bei der gleichen Geschwindigkeit nochmals zentrifugiert.
-
Der Extrakt wurde dann unter Verwendung
eines Spectra/Por Dialyseschlauchs mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze
von 6.000–8.000
D dialysiert. Der Dialysepuffer war wie vorstehend beschrieben. Das
Puffervolumen betrug 2 L (Extrakt 1) oder 3 L (Extrakt 2) und der
Puffer wurde dreimal während
einer Zeitperiode von 18 Std. ausgetauscht. Die Dialyse wurde bei
4°C durchgeführt.
-
Konzentration
-
Der dialysierte Extrakt wurde in
dem Dialyseschlauch aufbewahrt und in eine Sandwichschachtel gegeben.
Die Probe wurde mit PEG (Polyethylenglycol 17.500, Fluka) bedeckt.
Die Probe wurde bei 4°C
aufbewahrt, während
sich das Volumen reduzierte. Nach ~2 Tagen in dem PEG-Bad betrug
das Volumen der Extrakte 35 ml (Extrakt 1) und 30 ml (Extrakt 2).
Nach der Konzentration wurden die Extrakte wieder bei 15.000 upm
zentrifugiert und durch 0,45 und dann 0,22 μm Spritzenfiltereinheiten filtriert.
-
Herstellung
und Charakterisierung des Endextrakts
-
Die zwei wie vorstehend beschrieben
hergestellten Extrakte wurden zusammengegeben und in 5-ml-Mengen
aufgeteilt, bevor sie bei –20°C eingefroren
wurden. Dies war der für
den RI-Test und den Wassereistest vorgesehene Extrakt (siehe Beispiel
7).
-
Der Extrakt wurde unter Verwendung
des Splat-Assays auf GSP-Aktivität
untersucht. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (bewertet wie
in Beispiel 2 beschrieben). Die Ergebnisse zeigen, dass der Endextrakt
100fach verdünnt
werden kann und noch immer eine Aktivität in dem Splar-Assay zeigt.
-
-
Der pH-Wert des Extrakts wurde als
pH 6,9 gemessen.
-
Die Proteinkonzentration des Extrakts
wurde unter Verwendung des Coomassie Plus-200 Protein-Assays von
Pierce unter Verwendung der Version mit Standardprotokoll-Mikrovertiefungsplatten
gemäß den Anweisungen
des Herstellers abgeschätzt.
Die gesamte Proteinkonzentration des Endextrakts wurde als ~1 mg/ml
abgeschätzt.
-
Beispiel 7
-
Bestimmung, wie viel GSP
einem Nahrungsmittel zuzugeben ist
-
Rekristallisierungshemmungs
Assay (RI-Assay)
-
Eine Lösung, die GSP aus Nephroma
arcticum enthielt (wie in Beispiel 6 hergestellt), wurde auf einen Saccharosegehalt
von 30 Gew.-% mit Saccharosekristallen eingestellt. Ein 3-ml-Tropfen
der Probe wurde auf ein 22-mm-Deckglas
gegeben.
-
Ein Deckglas mit 16 mm Durchmesser
wurde dann darauf gesetzt und ein 200-g-Gewicht wurde auf die Probe
gesetzt, um eine gleichmäßige Objektträgerdicke
zu gewährleisten.
Die Kanten des Deckglases wurden mit durchsichtigem Nagellack versiegelt.
Der Objektträger
wurde auf einen temperaturgeregelten Linkam THM 600 Mikroskoptisch
gelegt. Der Tisch wurde schnell (50 °C pro Minute) auf –40°C gekühlt, um
eine große Polpulation
kleiner Kristalle herzustellen. Die Tischtemperatur wurde dann schnell
(50°C pro
Minute) auf –6,0°C erhöht und auf
dieser Temperatur gehalten. Die Eisphase wurde bei –6,0°C unter Verwendung
eines Leitz Ortholux II Mikroskops beobachtet. Bedingungen mit polarisiertem
Licht im Zusammenhang mit einer Lambdaplatte wurden verwendet, um
den Kontrast der Eiskristalle zu erhöhen. Bilder wurden bei T =
0 und T = 60 Minuten aufgenommen und unter Verwendung von Bildanalysesoftware
(AnalySIS, Soft-Imaging Software GmbH, D-48133 Münster, Hammerstraße 89, Deutschland)
analysiert. Das Kristallwachstum wurde wie folgt berechnet.
-
Die mittlere Größe einer Eiskristallpopulation
zu einem bestimmten Zeitpunkt wurde bestimmt, indem ein Bild der
Population (unter Verwendung der vorstehend erwähnten Ausrüstung) erfasst wurde und dann
ein Bereich des Bildes ausgewählt
wurde, der mindestens 200 Eiskristalle enthielt. Der größte Durchmesser
jedes Eiskristalls wurde bestimmt, indem um ihn herum gezeichnet
wurde und der größte Durchmesser
unter Verwendung der Bildanalysesoftware berechnet wurde.
-
Jedes RI-Experiment wurde dreimal
durchgeführt
(daher wurden die Bilder von mindestens 600 Eiskristallen analysiert).
Die Daten in der Tabelle zeigen das mittlere Eiskristallwachstum
(d. h. die Differenz zwischen dem mittleren Eiskristalldurchmesser
zum Zeitpunkt Null und nach 60 Minuten). Die Vertrauensgrenzen wurden
für einen
Vertrauensbereich von im Mittel 95% berechnet.
-
Mehrere Verdünnungen einer Zubereitung von
Nephroma-arcticum-GSP wurden hergestellt, um herauszufinden, wie
weit die Probe verdünnt
werden kann und immer noch eine wirksame Hemmung der Rekristallisierung
von Eis erreicht. Praktisch ausgedrückt sind wir der Ansicht, dass
eine GSP-Zubereitung oder eine Verdünnung einer GSP-Zubereitung zum Erreichen
einer wirksamen Hemmung der Rekristallisierung von Eis führt, wenn
eine Probe der Verdünnung
oder der Zubereitung ein Eiskristallwachstum in dem RI-Assay von
3 μm oder
weniger ergibt.
-
Ergebnisse des RI-Assays
-
Das mittlere Kristallwachstum wurde
durch Analysieren der Bilder von 1200 Kristallen bestimmt.
-
-
Die Ergebnisse zeigen, dass die GSP-Zubereitung
20fach verdünnt
werden kann und immer noch eine wirksame Hemmung der Rekristallisierung
von Eis erreicht wird. Daher wurde eine 1-in-20-Verdünnung (=
5%) dieser Zubereitung in Prototypen von gefrorenen Nahrungsmitteln
verwendet, wie in Beispiel 8 gezeigt ist.
-
Beispiel 8
-
Anwendung von Flechten-GSP
in einem Wassereis
-
Zwei flüssige Vormischungen wurden
für die
Herstellung von Wassereis hergestellt:
- (A)
20% Saccharose + 0,2% Johannisbrotgummi in Wasser (negative Kontrolle,
nicht gemäß der Erfindung).
- (B) 20% Saccharose + 0,2% Johannisbrotgummi in Wasser enthaltend
GSP aus Nephrorna arcticum. Das GSP wurde in der Vormischumg auf
eine Konzentration verdünnt,
die einen RI-Wert von ungefähr
2 μm ergeben
würde.
-
In diesem Fall war dies eine Verdünnung von
1 in 20 oder 5% – siehe
Beispiel 7 für
RI-Werte.
-
Daher hatte die Vormischung B die
folgende Zusammensetzung:
| Inhaltsstoff | Gewichts-% |
| Saccharose | 20,00 |
| JBG | 0,2 |
| GSP-Zubereitung
(in wässrigem
Puffer) | 5,00 |
| Wasser | 74,
80 |
-
Bestimmung
der Härte
durch den Vickers-Härte-Test
-
Würfelförmige Wassereisstücke (10
mm × 55
mm × 95
mm) wurden für
jede Zusammensetzung (A und B) wie folgt hergestellt. Jede Zusammensetzung
wurde auf –3,5°C in einem
Gelato Chef 2000 (Magimix UK Ltd.) Speiseeiszubereiter gefroren.
Die Mischung wurde in Silikongummiformen mit Innenabmessungen von
10 mm × 55
mm × 95
mm überführt, die
vorher auf –30°C gekühlt waren.
Die Zubereitung wurde dann bei –30°C für 1 Std.
gekühlt
bevor sie aus der Form entnommen und vor dem Härte-Test unter Verwendung des Vickers-Härte-Tests
bei –25°C gelagert
wurde.
-
Der Vickers-Härte-Test ist ein Eindrücktest,
der das Drücken
eines pyramidenförmigen
Stempels auf die Oberfläche
von Material und das Aufzeichnen der angelegten Kraft als Funktion
der Verschiebung; der Spitze beinhaltet. Kraft und Verschiebung
werden während
des Eindrückbeladungszyklus
und des Entladungszyklus gemessen. Dieser Test ist in „Handbook
of Plastics Test materials" Hrsg.
R. P. Brown, Pub. George Goodwin Limited, The Builder Group, 1–3 Pemberton
Row, Fleet Street, London, 1981, beschrieben. Die Vickers-Pyramidengeometrie
ist ein technischer Industriestandard (BSi 427, 1990). Sie hat an
der Spitze einen Spitzenwinkel von 136°. Die Härte wird Industriestandard
(BSi 427, 1990). Sie hat an der Spitze einen Spitzenwinkel von 136°. Die Härte wird
wie folgt bestimmt:
wobei H
V die
Vickers-Härte
ist, F
max die maximale angelegte Kraft ist
(siehe
2) und A die projizierte Eindrückfläche ist,
die auf der Materialoberfläche
zurückbleibt.
Die Fläche
A wird bestimmt, indem angenommen wird, dass der Eindruck die gleiche
Geometrie wie der Stempel hat, der sie geformt hat, d. h. eine Vickers-Pyramide,
und daher kann die projizierte Fläche aus der Eindrücktiefe
bestimmt werden, die in
3 durch d
i angegeben ist.
A = 24,5d2i -
Ergebnisse aus dem Härte-Test
-
Drei gefrorene Stücke wurden aus jeder Mischung
hergestellt. Insgesamt acht Härtemessungen
wurden für
jede gefrorene Mischung gemacht. [Die 8 Eindrücke wurden unter den 3 Stücken verteilt,
sodass jede Variante von einem Stück zum anderen in den Ergebnissen
berücksichtigt
wurde].
-
-
Die Ergebnisse zeigen, dass das Flechten-GSP
die Textur eines gefrorenen Nahrungsmittels signifikant modifizieren
kann. In dieser besonderen Formulierung (die typisch für ein Wassereis
ist) und bei Verwendung dieser besonderen GSP-Konzentration wurde
eine härtere
Textur erzeugt.
-
Beispiel 9
-
Aufreinigung von GSP für N-terminate
Analyse
-
Um genaue N-terminale Sequenzdaten
zu erhalten, musste eine sehr saubere Probe hergestellt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Probe ist nachstehend
angegeben. Es ist wichtig anzumerken, dass es normalerweise für eine Verwendung
als Nahrungsmittelzusatz nicht notwendig wäre, eine so reine Probe herzustellen.
-
Extraktion von GSP
-
8,6 g sauberes, trockenes Flechtengewebe
wurde in flüssigem
Stickstoff in einem vorgekühlten
Mörser und
Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Das Pulver wurde im Verhältnis 1
: 1 in Puffer A (0,2 M Tris, 10 mM EDTA, 20 mM Ascorbat; pH 7,8)
homogenisiert. Das Homogenat wurde in ein 50-ml-Falconröhrchen gegeben
und auf Eis 15 min mit Ultraschall behandelt bevor es in 1,5-ml-Eppendorfröhrchen überführt und
4 min, 14.000 upm, 4°C
zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden
gesammelt und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets wurden nochmals in
4 ml Puffer A extrahiert und der Überstand wurde dem vorher erhaltenen Überstand
zugefügt.
Die zusammengegebenen Überstände wurden
durch Zentrifugation für
10 min, 14.000 upm, 4°C
geklärt
und auf einer HiTrap Entsalzungssäule (Pharmacia) gemäß den Anweisungen
des Herstellers in Puffer B (50 mM TrisHCl, pH 7,5) entsalzt.
-
Ionenaustauschchromatographie
-
Die entsalzene Probe wurde filtriert
(0,2 μm
Mikrofilter) und 1,5 ml wurden auf eine 6 ml Mono Q Anionenaustauschsäule gegeben,
die mit demselben Puffer equilibriert war, bei einer Flussrate von
1 ml/min. Das Eluat wurde auf Leitfähigkeit und OD 280 überwacht
und es wurden 2-ml-Fraktionen gesammelt. Als die OD 280 zur Basislinie
zurückkehrte,
wurde ein linearer Gradient von 0–0,5 M NaCl angewandt. Die
Gefrierschutzaktivität
eluierte bei etwa 0,2 M NaCl (nach Beurteilung durch Splat-Assay).
-
Affinitätschromatographie
-
Die aktiven Anionenaustauschfraktionen
wurden zusammengegeben und konzentriert (durch Dialyse in Polyethylenglycolverbindung „PEG" bei 4°C). Die konzentrierte
Probe wurde auf eine 28 ml Concanavalin A (ConA) Säule (Pharmacia
FPLC) gegeben, die mit 3 Säulenvolumina
Puffer C [Tris-gepufferte Salzlösung
(TBS – 20
mM Tris/HCl; 0,5 M NaCl; pH 7,4); 1 mM CaCl2;
1 mM MnCl2] equilibriert war, und mit 2
Säulenvolumina Buffer
C durchgewaschen. Die Aktivität
wurde mit ungefähr
3 Säulenvolumina
Puffer D (TBS, 100 mM Methyl-α-D-mannopyranosid)
eluiert. Die Flussrate betrug 2 ml min–1 und
2-ml-Fraktionen wurden durchgehend gesammelt. Die aktiven Fraktionen
wurden zusammengegeben und konzentriert und auf eine Gelfiltrationssäule, wie
sie nachstehend beschrieben ist, gegeben.
-
Gelfiltrationschromatographie
-
Die aktiven Fraktionen wurden in
Milipore-Konzentratoren mit 30 kDa Ausschlussgrenze 10fach konzentriert
und der Durchlauf und das Retentat wurden auf Gefrierschutzaktivität geprüft. Die
aktiven Konzentrate wurden zusammengegeben und weiter konzentriert
(10fach); 22 μl
wurden filtriert und auf eine Superdex 75 Gelpermeationssäule auf
dem Pharmacia SMART-System geladen, die in Puffer B (50 mM Tris/HCl
pH 7,5) vorequilibriert war. Die Flussrate betrug 40 μl/min und
es wurden 50-μl-Fraktionen
gesammelt. Die aktiven Fraktionen nach dem Gelfiltrationsschritt
wurden zusammengegeben und konzentriert und für die N-terminale Analyse wie
in Beispiel 10 beschrieben verwendet.
-
Schlussfolgerung
-
Während
des vorstehend angegebenen Aufreinigungsablaufs wurde Gelelektrophorese
(SDS-PAGE mit Silberfärbung)
verwendet, um das GSP zu identifizieren. Mit dieser Technik wurde
gleichbleibend eine negativ gefärbte
Bande bei 29 kDA identifiziert, die mit der GSP-Aktivität zusammen
aufgereinigt wurde (wie durch den Splat-Assay beurteilt wurde).
Daher war es bekannt, dass dieses Protein GSP war, und es war diese Bande,
die N-terminal sequenziert wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben
ist.
-
Beispiel 10
-
Bestimmung der N-terminalen
Sequenz des von Nephroma arcticum gewonnenen GSP
-
90 μl aufgereinigte N.-arcticum-GSP-Probe
(hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben) wurden gleichmäßig auf
4 benachbarte Spuren aufgegeben und durch SDS-PAGE getrennt bevor
ein Western-Blot auf PVDF-Membran durchgeführt wurde. Die Membran war
in Methanol getränkt
worden und der verwendete Blot-Puffer war 10 mM CAPS, pH 11 plus
10% Methanol. Die Membran wurde mit Ponceau-Farbstoff eingefärbt und
die relevanten Banden mit einer Nadel markiert bevor der Farbstoff
mit Wasser entfernt wurde. Die Membran wurde luftgetrocknet und
aufbewahrt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Procise® 492 Proteinsequenzierers
(Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
Die erhaltene N-terminale Sequenz ist nachstehend angegeben. Die
Erfinder glauben, dass diese Sequenz neu ist und einzigartig für das GSP
ist, das Gegenstand dieser Erfindung ist.
-
N-terminale
Sequenz wie in Beispiel 10 beschrieben [SEQ. ID Nr. 1]
| 1 L | 10
F |
| 2 V | 11
G |
| 3 I | 12
V |
| 4 G | 13
V(S) |
| 5 S | 14
A |
| 6 T | 15
A |
| 7 A | 16
A |
| 8 Q(E) | 17
T |
| 9 N | |
-
Beispiel 11
-
Herstellung von GSP in
einem genetisch veränderten
Organismus
-
Um das Nephroma-arcticum-GSP in einem
wirtschaftlich zweckmäßigeren
Wirtsorganismus herzustellen, wird das GSP-Gen kloniert und in dem
gewählten
Wirtsorganismus exprimiert. GM-Expressionssysteme auf Basis von
Bakterien, Hefen, Pflanzen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen
sind bekannt; die auf Bakterien, Hefen und Pflanzen beruhenden sind
allgemein bevorzugt. Es wird nachstehend gelehrt, wie das GSP-Gen
aus Nephroma arcticum kloniert wird.
-
Klonieren
des GSP-Gens aus Nephroma arcticum
-
Der N-Terminus des Nephroma-arcticum-GSP
ist in Beispiel 10 angegeben. Sobald diese Sequenz bekannt ist,
kann das gesamte Gen für
das GSP kloniert werden – ohne
irgendwelche weiteren erfinderischen Schritte zu machen indem Standardtechniken
zum Klonieren eukaryotischer Gene verwendet werden, die im Fachgebiet
gut bekannt sind. Eine Beschreibung dieses Verfahrens ist nachstehend
angegeben.
-
Für
Eukaryoten gibt es verschiedene Ansätze, die genommen werden können, um
Gene zu klonieren, deren Nterminale Aminosäuresequenz bekannt ist. Alle
eukaryotischen Gene haben einen Poly-A-Schwanz und diese Information
wird zum Klonieren verwendet. Ein typischer erster Schritt würde darin
bestehen, eine Probe von Nephroma arcticum zu erhalten, die für einen
längeren
Zeitraum kaltem Wetter ausgesetzt war (und daher die Herstellung
von GSP induziert wurde). Anschließend folgt die Isolierung von
Poly-A-RNA aus der Probe unter Verwendung von Standard-Reagenzienkits, die
für diesen
Zweck verkauft werden, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt
werden. Alternativ könnte
die Poly-A-RNA aus einer GSP erzeugenden Kultur eines Teilorganismus
der Flechte isoliert werden. In diesem Fall würden die Kulturen einem Kälteschock ausgesetzt
werden, um die Produktion von GSP in den Zellen zu induzieren. Dies
kann erreicht werden, indem ein Kolben mit den Zellen auf Eis gestellt
wird. Sobald Poly-A-RNA isoliert wurde, kann komplementäre DNA hergestellt
werden, indem das Enzym Reverse Transkriptase verwendet wird.
-
Für
diesen Schritt sind Standardkits erhältlich. Zunächst kann Einfachstrang-cDNA
direkt in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden oder
Doppelstrang-DNA, die in der PCR hergestellt und verwendet wird,
oder um eine cDNA-Bibliothek zu schaffen.
-
In der PCR wird die DNA als Matrix
in der Reaktion verwendet. Die PCR-Reaktion benötigt zwei Primer. Ein Primer
wird an die bekannte N-terminale Aminosäuresequenz synthetisiert und
wird höchstwahrscheinlich
abgebaut, um dem Abbau Rechnung zu tragen, der der Kodonverwendung
innewohnt. Ein Beispiel für
eine Primersequenz für
die N-terminale Aminosäuresequenz
T A Q N F G V V A ist:
wobei I = Inosin, R = A oder
G, Y = C oder T.
-
Zusätzlich zu diesem Beispiel könnte ein
Fachmann auf dem Gebiet viele andere Primer synthetisieren, die
an verschiedene Bereiche der N-terminalen Aminosäuresequenz (wie in Beispiel
10 angegeben) synthetisiert sein können. Darüber hinaus ziehen es Fachleute
auf dem Gebiet oft vor, eine Anzahl von Primern an der N-terminalen
Sequenz in einem Klonierungsversuch zu verwenden.
-
Der zweite verwendete Primer ist
eine dT-Oligonukleotidsequenz, die den Poly-A-Schwanz an dem 3'-Ende des Klons binden
wird. Die diese Primer verwendende PCR-Reaktion wird zu einer Bande
führen,
die isoliert und in einen geeigneten Vektor unter Verwendung von
Standardverfahren kloniert werden kann. Der Vektor-Insert wird dann
sequenziert und die DNA in ihre korrespondierende Aminosäuresequenz
translatiert, um das Vorhandensein der von Nephroma arcticum erhaltenen
N-terminalen Sequenz zu zeigen. Durch Klonieren der DNA-Sequenz
in einen Expressionsvektor kann GSP hergestellt und geprüft werden,
um zu zeigen, dass es die gleichen Eigenschaften wie direkt aus
Nephroma isoliertes GSP hat.
-
Ein alternativer Klonierungsweg besteht
darin, die cDNA zu verwenden, um eine Bibliothek in einem geeigneten
Vektor zu erzeugen. Diese Bibliothek kann dann auf das das Nephroma-Protein
kodierende Gen gescreent werden. Verschiedene Wege können verwendet
werden, um auf das Gen zu screenen. Beispielsweise kann ein degenerierter
Primer an der N-terminalen Aminosäuresequenz wie vorstehend beschrieben
angebracht werden und auf irgendeine Weise markiert werden, wie
z. B. unter Verwendung von Radioaktivität. Dieser Primer kann dann
verwendet werden, um die Bibliothek zu screenen, da er an seinen
in der Bibliothek vorhandenen komplementären Strang binden wird. Der
identifizierte Klon kann dann wie vorstehend beschrieben sequenziert
werden. Ein Antikörper
gegen das aufgereinigte GSP-Protein aus Nephroma kann auch hergestellt
werden und dazu verwendet werden, die Bibliothek zu screenen, wenn
sie in einem Expressionsvektor hergestellt wurde. Der Klon kann
wieder wie vorstehend beschrieben sequenziert werden.
-
Beispiel 12
-
GSP-Herstellung durch
Kultivierung von aus Nephroma arcticum erhaltenen Organismen
-
Der Flechtenpilz kann getrennt unter
Laborbedingungen gezüchtet
werden. Dies erfordert ein Wachstumsmedium, das die Nährstoffe
liefert, die der Pilz normalerweise von dem Photobionten erhält, und
auch Spurenelemente, die die Flechte aus ihrer Umgebung erhält. Der
Pilz kann entweder in Flüssigmedien
gezüchtet
werden oder auf der Oberfläche
von Agar, der die geeigneten Wachstumsmedien enthält. Der
Pilz kann auch auf sterilisierter Erde gezüchtet werden (Stocker-Worgotter,
E. und Turk R. 1991, Lichenologist, 23, 127–138).
-
Askomen (die geschlechtlichen Fruchtkörper der
Schlauchpilze (Ascomyceten)) werden von den Flechtenthalli abgeschnitten
und in phosphatgepufferter Salzlösung
gewaschen, wie von Bubrick und Galun (1986, Lichenologist 18, 47–49) beschrieben
ist. Die Askomen können
dann über
Petrischalen befestigt werden, die ein geeignetes Wachstumsmedium
enthalten (Bishcoff, H. W. und Bold H. C., 1963, University of Texas
Publications Nr. 6318, Physiological studies, 4, 1–95). Die
Sporen werden freigesetzt und fallen auf das Wachstumsmedium. Nachdem
die Sporen keimen, können
kleine Agarblöcke
in Flüssigmedien überfuhrt
werden (Ahmadjian, V., 1993, The Lichen Symbiosis, John Wiley & Sons Ine., New
York). Beispiele für
Wachstumsmedien werden von Stocker-Worgotter, E. und Turk R. 1991
(Lichenologist, 23, 127–138)
angegeben.
-
Kulturen der Pilze können auch
von fragmentierten Thalli erhalten werden, wie von Yamamoto Y (1990,
PhD-Dissertation,
Kyoto University) beschrieben und von Stocker-Worgotter (1995, Canadian
Journal of Botany 74, (Suppl. 1) S579–S589) modifiziert wurde.
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Der Photobiont der Flechte kann auf ähnliche
Weise kultiviert werden. Um axenische bzw. keimfreie Kulturen zu
erhalten, werden kleine Thallusfragmente angeritzt und Algenzellen
werden unter einem Präpariermikroskop
mittels einer Mikropipette entnommen und in ein geeignetes Wachstumsmedium überführt (Ahmadjian,
V. 1973 in: The Lichens, V. Ahmadjian und M. E. Hale, Hrsg., Academic
Press, New York, S. 653–659).
Die Algenzellen können
sowohl in Flüssig-
als auch auf Festmedien (Agarmedien) wachsen. Für eine ausführliche Beschreibung der Kulturverfahren
und -medien siehe Ahmadjian 1993. Nephroma arcticum umfasst eine
Alge der Gattung Coccomyxa (Peveling, E. und Galun, M., 1976, New
Phytol. 77, 713) und ein Cyanobakterium der Gattung Nostoc auf (Wetmore,
C. M., 1960, Publ. Mus. Mich. State Univ. Biol. Ser. 1, 369). Cyanobakterien
der Gattung Nostoc und Algen der Gattung Coccomyxa können von
Kultursammlungen, wie z. B. der American Type Culture Colleetion,
erhalten werden. Diese Organismen stammen nicht aus Nephroma arcticum,
aber die mit diesen Kulturen durchgeführten Arbeiten haben Informationen über geeignete
Wachstumsmedien zum Kultivieren solcher Organismen bereitgestellt.
Cyanobakterien der Gattung Nostoc und die von Flechten erhaltenen
wurden von einigen Forschern kultiviert (Ahmadjian 1993).
