DE19732135C2

DE19732135C2 - Gefrorenes Nahrungsmittelprodukt

Info

Publication number: DE19732135C2
Application number: DE19732135A
Authority: DE
Inventors: Peter John Lillford; Andrew John Mcarthur; Christopher Michael Sidebottom
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2017-07-26
Also published as: IL127652A0; AU726699B2; NO990317D0; BR9710564A; FR2751657B1; EP0918863B1; US6156880A; JP4243663B2; WO1998004699A1; GB9714411D0; PA8434401A1; US6090917A; CA2261994A1; AU3443797A; JP2000515751A; DK0918863T3; GB2315752B; IL127652A; US6162789A; DE19732135A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Ge frierschutzproteinen (GSPen) und gefrorene Nahrungsmittel produkte, die GSPe enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Gefrierschutzproteine (GSPe) sind zur Erhöhung der Gefrier toleranz von Nahrungsmitteln vorgeschlagen worden.

Für den Zweck der Erfindung hat der Ausdruck GSP die auf dem Fachgebiet wohlbekannte Bedeutung, nämlich solche Proteine, die die Aktivität zum Inhibieren des Wachstums von Eiskri stallen zeigen. Siehe z. B. US 5,118,792.

Die WO 90/13571 offenbart Gefrierschutzpeptide, die chemisch oder durch rekombinierte DNA-Techniken hergestellt werden. Die GSPe können geeigneterweise in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden. Beispiel 3B zeigt modifizierte Eiskri stallformen, wenn eine Wasser-Eis-Mischung in Kombination mit 0,01 Gew.-% GSP zu einem Film gefroren wird.

Die WO 92/22581 offenbart GSPe aus Pflanzen, die zur Kon trolle der Eiskristallform in Eiscreme verwendet werden kön nen. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren zum Ex trahieren einer Polypeptidzusammensetzung aus extrazellulä ren Räumen von Pflanzen durch Infiltration von Blättern mit einem Extraktionsmedium ohne die Pflanzen aufzubrechen.

Die WO 94/03617 offenbart die Herstellung von GSPen aus Hefe und ihre mögliche Verwendung in Eiscreme. Die WO 96/11586 beschreibt durch Mikroben hergestellte Fisch-GSPe.

Mehrere Literaturstellen erwähnen auch die Isolierung und/oder Verwendung von Pflanzenproteinen für den Cryoschutz. Cryoschutzproteine haben eine Funktion beim Schutz von Pflanzenmembranen gegen Frostschäden. Diese Pro teine besitzen jedoch keine rekristallisationsinhibierenden Eigenschaften und sind daher nicht in den Ausdruck GSPe ein geschlossen.

Hincha beschreibt in Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240 die Isolierung von Cryoschutzproteinen aus Kohl.

Volger beschreibt in Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335-349 die Isolierung von Cryoschutzblattproteinen aus Spinat.

Boothe beschreibt in Plant Physiol (1995), 108: 759-803 die Isolierung von Proteinen aus Brassica napus. Man nimmt wie derum an, daß diese Proteine eher Cryoschutzproteine als GSPe sind.

Neven beschreibt in Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993 die DNA-Charakterisierung von einem Spinat-Cryoschutz protein.

Salzman beschreibt in Abstracts and Reviews der 18th Annual Meeting of the ASEV/Eastern Section in Am. J. Enol. Vitic., Bd. 44, Nr. 4, 1993 das Vorliegen von beim Kochen stabilen Polypeptiden in Vitisknospen. Obwohl die Proteine zu Fisch-Gefrierschutzpeptiden analog sind, sind sie Cryoschutzpro teine und nicht GSPe.

Lin in Biochemical and Biophysical Research Communication, Bd. 183, Nr. 3, 1992, Seiten 1103-1108 und Lin in, Plant Physiology (1992) 99, 519-525 beschreibt das 15 kDa-Cryo schutzpolypeptid aus Arabidopsis Hakaira.

Houde erwähnt in The Plant Journal (1995) 8(4), 583-593 Cryoschutzproteine aus Weizen.

Darüber hinaus haben - wie in Beispiel VIII veranschau licht - Extrakte aus Kohl, Spinat, Brassica napus und Arabidopsis nach dem Erhitzen keine die Rekristallisation inhibierenden Proteine.

Bis jetzt ist die Verwendung von GSPen jedoch nicht auf kom merziell verfügbare Nahrungsmittelprodukte angewandt worden. Ein Grund hierfür sind die hohen Kosten und ein komplizier tes Verfahren zum Erhalten von GSPen. Ein weiterer Grund be steht darin, daß die GSPe, die bislang für eine Verwendung in gefrorenen Nahrungsmittelprodukten vorgeschlagen worden sind, nicht in die Standardformulierungsmischung eingearbei tet werden können, da sie dazu neigen, während der Verarbei tung zu destabilisieren, insbesondere während des Pasteuri sierungsschritts. Man nimmt an, daß diese Destabilisation durch die Denaturierung der GSPe verursacht wird; dies ist ein wohlbekannter Effekt, der allgemein für Peptide und Pro teine beobachtet wird.

Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, Lösungen für diese Probleme zur Verfügung zu stellen.

Überraschend hat man gefunden, daß GSPe aus natürlichen Quellen wie an die Kälte akklimatisierten Pflanzen mittels eines neuen, relativ einfachen Verfahrens isoliert werden können. Dieses Verfahren führt zum ersten Mal zur Identifi kation von GSPen, die bequem in eine Mischung für die Her stellung gefrorener Produkte vor deren Pasteurisation einge arbeitet werden können.

Demgemäß betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren für die Gewinnung von GSPen aus natürlichen Quel len, wobei das Verfahren die Schritte

a) Isolierung eines GSP-enthaltenden Safts aus der na türlichen Quelle;
b) Wärmebehandlung der natürlichen Quelle oder des GSP-enthaltenden Safts auf eine Temperatur von minde stens 60°C;
c) Entfernung der unlöslichen Fraktion

einschließt.

Schritt c des obengenannten Verfahrens wird normalerweise nach den Schritten a und b stattfinden. Die Schritte a und b können in jeder gewünschten Reihenfolge ausgeführt werden, z. B. Schritt a gefolgt von Schritt b (in dem Fall wird der GSP-reiche Saft erwärmt werden) oder Schritt b gefolgt von Schritt a (in dem Fall wird die natürliche Quelle erwärmt werden) oder Schritte a und b gleichzeitig.

Überraschenderweise haben wir gefunden, daß das erfindungs gemäße Isolierungsverfahren eine Anzahl von Vorteilen hat.

Erstens ist es durch die Verwendung des Verfahrens nicht mehr notwendig ein Zerreißen der natürlichen Quelle wie Pflanzen zu vermeiden, wie es in den Verfahren gemäß WO 92/22581 notwendig war. Dies erhöht sofort wesentlich die kommerzielle Anwendbarkeit des Verfahrens, z. B. im Vergleich mit WO 92/22581, da hohe Investitionskosten für eine spe zielle Verarbeitung nicht länger notwendig sind.

Durch die Anwendung der hohen Temperaturen erscheint es auch möglich, aus einer großen Gruppe von in den natürlichen Quellen vorliegenden Peptiden eine neue Auswahl von sehr ak tiven GSPen aus dem natürlichen Material zu extrahieren, wo bei die GSPe Peptide einschließen, die unter Bezug auf die Eigenschaften zur Inhibierung der Eis-Rekristallisation sehr aktiv sind.

Drittens denaturiert entgegen den Erwartungen die Verwendung von hohen Temperaturen nicht das gesamte proteinöse Mate rial, sondern scheint nur einige der Proteine zu denaturie ren, während die verbleibenden GSPe eine erhöhte Temperatur stabilität aufweisen. Dies macht es möglich, die isolierten GSPe in Zusammensetzungen einzuschließen, die höheren Tempe raturen, z. B. einem Pasteurisationsschritt, unterworfen wer den müssen. Dies ist besonders überraschend, da z. B. die GSPe aus WO 92/22581 unter Erwärmungsbedingungen nicht sta bil sind (siehe Beispiel VI).

Das erfindungsgemäße Verfahren schließt in Schritt b das Er wärmen der natürlichen Quelle oder des GSP-reichen Safts auf eine Temperatur von mehr als 60°C ein. Bevorzugt ist die Temperatur von 60 bis 110°C, am bevorzugtesten von 80 bis 105°C. Der Erwärmungsschritt kann nach der Isolation des proteinreichen Safts (Schritt a) oder vor der Isolation des proteinreichen Safts stattfinden. Jeder geeignete Weg zum Erwärmen des Safts kann verwendet werden, z. B. herkömmliches oder Mikrowellenerwärmen, das Erwärmen wahlweise mit einem zugesetzten Extraktionsmedium, die Dampfeinleitung etc.

Wenn ein Extraktionsmedium verwendet wird, wird es bevorzugt in kleinen Volumina eingesetzt, um eine unnötige Verdünnung der GSP-Fraktion zu vermeiden. Jedes geeignete Extraktions medium kann verwendet werden, obwohl die Verwendung von Was ser besonders bevorzugt ist. Wenn gewünscht, können dem Was ser vor seiner Verwendung als ein Extraktionsmedium Zusätze zugesetzt werden. Am bevorzugtesten wird jedoch Wasser ver wendet, das im wesentlichen frei von Zusätzen ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf jede natürliche Quelle wärmestabiler GSPe angewandt werden. In dieser Liste sind Pflanzen, Fische, Insekten und Mikroorganismen einge schlossen. Sowohl natürlich vorkommende Arten als auch Ar ten, die durch genetische Veränderung erhalten wurden, kön nen verwendet werden. Zum Beispiel können Mikroorganismen oder Pflanzen genetisch verändert werden, um GSPe zu expri mieren, und die GSPe können dann gemäß der vorliegenden Er findung isoliert werden. GSPe mit einer Homologie von minde stens 80%, bevorzugter mehr als 95%, am bevorzugtesten 100% zu den GSPen, die direkt aus natürlichen Quellen erhalten werden, können so erhalten werden. Für den Zweck der Erfin dung sind Proteine, die diesen hohen Homologiegrad besitzen, auch in den Ausdruck GSPe eingeschlossen. Auch diese trans formierten Mikroorganismen oder Pflanzen, die in der Lage sind, Gene zu exprimieren, die die GSPe codieren, sind auch in den Bereich der Erfindung eingeschlossen.

Genetische Manipulationstechniken können zur Herstellung von in der Erfindung beschriebenen, wärmestabilen GSPen verwen det werden. Eine geeignete Wirtszelle oder -organismus würde durch eine Genkonstruktion transformiert, die das gewünschte wärmestabile Polypeptid codiert. Die Nucleotidsequenz, die für das wärmestabile Polypeptid codiert, kann in einen ge eigneten Expressionsvektor eingebracht werden, der die not wendigen Elemente für die Transkription und Translation enthält und in einer Art und Weise, daß sie unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden (z. B. in richtiger Orientierung und in richtigem Leserahmen und mit geeigneter Ziel- und Expressionssequenz). Die zur Erzeugung dieser Expressionsvektoren benötigten Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt.

Eine Anzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden, um die Codierungssequenz für das wärmestabile Polypeptid zu exprimieren. Diese schließen ein, sind aber nicht darauf be schränkt: Bakterien, Hefe, Insektenzellsysteme, Pflanzenzel lenzuchtsysteme und Pflanzen, alle mit den geeigneten Ex pressionsvektoren transformiert.

Eine breite Vielfalt von Pflanzen und Pflanzenzellsystemen können mit den Nucleinsäurekonstruktionen der in dem wärme stabilen Extrakt isolierten Polypeptide transformiert wer den. Bevorzugte Ausführungsformen schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Mais, Tomaten, Tabak, Karotten, Erdbeeren, Rapssamen und Zuckerrüben.

Bevorzugt stammt das GSP von Pflanzen (dies bedeutet, daß das GSP entweder direkt von der Pflanze als natürliche Quelle erhalten wird oder GSPe mit einem hohen Grad an Homo logie zu diesen GSPen transgenetisch in anderen Organismen hergestellt werden). Jede Pflanze, die wärmestabile GSPe enthält, kann verwendet werden, bevorzugt sind jedoch natür lich auftretende Pflanzen (oder ihre genetisch modifizierten Versionen), die in der Lage sind, unter kalten Bedingungen zu wachsen, so daß sie GSPe enthalten. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Winterroggen, winterharten Gräsern und Riedgräsern. Andere geeignete Pflanzen können z. B. aus der Gruppe der Holzpflanzen, Wintergetreiden, etc. stammen.

Besonders bevorzugt stammen die wärmestabilen GSPe aus Acer saccharoides, Bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis und Agrostis tenuis, Festuca contracta und Poa annua.

Der GSP-reiche Saft kann durch jedes brauchbare Verfahren von seiner Quelle getrennt werden, z. B. durch Pressen, Fil trieren, Homogenisieren, Extrahieren, etc. Bevorzugt wird die natürliche GSP-Quelle, wie das Pflanzenmaterial, in kleine Stücke oder in eine Aufschlämmung umgewandelt, bevor die proteinreiche Fraktion z. B. durch Filtration gesammelt wird. Dieses Aufschließen kann durch jede geeignete Methode ausgeführt werden, z. B. in einem Mischer. Der Fachmann wird gut in der Lage sein, das Material in solch eine Form zu zerteilen, daß das Aufsammeln des proteinreichen Safts leicht stattfinden kann.

Nach Sammeln und Erwärmen (in der gewünschten Reihenfolge) der Proteinfraktion kann dann die resultierende GSP-enthal tende Probe nach jedem brauchbaren Verfahren behandelt werden, um die unlösliche Fraktion zu entfernen und die GSP-reiche flüssige Fraktion zurückzuhalten. Die unlösliche Fraktion kann z. B. durch Filtration, Absetzenlassen, etc. entfernt werden. Die GSP-reiche Flüssigkeit kann dann vor teilhaft weiter verarbeitet werden, um die GSPe aufzukonzen trieren oder zu isolieren, um sie in eine für die weitere Verwendung geeignete Form zu bringen. Beispiele für ge eignete Verarbeitungsarten sind das Trocknen, um ein Pulver oder eine Paste zu erhalten, das weitere Aufkonzentrieren, um ein GSP-Konzentrat zu erhalten, die Chromatographie, um die GSPe von dem Extraktionsmedium zu trennen, etc. Der Fachmann wird wiederum wohl in der Lage sein, die geeigneten Mittel und Bedingungen für eine angemessene Isolierung zu bestimmen.

Für einige natürliche Quellen können die durch die oben ge nannten Methoden erhaltenen GSPe aus einer Mischung aus zwei oder mehreren verschiedenen GSPen bestehen. Wenn gewünscht, können diese GSPe durch jedes herkömmliche Verfahren ge trennt werden, z. B. durch Chromatographie oder andere Ver fahren, die auf den Unterschieden der physikalischen/chemi schen Eigenschaften wie das Molekulargewicht basieren.

Wenn gewünscht, kann auch die Aminosäurezusammensetzung und -sequenz der isolierten GSPe bestimmt werden. Jedes ge eignete Verfahren zur Bestimmung dieser Eigenschaften kann verwendet werden. Beispiele für geeignete Verfahren werden in den Beispielen beschrieben. Wenn gewünscht kann auch die die GSPe codierende Nucleinsäuresequenz bestimmt werden. Vektoren, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die in der Lage ist, die Aminosäuren zu codieren, sind auch in den Be reich der Erfindung eingeschlossen.

Basierend auf der oben gegebenen Information ist es auch möglich, andere natürliche Quellen genetisch so zu modifi zieren, daß sie wie hierin zuvor angegeben, die vorteilhaf ten GSPe produzieren. Beispiele für geeignete GSPe sind in den Beispielen beschrieben.

Man hat gefunden, daß die nach dem oben benannten Verfahren erhaltenen GSPe eine erhöhte Fähigkeit aufweisen, einer thermischen Behandlung zu widerstehen. Man nimmt an, daß solche GSPe niemals zuvor isoliert worden sind. Wie oben be schrieben, ist diese erhöhte thermische Resistenz besonders von Interesse für eine Verwendung in Nahrungsmittelproduk ten, die einem Wärmebehandlungsschritt, z. B. einer Pasteuri sation, unterworfen werden.

Demgemäß betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung GSPe, die eine thermische Stabilität aufweisen, wie nachgewiesen durch keine wesentliche Reduktion der Rekristallisationsin hibierungseigenschaften nach einer Wärmebehandlung für 1 Stunde bei 80°C oder 10 Minuten bei 100°C. Ein geeigneter Test zur Bestimmung der Eis-Rekristallisationsinhibierungs eigenschaften wird in den Beispielen beschrieben und schließt das schnelle Gefrieren auf -40°C gefolgt von einer Lagerung für 1 Stunde bei -6°C ein. Bevorzugt führen GSPe, die diesem Test nach der Wärmebehandlung unterworfen werden, zu einer Eiskristallteilchengröße, die weniger als 5 µm größer ist als die Eiskristallgröße einer Probe mit dem gleichen GSP, das nicht wärmebehandelt ist. Bevorzugt ist der Unterschied weniger als 3 µm, am bevorzugtesten weniger als 1 µm.

Bevorzugt werden solche GSPe ausgewählt, die signifikante Eis-Rekristallisationsinhibierungseigenschaften haben. Ein geeigneter Test zur Bestimmung der Rekristallisationsinhi bierungseigenschaften wird in dem Beispiel VI angegeben. Bevorzugt stellen GSPe gemäß der Erfindung eine Eis teilchengröße nach einem Eis-Rekristallisationsinhibierungs assay - wie in den Beispielen beschrieben - von 15 µm oder weniger zur Verfügung, bevorzugter von 5 bis 15 µm.

Die GSPe können bequem in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden, bevorzugt in Nahrungsmittelprodukten, die gefroren sind, oder die dazu bestimmt sind, eingefroren zu werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von GSPen in Produk ten, die erwärmt werden, z. B. durch Pasteurisation oder Ste rilisation vor dem Einfrieren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung in gefrorenen Konfektprodukten.

Beispiele für solche Nahrungsmittelprodukte sind: gefrorene Konfektmischungen wie Eiscrememischungen und Wassereismi schungen, die dazu bestimmt sind, vor dem Einfrieren pasteu risiert zu werden. Solche Mischungen werden normalerweise bei Raumtemperatur gelagert. Geeignete Produktformen sind z. B.: eine Pulvermischung, die z. B. in einem Beutel oder in Tütchen verpackt ist. Die Mischung ist in der Lage, die Ba sis des gefrorenen Nahrungsmittelprodukts zu bilden, z. B. nach Zugabe von Wasser oder wahlweise anderen Bestandteilen und - wahlweise - Belüftung.

Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Mischung könnte eine flüssige Mischung (wahlweise belüftet) sein, die, wenn notwendig nach Zugabe weiterer Bestandteile und wahlweise weiterer Belüftung, eingefroren werden kann.

Der klare Vorteil der obengenannten Mischungen besteht darin, daß das Vorliegen des GSP-Bestandteils bewirkt, daß die Mischungen unter ruhigen Bedingungen eingefroren werden können, z. B. in einer Laden- oder Heimgefriertruhe, ohne die Bildung unannehmbarer Eiskristallformen und somit mit einer Textur, die sich von Produkten, die normalerweise durch ru higes Einfrieren erhalten werden, unterscheidet.

Sehr bequem werden diese Mischungen in geschlossenen Behäl tern (z. B. Schachteln, Beuteln, Dosen, Plastikbehältern, etc.) verpackt. Für einzelne Portionen wird die Packungs größe im allgemeinen von 10 bis 1000 g sein. Für Mehrfach portionen können Packungsgrößen von bis zu 500 kg geeignet sein. Im allgemeinen wird die Packungsgröße von 10 g bis 5000 g reichen.

Wie oben angegeben, sind die bevorzugten Produkte worin die GSPe verwendet werden, gefrorene Konfektprodukte wie Eiscreme oder Wassereis. Bevorzugt ist der Gehalt der GSPe von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, basierend auf dem Endprodukt. Wenn Trockenmischungen oder Konzentrate verwendet werden, kann die Konzentration höher sein, um sicherzustellen, daß der Gehalt in dem gefrorenen Endprodukt in dem oben genannten Bereich liegt.

Überraschenderweise hat man gefunden, daß die erfindungsge mäßen Zusammensetzungen sehr geringe Mengen an GSPen enthal ten können, während sie weiter von guter Qualität sind.

Überraschenderweise hat man gefunden, daß der Gehalt an GSPen so gering wie 0,1 bis 50 ppm sein kann, während er weiterhin angemessene Rekristallisationseigenschaften und eine Temperaturtoleranz in gefrorenen Konfektprodukten zur Verfügung stellt. Obwohl die Anmelder unter keinen Bedingungen an eine Theorie gebunden sein möchten, kann der Grund hierfür sein, daß die Wechselwirkung zwischen den Feststoffen des gefrorenen Konfekts und den GSPen einen exzellenten Mechanismus zur Inhibierung des Kristallwachstums zur Verfügung stellt. Am brauchbarsten ist der Gehalt an GSP von 1 bis 40 ppm, besonders bevorzugt von 2 bis 10 ppm.

Für den Zweck der Erfindung schließt der Ausdruck gefrorenes Konfektprodukt Milch ein, die gefrorene Konfekte enthält, wie Eiscreme, gefrorener Joghurt, Fruchteis, Sorbet, Milcheis und gefrorene Eiercreme, Wassereissorten, Granitas und gefrorene Fruchtpürees. Für einige Anwendungen ist die Verwendung in fermentierten Nahrungsmittelprodukten weniger bevorzugt.

Bevorzugt ist der Gehalt an Feststoffen in dem gefrorenen Konfekt (z. B. Zucker, Fett, Geschmacksstoffe, etc.) mehr als 4 Gew.-%, z. B. mehr als 30 Gew.-%, bevorzugter von 40 bis 70 Gew.-%.

Erfindungsgemäße gefrorene Konfektprodukte können nach jedem Verfahren hergestellt werden, das zur Herstellung eines ge frorenen Konfekts geeignet ist. Besonders bevorzugt, werden jedoch alle Bestandteile der Formulierung vor der Pasteuri sation und bevor der Einfriervorgang beginnt, vollständig gemischt. Der Gefriervorgang kann vorteilhaft einen Här tungsschritt beinhalten, z. B. bei einer Temperatur von -34°C (-30 Fahrenheit) oder niedriger.

Beispiel I

Isolierung von GSPen durch zunächst Sammeln des Saftes gefolgt von der Wärmebehandlung und Isolation des GSP.

Winterroggen (Halo-Sorte) wurde im Januar geschnitten (die Durchschnittstemperatur in dem Monat war 3,5°C, was die ge eignete Kälteakklimatisation der Pflanzen sicherstellte). Das Gewebe wurde schnell zur weiteren Behandlung in das Labor transportiert und gründlich mit Wasser gewaschen, um Schmutz zu entfernen.

400 g der Schnitzel wurden bei Raumtemperatur in einem Waring-Mischer mit 800 g Wasser bis das Blattgewebe voll ständig zerrissen war, homogenisiert. Der GSP-reiche Saft wurde durch Filtrieren durch vier Lagen Musselin gesammelt.

Der GSP-reiche Saft wurde dann einer Temperaturbehandlung durch Kochen des Safts für 10 Minuten unterworfen. Dies be wirkte die Absetzung von Protein, während das GSP für die erfindungsgemäße Verwendung in Lösung blieb. Der Überstand wurde vom Niederschlag durch Zentrifugieren bei 15 000 g für 20 Minuten oder durch weitere Filtration durch Musselin ge trennt.

Die GSPe können aus dem Überstand durch Gefriertrocknen iso liert werden.

Für Kontrollzwecke kann ein apoplastisches Extrakt (extra zelluläres Extrakt) aus Winterroggen wie folgt erhalten wer den: Die Blätter von 30-tägigen, an die Kälte akklimatisier ten Roggenpflanzen wurden in 3 cm Längen geschnitten und gründlich in destilliertem Wasser gewaschen, um alle Zellin halte zu entfernen. Die Blattstücke wurden auf einem Papier handtuch trocken getupft und in einem Extraktionsmedium aus 5 mM EDTA, 10 mM Ascorbinsäure, 2 mM Capronsäure, 2 mM Benzamidin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) voll ständig untergetaucht. Sie wurden dann in einem Büchner-Kol ben für 60 Minuten vakuuminfiltriert und nach dieser Zeit wurden die Blätter entfernt und vollständig trocken getupft. Sie wurden dann in Längsrichtung in einer aufgeschnittenen Plastikspritzenhülse angeordnet und bei 2000 X g für 30 Mi nuten sanft zentrifugiert. Das apoplastische Extrakt wurde in einem Eppendorf-Röhrchen unter der Spritze gesammelt.

Beispiel II

Isolierung von GSPen durch zuerst Erwärmen der natürlichen Quelle, gefolgt von der Isolierung des GSP-reichen Safts und Isolierung des GSPs.

Gewebe von gemischtem Gras (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) wurde im Januar geschnitten (die Durchschnittstemperatur in dem Monat war 3,5°C, was die geeignete Kälteakklimatisation der Pflanzen sicherstellte). Das Grasgewebe wurde schnell zur weiteren Behandlung in das Labor transportiert und gründlich mit Wasser gewaschen, um Schmutz zu entfernen.

500 g Grasschnitzel wurden in einen 650 Watt Mikrowellenofen gegeben und bei voller Stärke für 5 Minuten erhitzt, wobei die Temperatur auf 85 bis 100°C stieg. Die Grasschnitzel wurden dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt.

Alternativ werden die Grasschnitzel mit 500 g kochendem Was ser gemischt und die Mischung wird auf 100°C wiedererwärmt, gefolgt vom Kochen für 10 Minuten unter Rühren und dann Ab kühlenlassen auf 60°C.

Nach dem Erwärmungsschritt wurde der GSP-reiche Saft durch Filtrieren von den Schnitzeln getrennt. Die Masse wurde in Gegenwart eines gleichen Volumens Wasser für 5 Minuten durchgehend gerührt und dann durch 3 Schichten Musselin ge drückt.

Der Überstand kann zur Entfernung des Wassers gefrierge trocknet werden, gefolgt von einer Lagerung. Alternativ kann der Überstand zur Lagerung gefroren werden.

Beispiel III

Eine flüssige Vormischung zur Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:

Bestandteil
Gew.-%
Magermilchpulver	11,390
Saccharose	3,410
Maltodextrin (MD40)	4,000
Johannisbrotgummi	0,072
Stärkezuckersirup aus Mais 63DE	20,705
Guar-gummi	0,048
Genulacta L100	0,020
Butter	9,015
Avicel RC581	0,240
Gelatine	0,140
Monoglycerid(palmitat)	0,450
Vanillin	0,010
GSP (aus Beispiel I*)	0,100 oder keines (Kontrolle)
Wasser	Ausgleich

* Beachte: Das GSP wird als konzentrierte GSP-Lösung unter Verwendung eines Teils des zugegebenen Wassers als Verdün nungsmittel zugegeben, die Prozentangabe bezieht sich auf die Menge an GSP.

Diese Mischung kann bequem bei 85°C für 15 Sekunden pasteu risiert und in einer Dose gekühlt gelagert werden.

Die Mischungen können bei der Herstellung von Eiscreme durch Schlagen mit einem herkömmlichen Haushaltsmischer auf einen Überlauf von etwa 100% gefolgt von ruhigem Einfrieren in einer Haushaltsgefriertruhe verwendet werden. Die erfin dungsgemäße Zusammensetzung hatte eine ausgesprochen bessere Textur als die Kontrollprobe.

Sehr gute Ergebnisse werden unter Verwendung des GSPs aus Beispiel II anstelle des GSPs aus Beispiel I erhalten.

Beispiel IV

Eine flüssige Vormischung für die Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:

Bestandteil
Gew.-%
Magermilchpulver	10,00
Saccharose	13,00
Maltodextrin (MD40)	4,00
Johannisbrotgummi	0,14
Butteröl	8,00
Monoglycerid(palmitat)	0,30
Vanillin	0,01
GSP (aus Beispiel I*)	0,01 oder keines (Kontrolle)
Wasser	Ausgleich

* Beachte: Das GSP wird als konzentrierte GSP-Lösung in einem Teil des Wassers zugegeben, die Prozentangabe be zieht sich auf die Menge an GSP.

Die Bestandteile wurden bei Raumtemperatur gemischt, gefolgt von einer Pasteurisation für 60 Sekunden bei 89°C. Die Mi schung wurde in Verpackungen von 500 ml aseptisch einge füllt, verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert.

Die Mischung kann für die Herstellung von Eiscreme durch Schlagen mit einem herkömmlichen Haushaltsmischer bis zu einem Überlauf von etwa 70% gefolgt von Einfrieren unter ruhigen Bedingungen in einer Haushaltsgefriertruhe verwendet werden.

Nach zwei-monatiger Lagerung hatte die erfindungsgemäße Zu sammensetzung eine ausgesprochen bessere Textur als die Kon trollprobe.

Beispiel V

Beispiel IV wurde wiederholt, aber jetzt wurde die Eiscreme mischung vor dem aseptischen Einfüllen und Verschließen bis zu einem Überlauf von 70% belüftet.

Das resultierende Produkt kann bei Raumtemperatur gelagert werden und eine Eiscreme kann durch Legen der Mischung in eine Haushaltsgefriertruhe und Einfrieren unter ruhigen Be dingungen hergestellt werden.

Beispiel VI

Die Eis-Rekristallisationsinhibierungseigenschaften der GSPe können wie folgt bestimmt werden:

Eine Probe eines GSP-enthaltenden Produkts wurde auf einen Saccharosegehalt von 30 Gew.-% eingestellt (wenn der An fangsgehalt der Probe größer als 30% war, wurde dies durch Verdünnen gemacht, wenn der Anfangsgehalt niedriger war, wurde Saccharose auf einen Gehalt von 30% zugegeben).

Ein 3 µl Tropfen der Probe wurde auf ein 22 mm Deckglas pla ziert. Ein Deckglas mit 16 mm Durchmesser wurde dann darauf gelegt und ein 200 g Gewicht wurde auf die Probe gelegt, um eine gleichmäßige Objektglasdicke sicherzustellen. Die Kanten des Deckglases wurden mit klarem Nagellack versiegelt.

Das Objektglas wurde auf einen Linkham THM 600 temperaturge regelten Mikroskoptisch gelegt. Der Tisch wurde schnell (50°C pro Minute) auf -40°C abgekühlt, um eine große Menge kleiner Kristalle zu erzeugen. Die Tischtemperatur wurde dann schnell (50°C pro Minute) auf -6°C erhöht und bei die ser Temperatur gehalten.

Die Eisphase wurde bei -6°C unter Verwendung eines Leica Aristoplan-Mikroskops beobachtet. Bedingungen polarisierten Lichts in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwen det, um den Kontrast der Eiskristalle zu erhöhen. Der Zu stand der Eisphase (Größe der Eiskristalle) wurde durch 35 mm Photomikrographie bei T = 0 und T = 1 Stunde aufgezeichnet.

Allgemein kann dieser Test auf jede geeignete Zusammenset zung angewandt werden, die GSP und Wasser umfaßt. Im allge meinen ist die Konzentration von GSP in einer solchen Test zusammensetzung nicht sehr kritisch und kann z. B. von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugter von 0,0005 bis 0,1 Gew.-%, am bevorzugtesten von 0,001 bis 0,05 Gew.-% reichen, z. B. 0,01 Gew.-%.

Jede geeignete GSP und Wasser umfassende Zusammensetzung kann zur Durchführung des Tests verwendet werden. Im allge meinen wird es jedoch nicht notwendig sein, das GSP in gereinigter Form zu erhalten. Für praktische Anwendungen ist es normalerweise ausreichend, ein flüssiges Extrakt oder einen Saft des natürlichen Materials herzustellen, wobei dieses Extrakt oder dieser Saft getestet werden kann.

Dieses Verfahren kann z. B. auf die GSP-enthaltenden Extrakte wie in den Beispielen I oder II erhalten, mit oder ohne einem Konzentrationsschritt, angewandt werden.

Die rekristallisationsinhibierenden Eigenschaften mehrerer Proben wurden gemessen. Die Proben wurden von Roggen erhal ten, der an verschiedenen Monaten während des Jahres geern tet worden war. Die GSP-Säfte, die nach Extraktion und Er wärmen gemäß Beispiel I erhalten wurden, wurden wie oben be schrieben, auf ihre Rekristallisationseigenschaften gemes sen. Als Vergleich wurde Roggen verwendet, der in einem Ge wächshaus gewachsen war (bei Temperaturen, die normalerweise nicht die GSP-Bildung auslösen).

Die folgenden Eiskristallgrößen wurden gemessen:

Probe
Eiskristallgröße nach 1 Stunde (µm)
Kontrolle	25
Probe Dezember	17
Probe Januar	10
Probe Februar	15
Probe März	18
Probe April	18
Probe Mai	25

Diese Messungen zeigen, daß für eine gute GSP-Aktivität die Pflanzen während der Wintermonate, z. B. Dezember-April geerntet werden sollten. Besonders bevorzugt sind Proben, die in der Lage sind, Eiskristallgrößen von 15 µm oder weni ger zur Verfügung zu stellen. In diesem Fall kann dies durch Ernten der Pflanzen im Januar oder Februar erreicht werden.

Die gleichen Messungen wurden an GSP-Proben aus Januar durchgeführt, die hitzebehandelt worden waren (1 Stunde bei 60°C). Keine wesentliche Verminderung der Rekristallisa tionseigenschaften wurde beobachtet.

Als ein Vergleich wurde das apoplastische Extrakt aus Bei spiel I verwendet. Dies führte zu einer endgültigen Eiskri stallgröße nach 1 Stunde von 11,1 µm; nach Wärmebehandlung durch Kochen für 10 Minuten bei 100°C führte der Test nach 1 Stunde zu einer Eiskristallgröße von 16,8 µm. Dieses Bei spiel zeigt, daß das apoplastische Extrakt aus Winterroggen nicht wärmestabil ist.

Beispiel VII

Nicht wärmebehandeltes Grasextrakt aus im Januar geerntetem Gras wurde von Silsoe (UK) erhalten. Das Extrakt wurde für 1 Stunde zur Entfernung von Schmutz und unlöslichem Schutt wie folgt zentrifugiert, Zentrifuge: Sorvall RC3C, Rotor: H6000A, Temperatur: +5°C, Rotorgeschwindigkeit: 5000 UpM (7268 g).

Eine Probe des Extrakts wurde zur Bestimmung seines Gesamt feststoffgehalts gefriergetrocknet. Man fand, daß dieser 11,48 mg/ml betrug. Das getrocknete Extrakt wurde dann mit 30% Saccharoselösung auf seine ursprüngliche Gesamtfest stoffkonzentration rehydratisiert. Mehrere Lösungen wurden durch Verdünnen des Extrakts wie notwendig mit 30% Saccha roselösung hergestellt.

Die Gefrierschutzaktivität wurde unter Verwendung des Assays aus Beispiel VI gemessen.

Man maß die mittleren Eiskristallgrößen der T = 0 und T = 1 Stunde Bilder aus den Rekristallisationsinhibierungsassays unter Verwendung des Zeiss TGA 10-Analysators. Die erhalte nen Ergebnisse werden in der unten angegebenen Tabelle ge zeigt.

Diese Ergebnisse zeigen die Veränderung der endgültigen Kri stallgröße und die Änderung der Eiskristallgröße über 1 Stunde bei -6°C für die verschiedenen Verdünnungen des Gras extrakts. Man kann sehen, daß der Feststoffgehalt in dem Grasextrakt über einen weiten Bereich variiert werden kann, während immer noch gute Rekristallisationsinhibierungseigen schaften erhalten werden. Bevorzugt werden solche Konzentra tionen gewählt, die zu einer Eiskristallgröße nach 1 Stunde von 15 µm oder weniger führen.

Ein ähnlicher Test wurde mit Grasextrakt durchgeführt, das einer Wärmebehandlung unterworfen worden war (10 Minuten bei 100°C). Keine wesentliche Verschlechterung der Rekristalli sationsinhibierungseigenschaften wurde beobachtet.

Zusätzlich wurden die Grasextrakte aus Beispiel II unter Verwendung des gleichen Rekristallisationsinhibierungstests getestet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Diese Ergebnisse zeigen, daß selbst nach Erwärmen das Ex trakt aus an die Kälte akklimatisiertem Gras die Fähigkeit zum Inhibieren von Eiskristallwachstum beibehielt.

Beispiel VIII

Mehrere GSP-enthaltende Pflanzen wurden im Januar geerntet. Extrakte wurden durch Zerkleinern von frischem Gewebe, z. B. Wurzeln, Stengel, Knospen oder Blätter, mit einem Pistill und einem Mörser (auf 4°C gekühlt) in einem gleichen Volumen Puffer A (10 mM EDTA, 20 mM Ascorbinsäure, mit Tris auf pH 7,4 gepuffert) auf Eis gehalten, erhalten. Die Homogenisate werden durch eine oder mehrere Schichten aus Musselin filtriert und für eine weitere Verwendung auf Eis gehalten.

Die Extrakte wurden dem Rekristallisationsinhibierungstest von Beispiel VI sowohl nach Erwärmen auf 60°C für 1 Stunde als auch Kochen für 10 Minuten unterworfen.

Die folgenden Pflanzen enthielten, wie nachgewiesen durch das Beibehalten der Rekristallisationsinhibierungseigen schaften, wärmestabile GSPe: Acer saccharoides, Bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis und Agrostis tenuis, Festuca contracta und Poa annua.

Die folgenden Pflanzen enthielten keine wärmestabilen GSPe: Kohl, Spinat, Brassica napus und Arabinopsis.

Beispiel IX

Die thermische Hystereseaktivität der GSPe kann wie folgt getestet werden:

1 ml Proben wurden in Eppendorfs in ein heißes Wasserbad ge halten und für 1 Stunde bei 60°C erwärmt. Die thermischen Hystereseeigenschaften der Proben wurden dann wie folgt ge messen:

Das geschmolzene Produkt wurde auf ein Mikroobjektglas (Camlab Cambridge, Weglänge 0,1 mm) gegeben. Die Enden des Mikroobjektglases wurden mit Rohvaseline verschlossen.

Eis wurde unter Verwendung eines Aerosolgefriersprays in der Probe erzeugt. Das Objektglas wurde dann in ein tempera turgeregeltes Ethanolbad bei -0,1°C eingetaucht. Nach 5-minütiger Gleichgewichtseinstellung wurde die Probe über prüft. Wenn das Eis vollständig schmolz, wurde die Tempera tur des Bades in 0,1°C Schritten erniedrigt, gefolgt von einer Gleichgewichtseinstellung. Diese Schritte wurden wie derholt, bis eine Temperatur erreicht wurde, bei der eine kleine Menge Eiskristalle in der Probe vorlag. Nach Gleichgewichtseinstellung bei dieser Temperatur wurde die Badtemperatur in Schritten von 0,01°C pro Minute herabge setzt. Der Gefrierpunkt der Probe wurde als die Temperatur aufgezeichnet, an der die Eisausbreitung von den ins Gleich gewicht gebrachten Kristallen beginnt.

Die Schmelztemperatur der Probe wird dann durch Erhöhen der Temperatur ausgehend vom Gefrierpunkt in Schritten von 0,01°C pro Minute, bis alle Eiskristalle schmelzen, be stimmt. Diese Temperatur ist die Schmelztemperatur der Probe.

Die thermische Hysterese der Probe ist die Differenz zwi schen der Schmelztemperatur und der Gefriertemperatur.

Dieser Test wird an einer ersten Probe (vor der Wärmebehand lung) und an einer zweiten Probe nach Wärmebehandlung, ge folgt vom Abkühlen, durchgeführt.

In gleicher Art und Weise kann die Wärmestabilität durch den oben genannten Test bestimmt werden, worin die Probe in Was ser für 30 Sekunden gekocht wird, gefolgt von der Bestimmung der thermischen Hysterese. Die thermische Hysterese mehrerer Proben wurde bestimmt.

Die Proben wurden aus Winterroggen erhalten, die an ver schiedenen Momenten während des Jahres geerntet worden wa ren. Die GSP-Säfte, die nach Extraktion und Erwärmen gemäß Beispiel I erhalten wurden, wurden auf ihre thermische Hy sterese wie in Beispiel VI gemessen. Als Vergleich wurde Winterroggen verwendet, der in einem Gewächshaus gewachsen war (bei Temperaturen, die normalerweise die GSP-Bildung nicht auslösen).

Die folgenden thermischen Hysteresen wurden gemessen:

Probe
Thermische Hysterese (°C)
Kontrolle	0,04
Probe Dezember	0,18
Probe Januar	0,21
Probe Februar	0,17
Probe März	0,15
Probe April	0,12
Probe Mai	0,05

Diese Messungen zeigen, daß für eine gute GSP-Aktivität die Pflanzen während der Wintermonate, z. B. Dezember-März, geerntet werden sollten.

Die gleichen Messungen wurden an den GSP-Proben aus Januar durchgeführt, die wärmebehandelt (1 Stunde bei 60°C) worden waren. Keine wesentliche Verminderung der thermischen Hy sterese wurde beobachtet.

Beispiel X

Bestimmung der Aminosäuresequenz von GSPen.

Das wärmestabile Grasextrakt aus Beispiel II wurde etwa 10 mal unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer Membran mit 10 kDa Rückhaltevermögen aufkonzentriert. Das resultierende Konzentrat wurde auf eine Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC-Anionenaustauschsäule gegeben. Die Bindung an die Säule erfolgte in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,5 und die RI-aktive Fraktion wurde mit einem linearen Gra dienten von NaCl auf eine Endkonzentration von 0,5 M in dem gleichen pH 8,5 Tris-Puffer eluiert. Die Chromatographie wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml min⁻¹ durchge führt und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf eine re kristallisationsinhibierende Aktivität durchgesehen (wie in Beispiel IX).

Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und auf ein Volumen von 0,05 ml an einem Centricon PM10 Zentrifugal-Kon zentrator (Amicon) durch Zentrifugieren bei 10 000 UpM für 10 Minuten in einem Sorvall SS 34 Rotor (8 × 50 ml) aufkon zentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Superdex 75 PC 3.2/30 Gelfiltrationssäule gegeben, die an einem SMART-Mi krotrennungssystem (Pharmacia) lief. Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,5 bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,05 ml min⁻¹ eluiert. Fraktionen von 0,05 ml wurden nachdem die Probe auf ein Gesamtvolumen von 3,5 ml auf gegeben worden war, gesammelt. Die Fraktionen wurden auf eine Rekristallisationsinhibierungsaktivität durchgesehen (wie in Beispiel IX) und die aktivsten Fraktionen wurden einer Trennung an einem SDS PAGE-Gel und einem Elek trofließen ("electroblotting") vor dem N-terminalen Sequenzieren unterworfen.

Die aktiven Superdex 75-Fraktionen wurden in einem das Gel beladenden Puffer aufgenommen (50 mM Tris/HCl, pH 6,8, 10% Glycerin, 10 mM Dithiothreitol, 2% SDS) und dann an einem 10% Polyacrylamidgel der Laemmli-Methode folgend getrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel gegen einen Bogen aus Methanol benetzter Problott-(Perkin Elmer)-Membran geschichtet und bei 20 Volt für 16 Stunden in 10 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure-(CAPS)-Puffer (pH 11,0), der 10% Methanol enthielt, elektroblottet. Nach dem Blotten wurde die Membran kurz mit Methanol und dann mit milli Q (Millipore) Wasser gewaschen und die gebundenen Pro teine wurden mit einer Lösung aus 0,1% (Gew./Vol.) Coomassie-Brilliantblau sichtbar gemacht.

Zwei Proteinbanden von scheinbaren Molekulargewichten von 25 kDa und 35 kDa wurden durch das Coomassieanfärben sichtbar gemacht. Das 35 kDa-Protein schien besonders nahe mit den RI-aktivsten Fraktionen zu korrelieren. Beide Banden wurden mit einem Skalpellblatt herausgeschnitten und sequenziert. Ein ungefärbter Bereich der Membran, der einem scheinbaren Molekulargewicht von 65-75 kDa entsprach, wurde auch einer Sequenzierung unterworfen, da ein Silberanfärben von Gelen der aktivsten Fraktionen vormals eine Proteinbande bei die sem Molekulargewicht gezeigt hatte.

Alle drei herausgeschnittenen Membranbereiche wurden durch Einladen in eine Blott-Sequenzier-Cartridge sequenziert und die Sequenz wurde unter Verwendung von Reaktions- und Kon versions-Zyklen, wie durch den Hersteller (Perkin-Elmer) be schrieben, bestimmt. N-terminale Sequenzlisten werden unter angegeben.

Das 25 kDA-GSP umfaßt eine Sequenz vom N-Terminus, die im wesentlichen homolog ist zu:

ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR

Das 35 kDa-GSP umfaßt eine Sequenz von dem N-Terminus, die im wesentlichen homolog ist zu:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO

Das 65-70 kDa-GSP umfaßt eine Sequenz von dem N-Terminus, die im wesentlichen homolog ist zu:

X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

In jeder Sequenz bezeichnet X eine Unbekannte, die jede in Pflanzenproteinen gefundene Aminosäure sein kann. Für den Zweck der Erfindung bezieht sich der Ausdruck im wesentlichen homolog auf eine mindestens 80% Überlappung der Aminosäuren, bevorzugter mehr als 90%, am bevorzugte sten 95 bis 100%.

Claims

1. Verfahren zum Gewinnen von Gefrierschutzproteinen (GSPen) aus natürlichen Quellen, wobei das Verfahren die Schritte

a) Isolierung eines GSP-enthaltenden Safts aus der na türlichen Quelle;
b) Wärmebehandlung der natürlichen Quelle oder des GSP-enthaltenden Safts bis auf eine Temperatur von min destens 60°C;
c) Entfernung der unlöslichen Fraktion

einschließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Schritte a und b in jeder Reihenfolge vor Schritt c stattfinden.

3. GSP mit einer thermischen Stabilität wie nachgewiesen durch keine signifikante Verminderung der Eis-Rekristal lisationsinhibierungseigenschaften nach Wärmebehandlung für 1 Stunde bei 60°C, 1 Stunde bei 80°C oder 10 Minuten bei 100°C.

4. GSP gemäß Anspruch 3, worin die Eiskristallgröße einer Zusammensetzung von wärmebehandeltem GSP in Wasser nach schnellem Gefrieren auf -40°C gefolgt von einer Lagerung bei -6°C für 1 Stunde weniger als 5 µm größer als die Eiskristallgröße des gleichen GSPs ist, das nicht wärme behandelt ist.

5. GSP nach Anspruch 3 oder 4, worin die Eiskristallgröße einer Zusammensetzung des GSPs in Wasser nach schnellem Gefrieren auf -40°C gefolgt von einer Lagerung bei -6°C für 1 Stunde 15 µm oder weniger ist.

6. GSP gemäß Anspruch 3 oder 4, umfassend ein oder mehrere Proteine mit einem Molekulargewicht von 25 kDa, 35 kDa und 65-75 kDa.

7. GSP gemäß Anspruch 6 mit einer N-terminalen Sequenz von im wesentlicher Homologie zu:
25 kDa-GSP:
ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR
35 kDA-GSP:
ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO
65-75 kDA-GSP:
X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

8. Vektor, der eine Nucleinsäuresequenz enthält, die in der Lage ist, mindestens eines der GSPe aus Anspruch 7 zu codieren.

9. Transformierter Organismus, der in der Lage ist, minde stens eines der GSPe aus Anspruch 7 zu exprimieren.

10. Gefrorenes Konfektprodukt, das von 0,0001 bis 0,5 Gew.-% des GSPs gemäß Anspruch 3 umfaßt.

11. Vormischung, die für eine Verwendung in der Herstellung eines gefrorenen Konfektprodukts nach Anspruch 10 ge eignet ist, umfassend das GSP aus Anspruch 3.

12. Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen Konfektpro dukts, umfassend die Herstellung einer Formulierungsmi schung, die 0,0001 bis 0,5 Gew.-% eines GSPs umfaßt, wo bei das GSP eine thermische Stabilität hat wie nachge wiesen durch keine wesentliche Verminderung der Eis-Re kristallisationsinhibierungseigenschaften nach Wärmebe handlung für 1 Stunde bei 60°C, 1 Stunde bei 80°C oder 10 Minuten bei 100°C, gefolgt durch Einfrieren der Mi schung unter ruhigen Bedingungen.