ITMI971752A1 - Procedimento per isolare proteine anticongelamento da prodotti alimentari e prodotto alimentare congelato contenente proteine per - Google Patents

Procedimento per isolare proteine anticongelamento da prodotti alimentari e prodotto alimentare congelato contenente proteine per Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento per isolare proteine anticongelamento (AFP) e prodotti alimentari congelati contenenti AFP.
E' stato suggerito che proteine anticongelamento (AFP) migliorano la tolleranza dei prodotti alimentari ad essere surgelati.
Allo scopo dell'invenzione 11 termine AFP ha il significato ben noto nella tecnica, cioè indica quelle proteine che presentano l'attività di inibire la crescita di cristalli di ghiaccio. Si veda ad esempio US 5.118.792.
WO 90/13571 descrive peptidi anticongelamento prodotti per via chimica oppure mediante tecniche del DNA ricombinante. Le AFP possono opportunamente essere utilizzate in prodotti alimentari. L'esempio 3B mostra le forme modificate di cristalli di ghiaccio se una miscela per sorbetto viene congelata in una pellicola in combinazione con lo 0,01% in peso di AFP.
WO 92/22581 descrive AFP derivanti da piante che possono essere utilizzate per controllare la forma dei cristalli di ghiaccio nel gelato. Questo documento descrive inoltre un procedimento per estrarre una composizione poiipeptidica dagli spazi extracellulari delle piante e infiltrando le foglie con un mezzo di estrazione senza rompere le piante.
WO 94/03617 descrive la produzione di AFP dal lievito e loro possibile impiego nel gelato.WO 96/11586 descrive AFP derivanti da pesce prodotte mediante microbi.
Diverse fonti della letteratura menzionano inoltre l'isolamento e/o l'impiego di proteine vegetali per la crioprotezione. Le proteine crioprotettive hanno la funzione di proteggere le membrane delle piante contro i danni derivanti dal congelamento. Tuttavia queste proteine non possiedono proprietà di inibizione della ricristallizzazione e non sono quindi comprese nel termine AFP.
Hincha nel Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240 descrive l'isolamento di proteine crioprotettive da cavolo.
Volger in Biochimica et Biiophysica Acta,412 (1975), 335-349 descrive l'isolamento di proteine crioprotettive da fogli di spinaci.
Boothe in Plant Physlol (1995), 108: 759-803 descrive l'isolamento delle proteine da Brassica napus. Ancora, si ritiene che queste proteine siano proteine crioprotettive piuttosto che AFP.
Nemmeno in Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993 si descrive la caratterizzazione del DNA di una proteina crioprotettiva di spinacio.
Salzman in Abstracts and Reviews del 18° Raduno Annuale del ASEV/Eastern Section in Am.J. Enol. Vitic., Voi.44, No.4, 1993 descrive la presenza di polipeptidi stabili per ebollizione in germogli di vite. Sebbene le proteine siano analoghe ai peptidi anticongelamento dei pesci sono proteine crioprotettive e non AFP.
Lin in Biochemical and Biophysical Research Communication, Vo. 183, No.3, 1992, pagg. 1103-1108 e in Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519-525 descrive il polipeptide crioprotettivo 15 kDa da Arabidopsis Hakaira.
Houde in The Plant Journal (1995) 8(4), 583-593 menziona proteine crioprotettive da grano.
Inoltre - come Illustrato nell'esempio Vili - estratti di cavolo, spinacio, Brassica napus e Arabldopsis non hanno proteine che inibiscono la ricristallizzazione dopo il riscaldamento.
Finora, tuttavia l'utilizzo delle AFP non è stato applicato a prodotti alimentari disponibili commercialmente. Una ragione di ciò sono gli elevati costi e procedimento complicato per ottenere le AFP. Un altro motivo è che le AFP delle quali è stato finora suggerito Γ impiego in prodotti alimentari congelati non possono essere incorporate nella miscela di formulazione standard poichdè tendono alla destabilizzazione durante la lavorazione in particolare durante la fase della pastorizzazione. Si ritiene che questa destabilizzazione sia provocata dalla denaturazione delle AFP; questo è un effetto ben noto che si osserva comunemente per i peptidi e le proteine.
La presente invenzione è volta a fornire soluzione a questi problemi. Si è trovato sorprendentemente che le AFP possono essere isolate da fonti naturali come ad esempio piante acclimatate al freddo mediante un procedimento nuovo relativamente semplice. Questo procedimento porta per la prima volta all'identificazione dell'AFP che possono essere convenientemente incorporate in una miscela per preparare prodotti congelati prima della loro pastorizzazione.
Di conseguenza, in un primo aspetto, l'Invenzione riguarda un procedimento per il recupero di AFP da fonti naturali, detto procedimento comprendendo le fasi di:
a) isolare un succo contenente AFP dalla fonte naturale;
b) termotrattare la fonte naturale o succo contenente AFP ad una temperatura di'almeno 60°C;
c) rimuovere la frazione insolubile.
La fase C del procedimento indicato sopra solitamente ha luogo dopo le fasi a e b. Le fasi a e b possono essere svolte in qualsiasi ordine desiderato, ad esempio la fase a seguita dalla fase b (nel qual caso il succo ricco di AFP sarà riscaldato) oppure la fase b seguita dalla fase a (nel qual caso la fonte naturale sarà riscaldata) oppure le fasi a e b simultaneamente.
Sorprendentemente abbiano trovato che il processo di isolamento dell'invenzione presenta una pluralità di vantaggi.
Innanzitutto utilizzando il procedimento non è più necessario evitare di rompere la fonte naturale come le piante come era richiesto nei procedimenti secondo WO 92/22581. Ciò aumenta immediatamente in misura significativa l'applicabilità commerciale del procedimento rispetto ad esempio a WO 92/22581, poiché non sono più necessari elevati costi di Investimento per la lavorazione specifica.
Inoltre, utilizzando le temperature elevate sembra possibile estrarre da un grande gruppo d1 peptidi presenti nelle fonti naturali una nuova scelta di AFP molto attive dal materiale naturale, dette AFP comprendendo peptidi che sono molto attivi dal punto di vista del w.r.t., proprietà di inibizione della ricristallizzazlone del ghiaccio.
In terzo luogo, contrariamente alle aspettative, l'impiego di temperature elevate non denatura tutto il materiale proteico,ma sembra denaturare solamente una parte delle proteine,mentre le restanti AFP presentano una maggiore stabilità alla temperatura. Questo rende possibile includere le AFP isolate in composizioni che debbono essere sottoposte a temperature superiori,ad esempio ad una fase di pastorizzazione. Questo è particolarmente sorprendente poiché le AFP da WO 92/22581 non sembrano stabili in condizioni di riscaldamento (si veda l'esempio VI).
Il procedimento dell'invenzione comprende nella fase b il riscaldamento della fonte naturale o succo ricco di AFP ad una temperatura superiore a 60°C. Preferibilmente la temperatura è compresa fra 60 e 110°C, in modo altamente preferibile fra 80 e 105°C. La fase di riscaldamento può avvenire dopo l'isolamento del succo ricco di proteina (fase a) oppure prima di isolare il succo ricco di proteina. Si può utilizzare qualsiasi modo adatto per riscaldare il succo, ad esempio riscaldamento convenzionale o riscaldamento a microonde, facoltativamente riscaldando con un mezzo di estrazione aggiunto, trattamento con vapore, eccetera.
Se si utilizza un mezzo di estrazione, preferibilmente viene utilizzato in piccoli volumi per evitare l'inutile diluizione della frazione di AFP. Si può utilizzare qualsiasi mezzo di estrazione adatto sebbene sia particolarmente preferito l'impiego di acqua. Se lo si desidera, si possono aggiungere additivi all'acqua prima di utilizzarla come mezzo di estrazione. In modo altamente preferito, si utilizza tuttavia acqua sostanzialmente priva di additivi.
Il procedimento dell'invenzione può essere applicato a qualsiasi fonte naturale di AFP termostabili. Inclusi in questa Usta vi sono piante, pesci, insetti e microorganismi. Si possono utilizzare sia specie presenti in natura che specie ottenute mediante manipolazione genetica. Ad esempio microorganismi o piante possono essere modificati geneticamente per esprimere AFP e le AFP possono essere quindi isolate secondo la presente invenzione. Si possono ottenere pertanto AFP con almeno l'80%, più preferibilmente più del 95%, in modo altamente preferito il 100% di omologia rispetto alle AFP ottenute direttamente da fonti naturali. Agli scopi dell'invenzione, le proteine che possiedono questo elevato livello di omologia sono pure comprese nel termine AFP. Anche questi microorganismi o piante trasformati in grado di esprimere geni che codificano le AFP sono compresi nell'ambito di protezione dell'invenzione.
Tecniche dimanipolazione genetica possono essere utilizzate per produrre le AFP termostabili descritte nell'invenzione. Una cella ospite appropriata o organismo vengono trasformati da un gene costruito che codifi ca il polipeptide termostabile desiderato. La sequenza di nucleotidiche che codifica il polipeptide termostabile può essere inserita in un vettore di espressione adatto che contiene gli elementi necessari per la trascrizione e la traduzione in un modo tale che saranno espressi in condizioni appropriate (ad esempio l'orientamento corretto e nello schema di lettura corretto e con le sequenze desiderate e di espressione appropriati). I procedimenti richiesti per costruire questi vettori di espressione sono ben noti agli esperti del ramo.
Per esprimere la sequenza di codifica di polipeptidi termostabili si può utilizzare una pluralità di sistemi di espressione. Questi comprendono ma non limitatamente batteri, lievito, sistemi di cellule di insetti, sistemi di colture di celle di piante e piante tutti trasformati con i vettori di espressione appropriati.
Un'ampia varietà di piante e sistemi di cellule di piante possono essere trasformate con costrutti di acido nucleico dei poiipeptidi isolati nell'estratto termostabile. Forme di realizzazione preferite comprendono ma non limitatamente mais, pomodoro, tabacco, carote, fragole, semi di colza, bietola da zucchero.
Preferibilmente la AFP viene derivata da piante (il che significa che una AFP viene ottenuta direttamente dalla pianta come fonte naturale oppure AFP con grado elevato di omologia a queste AFP vengono prodotte transgeneticamente in altri organismi). Si può utilizzare qualsiasi pianta contenente AFP termostabile, tuttavia preferibiImente sono piante presenti in natura (o le loro versioni modificate geneticamente) che sono in grado di crescere in condizioni fredde in modo tale da contenere AFP. Si preferisce in particolare l'utilizzo di segale invernale winter-ryg erbe perenni e piante del genere carex. Altre piante adatte possono ad esempio derivare dal gruppo delle piante legnose, cereali invernali, eccetera.
In modo particolarmente preferiv,.bile le AFP termostabili derivano da Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae,Usnea subfloridana, Forsythia,Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterllis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis e Agrostis tenuis, Festuca contracta e Poa annua.
Il succo ricco di AFP può essere separato dalla sua fonte mediante qualsiasi procedimento conveniente ad esempio mediante pressatura, filtraggio,omogeneizzazione,.estrazione,eccetera. Preferibilmente, la fonte naturale di AFP come ad esempio il materiale vegetale viene trasformato in piccoli pezzi o in una sospensione prima di raccogliere la frazione ricca di proteina ad esempio per filtraggio. Questa macerazione può essere realizzata con qualsiasi procedimento opportuno ad esempio in un miscelatore. Rientra nella capacità dell'esperto del ramo dividere il materiale in forma tale che la raccolta del succo ricco di proteina possa avvenire agevolmente.
Dopo la raccolta e il riscaldamento {nell'ordine desiderato nella frazione proteica, il campione contenente AFP risultante può quindi essere trattato mediante un qualsiasi procedimento conveniente per rimuovere la frazione insolubile e trattenere la frazione liquida ricca di AFP. La frazione insolubile può essere rimossa ad esemplo per filtraggio, precipitazione eccetera. Il liquido ricco di AFP può quindi vantaggiosamente essere trattato ulteriormente per concentrare o isolare le AFP e portarle in una forma adatta per l'ulteriore Impiego. Esempi di tali procedimenti adatti sono 1’essiccatura per ottenere una polvere o pasta, ulteriore concentrazione per ottenere concentrato di AFP, cromatografia per separare le AFP dal mezzo di estrazione, eccetera. Ancora, rientra nella capacità dell'esperto del ramo determinare mezzi adatti a condizioni opportune per un appropriato Isolamento.
Per alcune fonti naturali le AFP ottenute con 1 procedimenti indicati sopra possono consistere di una miscela di due o più diverse AFP. Se lo s1 desidera queste AFP possono essere separate mediante un qualsiasi procedimento convenzionale ad esempio mediante cromatografia o altri procedimenti che si basano sulle differenze di proprietà fisiche/chimiche come ad esempio il peso molecolare.
Pure se desiderato, si può determinare la composizione e la sequenza di ammino acidi delle AFP isolate. Per determinare ciò si può utilizzare qualsiasi procedimento opportuno. Esempi di procedimenti adatti sono descritti negli esempi. Pure se desiderato si può determinare la sequenza degli acidi nucleici che codifica le AFP. Il vettore contenente la sequenza di acidi nucleici in grado di codificare gli ammino acidi rientrano pure nell'ambito di protezione dell'invenzione.
Sulla base delle informazioni date sopra è pure possibile modificare geneticamente altre fonti naturali in modo che producano le AFP vantaggiose come identificate sopra. Esempi di AFP adatte sono descritti negli esempi.
Si è trovato che le AFP ottenute col procedimento di cui sopra presentano una maggiore capacità di resistere a trattamento termico. Si ritiene che tali AFP non siano mai state isolate in precedenza. Come descritto sopra, questa maggiore resistenza termica è particolarmente Interessante per noi in prodotti alimentari che subiscono fase di riscaldamento, ad esempio la pastorizzazione.
Di conseguenza, un altro aspetto dell'invenzione riguarda le AFP che presentano stabilità termica come viene evidenziato dall'assenza di riduzione significativa nelle proprietà di inibizione della ricristallizzazione dopo il termotrattamento per un'ora a 80°C oppure 10 minuti a 100°C. Un test adatto per determinare le proprietà di Inibizione della ricristal-Uzzazione del ghiaccio è descritto negli esempi e implica il congelamento rapido a -40°C seguito da conservazione per un'ora a -6°C. Preferibilmente, le AFP che vengono sottoposte a questo test dopo il termotrattamento hanno come risultato dimensioni di particelle dei cristalli di gas minore di 5 μπιe più grandi delle dimensioni di cristalli di ghiaccio di un campione con le stesse AFP non termotrattate. Preferibilmente, la differenza è minore di 3 μηι, in modo altamente preferito minore di 1μιη.
Preferibilmente si scelgono quelle AFP che presentano significative proprietà di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio. Un test adatto per determinare le pr'oprietà di inibizione della ricristallizzazione è indicato nell'esempio VI. Preferibilmente, le AFP in conformità con l'invenzione forniscono dimensioni delle particelle di ghiaccio e dopo un'analisi di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio - come descritto negli esempi - di 15 μm o meno, in modo altamente preferito fra 5 e 15 μm.
Le AFP possono essere utilizzate in modo conveniente in prodotti alimentari preferibilmente 1n prodotti alimentari che sono congelati o sono destinati ad essere congelati. Particolarmente preferito è l'impiego delle AFP in prodotti che vengono scaldati, ad esempio mediante pastorizzazione o sterilizzazione, prima del congelamento. Particolarmente preferito è l'utilizzo di prodotti dolciari congelati.
Esempi di tali prodotti alimentari sono:miscele per dolci congelate come ad esempio miscele di gelato e miscele di sorbetto che sono destinate ad essere pastorizzate prima del congelamento. Tali miscele vengono solitamente conservate a temperatura ambiente. Forme di prodotto adatte sono ad esempio:miscela in polvere confezionata ad esempio in un sacchetto o bustine. Detta miscela essendo in grado di formare la base del prodotto alimentare congelato, ad esempio dopo raggiunta di acqua e facoltativamente altri ingredienti e - in modo opzionale - aerazione.
Un altro esemplo di miscela adatta potrebbe essere una miscela liquida (opzionalmente aerata) che può essere congelata, se necessario dopo 1'aggiunta di ulteriori componenti e ulteriore aerazione opzionale.
Il chiaro vantaggio delle miscele menzionate in precedenza è che la presenza dell'ingrediente AFP fa sì che le miscele possono essere congelate in condizioni quiescenti ad esempio in un negozio o in un freezer domestico senza la formazione di forme di cristalli di ghiaccio inaccettabili e quindi con una consistenza diversa dei prodotti ottenuti normalmente attraverso congelamento quiescente.
In modo altamente conveniente queste miscele vengono confezionate in contenitori chiusi (ad esempio cartoni, sacchetti, scatole, contenitori di plastica, eccetera). Per porzioni singole, la dimensione del pacchetto sarà in generale tra 10 e 1000 g. Per dimensioni di pacchetto con porzioni multiple possono essere adatti fino a 500 kg. In generale, le dimensioni della confezione saranno comprese fra 10 g e 5000 g.
Come Indicato sopra, i prodotti preferiti in cui si utilizzano le AFP sono prodotti dolciari congelati come ad esempio gelato o sorbetto. Preferibilmente il livello delle AFP è compreso fra 0,0001 e/o 0,5% in peso rispetto al prodotto finale. Se si utilizzano miscele secche o concentrati, la concentrazione può essere maggiore al fine di garantire che il livello nel prodotto congelato finale rientri negli intervalli indicati sopra.
Si è trovato sorprendentemente che le composizioni dell'invenzione possono contenere quantità molto basse di AFP e pure conservare una buona qualità.
Sorprendentemente si è trovato che il livello delle AFP può persino essere di 0,1-50 ppm pur conservando proprietà di ricristallizzazione adeguate e tolleranza alla temperatura adeguata nei prodotti dolciari congelati. Sebbene i richiedenti non desiderino in alcun modo essere limitati da una teoria, la ragione di ciò potrebbe essere che l'interazione fra i solidi dei dolci congelati e le AFP fornisce un meccanismo eccellente per inibire la crescita dei cristalli. In modo altamente conveniente il livello di AFP è compreso fra 1 e 40 ppm, particolarmente preferito è 2-10 ppm.
Allo scopo dell'invenzione, il termine prodotto dolciario congelato comprende dolci congelati contenenti latte, come ad esempio gelato,yogurt congelato, sorbetto, latte congelato e creme congelate, ghiaccioli,granite e purè di frutta congelate. Per qualche applicazione l'impiego di prodotti alimentari fermentato è meno preferito.
Preferibilmente, il livello dei solidi nel dolce congelato (ad esempio zucchero, grassi, aromi, eccetera) è maggiore del 4% in peso, ad esempio più del 30% in peso,maggiormente preferito fra il 40 e il 70% in peso.
Prodotti dolciari congelati secondo l'invenzione possono essere ottenuti mediante qualsiasi procedimento adatto alla produzione di dolci congelati. Tuttavia, in modo particolarmente preferibile tutti gli ingredienti della formulazione vengono miscelati completamente prima della pastorizzazione e prima che inizi il processo di congelamento. Il processo di congelamento può vantaggiosamente implicare una fase di indurimento ad esempio ad'una temperatura di -30 Fahrenheit o meno.
Esemplo I
L' isolamento del le AFP mediante iniziale raccolta del succo seguita da termotrattamento e isolamento delle AFP.
La segale invernale (varietà Maio) è stata tagliata in Gennaio (la temperatura media in quel mese era 3,5°C che garantiva Γ acciimatamento al freddo appropriato delle piante). Il tessuto è stato rapidamente trasportato in laboratorio per ulteriore manipolazione e lavato accuratamente con acqua per rimuovere sporcizia.
400 g di pezzettini sono stati omogeneizzati a temperatura ambiente in un miscelatore Waring con 800 g di acqua finché il tessuto fogliare era stato completamente distrutto. Il succo ricco di AFP è stato raccolto mediante filtraggio attraverso quattro strati di mussolina.
Il succo ricco di AFP è stato quindi sottoposto a trattamento in temperatura facendo bollire il succo per 10 minuti. Ciò ha provocato la precipitazione della proteina mentre la AFP da utilizzare secondo l'invenzione restava in soluzione. Il supernatante è stato separato dal precipitato mediante centrifugazione a 15.000 g per 20 minuti o ulteriore filtraggio attraverso mussolina.
Le AFP possono essere isolate dal supernatante mediante liofilizzazione.
Per scopi di controllo, si può ottenere un estratto apoplastico (estratto extracellulare) di segale invernale come segue. Le foglie prelevate da piante di segale acclimatate al freddo da 30 giorni sono state tagliate in tratti di 3 cm e lavate accuratamente in acqua distillata per rimuovere eventuali contenuti di cellule. I pezzetti di foglia sono stati asciugati picchiettando con tovagliolini di carta e immersi totalmente in un mezzo di estrazione di 5 mM EDTA, 10 mM di acido ascorbico, 2 mM di acido caproico, 2 mM di benzammidina e 1mM di Fenilmetilsolforni Fluoruro (PMSF). Quindi sono stati infiltrate a vuoto in un fiasco Buchner per 60 minuti dopo di che le foglie venivano rimosse e asciugate completamente picchiettandole. Quindi sono state disposte longitudinalmente in un corpo di siringa di plastica tagliato e centrifugate delicatamente a 2000 g per 30 minuti. L'estratto apoplastico è stato raccolto in un tubo eppendorf al di sotto della siringa.
Esempio II
Isolamento delle AFP mediante riscaldamento iniziale della fonte naturale, seguito da isolamento del succo ricco di AFP e di isolamento delle AFP.
Tessuto da erba mista (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis), è stato tagliato in Gennaio (temperatura media in tale mese 3,5°C che garantiva l acciimatamento al freddo appropriato delle piante). Il tessuto dell'erba è stato rapidamente trasportato in laboratorio per ulteriore manipolazione ed è stato lavato accuratamente con acqua per rimuovere la sporcizia.
500 g di pezzetti di erba sono stati riposti in un forno a microonde da 650 Watt e riscaldati a piena potenza per 5 minuti, per cui la temperatura è stata portata a 85-100°C. I pezzettini di erba sono quindi stati raffreddati a temperatura ambiente.
In alternativa, i pezzetti di erba sono stati miscelati con 500 g di acqua bollente e la miscela è stata nuovamente riscaldata fino a 100 °C con successiva ebollizione per 10 minuti sotto agitazione e quindi è stata lasciata raffreddare fino a 60°C.
Dopo la fase di riscaldamento, il succo ricco di AFP è stato separato dai pezzettini mediante filtraggio. La massa è stata agitata continuamente per 5 minuti in presenza di uguale volume di acqua e quindi schiacciata attraverso tre strati di mussolina.
Il supernatante è stato quindi liofilizzato per rimuovere l'acqua con successivo imagazzinamento. In alternativa, il supernatante poteva essere congelato per l'imnagazzinamento.
Esempio III
Una premiscela liquida per preparare gelato è stata realizzata mischiando:
Questa miscela può essere convenientemente pastorizzata a 85°C per 15 secondi e quindi immagazzinata refrigerata in un lattina.
Le miscele possono essere utilizzate nella preparazione di un gelato mediante battitura o montatura con un convenzionale frullino domestico fino ad overrun di circa 100%, seguito da congelamento quiescente in un freezer domestico. La composizione secondo l'invenzione aveva una consistenza nettamente migliore del campione di controllo.
Risultati molto buoni vengono ottenuti utilizzando la AFP dell'esempio II invece dell'AFP dell'esempio I.
Gli ingredienti sono quindi stati mischiati a temperatura ambiente con successiva pastorizzazione per 60 secondi a 89°C. La miscela è stata inserita asetticamente in confezioni da 500 mi, sigillata e immagazzinata a temperature ambiente.
La miscela può essere utilizzata per la preparazione di gelato mediante battitura con un convenzionale frullino domestico ad un overrun di circa 70% seguito da congelamento in condizioni quiescenti in un freezer domestico.
Dopo due mesi di conservazione, la composizione secondo l'invenzione aveva una consistenza nettamente migliore del campione di controllo.
Risultati molto buoni vengono ottenuti utilizzando l'AFP dell'esempio II invece della AFP dell'esempio I.
Esempio V
L'esempio IV è stato ripetuto ma ora si è preparata la premiscela con un overrun 70% prima del riempimento asettico e della sigillatura.
Il prodotto risultante può essere immagazzinato a temperatura ambiente e si può produrre un gelato ponendo la miscela in un congelatore domestico e congelandola in condizioni quiescenti.
Esempio VI
Le proprietà di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio e delle AFP possono essere determinate nel modo seguente.
Un campione di prodotto contenente AFP è stato portato ad un livello di saccarosio del 30% in peso (se il livello di partenza del campione era maggiore del 30% questo è stato realizzato mediante diluzione, se il livello di partenza era inferiore si è aggiunto saccarosio fino al livello del 30%).
Una goccia da 3 μl del campione è stata posta su un vetrino coprioggetto da 22 rim. Un vetrino coprioggetto con diametro 16 mm è stato quindi posto in cima e sul campione si è posto un peso da 200 g per garantire spessore di vetrini uniforme. Il bordo del vetrino coprioggetto è stato sigillato con smalto per unghie trasparente.
Il vetrino è stato posto sulla piattaforma di un microscopio a temperatura controllata Linkham THM 600. La piattaforma è stata rapidamente raffreddata (50° al minuto) fino a -40°C per produrre una grande popolazione di piccoli cristalli. La temperatura della piattaforma è stata quindi aumentata rapidamente (50°C al minuto) fino a -6°C e mantenuta questo livello.
La fase di ghiaccio è stata osservata a -6°C utilizzando un microscopio Leica Aristoplan.Si sono utilizzate condizioni di luce polarizzata in congiunzione con una piastra lambda per migliorare il contrasto dei cristalli di ghiaccio. Lo stato della fase di ghiaccio (dimensioni dei cristalli di ghiaccio) è stata registrata mediante fotomicrografia da 35 mm a T=0 e T=1 ora.
In generale questo testo può essere applicato qualsiasi composizione adatta che comprende AFP e acqua. In generale il livello di AFP in tale composizione di prova non è particolarmente critico e può essere compresa ad esempio fra lo 0,0001 e a 0,5% 1n peso, particolarmente preferito fra 0,0005 e lo 0,1% in peso, in modo altamente preferito fra 0,001 e 0,05% in peso, ad esempio 0,01% in peso.
Per lo svolgimento del testo si può utilizzare qualsiasi composizione adatta comprendente AFP e acqua. Tuttavia in generale non sarà necessario ottenere la AFP in forma purificata. Per applicazioni pratiche sarà sufficiente preparare un estratto liquido o succo d1 materiale naturale, in cui si possa analizzare questo strato o succo.
Questo procedimento può essere applicato ad esempio ad estratti contenenti AFP ottenuti nell'esempio I o II, con o senza una fase di concentrazione.
Sono state misurate le proprietà di inibizione della ricristallizzazione dei diversi campioni. I campioni sono stati ottenuti da segale che era stata raccolta in diversi momenti dell'anno. I succhi di AFP ottenuti dopo l'estrazione e riscaldamento secondo l'esempio I sono stati misurati per verificare le loro proprietà di ricristallizzazione come spiegato in precedenza. Si è utilizzato una segale di confronto cresciuta in una serra (a temperature che normalmente non inducono la formazione di AFP).
Si sono misurate le seguenti dimensioni dei cristalli di ghiaccio: Campione Dimensioni dei cristalli di ghiaccio dopo 1 ora (μνη) Controllo 25
Campione di Dicembre 17
Campione di Gennaio 10
Campione di Febbraio 15
Campione di Marzo 18
Campione di Aprile 18
Campione di Maggio 25
Queste misure mostrano che per una buona attività delle AFP le piante dovrebbero essere raccolte durante i mesi Invernali, ad esempio Dicembre-Aprile. Particolarmente preferiti sono campioni in grado di fornire dimensioni dei cristalli di ghiaccio di 15 μm o meno. In questo caso questo può essere ottenuto raccogliendo le piante in gennaio o in febbraio.
Le stesse misure sono state prese su campioni di AFP di Gennaio che sono state quindi termotrattati (1 ora a 60°C). Non si è osservata alcuna significativa riduzione delle proprietà di ricristallizzazione.
Come confronto si è utilizzato l'estratto apoplastico dell'esempio I. Questo aveva come risultato dimensioni finali dei cristalli di ghiaccio dopo 1 ora di 11,1μκι; dopo termotrattamento per ebollizione per 10 minuti a 100°C, la prova ha avuto come risultato dopo un'ora dimensioni dei cristalli di ghiaccio di 16,8 μιτι. Questo esempio mostra che l'estratto apoplettico da segale invernale non è termostabile.
Esempio VII
Estratto di erba non termotrattata da erba raccolta in gennaio è stato ottenuto da Sllsoe (GB). L'estratto è stato centrifugato per 1 ora per rimuovere terra e detriti insolubili come segue: Centrifuga:Sorvall RC3C, Rotore:H60Q0A, Temperatura:+5°C, velocità del rotore:5000rpm(7268g).
Un campione dell'estratto è stato liofilizzato per determinare il suo contenuto totale di solidi. Si è trovato che questo era 11,48 mg/ml. L'estratto essiccato è stato quindi reidratato con una soluzione di saccarosio al 30% fino alla sua concentrazione originale di solidi totali. Diverse soluzioni sono state preparate diluendo l'estratto come necessario con la soluzione di saccarosio al 30%.
Utilizzando l'analisi dell'esempio VI si è misurata l'attività anticongelamento.
Dalle immagini T=0 e T=1 ora dalle analisi di inibizione della ricristallizzazione si sono misurate le dimensioni medie dei cristalli di ghiaccio utilizzando l'analizzatore Zeiss TGA 10. I risultati ottenuti sono mostrati nella seguente tabella.
I risultati mostrano la variazione delle dimensioni finali dei cristalli e il cambiamento delle dimensioni dei cristalli di ghiaccio in un'ora a -6°C per varie diluzioni dell'estratto di erba. Si può vedere che il livello di solidi nell'estratto di erba può essere variato in un ampio intervallo pur tenendo ancora buone proprietà di inibizione della ricristallizzazione. Preferibilmente si scelgono quelle concentrazioni che hanno come risultato dimensioni dei cristalli di ghiaccio dopo un'ora pari a 15 μπιo meno.
Un'analisi analoga è stata condotta con estratto di erba che era stata sottoposta a termotrattamento (10 minuti a 100°C). Non si è osservato alcun significativo deterioramento delle proprietà di inibizione della ricristallizzazione
In aggiunta, agli estratti di erba dell'esempio II sono stati analizzati utilizzando la stessa prova di inibizione della ricristallizzazione. Si sono ottenuti risultati seguenti:
Questi risultati mostrano che anche dopo riscaldamento, l'estratto da erba acclimatata al freddo manteneva la capacità di inibire la crescita dei cristalli di ghiaccio.
Esempio VIII
Diverse piante contenenti AFP sono state raccolte in Gennaio. Gli estratti sono stati ottenuti macinando tessuti freschi, ad esempio radici, steli, boccioli o fogli con pestello e mortaio (raffreddato a 4°C) in un uguale volume di soluzione tampone A (10 mM EDTA, 20 mM acido Ascorbico, tamponato con Tris fino a pH 7,4) tenuto su ghiaccio. Gli omogeneizzati sono stati-filtrati attraverso uno o più strati di mussolina e tenuti su ghiaccio prima di ulteriore Impiego.
Gli estratti sono stati sottoposti a prova di inibizione della ricristaliizzazione dell'esempio VI sia dopo riscaldamento a 60°C per un'ora che dopo ebollizione per 10 minuti.
Le seguenti piante contenevano AFP termostabili come dimostrato dal mantenimento delle proprietà di inibizione della rlcristallizzazione:Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis e Agrostis tenuis, Festuca contraete e Poa annua.
Le seguenti piante non contenevano AFP termostabili: cavolo, spinacio, Brassica napus e Arabinopsis.
Esempio IX
L'attività di isteresi termica nelle AFP può essere misurata come segue:
campioni da 1 ml sono stati posti in tubi Eppendorf in un bagno di acqua calda e riscaldati per 1 ora a 60°C. Le proprietà di isteresi termica del campione sono state quindi misurate nel modo seguente.
Il prodotto fuso è stato posto su un vetrino del microscopio (Camlab Cambridge, la lunghezza di percorso di 0,1πτη). Le estremità del vetrino sono state sigillate con gelatina di petrolio.
Ghiaccio è stato introdotto nel campione utilizzando una spruzzatura di congelamento da aerosol. Il vetrino è stato quindi irmierso in un bagno di etanolo a temperatura regolata a -0,1°C. Dopo 5 minuti si è controllato l'equilibrio del campione.Se il ghiaccio era fuso completamente la temperatura del bagno veniva abbassata in paste da 0,1°C e successivamente equilibrato. Queste fasi venivano ripetute finché si è raggiunta una temperatura in cui esisteva nel campione una piccola quantità di cristalli di ghiaccio. Dopo l'equilibrio a tale temperatura, la temperatura del bagno è stata diminuita a pasti di 0,01°C al minuto. Il punto di congelamento del campione è stato registrato come temperatura alla quale inizia la propagazione del ghiaccio dai cristalli in equilibrio.
La temperatura di fusione del campione è quindi determinata facendo aumentare la temperatura a partire dal punto di congelamento in passi da 0,01°C al minuto finché tutti i cristalli di ghiaccio si fondono. Questa temperatura è la temperatura di fusione del campione.
L'isteresi termica del campione è la differenza fra la temperatura di fusione e la temperatura di congelamento.
Questa procedura di prova viene effettuata sul primo campione {prima del trattamento termico) e su un secondo campione dopo trattamento termico, con successivo raffreddamento.
Analogamente si può determinare la stabilità termica mediante procedimento indicato sopra, in cui il campione viene bollito in acqua per 30 secondi e successivamente si ha la determinazione dell'isteresi termica. Si è misurata l'isteresi termica di diversi campioni.
I campioni sono stati ottenuti da segale invernale che è stata raccolta in diversi mesi durante l'anno. Succhi di AFP ottenuti dopo l'estrazione e riscaldamento secondo l'esempio I sono stati misurati per verificare la loro isteresi termica come nell'esempio VI. Come confronto si è utilizzata segale invernale cresciuta in serra (a temperatura che normalmente non inducono la formazione di AFP).
Si è misurata la seguente isteresi termica:
Campione Isteresi termica (°C)
Controllo 0,04
Campione di dicembre 0,18
Campione di gennaio 0,21
Campione di febbraio 0,17
Campione di marzo 0,15
Campione di aprile 0,12
Campione di maggio 0,05
Queste misure mostrano che per una buona attività di AFP le piante dovrebbero essere raccolte durante i mesi invernali, ad esempio Dicembre-Marzo.
Le stesse misure sono state prese su campioni di AFP di Gennaio che sono stati termotrattati (1 ora a 60°C). Non si è osservata alcuna significativa riduzione dell'isteresi termica.
Esempio X
Determinazione della sequenza di ammino acidi delle AFP.
L'estratto di erba termostabile dell'esempio II è stato concentrato approssimativamente di 10 volte utilizzando una camera di ultrafiltrazione Amicon con una membrana di intercettazione da lOkDa. Il concentrato risultante è stato caricato su una colonna a scambio di anioni Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC. Un legame alla colonna era in 50 mM di Tris/tampone di HC1 pH 8,5 e la frazione attiva a RI è stata eluita con un gradiente lineare di NaCl ad una concentrazione finale di 0,5M nello stesso tampone Tris con pH 8,5. La cromatografia è stata svolta con una portata di 1ml min-1 e si sono raccolte e analizzate frazioni da 1 ml per la verifica dell'analisi di inibizione della ricristai1izzazione (come nell'esempio IX).
Le frazioni attive sono state radunate assieme e concentrate ad un volume di 0,05 mi su un concentratore centrifugo centricon PM10 (Amicon) centrifugato a 10.000 giri al minuto per 10 minuti in un rotore Servali SS 34 (8 x 50 mi). Il concentrato è stato caricato su una colonna di filtraggio di gel Superdex 75 PC 3,2/30 che funzionava su un sistema di microseparazione SMART (Pharmacia). La colonna è stata eluita con 50mM Tris/tampone di HC1 pH 8,5 con una portata di 0,05 mi min-1. Frazioni di 0,05 mi sono state raccolte dopo un campione è stato caricato ad un volume totale di 3,5 mi . Le frazioni sono state valutate per l 'attività di inibizione della ricristallizzazione (come nell 'esempio IX) e le frazioni maggiormente attive sono state sottoposte a separazione su un gel SDS PAGE e sottoposte alla cosiddetta "electroblotting" prima della sequenziazione N-terminale.
Le frazioni Superdex 75 attive sono state raccolte con buffer di carico di gel (50mM Tr1s/HCl , pH 6,8, 10% di glicerolo, lOmM ditiotreitolo, 2% di SDS) e quindi separate su un gel di poi iacri lamriide al 10% seguendo il procedimento di Laemmli . Dopo elettroforesi , il gel è stato schiacciato a sandwich contro una lastra di membrana Probi ott (Perkin Elmer) inumidita da metanolo e sottoposta a elettroblotting a 20 volt per 16 ore in lOmM di tampone di acido 3 (cicloesi lammino) - 1 -propansolfonlco (CAPS) (pH 11,0) contenente il 10% di metanolo. Dopo il blotting, la membrana è stata lavata brevemente con metanolo e quindi con acqua milli Q (Mill ipore) e le proteine legate sono state visualizzate con una soluzione allo 0,1% (p/v) d1 blu brillante coomassi .
Mediante colorazione coomassi sono state visualizzate due bande proteiche di pesi molecolari apparenti pari a 25kDa e 35kDa. La proteina da 35 kDa sembrava in particolare strettamente correlata con le frazioni maggiormente attive per RI. Entrambe queste bande sono state asportate con una lama di bisturi e sequenziate. Un'area non colorata della membrana che corrisponde ad un peso molecolare apparente di 65 - 75 kDa è stata pure sottoposta a sequenziamento in quanto la colorazione all 'argento di gel delle frazioni maggiormente attive hanno mostrato in precedenza una banda proteica in corrispondenza di questo peso molecolare.
Tutte e tre le aree di membrana asportate sono state sequenziate inserendole in una cartuccia di sequenziamento Blott e la sequenza è stata determinata utilizzando cicli di reazione e conversione come descritto da fabbricante (Perkin-Elmer). Gli elenchi delle sequenze N-terminali sono dati nel seguito.
La AFP da 25 kDa comprende una sequenza dal terminale N sostanzialmente omologa a:
ALA-THR -ILE-THR-ALA-VAL·-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE -VAL-PRO-THR
La AFP da 35 kDa comprende una sequenza dal terminale N sostanzial -mente omologa a:
ALA- GLN - PHE - THR - ILE - THR - ASN - L YS - CYS - GLN - PHE - THR - VAL - TRP -ALA- ALA - X - VAL - PRO
La AFP da 65-70 kDa comprende una sequenza dal terminale N sostanzialmente omologa a:
X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY -THR
Ciascuna sequenza, X indica con incognita che può essere un qualsiasi amminoacido trovato nelle proteine delle piante. Per gli scopi dell'invenzione il termine sostanzialmente omologo si riferisce ad una sovrapposizione pari ad almeno l'80% di amminoacidi, in modo maggiormente preferito più del 90%, altamente preferito il 95-100%.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per il recupero di AFP da fonti naturali, detto procedimento implicando le fasi di: a) isolare un succo contenente AFP dalla fonte naturale; b) termotrattare la fonte naturale o il succo contenente AFP ad una temperatura di almeno 60°C; c) rimuovere la frazione insolubile.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le fasi a e b (in qualsiasi ordine) avvengono prima della fase c.
  3. 3. AFP con stabilità termica come posta in evidenza dall'assenza di riduzione significativa nelle proprietà di inibizione della ricrlstallizzazione del ghiaccio dopo termotrattamento per un'ora a 60°C, un'ora a 80°C o 10 minuti a 100°C.
  4. 4. AFP secondo la rivendicazione 3, in cui la dimensione dei cristalli di ghiaccio di una composizione di AFP termotrattata in acqua dopo rapido congelamento a -40°C seguito da conservazione a -6°C per un'ora è meno di 5^m più grande della dimensione dei cristalli di ghiaccio della stessa AFP non termotrattata.
  5. 5. AFP secondo le rivendicazioni 3 o 4, in cui la dimensione dei cristalli di ghiaccio di una composizione dell'AFP 1n acqua dopo rapido raffreddamento a -40°C seguito dalla conservazione a -6°C per un'ora è 15 μνη o meno.
  6. 6. AFP secondo la rivendicazione 3 o 4, comprendente una o più pròteine con un peso molecolare di 25 kDa, 35 kDa e 65-75 kDa.
  7. 7. AFP secondo la rivendicazione 6, avente una sequenza N-terminale sostanzialmente omologa a:
  8. 8. Vettore contenente una sequenza di acidi nucleici in grado di codificare almeno una delle AFP della rivendicazione 7.
  9. 9. Organismo trasformato in grado di esprimere almeno una delle AFP della rivendicazione 7.
  10. 10. Prodotto dolciario congelato comprendente lo 0,0001-0,5% in peso della AFP secondo la rivendicazione 3.
  11. 11. Premiscela adatta all'impiego nella produzione d1 un prodotto dolciario congelato secondo la rivendicazione 10, comprendente la AFP della rivendicazione 3.
  12. 12. Procedimento per la preparazione di un prodotto dolciario congelato comprendente la preparazione di una miscela di formulazione che comprende lo 0,0001-0,5% in peso di una AFP, detta AFP presentando stabilità termica che viene evidenziata da assenza di riduzione significativa nelle proprietà di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio dopo termotrattamento per un'ora a 60°C, un'ora a 80°C oppure 10 minuti a 100°C, seguito da congelamento della miscela in condizioni quiescenti.
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