CZ698A3

CZ698A3 - Exprese peptidu mořských ryb chránící proti zmrznutí v organizmu vhodném pro potravinářský průmysl a aplikace těchto peptidů v potravinářských produktech

Info

Publication number: CZ698A3
Application number: CZ986A
Authority: CZ
Inventors: John William Chapman; Wouter Musters; Wassenaar Pieter Dirk Van
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 1998-05-13
Also published as: SK179497A3; EP0836646B1; US20050205833A1; TR199701752T1; ES2420105T3; CA2226101A1; JP2004043484A; ES2248819T3; AU6519096A; EP1614753B1; BR9609325A; DE69635225T2; CN1193999A; PL324437A1; US6914043B1; JPH11508451A; JP3926843B2; ATE305509T1; CN1149285C; MX9800016A

Description

Exprese peptidu mořských ryb chránící proti zmrznutí v organizmu vhodném pro potravinářský průmysl a aplikace těchto peptidů v potravinářských produktech.

Oblast techniky

Vynález popisuje modifikaci	procesů	růstu	ledových
krystalů, která ovlivňuje	velikostní	a	tvarové
charakteristiky ledu.
Dosavadní stav techniky
Krev polárních ryb je	chráněna	před	zmrznutím

přítomností peptidů chránících proti zmrznutí (AFP). Tyto AFP se mohou podle své struktury rozdělit do čtyř typů (Davies,P.L. and Chow, H.L., (1990), Biochemistry of fish antifreeze proteins, The FASEB. Journal 4 R2460-2468). AFP peptidy typ I jsou bohaté na alanin a mají pravidelně rozmístěné zbytky treoninu a asparaginu. Jejich konformace je α-helix. Pro AFP peptidy typ II je charakteristický vysoký obsah cysteinu (8%). AFP peptidy typ III jsou malé (přibližně 64 aminokyselin dlouhé) globurální peptidy. Skupina vyskytující se na konci molekuly glykoproteinů chránících proti zmrznutí má opakovaný tripeptidový motiv, ke kterému je připojený specifický disacharid. Všechny tyto peptidy mají stejnou vlastnost, kterou je nekoligativní snížení bodu mrazu a inhibice tvorby krystalů ledu. Tento rys se může uplatnit při změnách stavu krystalů ledu mražených produktů. Vzhledem k tomu, že izolace AFP z krve ryb není způsob ekonomicky výhodný uvažuje se, že se pro produkci AFP ve velkém měřítku použije moderní biotechnologie.

Na začátku řešení problému produkce AFP v mikroorganizmech se většina prací zaměřila na expresi AFP typ I v kvasinkách a bakteriích Escherichia coli (Warren, G.J., Hague, C.M., Corroto, L.V. and Mueller, G.M. (1993) • ·· · · · · · ··· · · · · · · · 9

Properties of engineered antifreeze peptides. FEBS Letters 321, 116-120). Vzhledem k tomu, že bakterie E.coli může produkovat toxiny, obecně se na tuto bakterii nepohlíži jako na bezpečný organizmus (GRAS), protože při jejím využiti při produkci AFP, které jsou určeny pro potravinářský průmysl, mohou nastat problémy.

Kmeny kvasinek, jako jsou Saccharomyces cerevisiae, jsou známy, že se považují za GRAS organizmy, ne jako E.coli, a mají kapacitu vylučovat heterologní proteiny do kultivačního media, což napomáhá zpracování produktu. Kvasinky jsou proto atraktivní hostitelský organizmus k produkci různých heterologních proteinů (Romanos, M.A., Scorer, C.A. and Clare, J.J., (1992), Foreign Gene ezpression in yeast: a review, Yeast 8 423-488).

První zprávy o produkci AFP v kvasinkách se týkají intracelulární akumulace fúzních syntetických AFP typu I se zkráceným proteinem A bakterií Staphylococcus aureus (Warren et al., (1993), citace uvedena shora). Nárokovala se skutečnost, že tento peptid chrání kvasinky proti škodlivému účinku mrazení. Extracelulární produkce AFP typu I jako taková není popsána. Nic se také neuvádí o AFP jiných typů.

Kvasinkové transformanty nesou expresivní vektor obsahující syntetický gen přirozeného AFP typu I pocházející ze zimního platýze (Winter Flounder) (HPLC6), který byl zkonstruován v této laboratoři (Driedonks, R.A., Toschka, H.Y van Almkerk, J.W., Scháffers and Verbakel, J.M.A. (1995) Expression and secretion of antifreeze peptides in the yeast Saccharomyces cerevisiae Yeast 11). Tyto skutečnosti se popisují v PCT přihlášce WO 94/03617. Sekrece aktivního monoméru AFP pomoci těchto kvasinek nebyla demonstrována. Exprese multimérů AFP typu I, které jsou následně zpracovány endogenní kvasinkovou proteázou za vzniku aktivních monomérů (Driedonks et el. , 1995, citace uvedena shora) je jediná cesta, jak dosáhnout podstatné inhibiční aktivity rekrystalizace ledu. Tento přistup, ačkoli definitivně umožňuje produkci aktivního AFP typu I, vede ke sekreci částečně zpracovaných heterologních forem multimérniho AFP. Následné zpracování za účelem získání aktivního peptidu jako monoméru není přijatelné pro účely průmyslového zpracování. Vedle nadměrného úsilí a nákladů by mohly také vzniknout problémy při získání povolení použití u potravinářských výrobků. Tyto problémy mohou být způsobeny aplikací chemikálií, které se používají za účelem získání aktivního monoméru, a expresí sekvencí, které nejsou přirozené.

Tak se jeví nemožné, použít při expresi a sekreci aktivního monomerického AFP, organizmus vhodný pro potravinářský průmysl a tak získat jednoduchý a účinný průmyslově přijatelný postup pro produkci potravin.

S cílem obejít problémy způsobené expresí AFP typu I v kvasinkách, se pozornost zaměřila na expresi AFP typu III z mořské tresky v kvasinkách. AFP typu III jsou malé globurální proteiny a uvažuje se, že z tohoto důvodu by mohly být vhodnější pro expresi v kvasinkách, než α-helixové AFP typu I.

AFP typu III se nacházejí v krvi polárních ryb, jako jsou mořská treska (Macrozoarces americanus) a vlkouš severní (Davies and Hew et al., 1990, citace uvedena shora). Frakcionace krve mořské tresky vedla k objevení přítomnosti nejméně 12 různých typů AFP typ III (obrázek č. 1, Hew, C.L., Slaughter, D., Shashikant, B.J., Fletcher G.L. and Ananthanarayanan V.S. (1984) Antifreeze peptides from the Newfoundland Oceán Pount Macrozoarces americanus: presence of multiple and compositionally diverse components. J. Comp. Physiol B. 155, 81-88, Davies end Hew, 1990, citace uvedena shora). Tyto peptidy jsou vysoce homologní, mají asi 60% identických aminokyselin a mutageneze in vitro demonstrovala • · klastr povrchových zbytků, které jsou běžné pro všechny varianty AFP pocházející z mořské tresky. AFP jsou nutné při vázání ledu (Chao, H., Sonnichsen, F.D., DeLuca, C.I., Sykes, B.D. and Davies, P.L. (1994) Structure-function relationships in the globural type III antifreeze protein: identification of a cluster of surface residues required for binding to ice. Protein Science 3 1760-1769). Negativní náboj kyseliny glutamové (Glu) v polohách 23 a 36 hraje jistou úlohu v tepelné stabilitě a tepelné hysterézní aktivitě polypeptidů (Li, X., Trinh, K.Y. and Hew, C.L. (1992), Expression and characterization of an active and thermally more stable recombinant antifreeze polypeptide from Oceán Punt, Macrozoarces americanus, in Escherichia coli: improved expression by modification of the secondary structure of the mRNA. Protein Engeneering 4 995-1002). Asparagin (Asn) v poloze 14, treonin (Thr) v poloze 18 a glutamin (Gin) v poloze 44 a další tři konzervativní aminokyseliny se také jeví být zbytky, které hraji klíčovou roli v aktivitě vázání ledu AFP-III (Chao et al, 1994, citace uvedena shora).

Uskutečnila se exprese varianty HPLC-1 AFP typu III pocházející z mořské tresky v kvasinkách. Nebylo možné získat sekreci dostatečně aktivního monoméru AFP typu III. Shora uvedený problém se tímto nevyřešil.

Navíc jsme zjistily, že varianta HPLC-1 AFP typu III se produkuje v kvasinkách, které vykazují neočekávaně nízkou specifickou aktivitu ve srovnání s preparátem AFP izolovaným z krve mořské tresky. Tato nízká aktivita je pravděpodobně vysvětlitelná špatným zbalenim peptidu nebo inherentně nižší specifickou aktivitou varianty HPLC-1. Vedení výzkumu tímto směrem se nezdá být přínosem pro produkci AFP, které jsou aktivnější než ty peptidy nalezené u zimního platýse (Winter Flounder).

• · · · • · • · β ···· ···· • · ······· • ·····»····· • · · ··· · · · ····· ······ ····

Také AFP získané z krve mořské tresky se rozdělily do různých frakcí HPLC a analyzovala se jejich rekrystalizační aktivita za účelem ujistit se, která frakce odlišná od HPLC1, by mohla být potencionálně použitelná v případě naší aplikace. Pouze HPLC 12, z dvanácti frakcí AFP-III v testovaných koncentracích, se jeví býti aktivní při inhibici rekrystalizace. Z toho plyne, že HPLC-12 by mohla být středem zájmu, jestliže se podaří obejít problémy její rekombinantní produkce, které se vyskytovaly u AFP typ-I a varianta HPLC-1 AFP typ-III.

Trochu neočekávané, ve světle shora uvedených experimentů s AFP typ-I a typ-III, bylo zjištění, že exprese nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci určenou pro variantu HPLC-12 AFP typ-III v kvasinkách dá vzniknout produktu, který se exprimuje a vylučuje jako monomér a nevykazuje sníženou aktivitu. Tento postup je eminentně vhodný pro produkci čisté formy aktivního AFP za použití metody genového inženýrství.

Fakticky bylo zjištěno, že rekombinantní HPLC-12 vylučovaná kvasinkami jako monomér, jako taková vykazuje vysokou AFP aktivitu směsi AFP izolovaných z krve mořské tresky. Tato aktivita ochrany proti zmrznutí je skoro dvojnásobná ve srovnání s AFP typ-I ze zimního platýze. Navíc produkt je aktivnější v testu rekrystalizace a je vhodnější pro požadované aplikace ve srovnání s jinými AFP.

Složení aminokyselin, aminokyselinové sekvence a sekvence nukleových kyselin různých AFP typu III vyskytujících se v přírodě jsou už známy. Autoři Davies a Hew (citace shora uvedena) poskytli jejich shrnutí. V publikaci autora Li et al. z roku 1985 (citace uvedena shora) a Hew et al. (Hew, C.L., Wang, N-C., Joshi,S., Fletcher, G.L., Scott, G.K., Hayes, P.H., Buettner, B. and Davies, P.L., (1988),

Multiple genes provide the basis for antifreeze protein • · · · • · • · · · · · · · · ··· ·· ·· ···· ·· ·· diversity and dosage in Oceán Punt. J.Biol.Chem. 263, 1204912055) se popisují sekvence variant proteinu HPLC-1,4,57,9,11 a 12, které se stanovily pro mořskou tresku na základě cDNK klónů genomové DNK ryby ve fágách. V další publikaci autor Chao et al. z roku 1994 (citace uvedena shora) popisuje syntézu a expresi izoformy varianty HPLC-12 AFP typ-III v bakteriích E.coli, která se použila pro studii dvoudimenzální NMR, za účelem porozumět vztahům struktury a funkce u AFP a definovat motivy pro vázání ledu. Nukleová kyselina je následně mutována za účelem produkce mutantního polypeptidu AFP typ-III. Zmíněné mutanty jsou prolinové mutanty. Hodnota termální hystereze nemutované rekombinantní formy HPLC-12 se porovnala s AFP izolovaného z mořské tresky, to je AFP typIII. Profily aktivity se popisují jako nerozlišitelné v omezení standarní chybou. Nezmiňují se o srovnání s jinými typy AFP. Nezjistila se žádná abnormálně vysoká hodnota termální hystereze, ve skutečnosti se nestanovila žádná taková hodnota. Také se nic nezmiňuje o účinku na rekrystalizačni vlastnosti. Zde se uvádí, že thermálni hysterézní aktivity nejsou spojené s rekrystalizačními vlastnostmi. Hodnoty termální hystereze ukazují pevnost vazby a neposkytují míru aktivity ochrany proti zmrznutí, jako je to v případě rekrystalizačního testu. Jsou známy příklady proteinů, které vykazuji vysoké hodnoty hystereze, ale nemají žádný účinek na rekrystalizaci a naopak poukazují na chybějící korelaci.

Na základě výsledků získaných pro rekombinantní HPLC-1 a na základě skutečností, které se dokládají v publikacích týkajících se AFP, se vysoká aktivita rekombinantní varianty HPLC-12 AFP zcela neočekávala. Hodnoty termální hystereze frakcí AFP typ-III, které se získaly frakcionací AFP typ-III izolovaných z krve mořské tresky na Sephadexové koloně, jsou uvedeny v publikaci autora Hew et al. z roku 1984 (citace

uvedena shora) v tabulce č. 1. Jsou to hodnoty pro AFP získané z platýse (typ-I) a z mořského krkavce (Sea Raven) (typ-I). Tyto hodnoty se získaly z frakcí izolovaných z krve relevantních živočišných druhů, nikoli prostřednictvím metod genového inženýrství. V aktivitách mezi AFP se objevily pouze malé rozdíly. Nejaktivnější je QAE-A. QAE-A je jeden z pěti odlišných variant, které se mohly separovat na QAE Sephadexové koloně a ukázalo se, že jsou odvozeny z varianty HPLC-12. Avšak rozdíly jsou tak malé, že zanikají v odchylce měření. Hew et al. ve velmi podobném článku jasně zamítá rozdíly v hodnotách termální hystereze jako irelevantní. Uvádí se Většina AFP získaných z mořské tresky vykazovaly termální hysterezi srovnatelnou s hodnotami, které se zjistily u jiných známých AFGP a AFP. V pozdější literatuře se hodnoty termální hystereze různých typů AFP nebo porovnání mezi typy I a III neuvádí. Nezmiňuje se ani žádná zmínka o účincích různých frakcí na rekrystalizaci. Proto se neočekávalo, že jakýkoli AFP typ-III bude vykazovat daleko vyšší specifickou aktivitu inhibice růstu krystalů ve srovnání s AFP zimního platýse. Neexistuje také žádná zmínka o skutečnosti, že HPLC-12 vykazuje daleko vyšší aktivitu ve srovnání s libovolným AFP typ-I nebo typ-III.

Za účelem testování, zda aktivita varianty HPLC-12 AFP typ-III je vyšší, se preparát AFP získaný z krve mořské tresky rodělil do frakci na HPLC a testovala se schopnost jednotlivých peptidových komponent inhibovat růst ledových krystalů. Zjistilo se, že varianta HPLC-12 měla nejvyšší specifickou aktivitu. Jiné komponenty nevykazují detekovatelnou aktivitu při koncentracích, které jsou ekvivalentní lOOmg rybího AFP typ III obsažených v jednom mililitru.

Našel se způsob přípravy čistého polypeptidu, který je vhodný pro potravinářský průmysl a který vykazuje AFP

aktivitu skoro dvojnásobnou ve srovnání s AFP typ-I. Na rozdíl od AFP typ-I se může vylučovat jako monomér a z toho důvodu je ideální pro produkci ve velkém měřítku, protože vyžaduje méně dalšího zpracování ve srovnáni s AFP typ-I, který se připravuje způsobem genového inženýrství. Navíc exprese jako monomér znamená produkt, který je skoro stejný jako přirozeně se vyskytující peptid, jež vzniká v krvi mořské tresky. Takový produkt bude snadněji uznán jako použitelný v potravinářství, vzhledem k jeho podobnosti s přirozeně se vyskytujícím AFP v přírodním organizmu, který je vhodný pro využití v potravinářství, jako je mořská treska.

Vynález nyní poprvé umožňuje produkci rekombinantní varianty HPLC-12 AFP typ-III ve velkém měřítku s nízkými náklady. Tento AFP má inherentně vyšší specifickou aktivitu ve srovnání s AFP typ-I získaných ze zimního platýse. AFP typ-III podle vynálezu jsou pro své vysoké specifické inhibiční aktivity rekrystalizace nejslibnějšími kandidáty pro aplikaci v potravinách, které se zmrazují, jako jsou zmrzliny a mrazené těsto nebo jiné mrazené pekárenské produkty.

Další výhodou je skutečnost, že k sekreci exprimovaného produktu jako aktivního polypeptidu, preferuje se forma monoméru, může docházet in sítu během procesu produkce potravin. Tím se eliminuje požadavek přidávání AFP jako takového. Nyní je možné vyrábět fermentační produkty za použití kvasinek, které jsou schopny vylučovat polypeptid v podstatě odpovídající HPLC-12 AFP typ-III ve fermentačním procesu, čímž se in šitu produkce polypeptidu v podstatě odpovídajícího HPLC-12 AFP typ-III obejde bez požadavku na další stupně výroby, jako jsou čištění polypeptidu a následné přidání polypeptidu do procesu výroby potravin. Také je možný vývoj rostlin, ovoce nebo zeleniny a transgenních zvířat nebo jejich částí, které vykazují lepší vlastnosti při zmrazování.

··· ·· ·· · ···

Tyto vlastnosti ovlivňuje in sítu exprese polypeptidu v podstatě odpovídajícího HPLC-12 AFP typ-III.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob přípravy vylepšeného procesů růstu velikostní a

Vylepšení krystalů, charakteristiky ledu například zmrazením, spočívá v modifikaci která ovlivňuje zvláště při produktu, ledových tvarové čímž se znovuvytváření, minimalizuje potencionální poškození například prevencí nebo inhibicí rekrystalizace způsobené ledu ve zmrazovaném produktu. Zmíněný proces zahrnuje přidání polypeptidu nebo proteinu s aminokyselinovou skevencí, která v podstatě odpovídá sekvenci varianty HPLC-12 AFP typ-III, jež vykazuje AFP aktivitu vyšší ve srovnání s AFP typ-I získaného ze zimního platýse, k produktu, který není vylepšen nebo k přísadě nebo ke směsi normálně užívané při přípravě nevylepšeného produktu. Zmíněné přidání rekombinantního polypeptidu nebo proteinu probíhá v množství, které je dostatečné k ovlivnění růstu ledových krystalů. Produktem může být potravina nebo bilogický materiál. Biologickým materiálem může například být zvířecí orgán nebo tkáň nebo rostlinný materiál. Zvláště může být přidán rekombinantní polypeptid. Je výhodné, aby polypeptid měl status použitelnosti v potravinářství, protože pak vzniklý konečný produkt bude mít stejný status. Preferuje se způsob podle vynálezu, kde produktem je potravina. Specifické provedení vhodného polypeptidu je kvasinkový AFP, jak se popisuje v příkladech. Je vhodné, aby způsob výroby podle vynálezu určený pro produkci vylepšeného výrobku, který vykazuje vylepšené vlastnosti při zmrazování, mohl zahrnovat přidání AFP, jež se získal novým způsobem produkce polypeptidu, který také spadá do rozsahu vynálezu a je popsán dále v popisu.

• · · * · · • · · · · • · · · · ··«· • · · · · ······· ··· · · · ··· ··· ·· ·· ···· ·· ··

Termín polypeptid nebo protein s aminokyselinovou sekvenci, která v podstatě odpovídá sekvenci varianty HPLC-12 AFP typ-III, zahrnuje aminokyselinovou sekvenci shodnou s aminokyselinovou sekvenci varianty HPLC-12 izolované z mořské tresky a také zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší jednou nebo dvěmi aminokyselinami od známé aminokyselinové sekvence, ale která stále kóduje polypeptid se stejnou AFP aktivitou jako vykazuje přirozený protein. Mutace nebo rozdíly se nemohou vyskytovat v aminokyselinách, o kterých je známo, že jsou podstatné pro aktivitu polypeptidu. Preferuje se proto, aby nedocházelo k deleci nebo záměně prolinových zbytků. Je výhodné, aby libovolné rozdíly v sekvenci aminokyselin byly tiché mutace, což znamená, že substituce jsou konzervativními substitucemi, která nezmění profil hydropatie polypeptidu a tak pravděpodobně silně neovlivní strukturu polypeptidu a aktivitu, t.j. aminokyselina s hydrofóbním postranním řetězcem se pouze z výhodou zamění za jinou aminokyselinu s hydrofóbním postranním řetězcem a aminokyselina s hydrofilním postranním řetězcem se pouze zamění za jinou aminokyselinu s hydrofilním postranním řetězcem. Homologie aminokyselin mezi HPLC-12 a HPLC-1 je méně než 60%. Očekává se, že aminokyselinová sekvence vykazující homologii nad 60%, s výhodou více jak 70% a nej výhodněji více jak 80% bude reprezentovat polypeptid vykazující podobné vlastnosti jako HPLC-12 a také se uvažuje, že v podstatě odpovídá HPLC-12. Navíc polypeptid kódovaný aminokyselinovou sekvencí by měl vykazovat nejméně AFP aktivitu AFP typu-I získaného ze zimního platýse a s výhodou nejméně AFP aktivitu přirozeného HPLC-12. AFP aktivitu lze stanovit provedením porovnání rekrystalizačních testů za použití sérií ředění polypeptidu, jehož aktivita se má určit, a stejné množství a ředění AFP typ-I a/nebo přirozeného HPLC-12, který se získal z krve • 4 · mořské tresky. Způsob, ve kterém takový rekristalizační test může být proveden a zhodnocen, se popisuje v příkladech. Polypeptid vykazující libovolnou nebo řadu shora uvedených charakteristik může být považován v podstatě za odpovídající HPLC-12.

Způsob přípravy vylepšeného produktu, kde vylepšení zpočívá ve vylepšení vlastností, které způsobují modifikaci procesu růstu ledových krystalů, ovlivňující velikostní a tvarové charakteristiky ledu zvláště při obnoveném růstu, čímž se například minimalizuje potencionální poškození mrazením například prevencí nebo inhibicí rekrystalizace ledu mrazených produktů. Zmíněný proces zahrnuje přidání hostitelského organizmu schopného exprese rekombinantního polypeptidu nebo proteinu využitelných v potravinářství s aminokyselinovou sekvencí v podstatě odpovídající sekvenci AFP typ III HPLC 12, k nevylepšenému produktu jako takovému nebo k přísadě nebo ke směsi normálně užívané při přípravě nevylepšeného produktu a následné vystavení hostitelského organizmu podmínkám, při kterých sekvence nukleové kyseliny kódující HPLC-12 AFP typ III se exprimuje do produktu nebo do přísady nebo do směsi, přičemž probíhá způsob produkce polypeptidu podle vynálezu, který se popisuje v příkladech a který spadá do rozsahu vynálezu. Vhodný produkt je potravina nebo biologický materiál. Biologický materiál může například být zvířecí orgán nebo tkáň nebo rostlinný materiál. Zvláště se může přidat rekombinantni polypeptid. Je výhodné, aby polypeptid měl status použitelnosti v potravinářství, protože pak vzniklý konečný produkt bude mít stejný status. Preferuje se způsob podle vynálezu, kde produktem je potravina. Specifické provedení vhodného polypeptidu je kvasinkový AFP, jak se popisuje v příkladech. Aby došlo k uvolnění polypeptidu AFP nebo proteinu do směsi nebo přísady produktu nebo přímo do produktu během nebo po produkci polypeptidu, hostitelský organizmus může být buď zničen nebo poškozen. Takové poškození může proběhnout mnoha způsoby, které jsou známy v oboru. Proto se zvláštní pozornost musí věnovat podmínkám, při kterých proces probíhá, aby nebyly příliš nepříznivé a tak nedošlo ke strátě aktivity AFP polypeptidu nebo proteinu. V jiném případě je hostitelský organizmus schopen uvolňovat polypeptid nebo protein AFP do přísady nebo směsi nebo potravinářského produktu, jako takový se může použít při způsobu produkce. Například pekařské kvasinky mohou být hostitelským organizmem při způsobu produkce potravinářských produktů, jako jsou pekárenské produkty. Způsob produkce může probíhat obvyklým způsobem, rozdíl spočívá v přidání odlišných kvasinek, to je kvasinek, které obsahují konstrukci DNA umožňující expresi a sekreci polypeptidu nebo proteinu v podstatě odpovídajícího HPLC-12 AFP typ III do těsta a to před nebo během pečení, což umožňuje přípravu těsta nebo pekárenských produktů s vylepšenými vlastnostmi při zmrazení. Obdobně způsoby, kde se používají bakterie, jako jsou laktobakterie, tvoří vhodná provedení vynálezu. Způsoby pro přípravu sýru nebo jogurtu nebo dalších potravin, kde se požaduje proces fermentace, spadají do rozsahu vynálezu.

Je výhodné, aby způsob produkce podle vynálezu nevyžadoval přidání proteáz a nebo chemikálií po té, co dojde k expresi nebo sekreci rekombinantního polypeptidu nebo proteinu s aminokyselinovou sekvencí, která v podstatě odpovídá HPLC-12 AFP typ III, aby se mohl získat polypeptid nebo protein AFP ve formě monomérního produktu.

Polypeptid nebo protein s aminokyselinovou sekvencí v podstatě odpovídající HPLC-12 AFP typ III se může použit jako aditivum do produktu, což má vést k vylepšení zmíněného produktu v libovolném shora doloženém provedení. Zmíněné vylepšení produktu spočívá ve vylepšených vlastnostech • ··· · · · ♦··· · • · · ··· ··· ··· ·· ·· ···· ·· ·· modifikace procesu růstu ledových krystalů ovlivňující velikostní a tvarové charakteristiky ledu zvláště obnovený růst, čímž se například minimalizuje potencionální poškození zmrazením, například prevencí nebo inhibicí rekrystalizace ledu produktu, který je mrazen. Zmíněné použití při způsobu, který je znám odborníkovi pro AFP za účelem získat specifickou aktivitu ochrany proti zmrznutí, která bude vyšší než ta, jež se dá získat z AFP zimního platýse, spadá do rozsahu vynálezu. Produktem je s výhodou potravina. Vhodným produktem může být biologický materiál. Protein nebo polypeptid může být rekombinantní protein nebo polypeptid.

Preferovaným provedením způsobu nebo použití za účelem vylepšení produktů je způsob nebo použití, kde produkt je produkt určený pro zmrazení. Zmrzlina je vhodný příklad potravinářského produktu. Jak je shora uvedeno, také těsto nebo pekárenské produkty jsou středem zájmu.

Potravinářské produkty obsahující rekombinantní polypeptid nebo protein použitelný v potravinářství s aminokyselinovou sekvencí v podstatě odpovídající HPLC-12 AFP typ III v libovolném provedení shora doloženém jako aditivum do potravinářského produktu za účelem vylepšeni potravinářského produktu, přičemž zmíněné vylepšení spočívá ve vylepšených vlastnostech modifikace procesu růstu ledových krystalů ovlivňující velikostní a tvarové charakteristiky ledu zvláště obnovený růst, čímž se například minimalizuje potencionální poškození zmrazením, například prevencí nebo inhibicí rekrystalizace ledu produktu, který je mrazen, spadají do rozsahu vynálezu. Takový potravinářský produkt nezahrnuje přirozeně se vyskytující poživatelné organizmy jako mořskou tresku pouze zahrnující sekvence kódující polypeptid nebo protein, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci HPLC-12 z mořské tresky ve formě a v počtu, ve kterém se vyskytují u mořské tresky ve

volné přírodě. Vhodnou kategorií produktů podle vynálezu nejsou zvířecí produkty. Jiná vhodná kategorie je kategorie produktů vytvořených člověkem. Rostlinné produkty jsou také vhodnými příklady produktů podle vynálezu. Potravinářské produkty podle vynálezu se mohou získat způsobem, který zdokonaluje produkt v libovolných provedeních, které jsou shora popsány.

Také se nárokuje potravinářský produkt zvláště zahrnující rekombinantní hostitelský organizmus použitelný v potravinářství, který lépe toleruje zmrazení, přičemž zmíněné vylepšení spočívá ve vylepšených vlastnostech modifikace procesu růstu ledových tvarové charakteristiky například například produktu, využitelný polypeptid který je minimalizuj e prevencí který nebo j imi krystalů ovlivňující velikostní a ledu zvláště obnovený růst, čímž se potencionální nebo inhibicí je mrazen a zmíněný potravinářství obsahující protein využitelný v potravinářství a/nebo obklopen, s aminokyselinovou skevencí v poškození zmrazením, rekrystalizace ledu hostitelský organizmus rekombinantní podstatě odpovídající HPLC-12 AFP typ III v libovolných provedeních shora doložených a/nebo exprimující nebo vylučující takový polypeptid nebo protein.

Takový rekombinantní hostitelský organizmus využitelný v potravinářství také spadá do rozsahu ochrany vynálezu. Když rekombinantní hostitelský organizmus je schopný exprimovat nejméně sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP, zmíněná sekvence nukleové kyseliny je obsažená v konstrukci DNK, zmíněná konstrukce DNK není přítomna v přirozeném hostitelském organizmu a zmíněná konstrukce DNK zahrnuje v danném pořadí (a) silný, volitelně indukovatelný promotor, který je aktivní v hostitelském organizmu, • ···· ·· 44 ····

4 · 4 4 4 4 4 4 44 • · 4 4 · · 4· · « 4 4 4 4 4 4 44444 (b) startovací kodon ATG, který může být přítomný ve volitelné signální sekvenci DNK schopné sekretovat protein produkovaný hostitelským organizmem během exprese sekvence (popisuje se dále v textu v odstavci (c) ) nukleové kyseliny kódující AFP, přičemž tato signální sekvence může být homologní nebo heterologní k sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP a leží ve čtecím rámci se startovacím kodonem ATG, (c) nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající aminokyselinové sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III, zmíněná sekvence nukleové kyseliny je ve čtecím rámci se starovacím kodonem ATG, a volitelně (d) terminační kodon vázaný na 3'-konci sekvence nukleové kyseliny kódující AFP.

Vhodná provedení takového rekombinantního hostitelského organizmu se popisuji dále v textu ve způsobu produkce polypeptidu a tyto organizmy jako takový se také nárokují.

Vynález dále popisuje způsob produkce rekombinantních polypeptidů nebo proteinů vykazujících modifikační aktivitu růstu ledových krystalů tzv. rekombinantních peptidů chránících proti zmrznutí (AFP), které vykazují specifickou aktivitu proti mrznutí výšší než je aktivita AFP získaných z mořské tresky, zahrnující

1) kultivaci hostitelského organizmu využitelného v potravinářství za podmínek, kdy dochází nebo kdy je indukovaná exprese nejméně jedné sekvence nukleové kyseliny kódující AFP, zmíněná sekvence nukleové kyseliny je zahrnuta do konstrukce DNK, zmíněná konstrukce DNK není přítomna v hostitelském organizmu a zmíněná konstrukce DNA obsahuje v danném pořadí (a) silný, volitelně indukovatelný promotor, který je aktivní v hostitelském organizmu,

(b) startovací kodon ATG, který může být přítomný ve volitelné signální sekvenci DNK schopné sekretovat protein produkovaný hostitelským organizmem během exprese sekvence (popisuje se dále v textu v odstavci (c)) nukleové kyseliny kódující AFP, přičemž tato signální sekvence může být homologní nebo heterologní k sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP a leží ve čtecím rámci se startovacím kodonem ATG, (c) nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající aminokyselinové sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III, zmíněná sekvence nukleové kyseliny je ve čtecím rámci se starovacím kodonem ATG, a volitelně (d) terminační kodon vázaný na 3'-konci sekvence nukleové kyseliny kódující AFP.

Vhodná provedení takového rekombinantního hostitelského organizmu se popisují dále v textu ve způsobu produkce polypeptidu a tyto organizmy jako takový se také nárokují

Způsob může dále podle volby zahrnovat shromáždění produktu exprimovaného ze sekvence nukleové kyeseliny kódující AFP. Za účelem získat sekreci exprimovaného produktu sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající aminokyselinové sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III konstrukce DNK může dále zahrnovat signální sekvenci vhodnou pro hostitelský organizmus, která umožňuje sekreci během kultivace hostitelského organizmu. Je vhodné, aby hostitelský organizmus byl organizmus. Vhodnými mikroorganizmy využitelnými v potravinářství jsou houbi, jako jsou kvasinky, a bakterie, jako jsou laktobakterie. Buňky kvasinek Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis jsou příklady vhodných kvasinkových hostitelských buněk. Odborník, který se vyzná ve fermentačnich procesech produkce potravin bude vědět, které ···♦ ·· ·· · · ·· • · · . · · · · · • · · · · · e · · · · · · · • · · · · ·' ··· «·· ·· ·· ···· ·· ·· buňky kvasinek jsou vhodné a které transformanty a expresivní systémy jsou dostupné (Romanos et al._z citace uvedena shora v textu, Campbell, I and Duffus, J.H., (1988) Yeast, a practical approach. IRL press, Oxford.). Laktobakterie Lactobacillus, streptococcus a Bidobacterium jsou také příklady vhodných bakteriálních hostitelských organizmů, z nichž je řada kmenů známa a pro které existují vhodné transformační a expresivní systémy, což je známo osobám vzdělaným v metodách genového inženýrství bakterií, které jsou spojeny s produkcí mlékárenského průmyslu (Gasson, M.J. (1993), progress and potential in the biotechnology of lactic acid bacteria F.E.M.S. microbiology Reviews 12 3-20). FDA má seznam organizmů vhodných pro potravinářství, který je dostupný veřejnosti. Odborník si je vědom, které organizmy se považují za použitelné v potravinářství, to znamená mají GRAS status (generally recognised as safe; obecně uznávané jako bezpečné) . Jsou vhodné organizmy spojované s fermentací potravinářských produktů a s výrobou mléčných výrobků.

Termín jedna sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III zahrnuje libovolnou nukleovou kyselinu kódující přirozený HPLC-12 z mořské tresky. Taková sekvence nukleové kyseliny se může lišit, což je způsobeno degenarací genetického kódu, to znamená skutečnost, že různé kodony nukleové kyseliny kódují stejnou aminokyselinu. Navíc sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci, která se od známé skevence liší jednou nebo dvěmi aminokyselinami, ale stále kóduje polypeptid se stejnou AFP aktivitou jako přirozený protein, také spadá do rozsahu vynálezu. Mutace nebo rozdíly nemohou být v aminokyselinách, o kterých je známo, že jsou podstatné pro aktivitu polypeptidů. Proto se preferuje, aby nedocházelo k deleci nebo záměně prolinových zbytků. Dále je výhodné, aby

libovolné rozdíly v aminokyselinové sekvenci byly tiché mutace, přičemžsubstituce jsou konzervativními substitucemi, které nemění profil hydropatye polypeptidů a tak se předpokládá, že vážně neovlivňují strukturu a aktivitu polypeptidů, t.j. aminokyselina s hydrofóbním postranním řetězcem se pouze z výhodou zamění za jinou aminokyselinu s hydrofóbním postranním řetězcem a aminokyselina s hydrofilním postranním řetězcem se pouze zamění za jinou aminokyselinu s hydrofilním postranním řetězcem. Homologie aminokyselin mezi HPLC-12 a HPLC-1 je méně než 60%. Očekává se, že aminokyselinová sekvence vykazující homologii nad 60%, s výhodou více jak 70% a nejvýhodněji více jak 80% bude reprezentovat polypeptid vykazující podobné vlastnosti jako HPLC-12 a také se uvažuje, že v podstatě odpovídá HPLC-12. Termín v podstatě odpovídající zahrnuje sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinové sekvence, které vykazují více jak 60% homologie s aminokyselinovou sekvencí přirozeného HPLC-12. Navíc polypeptid kódovaný aminokyselinovou sekvencí by měl vykazovat nejméně AFP aktivitu AFP typu-I získaného ze zimního platýse a s výhodou nejméně AFP aktivitu přirozeného HPLC-12. AFP aktivitu lze stanovit provedením porovnání rekrystalizačních testů za použití sérií ředění polypeptidů, jehož aktivita se má určit, a stejné množství a ředění AFP typ-I a/nebo přirozeného HPLC12, který se získal z krve mořské tresky. Způsob, ve kterém takový rekristalizační test může být proveden a zhodnocen, se popisuje v příkladech. Polypeptid vykazující libovolnou nebo řadu shora uvedených charakteristik může být považován v podstatě za odpovídající HPLC-12.

V preferovaném provedení vynálezu konstrukce DNA a kultivační podmínky hostitelského organizmu jsou takové, že tento organismus vylučuje monomérní polypeptid s aminokyselinovou sekvencí v podstatě odpovídající sekvenci • · · ·

proteinu HPLC-12 AFP typ III. Konstrukce DNA pak nebude exprimovat za sebou jdoucí dimérovou nebo multimérovou aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III. Produkce dimérů nebo multimérů bude vyžadovat další stupně zpracování nebo může bránit sekreci aktivního polypeptidu. Upřednostňuje se konstrukce DNA, která proto bude obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou skevenci v podstatě odpovídající sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III v monomérní formě. Přirozeně konstrukce DNA může zahrnovat více kopií sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typ III, které jsou v monomérní formě v tandemu.

Další preferované provedení vynálezu zahrnuje konstrukci DNA, ve které sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající proteinu HPLC 12 AFP typ III, zahrnuje preferované kodony hostitelského organizmu. Tato skutečnost se preferuje, protože účinnost translace se zvýší, tím že se v určitých hostitelských organizmech zruší některé kodony. Preferované použití kodonu se liší u prokaryont, u kvasinek a rostlin od použití u zimního platýze. Například kodony GCA, GCG a GCT dohromady zodpovídají za více než 65% alaninových kodonů známých genů bakterií E.coli, S.Cerevisiae a Z. mays, zatímco odpovídají za méně než 25% alaninových kodonů u ryb, jako je zimné platýs. Podobně je tomu v případě treoninových kodonů ACA, ACG a ACT (PCT/US90/02626). Použití kodonu, které se preferuje u laktobakterií a kvasinek, se může nalézt v literatuře o těchto skupinách organizmů. Odborník vzdělaný v uvedeném oboru ví, které kodony se preferují.

V případě, že hostitelským organizmem jsou kvasinky, preferované provedení konstrukce DNA obsahuje jako signální sekvenci pre-sekvenci DNA a faktor dělení (α-mating factor) • · · ·

S. cerevisiae. V dalším provedeni může mezi pre-sekvencí a sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP být obsažena prosekvence a faktor dělení (α-mating factor) S. cerevisiae, přičemž pre-sekvence, pro-sekvence a sekvence nukleové kyseliny kódující AFP jsou ve stejném čtecím rámci. V jiném případě, kdy hostitelský organizmus je kvasinka, preferované provedení konstrukce DNA bude zahrnovat signální sekvenci invertázy S. cerevisiae, která předchází sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP.

V případě, že hostitelský organizmus je kvasinka preferované provedení konstrukce DNA bude obsahovat indukovatelný promotor GAL7 nebo konstitutivní promotor GAPDH Saccharomyces cerevisiae. Dobře známy jsou i další promotory vhodné pro inkluzi do konstrukce DNA.

Následné citované reference poskytují příklady možných transformačních systémů nebo jejich elementů: v případě kvasinek t.j. Campbell and Duffus, citace uvedena shora; v případě rostlin PCT/US90/0626 a van den Elzen et al. (1985) Plant. Mol. Biol., 5: 149-154; a v případě zvířat Hannah, (1988) Ann. Rev. Genetics 22: 479-519.

Tento vynález poprvé poskytuje v podstatě izolovaný čištěný rekombinantní polypeptid nebo protein využitelný v potravinářství v podstatě ekvivalent! s HPLC-12 AFP typu III, vykazující tak vysokou AFP aktivitu. Tento vynález poprvé poskytuje v podstatě izolovaný rekombinantní polypeptid nebo protein využitelný v potravinářství v podstatě ekvivalent! s HPLC-12 AFP typu III, vykazující AFP aktivitu vyšší než je aktivita zimního platýse. Vynález zahrnuje v podstatě čistý a izolovaný rekombinantní polypeptid nebo protein využitelný v potravinářství, který vykazuje vylepšené vlastnosti modifikace procesu růstu ledových krystalů ovlivňující velikostní a tvarové charakteristiky ledu, zvláště při obnovení růstu, přičemž se například minimalizuje • •toto • to ·· ·· · · · · · • ♦ · · · • · · ·· <· • · · to ·· •toto ·» ······ ·· ·· • · · · • to ·· ·♦ · to · • · to ·· ·· potencionální poškozeni zmrazením, například prevencí nebo inhibicí rekrystalizace ledu při zmrzování, jedná se o tak zvané rekombinantní peptidy chránící proti zmrazení (AFP), které vykazují AFP aktivitu vyšší než stejné množství AFP typu I získaného ze zimního platýse. Zmíněný polypeptid nebo protein má aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci proteinu HPLC-12 AFP typu III. Takové rekombinantní polypeptidy a zvláště rekombinantní polypeptidy nebo proteiny vykazující shora modifikovanou aktivitu, jako je inhibiční aktivita růstu ledových krytalů, se nazývají rekombinantní peptidy chránící proti zmrazení (AFP) a vykazují vyšší specifickou aktivitu proti zmrazení ve srovnání s AFP ze zimního platýse. Tyto AFP se připravují podle libovolného uvedeného provedení podle vynálezu a spadají do rozsahu vynálezu.

Materiály a metody

Kmeny a podmínky kultivace.

Bakterie E.coli kmen JM109 (andAl, recAl, syrA96, thi, hsdR17, rk, mk⁺ relAl supE44, Yanisch-Perron, C., Viera, J. , Messing, J. (1985), Improved M13 phage clonning vectors and host strains: Nucleotide sequence of the M13 mpl8 a pUC19 vectors. Gene 33, 103-119)) se použily při amplifikaci plazmidů. Kvasinky S.cerevisiae kmen SU50 (MATa, cir°, leu2, his4, canl; Verbakel, J.M.A. (1991), Heterologous gene expression in the yest Saccharomyces cerevisiae. PhD. Thesis, University of Utrecht)) se použily při transformaci zavedení plazmidů, které tvoří více kopií. Na plotnách s Luria agarem, který obsahuje 100gg ampicilinu na jeden mililitr, se selektovaly transformanti bakterií E.coli (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor • · · · • · · : . · ··· ..........

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.)). Kmeny kvasinek se udržovaly na plotnách se selektivním YNB médiem (0,67% kvasinková dusíkatá báze Difco bez aminokyselin, 2 % glukóza, 2% agar), které se doplnilo podstatnými aminokyselinami (histidin 20gg/ml, uráčil 20gg/ml). Stejné kapalné médium se použilo při prekultivaci, která proběhla při teplotě 30°C po dobu 48 hodin. Pre-kultura se naředila v YP médiu, které obsahuje 5 % galaktózu za účelem indukce promotoru GAL7, v poměru 1:10 (1 % kvasinkový extrakt Difco, 2 % pepton Difco).

Plazmidy

Relevantní detaily AFP-III obsahující plazmidy jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Transformace

Transformace kmene JM109 se provedla podle publikace Chung, C.T., Niemela, S.L., Miller, R.H. (1989), One-step preparation of competent E.coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86; 2172-2175. Transformace kmene kvasinek se provedla elektroporací s velké části podle způsobu, který popisuje Becker et al. (1991). Transformanti se získaly z ploten se selektivním médiem. Odborník ví, že existuje řada transformačních metod. Jednotlivé alternativy závisí na transformovaném organizmu a jsou dobře popsány v různých příručkách, jako je Sambrook et al., (1989) (citace uvedena shora) a Campbell and Duffus (1988) (citace uvedená shora).

Způsoby molekulární biologie

Restrikční enzymy a enzymy modifikující DNA se použily podle doporučení výrobce.

Oligonukleotidy se syntetizovaly na syntetizéru DNA typ 380A Applied Biosystems a čistily se standardním postupem.

Čištěni AFP-III

AFP III z mořské tresky, Macrozoarces americanus, se izolovaly z krve ryb chycených v pobřežních vodách Nového Foundlandu. Vzorek AFP III se připravil centrifugaci vysráženého rybího séra, jak popisuje Hew et al. (1984) (citace uvedena shora).

• Kationtoměničová chromatografie

Kationtoměničová chromatografie proběhla na Mono S koloně (HR5/5, Pharmacia Biotech) na systému SMART (Pharmacia Biotech) . Jako vzorkový pufr se použil lOmM Na2HPC>4/NaH2PO4, (Měrek) pH6,0 a eluce se provedla s lineárním gradientem 0 až 0,5M NaCl (Měrek) s průtokem ΙΟΟμΙ/min. Peptidy se detekovaly použitím μ Peak Monitor (Pharmacia Biotech) při vlnové délce 214 a 280nm. Frakce se sbíraly za použiti kolektoru frakci s integrovaným systémem SMART, monitoroval se signál při vlnové délce 214nm. Teplota systémy se nastavila na 15°C.

Vysokovýkonná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi

Vysokovýkonná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC) se uskutečnila za použiti kolony μβΡΟ C4/C18 SC2.1/10 (Pharmacia Biotech) se systémem SMART (Pharmacia Biotech). Vzorek se nanesl na kolonu v 0,06 % roztoku kyseliny trifluorooctové (TFA, Měrek) v Milli Q vodě (rozpouštědlo A) a eluoval se za použiti roztoku obsahujícího 80 % acetonitril (Měrek), 0,054 % TFA v Milli Q vodě (rozpouštědlo B) . Užívaný standardní gradient se naprogramoval následovně : 0 min. 100% rozpouštědlo A, 5 min. 100% rozpouštědlo A, 10 min. 65 % rozpouštědlo A, 50 min. 40% rozpouštědlo A, 55 min. 0 % rozpouštědlo A, 57,5 min. rozpouštědlo A a při 58 min. 100% rozpouštědlo A při průtoku • · • ·

ΙΟΟμΙ/min. Peptidy se detekovaly pomoci zařízeni gPeak Monitor (Pharmacia Biotech) při třech vlnových délkách 214, 256 a 280nm. Sbíraly se frakce plků při monitorování signálu 214nm za použití kolektoru frakcí s integrovaným systémem SMART. Teplota systému se nastavila na 20°C.

Izoformy 1, 2, a 3 AFP-III se separovaly způsobem modifikovaného gradientu: 0 min. 100% rozpouštědlo A, 10 min. 65 % rozpouštědlo A, 35 min. 55 % rozpouštědlo A, 36 min. 45 % rozpouštědlo A, 45 min. 45 % rozpouštědlo A, 46 min. 0 % rozpouštědlo A, 50 min. 0% rozpouštědlo A, 50,1 min. 100 % rozpouštědlo A, a při 60 min. 100% rozpouštědlo A. Pufry a detaily systému SMART jsou stejné jako ty, které se používaly u standardního gradientu.

Elektroforéza na SDS polyakrylovém gelu

Elektroforéza proběhla v Xcell elektroforetické buňce (Novex) na 16 % polyakrylamidových tricínových gelech (Novex) podle protokolu výrobce. Pufr na ředění vzorků obsahoval

3,0ml TRIS-HC1 3,0M, 2,4 ml glycerolu, 0,8g SDS, l,5ml 0,1%

Coomassieové modře G,

0,5ml 0,1% fenolové červeně a 5% β merkaptoetanolu (Novex), konečný objem se upravil destilovanou vodou na lOml, pH8,45.

Elektroforetický prufr obsahoval 12,lg TRIS, 17,9g tricinu a lg SDS, objem se doplnil destilovanou vodou na 11, hodnota pH byla přibližně 8,3. Gel se obarvil za použití Coomassieové modře R250 (BioRad) rozpuštěné v roztoku 40 % etanolu (Měrek), 10 % kyseliny octové (Měrek) a 50 % destilované vody, tento roztok se zahříval v mikrovlně troubě po dobu 45 vteřin, pak se gel barvil po dobu 15 min. na rotační míchačce. Gely se odbarvily roztokem 10 % teanolu (Měrek), 7,5 % kyseliny octové (Měrek) a 82,5 % destilované vody. Pro stanovení molekulové hmotnosti se použil obarvené markey MARK 12 (Novex).

Westernův přenos

Tricinové gely (Novex) se blotovaly za použiti transferového média (Bio-Rad) na westernový transferový blotovací modul (Novex) podle protokolu výrobce. Po blotování se membrána blokovala 5 % odstředěným mlékem ve 150mM NaCl, 50mM Tris/HCl pH7,4 a pak se inkubovala v roztoku 1% odstředěného mléka, 150mM NaCl, 50mM Tris/HCl, 0,1% Tween 20, pH7,4 a monoklonálniho antisera proti AFP z mořské tresky. Za účelem stanoveni S skupin a Q skupin jsme získaly dvě různé protilátky (dárek od M.M.Gani, Unilever Research, Colworth House Laboratory). Inkubace proběhla přes noc při teplotě místnosti za jemného míchání. Neabsorbované protilátky se odstranily promytím inkubačním pufrem (3x5 min.). Membrána se inkubovala s druhou protilátkou (kozí anti-myší IgG (H+L), konjugát alkalické fosfatázy; BioRad, Richmond) po dobu 2 hod. při teplotě místnosti. Enzym se vizualizoval za použití BCIP/NBT (Biorad).

Štěpení trypsinem

Za účelem štěpení trypsinem se vzorek rozpustil v O,1M NH4HCO3 pufru pH8,3, přidal se trypsin (ošetřený TPCK, Worthington, Millipore Corporation) v poměru enzym: substrátu 1:100. Po 30 minutách se kontrolovala hodnota pH a přidalo se stejné množství trypsinu. Inkubace proběhla přes noc při teplotě 37°C. Štěpící reakce se zastavila přidáním TFA, což vedlo k poklesu pH na hodnotu 2. Peptidy se separovaly RPHPLC se systémem SMART (Pharmacia).

Analýza aminokyselinové sekvence N-konce

Analýza aminokyselinové sekvence N-konce proběhla proteinovém sekvenátoru LF 3000 (Beckman) podle protokolu výrobce. PTH-deriváty aminokyselin se analyzovaly na automatizovaném systému RP-HPLC, systém Gold (Beckaman).

Určeni proteinu analýzou aminokyselin

Vzorky AFP-III se hydrolyzovaly 6M HC1 obsahující 1% fenol za teploty 100°C, při vakuu po dobu 24 hodin a pak se usušily. Analýzy se proběhly na aminokyselinovém sekvenátoru Alfa plus serie 2 (Pharmacia Biotech) podle protokolu výrobce.

Rekrystalizační test

U vzorků se testovala aktivita AFP III. Vzorky se smíchaly s práškovou sacharozou, vznikl 30 % (objemová procenta) roztok sacharozy. Část tohoto roztoku se umístil na mikroskopické sklíčko, překrylo se krycím sklíčkem, aby nedošlo k odpaření a umístilo se do chladícího zařízení Linkám THMS, spojilo se s chladícím systémem Linkám CS 196 a chlazení se řídilo zařízením Linkám TMS 91. Tento roztok se ochladil na -40°C (δ 99°C/min) a následovně se zahřál na teplotu -6°C. Růst ledových krystalů se pozoroval mikroskopem po dobu 30min. inkubace při teplotě -6°C.

Za účelem testování izolovaných peptidů pomocí HPLC se vzorky z RP-HPLC kolony obsahující čisté izoformy AFP-III dvakrát sušily na zařízení Speed Vac Concentrator (Savant) po jedné rehydrataci ve vodě Milli Q. Po druhém sušení se vzorky rozpustily ve ΙΟΟμΙ vody Milli Q a kontrolovalo se pH za účelem ujištění, že se odstranila veškerá TFA pocházející z pufru RP-HPLC. Vzorky se naředily na hodnotu absorbance při vlnové délce 214nm 0,7, to je ekvivalent přibližně 0,1 μ?/ω1 roztoku rybího AFP-III. Za účelem ujištěni, že vzorky obsahovaly ekvivalentní množství AFP-III, byla později provedena analýza aminokyselin. Když se použily izolované vzorky izoformy AFP-III, jejich čistota se kontrolovala analýzou aminokyselin N-konce.

• ·· ·

Fed-batch fermentace

Postup inokulace: Kultura vhodného transformantu se kultivovala v 25ml minimálního média, přes noc, při teplotě 37°C a 300ot./min.. Kultura se následně přenesla do lOOOml míchací nádoby obsahující 500ml YP obsahující 2 % glukózu a kultivovala se přes noc při teplotě 37°C a 300ot/min.. Tato kultura se použila jako inokulum pro fed-batch expreiment.

Použilo se následující batoh médium: IlOg glukózy.1 H₂0 doplněno demineralizovanou vodou do 500g. 25g Trusoy, 50g kvasinkového extraktu (Ohiy), 10,5g K₂HPO₄, 5ml 1 OOOx roztoku vitaminů podle Egliho, 50ml lOOx stopových kovů podle

Egliho (Egli, T. (1980), Wachstum von methanol assimelerende

Hefen,

PhD Thesis, Zurich no 6538), (Sigma) , 3g MgSO₄, 2g protipěnícího

0,25g L-histidin.HCI doplnilo se činidla demineralizovanou vodou

Roztok sterilizoval teplem a na 4500g.

roztok vitaminů se glukózy se sterilizoval filtrací. Všechny další přísady se sterilizovaly ve fermentátoru. Teplota se nastavila na 30°C a hodnota pH byla 5,0. Inokuloval se fermentátor a buňky se kultivovaly při provzdušňování (průtok vzduchu 21/min) a rychlosti míchání 600ot./min. Po 18 hodinách začala feed fáze.

Použilo se následující feed médium: IlOOg glukózy.1 H₂O doplněno demineralizovanou vodou do 1750g. 62.5g kvasinkového extraktu (Ohiy), 30g K₂HPO₄, 5ml 1 OOOx roztoku vitaminů podle Egliho, 50ml lOOx stopových kovů podle Egliho (Egli, (1980)), 6,25g L-histidin.HCI (Sigma), 6,25g MgSO₄.7H₂O, 2g protipěnícího činidla doplnilo se demineralizovanou vodou na 850g.

Tabulka č. 1: Plazmidy obsahující AFP-III

Název plazmidu	Relevantní charakteristiky
PUR7700	pTZ19 nesoucí syntetický gen HPLC-1

PUR7701	pTZ19 nesoucí signální sekvenci invertázy
PUR7702	pTZ19 nesoucí fúzní gen signální sekvence invertázy-HPLC-1
PUR7703	pTZ19 nesoucí fúzní gen signální sekvence faktoru dělení a-HPLC-1
PUR7704	kvasinkový expresivní vektor nesoucí fúzní gen signální sekvence invertázy-HPLC-1
PUR7706	kvasinkový expresivní vektor nesoucí fúzní gen signální sekvence faktoru dělení a-HPLC-1
pUR7718	kvasinkový expresivní vektor nesoucí fúzní gen signální sekvence invertázy-HPLC-12

Tabulka č. 2: Frakce z koloy Mono S obsahující izoformy AFPIII

Frakce Mono S	Izoforma AFP 3
Q	12
SI	4
	5
	6
S2	1
	2
	3
	11
S3	7
S4	7
	9

Tabulka č. 3: Aminokyselinové sekvence N-konce izoform

AFP-III

Lysozym mořské tresky; peptid drive uváděný jako izoforma 7

AFP 3:

Lys-Vai-Phe-Asp-Arg-?-Giu-Trp-Aia-Arg-Vai-Leu-Lys-Ala-Asn-Giy-Met-Asp-Gly-Tyr20

2!

Arg-Gly-I!e-Ser-Leu-Ala-Asn-Trp-Val-?-Leu-Ser-Lys-Trp-Gíu-Ser-?-Tyr-?-ThrIzoforma č. 9

Ser-Gln-Ser-Vai-Val-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ile-Pro-Met-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Pro-Ala-MetIzoforma č. 12

Asn-GIn-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gin-Leu-IIe-Pro-Ile-Asn-Thr-Ala-LeuTabulka č. 4: Aminokyselinová sekvence tryptických peptidů izoformy č. 12 AFP-III peptid č. 1:

N-konec 1 až 23

Asn-Gln-Ala-Ser-Vai-Val-Ala-Asn-Gln-Lcu-Ile-Pro-lle-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Lsu-Val23

Mct-Met-Arg • · • ·

peptid č. 3: 40 až 47 i

Leu-Vaí-Ser-Mct-Gln-Vai-Asn-Arg peptid č. 4: 48 až 61 >0

Ála-Vai-ProLeu-Gly-Thr-Thr-Leu-Ma-Pro-Asp-Mct-Vai-Lys peptid č. 5: 62 až 66

Giy-Tyr-Pro-Pro-Ala peptid č. 2: 24 až 39

I 10

Ser-Giu-Vai-Vai-Thr-Pro-Vai-Gly-ile-Pro-Ala-Glu-Asp-lle-Pro-Arg

Popis obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 ukazuje izoformy AFP typ III. Oblasti ohraničené rámečkem reprezentuji identické oblasti a stínované aminokyseliny jsou ty, které se označily za důležité pro vlastnosti peptidů chránících před zmrznutím.

Obrázek č. 2 ukazuje syntetický gen kódující HPLC1 AFP typ III.

Obrázek č. 3 ukazuje schéma konstrukce pLJR7700; plazmid nesoucí syntetický gen AFP typ III.

Obrázek č. 4 znázorňuje restrikční mapu kvasinkového expresivního vektoru pUR2778.

Obrázek č. 5 znázorňuje schéma konstrukce pUR7701; plamid nesoucí signální sekvenci invertázy.

Obrázek č. 6 znázorňuje schéma pCJR7702; plazmid nesoucí syntetický gen AFP-III, který je v rámci spojený se signální sekvencí invertázy.

Obrázek č. 7 znázorňuje schéma konstrukce pUR7703; plazmid nesoucí syntetický gen AFP-III fúzovaný v rámci s

pre-pro sekrečni signální sekvenci faktoru dělení (a-mating factor).

Obrázek č. 8 znázorňuje schéma konstrukce plazmidu pUR7704; rDNK integračního vektoru, který tvoří více kopií a nese syntetický gen AFP-III spojený v rámci se signální sekvencí invertázy.

Obrázek č. 9 znázorňuje schéma konstrukce plazmidu pUR7706; rDNK integrační vektor, který tvoří více kopií a nese syntetický gen AFP-III spojený v rámci s pre-pro sekrečni signální sekvencí faktoru dělení.

Obrázek č. 10 znázorňuje eluční patern AFP z mořské tresky z kolony Mono S.

Obrázek č. 11 znázorňuje chromatogram AFP separovaných na HPLC s reverzními fázemi.

Obrázek	č.	12	znázorňuje chromatogram	Mono	S	S1	AFP
separovaných	na	HPLC	s reverzními fázemi.
Obrázek	č.	13	znázorňuje chromatogram	Mono	S	S2	AFP
separovaných	na	HPLC	s reverzními fázemi.
Obrázek	č.	14	znázorňuje chromatogram	Mono	S	S3	AFP
separovaných	na	HPLC	s reverzními fázemi.
Obrázek	č.	15	znázorňuje chromatogram	Mono	S	S4	AFP
separovaných	na	HPLC	s reverzními fázemi.
Obrázek	č.	16	znázorňuje chromatogram	Mono	S	S1	AFP
separovaných	na	HPLC	s reverzními fázemi.
Obrázek	č.	17	znázorňuje fúzní protein	syntetický	gen
kódující HPLC12	AFP	typIII signální sekvence	invertázy
Obrázek	č.	18 znázorňuje schéma plazmidu pUR7718.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Konstrukce syntetického genu kódujícícho AFP typ

III ····

Zkonstruovala se nukleotidová sekvence kódující HPLC I AFP a optimalizovala se pro expresi v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Tato seekvence se zkonstruovala následujícícm způsobem: syntetizovala se sada 12 oligonukleotidů (invafpl, invafp2, invafp3, invafp4, invafp5, invafp6, invafp7, invafp8, invafp9, invafplO, invafpll invafpl2), hlavně zahrnující sekvenci DNA přirozeného AFP, která se exprimuje v preferentně používaných codonech S. cerevisiae. Syntetický gen obsahuje jednořetězcové oblasti 5'-konce kompatibilní s konci, které se vytvořily restriktázami Pstl a HindlII. (obrázak č. 2).

Za účelem sestavení syntetického genu AFP se 50pmol každého oligonukleotidu rozpustilo v 12 μΐ vody, směs se inkubovala 2min. při teplotě 95°C a bezprostředně po tom se přenesla na led. Po tomto denaturačním kroku se oligonukleotidy fosforylovaly v konečném objemu 20μ1, kde je obsaženo 2,5mM ATP, 5mM DTT a okolo 10U polynukleotidové kinázy. Směs se inkubovala po dobu 40min. při teplotě 37°C. Pak následovala dvou minutová denaturace při teplotě 95°C a dále bezprostřední přemístění na led. 10μ1 každého fosforylovaného oligonukleotidu se smíchalo s oligonukleotidy jejich nejvíce komplementární DNA za účelem získat duplexové uspořádání. Po dvou minutách denaturace při teplotě 95°C se každý duplex pomalu ochladil na teplotu 30°C. Spojilo se 10μ1 všech šesti duplexových směsí a inkubovaly se v konečném objemu ΙΟΟμΙ, obsahujícím 50mM Tris/HCl, pH7,5, 8mM MgCl₂, 8mM DTT a 40μρ/ιη1 želatiny a 10U DNA ligázy, po dobu dvou hodin při teplotě 20°C. Ligační směs se pak srážela a rozpustila se ve 30μ1 TE-pufru. 15μ1 směsi se naneslo na 2 % agarozový gel a pruh DNA odpovídající očekávané velikosti (přibližně 224 párů baží) se vyřízl a DNA se izolovala pomocí sady Gene Clean II, podle protokolu výrobce.

• · ····

Získaný fragment DNA se pak ligoval do linearizovaného vektoru pTY19R (Pharmacia) restriktázami Pstl/HindlII a vektor se transformoval do bakterií E.coli JM109 pomocí standarního postupu. Z několika transformantů se izoloval plazmid trochu modifikovanou mini preparační metodou alkalické lyže a analyzoval se restrikční analýzou několika enzymy. Sekvence inzertu, která je obsažena v jednom takovém plazmidu byla potvrzena dideoxy-sekvenováním dvouřetězcového plazmidu podle Sangera (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977), DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)). Tato konstrukce obsahující syntetickou kazetu AFP-III se nazývá pUR7700 (obrázek č. 3).

Příklad 2: Konstrukce kvasinkových expresivních vektorů obsahujících syntetický gen kódující HPLC-I AFPIII.

Syntetický gen AFP-III obsažený ve vektoru pUR7700 neobsahuje žádnou informaci, která je nutná pro expresi peptidu v kvasinkách. Za účelem dosaženi exprese a sekrece tohoto genu se vytvořily konstrukce obsahující translační fúze genu AFP-III s vhodnou sekreční signální sekvencí a tyto fúzni sekvence se řídí promotorem kvasinkového genu.

Vhodné sekreční signální sekvence se mohou vybrat z různých genů, které kódují proteiny, jež kvasinky vylučují v dostatečném množství, například invertáza kódovaná SUC2 nebo a faktor dělení (a mating factor) kódovaný MFdl a MFa2. Za účelem získat vhodnou fúzi se signální sekvencí invertázy, se vytvořil fragment PCR obsahující signální sekvenci invertázy, část promotoru GAL7 a vhodná místa, která rozeznávají restrikční enzymy.

Za účelem získat tento fragment vytvořil se primer invafpl4 pro PCR, který má následující sekvenci:

• · · ·

Nhel_ BamHI_

CCA AAA CGT CGG TTT TAT AGA CGATCG CCTAGGGC 5' invafpl4 GFAA KISA

Tento primer se použil jako 3'primer při reakci PCR ve spojení s 5primerem PG7 05 AF (Verbakel, 1991; citace uvedená shora), který hybridizuje se sekvencí nalezenou v promotoru GAL7. Při reakci, kterou vznikl přibližně 243bp velký fragment, se použil jako templát DNA plazmidu pUR2778 (obrázek č. 4, Van Gorcom, R.F.M., Hessing, J.G.M., Maat, J. and Verbakel, J.M.A. (1991) Xylanase Production. International Patent WO 91/19782)). Tento fragment se eluoval z gelu a izoloval se postupem Gene Clean podle návodu výrobce. Izolovaný fragment se následně štěpil restriktázami Sací a BamHI a výsledný fragment o velikosti 88bp se ligoval do vhodného místa plazmidu pTZ19R. Ligační směs se zavedla transformací do bakterií E.coli JM109 a z jednoho transformantu se izolovala plazmidová DNA. Ta se dále sekvenovala, aby se potvrdila shodnost klonovaného inzertu. Tento plazmid se označil pUR7701 (obrázek č. 5).

Za účelem vytvořit v čtecím rámci fúzi signální sekvence invertázy se syntetickým genem AFP-III se pUR7700 štěpil restriktázami Nhel a HindlII a izoloval se fragment o přibližné velikosti 196bp a ligoval se do přibližně 2911 bp velkého fragmentu, který vznikl štěpením pUR7701 restriktázami Nhel a HindlII. Výsledný plazmid se nazval pUR7702 (obrázek č. 6).

Podobným způsobem vznikl fragment PCR obsahující pre-pro signální sekvenci a faktoru dělení. Jako 3'primer se použil MFCIAFPIII primer:

····

Nhel

3' CTA TTT TCT CTC CGA CTT CGATCGCC 5' MFCCAFPIII D K R E A E G

Fragment PCR obsahující část promotoru GAL7 a všechny pre-pro kódující sekvence (a mating factor) a faktoru dělení se vytvořil z pUR2660 (WO 94/03617), který sloužil jako templátová DNA za použití primerů MFCCAFPIII a PG7 05 AF. pUR2660 obsahuje pre-pro sekvence a faktoru dělení, které řídí promotor GAL7. Výsledný plazmid o přibližné velikosti 462bp se izoloval způsobem, který se popisuje shora v textu a štěpil se restriktázami Sací a Nhel. Tímto způsobem získaný přibližně 292bp velký fragment se ligoval do přibližně 3025bp velkého fragmentu získaného štěpením plazmidu pUR7702 restriktázami Sací a Nhel. Plazmidová DNA z několika tranformantů E.coli se sekvenovala za účelem potvrdit správnost klonovaného fragmentu. Jeden z těchto plazmidů se označil jako pUR7703 (obrázek č. 7).

Konstrukce plazmidů, která je schopná exprimovat v kvasinkách kazetu AFP-III obsahující fúzi syntetický gensignální sekvence se začlenila do různých kvasinkových expresivních vektorů. Postup byl následovný:

Přibližně 278bp velký fragment SacI/HindlII plazmidu pUR7702 a přibližně 488bp velký fragment SacI/HindlII plazmidu pUR7703, který nese fúzi invertázy a a faktoru dělení k AFP-III, se za použití standardních metod nezávisle klonovaly do kvasinkových expresivních vektorů, které se také štěpí restriktázami Sací a HindlII. Oba tyto expresivní vektory nesou promotor Gal7 S. cerevisiae tak, že inzerce genů do Sací restrikčního místa umožňuje transkripci inzerovaných genů řízenou Gal7.

Plazmid pUR7704 (obrázek č.8) se vytvořil inzercí kazety signální sekvence invertázy AFP-III z plazmidu pUR7702 do • ···

vektoru pUR2778, který slouží jako integrační vektor pro ribozomální DNA a tvoři větší počet kopií. Plazmid pUR7706 (obrázek č. 9) je plazmid pUR2778 obsahující kazetu a faktoru děleni AFP-III, získanou z pUR7703, která se začlenila mezi restrikčni místa Sací a HindlII.

Příklad 3: Exprese AFP-III v S.cerevisiae

Plazmidy pUR7704 a pUR7706 se linearizovaly štěpením restriktázou Hpal, což umožňuje integraci plazmidů do kvasinkové rDNA oblasti a pak následuje nezávislé zavedení plazmidů do kvasinek S.cerevisiae kmene SU50 elektroporací. Transformanty se izolovaly na základě jejich schopnosti růstu v nepřítomnosti leucinu. Za účelem dosaženi exprese klonovaných AFP-III genů, se transformanti nesoucí plazmid pUR7704 nebo pUR7706 nejdříve kultivovaly po dobu 40 hodin v kapalném minimálním médiu při teplotě 30°C a pak se naředily v poměru 1:10 čerstvě připraveným indukčním médiem (1 % kvasinkový extrakt, 2 % pepton Difco, 5 % galaktóza) a inkubovaly se při teplotě 30°C po dalších 48 hodin. Na konci této periody se ve vzorcích supernatantu kultury testovala jejich schopnost inhibovat růst ledových krystalů.

Růst ledových krystalů se pozoroval mikroskopem během 30min. inkubace při teplotě -6°C. Bylo zcela zřetelné, že vzorky supernatantu získaného z kvasinek, které nesou syntetické AFP-III geny inhibovaly růst ledových krystalů ve srovnání s podobnými, kontrolními vzorky připravenými ze supernatantu netransformovaných kvasinek nebo z kvasinek, které nesou exprimující vektor bez syntetického AFP-III genu. Avšak inhibični aktivita rekrystalizace materiálu, který produkují kvasinky, je podstatně nižší než aktivita stejného množství AFP preparátu z ryb.

Za účelem další analýzy produkovaného AFP se lOml vzorků indukovatelné kultury transformantů s plazmidy p(JR7704 a • · · • · ·· ··♦ ·

pUR7706 centrifugovalo po dobu 5min. při 4 OOOot./min. a buňky a supernatanty se oddělily a uložily se při teplotě 20°C. Proteiny se separovaly denaturační SDS elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a AFP se detekovaly westernovým přenosem za použiti anti-AFP specifických monoklonálních protilátek.

Přítomnost pruhu, jehož zdánlivá molekulová hmotnost je 6,5kD, ve vzorcích supernatantu kvasinkového transformantu, který nese plazmid pUR7704 a p(JR7706, jasně naznačuje, že tyto transformanty jsou schopny produkovat AFP-III. Peptid se izoloval na HPLC s obrácenými fázemi a stanovila se sekvence N-konce. Tato sekvence ukazuje, že peptid HPLC-1 je kvasinkami správně zpracován a vyloučen.

Příklad 4: Stanovení subtypu AFP z mořské tresky s nej vyšší aktivitou

Za použití dvoustupňového postupu se izolovaly izoformy AFP-III. Vzorky se najprve nanesly na kationtoměničovou Mono S kolonu a eluovaly se popsaným gradientem. Eluční patern je na obrázku č. 10. Z kolony se izoloval jeden neretardovaný pík (pík Q) a čtyři eluované píky (S1 až S4). Pík S1 reprezentuje protein, který má za těchto podmínek nejnižší vazebnou kapacitu na kationtoměničové koloně Mono S. Pík S4 obsahuje protein s nejvyšší vazebnou kapacitou na kolonu. Frakce plků se spojily a nanesly se na RP-HPLC kolonu za použití popsaného gradientu. Chromatogram vytvořený z celkového materiálu je ukázán na obrázku č. 11. Frakce plků obsahují izoformy AFP-III a jsou označeny čísly od 1 do 12 podle jejich chování na uvedené koloně za specifikovaných podmínek. Všechny izoformy AFP-III se eluují mezi 25 a 45 minutami. RP-HPLC chromatogramy frakcí Q a S1 až S4 jsou na obrázku č. 12 až 16. Každá frakce obsahuje jiné izoformy AFPIII a přehled zastoupení AFP izoformy v určité frakci je • · uveden v tabulce č. 2. Frakce získané z Mono S a RP-HPLC kolon se testovaly myšími anti-AFP-III antisérem a všechny izoformy od S1 až S4 vykázaly pozitivní reakci s S typem antiséra. Izoforma 12 ze skupiny Q reagovala s Q typem antiséra. U pěti izoforem se stanovila aminokyselinová sekvence N-konce (tabulka č. 3) . Frakce píku AFP-III HPLC 7 byla kontaminována rybím lysozymem, ale ostatní identifikované aminokyselinové sekvence mohly vykazovat příbuznost se známými sekvencemi AFP-III izoforem. U stejných množství čištěného proteinu se testovala AFP aktivita.

Jak vyplývá z inhibičního testu rekrystalizace pouze izoforma HPLC-12AFP-III vykazuje podstatnou AFP aktivitu. Za účelem potvrdit toto zjištění AFP-III izoformy z mořské tresky se rekonstituovaly v přítomnosti a bez přítomnosti HPLC-12 izoformy. Zcela rekonstituovaný preparát peptidu udržoval aktivitu surového rybího preparátu, zatímco preparát, který neobsahoval HPLC-12 izoformu vykazoval vysoce redukovanou AFP aktivitu, jak dokazuje rekrystalizační test.

Ke stanovení celkové aminokyselinové sekvence této izoformy se použila izoforma 12 trávená trypsinem. Zjistilo se, že sekvence je shodná se sekvencí popsanou v literatuře (Davies and Chow, 1990; citace uvedena shora v textu).

Příklad

5: Konstrukce syntetického genu, který kóduje variantu HPLC-12 typu III AFP.

Následuje konstrukce nukleotidové

HPLC-12 AFP spojené se signální skevencí kodonem optimalizovaným

Saccharomyces cerevisiae: oligonukleotidů (HPLC12.1,

HPLC12.5, HPLC12.6, HPLC12.7, pro expresi sekvence kódující invertázy a s kvasinkách syntetizovala

HPLC12.2, HPLC12.2,

HPLC12.8, HPLC12.9, se sada 15

HPLC12.4,

HPLC12.10,

HPLC12.il, HPLC12.12, HPLC12.13, HPLC12.14, HPLC12.15) hlavně zahrnující sekvenci DNA přirozeného AFP, která se exprimuje v • 4 • 4

preferentně používaných codonech S. cerevisiae. Syntetický gen obsahuje jednořetězcové oblasti kompatibilní s konci, které se vytvořily restriktázami Sací a HindlII. (obrázek č. 17).

Za účelem sestavení syntetického genu HPLC-12 se 50pmol každého oligonukleotidu rozpustilo v 12 μΐ vody, směs se inkubovala 2min. při teplotě 95°C a bezprostředně po tom se přenesla na led. Po tomto denaturačním kroku se oligonukleotidy fosforylovaly v konečném objemu 20μ1, kde je obsaženo 2,5mM ATP, 5mM DTT a okolo 10U polynukleotidové kinázy. Směs se inkubovala po dobu 40min. při teplotě 37°C. Pak následovala dvou minutová denaturace při teplotě 95°C a dále bezprostřední přemístění na led. 10μ1 každého fosforylovaného oligonukleotidu se smíchalo s oligonukleotidy jejich nejvíce komplementární DNA za účelem získat duplexové uspořádání. Po dvou minutách denaturace při teplotě 95°C se každý duplex pomalu ochladil na teplotu 30°C. Spojilo se 10μ1 všech duplexových směsí a inkubovaly se v konečném objemu ΙΟΟμΙ, obsahujícím 50mM Tris/HCl, pH7,5, 8mM MgCl₂, 8mM DTT a 40μς/πι1 želatiny a 10U DNA ligázy, po dobu dvou hodin při teplotě 20°C. Ligační směs se pak srážela a rozpustila se ve 30μ1 TE-pufru. 15μ1 směsi se naneslo na 2 % agarozový gel a pruh DNA odpovídající očekávané velikosti (přibližně 291 párů baží) se vyřízl a DNA se izolovala pomocí sady Gene Clean II, podle protokolu výrobce

Tento fragment se ligoval s fragmentem vektoru, který se vytvořil z integračního vektoru pUR2778 tvořícího větší počet kopií štěpením restriktázami Sací a HindlII. Potvrdila se sekvence inzertu a výsledný plazmid se označil pUR7718 (obrázek č. 18) .

Plazmid pUR7718 se linearizoval štěpením restriktázou Hpal, což umožňuje integraci plazmidú do kvasinkové rDNA • ·» · ·· ·· • · · · · • · · · • · · · · • ·· ·· ···· • ·» • · · • · · ·· • ·· • · · · oblasti a pak následuje nezávislé kvasinek S.cerevisiae kmene transformanty se v nepřítomnosti klonovaného genu pUR7718 nejdříve minimálním médiu izolovaly na leucinu.

HPLC-12, se zavedení plazmidů do

SU50 elektroporací. Výsledné základě jejich schopnosti růstu Za účelem dosaženi exprese transformanty nesoucí plazmid po dobu 4 0 hodin v kapalném kultivovaly při teplotě 30°C a pak se naředily v poměru 1:10 čerstvě připraveným extrakt, 2 % pepton Difco, teplotě 30°C po dalších vzorcích supernatantu inhibovat růst ledových

Výsledky indukčním médiem (1 % kvasinkový % galaktóza) a inkubovaly se při této periody se ve jejich schopnost hodin. Na konci jasně ukazují, že aktivity.

u kvasinek kultury testovala krystalů.

(rekrystalizačniho testu) supernatanty kultury měly vysoké hladiny AFP Srovnání těchto výsledků s výsledky získanými exprimujicich variantu HPLC-12 ukazuji, že supernatant z transformantu, který vykazuje nejnižší HPLC-12 AFP aktivitu překračuje aktivitu vykazovanou nej lepším transformantem HPLC-1.

Fed-batch fermentace se uskutečnila s transformantem, buňky shromáždily v jednolitrových dobu který nese pUR7718. Na konci feed fáze se centrifugaci v centrifuze Jouan LR 5.22 kyvetách. Centrifugace probíhala po

4650ot./min. (7200g). AFP aktivita supernatantu testem inhibice rekrystalizace ledu. Neředěný jasně brání růstu krystalů, což ukazuje, že v kultury je přítomna vysoká koncentrace aktivních Westernův přenos supernatantu zmíněné že došlo ke sekreci molekulová hmotnost

30min. při se testovala supernatant supernatantu

AFP.

fermentace ukazuje, Zdánlivá kvasinky,

HPLC12.

je stejná jako zdánlivá

Izolace a sekvenace materiálu AFPIII-HPLC12. HPLC12, který produkují molekulová hmotnost rybího aminokyselin kvasinkami produkovaného peptidu potrvdily, že tento materiál není rozlišitelný od peptidu HPLC12 produkovaného mořskou treskou.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob produkce rekombinantních polypeptidů nebo proteinů, vyznačující se tím, že zahrnuje

1) kultivaci organizmu využitelného v potravinářství za podmínek, při kterých dochází k expresi nebo k indukci exprese alespoň sekvence nukleové kyseliny kódující AFP, zmíněná sekvence nukleové kyseliny je obsažena v konstrukci DNK, zmíněná konstrukce DNK není přítomna v přirozeném hostitelském organizmu a zmíněná konstrukce DNK zahrnuje v daném pořadí (a) silný, volitelně indukovatelný promotor, který je aktivní v hostitelském organizmu, (b) startovací kodon ATG, který může být přítomný ve volitelné signální sekvenci DNK schopné sekretovat protein produkovaný hostitelským organizmem během exprese sekvence nukleové kyseliny kódující AFP podle odstavce (c) uvedeného dále v textu, přičemž signální sekvence může být homologní nebo heterologní k sekvenci nukleové kyseliny kódující AFP a nachází se ve čtecím rámci se startovacím kodonem ATG, (c) nejméně kóduj ící vykazuje nukleové kyseliny sekvenci, která jednu sekvenci aminokyselinovou nejméně 80 aminokyselinovou typ III, zmíněná ve čtecím rámci sekvencí sekvence % homologii proteinu HPLC-12 AFP nukleové kyseliny je se starovacím kodonem ATG, a volitelně (d) terminační kodon vázaný na 3'-konec sekvence nukleové kyseliny kódující AFP, a volitelně
2) zachycení takto získaného produktu exprimovaného sekvencí nukleové kyseliny kódující AFP.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že konstrukce DNK obsahuje signální sekvenci vhodnou pro hostitelský organizmus, která umožňuje sekreci exprimovaného produktu sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje nejméně 80 % homologii se sekvencí proteinu HPLC-12 AFP typ III/ hostitelem během jeho kultivace.

3.

Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, ž e hostitelský organizmus je mikroorganizmus.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že hostitelský organizmus je kvasinka.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že signální sekvence DNK je pre-sekvence DNK α-faktoru dělení (α-mating factor) S.cerevisiae.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že promotor je indukovat elný promotor GAL 7 nebo konstitutivní promotor GAPDH Saccharomyces cerevisiae.

7. Rekombinantni hostitelský organizmus využitelný v potravinářství, vyznačující se tím, že je ho možné získat způsobem podle nároku 1.

8. V podstatě čistý a izolovaný rekombinantni polypeptid nebo protein využitelný v potravinářství, jehož aminokyselinová sekvence vykazuje 80% homologii se sekvencí proteinu HPLC 12 AFP typ III.

9. Potravinářský produkt nebo biologický materiál, vyznačující se tím, že zahrnuje polypeptid nebo protein s aminokyselinovou sekvencí, která vykazuje nejméně 80 % homologii s HPLC 12 AFP typ III a/nebo hostitelský organizmus schopný exprimovat rekombinantní polypeptid nebo protein s aminokyselinovou sekvencí, která vykazuje nejméně 80 % homologii s HPLC 12 AFP typ III, zmíněný potravinářský produkt nebo biologický materiál není poživatelný organizmus, který zahrnuje zmíněný polypeptid nebo protein ve zmíněné formě nebo množství.

10. Produkt podle nároku 9, vyznačující se tím, že produkt je určen ke zmrazení.

11. Produkt podle nároku 10, vyznačující se tím, že jde o zmrzlinu.

12. Produkt podle nároku 10, vyznačující se tím, že jde o zmrazené těsto nebo mrazený pekárenský produkt.

13 . Produkt podle nároku 9, v y z n a č u j 1 C 1 s e t í m, že biologický materiál je zvířecí orgán nebo tkáň nebo rostlina. 14 . Produkt podle nároku 9, v y z n a č u j S s 1 C 1 s e t í m, že polypeptid nebo protein je rekombinanntí

polypeptid nebo protein.

15. Produkt podle nároku 9, vyznačující se tím, že polypeptid nebo protein je polypeptid nebo protein použitelný v potravinářství.