ES2248819T3 - Peptidos anticongelantes de peces marinos como aditivos para productos alimentarios. - Google Patents
Peptidos anticongelantes de peces marinos como aditivos para productos alimentarios.Info
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Abstract
USO DE UN POLIPEPTIDO PROTEINA CON UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS QUE CORRESPONDE ESENCIALMENTE A UN PAC TIPO III HPLC 12 COMO ADITIVO EN UN PRODUCTO PARA MEJORAR DICHO PRODUCTO, RESIDIENDO DICHA MEJORA EN LAS PROPIEDADES MEJORADAS DE MODIFICACION DE LOS PROCESOS DE DESARROLLO DE LOS CRISTALES DE HIELO QUE INFLUYEN EN LAS DIMENSIONES Y LAS CARACTERISTICAS DEL HIELO, EN PARTICULAR EL RECRECIMIENTO, CON LO QUE SE REDUCE AL MINIMO LA CAPACIDAD DE DAÑO POR CONGELACION, P. EJ., AL IMPEDIR O INHIBIR LA RECRISTALIZACION DEL HIELO PRESENTE EN EL PRODUCTO SOMETIDO A CONGELACION, PRODUCIENDOSE ESTE USO PER SE DEBIDO A LOS PEPTIDOS ANTICONGELACION PARA OBTENER UNA MODIFICACION MAS ESPECIFICA DE LA ACTIVIDAD, EN PARTICULAR DE LA ACTIVIDAD ANTICONGELACION, QUE LA QUE SE OBTENDRIA CON LA MISMA CANTIDAD DEL PAC WINTER FLOUNDER.
Description
Péptidos anticongelantes de peces marinos como
aditivos para productos alimentarios.
La sangre del pez polar está protegida de la
congelación mediante la presencia de péptidos anticongelantes.
Estos péptidos anticongelantes se pueden clasificar en cuatro tipos
de acuerdo con sus estructuras (Davies y Hew, 1990). Los AFP de tipo
I son ricos en alanina con residuos de treonina y asparagina
espaciados de manera regular y tienen una conformación en hélice
\alpha. Los AFP de tipo II tienen un alto contenido característico
en cisteína (8%). Los AFP de tipo III son pequeños péptidos
globulares (con aproximadamente una longitud de 64 aminoácidos). El
grupo final, las glicoproteínas anticongelantes, tienen un motivo
repetido de tripéptido que se une a un disacárido específico. Todos
estos péptidos comparten la propiedad no coligativa de la depresión
del punto de congelación y la inhibición del crecimiento del cristal
de hielo. Estas características pueden encontrar aplicación en la
alteración del estado del cristal de hielo de los productos
congelados. Como es poco probable que la purificación de estos
péptidos a partir de la sangre del pescado para sea un procedimiento
económicamente viable, se ha buscado un procedimiento para la
producción a granel de los AFP usando la moderna biotecnología.
Un primer trabajo sobre la producción de péptidos
anticongelantes en microorganismos se centró sobre la expresión de
los AFP de tipo I en levaduras y Escherichia coli (Warren
y col., 1993, McKown y col., 1991). Como E.
coli tiene capacidad de producir toxinas, no se considera
generalmente esta bacteria como segura (GRAS) lo que plantea
problemas para su uso en la producción de AFP destinados a
aplicación en la industria de alimentos.
Se conocen cepas de levaduras similares a
Saccharomyces cerevisiae que se consideran organismos GRAS,
que a diferencia de E. coli, tienen la capacidad de segregar
proteínas heterólogas en el medio de crecimiento que facilitan el
procesamiento del producto corriente abajo. La levadura es, por
tanto, un organismo huésped atractivo para la producción de una
variedad de proteínas heterólogas (Romanos y col.,
1992).
Los primeros informes de producción de AFP en
levaduras se refieren a la acumulación intracelular de una fusión de
una AFP de tipo I sintética con una proteína A truncada de
Staphylococcus aureus (Warren y col., 1993). Se
reivindicó que este péptido protegía a la levadura frente a los
efectos deletéreos de la congelación. No se describe como tal la
producción extracelular de AFP de tipo I. No se menciona nada al
respecto de otros tipos de
AFP.
AFP.
En este laboratorio se han construido
transformantes de la levadura que llevan un vector de la expresión
que contiene un gen sintético procedente de una AFP natural de tipo
I de solla roja (HPLC6) (Driedonks y col., 1995); y este se
describe en la solicitud PCT WO 94/03617 del demandante abandonada
en la actualidad. No fue demostrable la secreción del monómero de
AFP activo por estas levaduras. El único camino para obtener una
inhibición significativa de la actividad de recristalización del
hielo fue expresar multímeros de los AFP de tipo I diseñados para
permitir su procesamiento posterior por una proteasa endógena de
levadura para dar como resultado monómeros activos (Driedonks y
col., 1995). Esta hipótesis, aunque permite definitivamente la
producción de AFP activa de tipo I, dio como resultado la secreción
de formas heterogéneas parcialmente procesadas de las AFP
multiméricas. El tratamiento posterior para obtener el péptido
activo en forma de monómero se consideró inaceptable a efectos de
una producción industrial. Además del esfuerzo y costes extra, dicha
adición podría conducir también a problemas para obtener el permiso
para la aplicación en artículos alimenticios. Esto se debe en
primer lugar al uso de productos químicos para obtener monómeros
activos y en segundo lugar se debe a la expresión de secuencias no
nati-
vas
vas
Parece imposible por tanto usar un organismo de
calidad alimentaria para expresar y segregar los AFP monomérica
activa de una manera sencilla y eficiente proporcionando un
procedimiento industrialmente aceptable aplicable en la producción
de alimentos
En un intento por resolver los problemas
planteados por la expresión de los AFP de tipo I en levaduras
intentamos expresar los AFP de tipo III procedente de la babosa
vivípara americana en levaduras. Los AFP de tipo III son pequeñas
proteínas globulares, y consideramos que por esta razón podrían ser
más adecuadas para la expresión en levaduras que los AFP de tipo I
con hélice \alpha.
Se encontraron AFP de tipo III en la sangre del
pez polar tal como en la babosa vivípara americana (Macrozoarces
americanus) y el perro del norte (Davies y Hew, 1990). Se ha
descrito el fraccionamiento de la sangre de la babosa vivípara
americana que revelando la presencia de 12 variedades diferentes de
AFP de tipo III (Fig. 1, Hew y col., 1984, Davies y Hew,
1990. Estos péptidos son altamente homólogos, compartiendo al menos
un 60% de la identidad de aminoácidos, y la mutagénesis in
vitro ha demostrado un clúster de residuos superficiales comunes
a todas las variantes de AFP de babosa vivípara americana que se
requieren para la unión con el hielo (Chao y col., 1994). La
carga negativa de ácido glutámico (Glu) en las posiciones 23 y 26
parece estar implicada en la estabilidad térmica y en la actividad
histerética térmica del polipéptido (Li y col., 1991). Los
tres aminoácidos conservados siguientes, la asparagina (Asn) en la
posición 14, la Treonina (Thr) en la 18 y la Glutamina (Gln) en la
44, parecen ser también los residuos clave en la actividad de unión
al hielo de los AFP-III (Chao y col.,
1994).
Nosotros manipulamos los AFP de tipo III en
levadura de la babosa vivípara americana para expresar la variante
HPLC-1, pero no fuimos capaces de obtener la
secreción de un monómero suficientemente activo de AFP de tipo III.
Esto no resolvió obviamente los problemas anteriormente
mencionados.
De manera adicional determinamos que los AFP
HPLC-1 de tipo III producidos por la levadura
presentaban una actividad específica inesperadamente baja cuando se
la comparaba con la preparación de AFP aislada de sangre de babosa
vivípara americana. Esta baja actividad podría ser debida
posiblemente al incorrecto plegado del péptido o debido a una
actividad específica inherentemente más baja de la variante
HPLC-1. Esto, desde luego, no parece prometedor
para continuar esta línea de investigación para producir más AFP
activas que aquellas encontradas en la solla roja.
También hemos fraccionado los AFP derivados de la
sangre de babosa vivípara americana en diversas fracciones HPLC y
analizado su actividad de recristalización con el fin de determinar
que otra fracción de HPLC-1 podría ser útil
potencialmente para nuestra aplicación deseada. La HPLC12 mostró
ser la única fracción de las 12 fracciones de los AFP de tipo III
activa en la inhibición de la recristalización a las
concentraciones ensayadas. De esta manera determinamos que la
HPLC-12 podría ser de interés si la manipuláramos
para resolver los problemas en la producción recombinante del mismo
que habíamos encontrado para los AFP de tipo I y los AFP
HPLC-1 de tipo III.
De manera bastante inesperada a la vista de los
anteriores experimentos con los AFP de tipo I y los AFP de tipo III
se encontró posteriormente que la expresión del ácido nucleico de
la levadura que codificaba la secuencia de aminoácidos determinada
para los AFP HPLC-1 de tipo III 2 conduce a un
producto que se expresa y secreta en forma de monómero y no
presenta actividad reducida. De esta manera estaba disponible un
procedimiento de producción eminentemente adecuado usando tecnología
de ADN recombinante para producir AFP pura.
Lo que se descubrió de hecho de manera adicional
fue que la HPLC-12 recombinante segregada por la
levadura en forma de monómero puede presentar tal cual la elevada
actividad del péptido anticongelante de una mezcla de los AFP
aislados a partir de sangre de babosa vivípara americana. Esta
actividad anticongelante es al menos el doble que la de los AFP de
tipo I de la solla roja. De manera adicional el producto es más
activo de esta manera en los ensayos de recristalización y mucho más
adecuado para las aplicaciones deseadas que las otras AFP.
Se conocía ya la composición de aminoácidos, las
secuencias y las secuencias de ácido nucleico de diversas AFP de
tipo III que se producen en la naturaleza. Davies y Hew (1990)
presentan una revisión de las mismas y hacen referencia a los
artículos de Li y col. de 1985 y Hew y col., de 1988
para las secuencias de HPLC- 1, 4, 5-7, 9, 11 y 12
tal como se han determinado para la babosa vivípara americana sobre
la base de clones de ADNc del ADN genómico de pescado en fagos. En
Protein Science en 1994 Chao, H y col., describen cómo una
isoforma de los AFP HPLC-12 de tipo III se
sintetiza de manera sintética y se expresa en E. coli para
estudios de RMN bidimensionales para ayudar a comprender las
relaciones de estructura/función en proteínas anticongelantes, y
para definir los motivos de la unión con el hielo. El ácido nucleico
se muta a continuación con el fin de producir un polipéptido mutante
de los AFP de tipo III, siendo dichos mutantes de prolina. Se
comparó el valor de la histéresis térmica de la
HPLC-12 recombinante no mutada para los AFP aísla de
babosa vivípara americana, es decir, los AFP de tipo III. Se
describieron los perfiles de actividad como siendo indistinguibles
dentro de los límites de los errores estándares. No se mencionó
comparación con otros tipos de AFP. No se proporcionó indicación de
un valor anormalmente alto de histéresis térmica, de hecho, no se
dio valor a todo. Nada se indica con respecto a cualquier efecto
sobre las propiedades de recristalización. Nosotros señalamos por la
presente que las actividades de histéresis térmica no se ligan a
las propiedades de recristalización. Los valores de histéresis
térmica son indicativos de la fuerza de la unión y no proporcionan
una medida de la actividad anticongelante similar a la del ensayo de
recristalización. Se conocen ejemplos de proteínas que presentan
valores altos de histéresis pero no efectos sobre la
recristalización y viceversa que ilustran la ausencia de
correlación.
Fue completamente inesperada la elevada actividad
de los AFP de la HPLC-12 recombinante a la vista de
los resultados obtenidos para la HPLC-1 recombinante
y a la vista de lo que se ha descrito en publicaciones relacionadas
con los AFP. Se proporcionan en la Tabla 1 los valores de histéresis
térmica de las fracciones de AFP de tipo III obtenidos mediante el
fraccionamiento en columna Shephadex de los AFP de tipo III
procedentes de sangre de babosa vivípara americana reseñados el
artículo de Hew y col., 1984, usando los valores de los AFP
de solla (= Tipo I) y los AFP del cuervo de mar (Tipo II). Estos
valores se derivaron de fracciones que provienen de la sangre de
especies relevantes, no a través de tecnología del ADN recombinante.
Aparecieron únicamente ligeras diferencias en las actividades entre
los AFP, siendo la más activa la QAE-A.
QAE-A fue una de las 5 variantes distintas que se
pudieron separar en una columna QAE Sephadex y mostraron
posteriormente que se derivaban de HPLC-12. Sin
embargo, se describen las diferencias tan ligeras que entran dentro
de la desviación debida a las variaciones de medida. Las diferencias
en los valores de histéresis térmica fueron rechazadas de manera
clara por irrelevantes por Hew y col., en el mismo artículo.
Ellos manifestaron que "la mayor parte de los AFP de babosa
vivípara americana presentaron histéresis térmica comparable con la
encontrada para otras AFPG y AFP conocidas". En la bibliografía
posterior no se mencionan los valores de histéresis térmica para
los diversos tipos o se dan comparaciones entre el Tipo I y el Tipo
III. Nada se enseña o sugiere acerca de los efectos de la
recristalización de las diversas fracciones. Por tanto, no se
esperaba que ninguna AFP de tipo III única podría presentar una
actividad específica más alta para la inhibición del crecimiento del
cristal de hielo que los AFP de la solla roja. No se ha descrito o
sugerido también que la HPLC-12 presenta una
actividad mucho más alta que cualquier tipo de péptido de AFPI u
otro tipo de péptido de AFP III.
Para ensayar si fue mayor la actividad AFP de los
HPLC-12 de tipo III fraccionamos la preparación de
AFP de babosa vivípara americana derivada de la sangre mediante
HPLC, y ensayamos los componentes péptidos individuales respecto de
su capacidad para inhibir el crecimiento de cristales de hielo.
Determinamos que la variante HPLC-12 tenía la
actividad específica más alta. Los otros componentes no mostraron
actividad detectable a una concentración equivalente de 100 mg de
AFP de tipo III de pescado por ml.
De esta manera hemos encontrado un procedimiento
para preparar un polipéptido puro de calidad alimentaria que
presenta casi el doble de actividad AFP que la de los AFP de tipo
I. Debido a que esta se puede segregar en forma de monómero en
contraste a los AFP de tipo I, esto la hace ideal para la producción
a gran escala, ya que requiere mucho menos procesamiento corriente
abajo que los AFP de tipo I producidos mediante tecnología
recombinante. De manera adicional, la expresión en forma de monómero
significa que se puede producir un producto casi idéntico al péptido
que se produce de manera natural en la sangre de la babosa vivípara
americana. Dicho producto puede ser admitido de manera más fácil
para uso en artículos alimentarios debido a su semejanza cercana a
los AFP que se produce de manera natural en el organismo de calidad
alimentaria nativo, la babosa vivípara americana.
La presente invención nos permite producir por
primera vez, a gran escala y bajo coste y con gran facilidad, AFP
recombinante de tipo III de tipo HPLC-12 que tiene
una actividad específica inherentemente más elevada que los AFP de
tipo I de solla roja. Los péptidos anticongelantes de tipo III de
acuerdo con la invención son los candidatos más prometedores para
la aplicación en productos alimenticios destinados a congelación,
tales como helados y masa congelada, y otros productos congelados de
panadería debido a sus actividades altamente específicas
inhibidoras de la recristalización.
Una ventaja adicional se basa en el hecho que la
secreción del producto de expresión como polipéptido activo, de
manera preferible en forma de monómero, se puede producir ahora
in situ en el procedimiento de producción de alimentos,
eliminando por tanto el requisito de adición de los AFP tal cual.
Puede llegar a ser posible ahora producir productos de fermentación
usando una levadura capaz de segregar un polipéptido que corresponde
de manera sustancial a los AFP HPLC-12 de tipo III
en el procedimiento de fermentación, por lo cual tiene lugar la
producción in situ del polipéptido que corresponde de manera
sustancial con los AFP HPLC-12 de tipo III sin que
se necesiten etapas adicionales, tales como la purificación del
polipéptido y la adición posterior del mismo en el procedimiento de
producción de alimentos. También es ahora posible el desarrollo de
plantas, frutas o vegetales y animales transgénicos o partes de los
mismos con mejores propiedades de congelación debido a la expresión
in situ de un polipéptido que corresponde de manera
sustancial con los AFP HPLC-12 de tipo III
La presente invención se dirige a un
procedimiento para preparar un producto mejorado, residiendo la
mejora en la modificación de los procedimientos de crecimiento del
cristal de hielo que tienen influencia sobre las características de
tamaño y forma del hielo de manera particular en el recrecimiento
del mismo, por ejemplo minimizando el daño potencial por
congelación, por ejemplo, para evitar o inhibir la recristalización
del hielo del producto tras congelamiento, comprendiendo dicho
procedimiento la adición de un polipéptido o proteína con una
secuencia de aminoácidos que corresponde de manera sustancial a la
de los AFP HPLC-12 de tipo III, que presentan una
actividad de los AFP mayor que los AFP de tipo I de la solla roja
al producto no mejorado o a un ingrediente o mezcla normalmente
usado para preparar el producto no mejorado, dicha adición de
polipéptido o proteína recombinante se produce en cantidad
suficiente para afectar al crecimiento del cristal de hielo. El
producto puede ser un producto alimenticio o un material biológico.
El material biológico puede, por ejemplo, ser un órgano o tejido
animal o ser un material de planta. De manera particular se puede
añadir el polipéptido recombinante. De manera preferible el
polipéptido tendrá la categoría de calidad alimentaria con el fin de
proporcionar el producto final con categoría de calidad
alimentaria. Se prefiere un procedimiento de acuerdo con la
invención en el que el producto es un producto alimenticio. Una
forma de realización específica de un polipéptido adecuado es una
levadura AFP tal como se ilustra en los Ejemplos. Un procedimiento
de producción adecuado de acuerdo con la invención dirigido a la
producción de un producto mejorado que presente propiedades de
congelación mejoradas puede comprender la adición de una AFP
obtenida en un procedimiento de producción de polipéptido nuevo que
se elucida de cualquier forma en la descripción.
El término "un polipéptido o proteína con una
secuencia de aminoácidos que corresponde de manera sustancial a la
de los AFP HPLC-12 de tipo III" comprende una
secuencia de aminoácidos igual a la secuencia de aminoácidos de la
HPLC-12 aislada de babosa vivípara americana y
comprende también una secuencia de aminoácidos que difiere por uno o
dos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos conocida pero que
sigue codificando un polipéptido con la misma actividad de AFP que
la proteína nativa. Las mutaciones o diferencias pueden no estar en
aminoácidos conocidos por ser esenciales para la actividad del
polipéptido. Los residuos de prolina, de manera preferible por
tanto, no se borran o se reemplazan. De manera preferible, cualquier
diferencia en la secuencia de aminoácidos son mutaciones
silenciosas, por lo cual las sustituciones son sustituciones
conservativas que no alteran el perfil hidropático del polipéptido
y de esta manera presumiblemente no influencian de manera grave la
estructura y actividad del polipéptido, es decir, es decir, un
aminoácido con una cadena secundaria hidrófoba se intercambia
únicamente de manera preferible por otro aminoácido con una cadena
secundaria hidrófoba y un aminoácido con una cadena secundaria
hidrófila se reemplaza únicamente por otro aminoácido con una
cadena secundaria hidrófila. La homología del aminoácido entre
HPLC-12 y HPLC-1 es inferior al 60%.
Se puede esperar que una secuencia de aminoácidos que presente
homología por encima del 60%, de manera preferible más del 70% y de
manera más preferible más del 80% sea representativa de un
polipéptido que presente propiedades similares a la
HPLC-12, y de esta manera se considera también que
corresponde de manera sustancial a la HPLC-12. De
manera adicional, el polipéptido codificado por la secuencia de
aminoácidos presentaría al menos la actividad de los AFP de los AFP
de tipo I de la solla roja, y de manera preferible al menos la
actividad de los AFP de la HPLC-12 nativa. La
actividad de los AFP se puede determinar llevando a cabo
comparaciones con ensayos de recristalización usando una serie de
diluciones del polipéptido que se va a determinar y cantidades y
diluciones iguales de los AFP de tipo I y/o la
HPLC-12 nativa, tal como las que se obtienen de la
sangre de la babosa vivípara americana. En los Ejemplos se ilustra
la manera en la que se puede llevar a cabo y evaluarse dicho ensayo
de recristalización. Se puede considerar que un polipéptido que
presenta alguna o numerosas de las características mencionadas
anteriormente corresponde de manera sustancial a la
HPLC-12.
Un procedimiento para preparar un producto
mejorado, residiendo la mejora en propiedades mejoradas debidas a la
modificación de los procedimientos de crecimiento del cristal de
hielo que tienen influencia sobre las características de tamaño y
forma del hielo, en particular el recrecimiento del mismo,
minimizando por ejemplo el daño potencial por congelación, evitando
o inhibiendo por ejemplo la recristalización del hielo del producto
tras congelamiento, comprendiendo dicho procedimiento la adición de
un organismo huésped capaz de la expresión de un polipéptido o
proteína recombinante de calidad alimentaria con una secuencia de
aminoácidos que corresponde de manera sustancial a la de los AFP
HPLC-12 de tipo III en un producto no mejorado como
tal o en un ingrediente o mezcla usados normalmente para preparar el
producto no mejorado y someter posteriormente el organismo huésped
a condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico que codifica
los AFP de tipo III de tipo HPLC 12 se expresa en el producto o
ingrediente o mezcla llevando a cabo un procedimiento de producción
de un polipéptido tal como se describe en otra parte de la
descripción y se describe de manera adicional a las etapas que se
toman normalmente para preparar el producto no mejorado. El
producto puede ser de manera adecuada un producto alimenticio o un
material biológico. El material biológico puede ser, por ejemplo, un
órgano o tejido animal o ser un material de planta. De manera
particular se puede añadir el polipéptido recombinante. De manera
preferible el polipéptido será de categoría de calidad alimentaria
con el fin de proporcionar el producto final con categoría de
calidad alimentaria. Se prefiere un procedimiento en el que el
producto que se va a mejorar es un producto alimenticio. tal como
se ilustra en los Ejemplos, una forma de realización específica de
un polipéptido adecuado para un procedimiento de acuerdo con la
invención es una AFP de levadura. El organismo huésped puede o bien
destruirse o dañarse durante o después del procedimiento de
producción con el fin de liberar los AFP del polipéptido o proteína
en la mezcla o ingrediente del producto o en el producto per
se. Dicha destrucción o daño se puede producir de numerosas
maneras conocidas por una persona experta en la técnica, por lo cual
se deberá tener cuidado en no llevar el procedimiento bajo
condiciones demasiado drásticas para evitar pérdidas de actividad de
los AFP del polipéptido o proteína. De manera alternativa se puede
usar como tal en el procedimiento de producción un organismo huésped
capaz de segregar el polipéptido o proteína de los AFP en el
ingrediente o mezcla. Por ejemplo, el organismo huésped puede ser
una levadura de panadería en un procedimiento para producir un
producto alimentario tal como un producto de panadería. El
procedimiento de producción se puede llevar a cabo como el usual
siendo la única diferencia la adición de una levadura diferente, es
decir, una levadura que comprende un constructo de ADN que permita
la expresión y secreción de un polipéptido o proteína que
corresponde de manera sustancial a los AFP HPLC-12
de tipo III en la masa previa a o durante la cocción permitiendo de
esta manera la producción de producto amasado o cocido con
propiedades de congelamiento mejoradas. De manera análoga, los
procedimientos en los que se usan bacterias tales como bacterias de
ácido láctico forman formas de realización adecuadas de la
invención. La procedimiento de fabricación de queso y de fabricación
de yogurt u otros procedimientos de producción de alimentos que
requieren fermentación se incluyen entre el tipo de procedimientos
cubiertos por la invención.
De manera ventajosa, se puede llevar a cabo un
procedimiento de producción para mejorar productos de acuerdo con la
invención sin requerir la adición de proteasas o productos químicos
tras el polipéptido o proteína recombinante con la secuencia de
aminoácidos que corresponde de manera sustancial con los AFP
HPLC-12 de tipo III que se ha expresado o segregado
para obtener el polipéptido o proteína de AFP en forma de producto
monomérico.
El uso de un polipéptido o proteína
correspondiendo la secuencia de aminoácidos de manera sustancial
con los AFP HPLC-12 de tipo III en cualquiera de las
formas de realización descritas anteriormente como aditivo en un
producto para la mejora de dicho producto, residiendo dicha mejora
en propiedades mejoradas de modificación de los procedimientos de
crecimiento del cristal de hielo que tienen influencia en las
características de tamaño y forma o hielo, en particular en el
recrecimiento del mismo minimizando, por ejemplo, el daño potencial
por congelamiento, evitando o inhibiendo por ejemplo la
recristalización del hielo del producto tras el congelamiento,
produciéndose dicho uso de una manera conocida per se para
los AFP para obtener mayor actividad específica anticongelante que
se puede obtener como se describe con los AFP de la solla roja. De
manera preferible el producto será un producto alimenticio. El
producto puede ser de manera adecuada un material biológico. La
proteína o polipéptido puede ser una proteína o polipéptido
recombinante.
Una forma de realización preferida del
procedimiento o uso para la mejora de productos es un procedimiento
o uso, en el que el producto es un producto destinado a ser
congelado. Para los productos alimenticios la helado es un ejemplo
adecuado. Tal como se ha indicado anteriormente un producto amasado
o de panadería son también de interés.
Los productos alimenticios que comprenden
polipéptidos o proteínas recombinantes de calidad alimentaria
correspondiendo la secuencia de aminoácidos de manera sustancial
con los AFP de tipo II de tipo HPLC 12 en cualquiera de las formas
de realización descritas anteriormente como aditivos en un producto
alimenticio para la mejora de dicho producto, residiendo dicha
mejora en propiedades mejoradas de modificación de los
procedimiento de crecimiento del cristal de hielo que tienen
influencia sobre las características de tamaño y forma del hielo,
en particular en el recrecimiento del mismo, minimizando por
ejemplo el daño potencial por congelamiento, evitando o inhibiendo
por ejemplo la recristalización del hielo del producto como se
describe tras el congelamiento. Dicho producto alimenticio no
comprende organismos comestibles de incidencia natural como la
babosa vivípara americana que comprende meramente secuencias que
codifican un polipéptido o proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que se corresponde con la secuencia de aminoácidos de
la HPLC-12 de la babosa vivípara americana en la
forma y número en la que aparecen de forma natural en la babosa
vivípara americana. Una categoría deseable de productos de acuerdo
con la invención no son productos animales. Otra categoría adecuada
es la categoría de productos manufacturados. Los productos de
plantas son también ejemplos adecuados de los productos de acuerdo
con la invención. Los productos alimenticios de acuerdo con la
invención se pueden obtener mediante un procedimiento o uso para la
mejora de un producto en cualquiera de las formas de realización
que se describen anteriormente.
De manera particular, se reivindica también un
producto alimenticio que comprende un organismo huésped
recombinante que tiene una tolerancia mejorada al congelamiento,
residiendo dicha mejora en propiedades mejoradas de modificación de
los procedimientos de crecimiento del cristal de hielo que tienen
influencia sobre las características de tamaño y forma del hielo,
en particular el recrecimiento del mismo, minimizando por ejemplo
el daño potencial por congelamiento evitando o inhibiendo por
ejemplo la recristalización del hielo del producto tras
congelamiento, conteniendo dicho organismo huésped de calidad
alimentaria y/o siendo rodeado por un polipéptido o proteína
recombinante de calidad alimentaria con una secuencia de aminoácidos
que corresponde de manera sustancial con los AFP
HPLC-12 de tipo III en cualquiera de las formas de
realización descritas anteriormente y/o capaces de expresar y/o
segregar dicho polipéptido o proteína.
Se describen a continuación las formas de
realización adecuadas de dicho organismo huésped recombinante en el
procedimiento para la producción del polipéptido.
Un procedimiento adecuado para producir
polipéptidos o proteínas recombinantes que presentan actividad
modificadora de la forma y el crecimiento del cristal de hielo,
denominados péptidos anticongelantes recombinantes (AFP) que
presentan una actividad anticongelante específica mayor que la de
los AFP de la solla roja, implica
1) cultivar un organismo huésped de calidad
alimentaria bajo condiciones por las cuales se produce o se induce
la expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico que
codifica los AFP, estando comprendida dicha secuencia de ácido
nucleico en un constructo de ADN, no estando presente dicho
constructo de ADN en el organismo huésped nativo y comprendiendo
dicho constructo de ADN en el orden dado
- (a)
- un promotor activo, fuerte, opcionalmente inducible, en el organismo huésped,
- (b)
- un códon de inicio ATG, que puede estar presente en una secuencia señal de ADN opcional capaz de segregar la proteína producida mediante el organismo huésped durante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP de (c) a continuación, cuya secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga con la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP y está en el marco de lectura con el códon de inicio ATG,
- c)
- al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos cha corresponde de manera sustancial con la de la AFP de tipo III-proteína HPLC-12, dicha secuencia de ácido nucleico en marco de lectura con el códon de inicio ATG, y de manera opcional
- (d)
- un códon de detención enlazado con el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP.
Este procedimiento puede comprender
adicionalmente de manera opcional recoger el producto expresado de
la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP obtenidos del
mismo mediante procesamiento adicional de una manera conocida per
se. Con el fin de obtener la secreción del producto de
expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una
secuencia de aminoácidos que corresponde de manera sustancial con
la de los Proteína AFP HPLC-12 de tipo III del
constructo de ADN puede comprender de manera adicional una secuencia
señal para el organismo huésped que permite la secreción por el
huésped durante el cultivo del huésped. El organismo huésped es de
manera adecuada un microorganismo. Los microorganismos de calidad
alimentaria adecuados son hongos tales como levaduras y bacterias
tales como bacterias de ácido láctico. Las células de levadura de
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis y
Saccharomyces lactis son ejemplos de una célula huésped de
levadura adecuada. Una persona experta en la técnica de los
procedimientos de fermentación en la producción de alimentos
conocerá que células de levadura son adecuadas y que sistemas de
transformación y expresión están disponibles (Romanos y col.,
Campbell y Duffus). Las bacterias de ácido láctico
lactobacillus, Streptococcus y Bifidobacterium
son también ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados de
los que se conocen muchas cepas y para los que existen sistemas
adecuados de transformación y expresión como conoce cualquier
persona experta en la técnica de trabajar con ADN recombinante de
las bacterias asociadas con productos lácteos (Gasson, 1993). La FDA
tiene una lista de organismos de calidad alimentaria que está
disponible al público. Una persona experta en la técnica está
enterada de los organismos que se consideran de calidad
alimentaria, es decir, que tienen categoría de GRAS (reconocidos de
manera general como útiles). De manera particular son adecuados los
organismos asociados con la fermentación de productos alimenticios y
la producción de productos lácteos.
La frase "una secuencia de ácido nucleico que
codifica una secuencia de aminoácidos que corresponde de manera
sustancial con la de los Proteína AFP HPLC-12 de
tipo III" comprende cualquier ácido nucleico que codifica de
manera exacta la secuencia de aminoácidos de la
HPLC-12 nativa de babosa vivípara americana. Dicha
secuencia de ácidos nucleicos puede diferir debido a la
degeneración del código genético, es decir, el hecho que diferentes
codones de ácido nucleicos codifican el mismo aminoácido. De manera
adicional también se puede usar también en la presente invención una
secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de
aminoácidos pero codifica además un polipéptido con la misma
actividad de los AFP tal como la proteína nativa. Las mutaciones o
diferencias pueden no estar en aminoácidos conocidos por ser
esenciales para la actividad del polipéptido. Los residuos de
prolina son por tanto de manera preferible no borrados o
reemplazados. De manera preferible, cualquier diferencia en la
secuencia de aminoácidos son mutaciones silenciosas, por lo cual las
sustituciones son sustituciones conservativas que no alteran el
perfil hidropático del polipéptido y de esta manera presumiblemente
no influencia de manera grave la estructura y actividad del
polipéptido, es decir, un aminoácido con una cadena secundaria
hidrófoba únicamente se intercambia de manera preferible por otro
aminoácido con una cadena secundaria hidrófoba y un aminoácido con
una cadena secundaria hidrófila únicamente se reemplaza por otro
aminoácido con una cadena secundaria hidrófila. La homología del
aminoácido entre HPLC-12 y HPLC-1 es
inferior al 60%. Se puede esperar que una secuencia de aminoácidos
que presenta una homología por encima del 60%, de manera preferible
más del 70% y de manera más preferible más del 80% sea
representativa de un polipéptido que presente propiedades similares
con HPLC-12 y de esta manera se considera que
corresponde de manera sustancial con HPLC-12. La
frase "que corresponde de manera sustancial con" incluye de
esta manera las secuencias de ácido nucleico que codifican las
secuencias de aminoácidos que presentan más de un 60% de homología
con la secuencia de aminoácidos de la HPLC-12
nativa. De manera adicional el polipéptido codificado por la
secuencia de aminoácidos deberá presentar al menos la actividad de
los AFP de tipo I de solla roja y de manera preferible al menos la
actividad de los AFP de la HPLC-12 nativa. La
actividad de los AFP se puede determinar llevando a cabo
comparaciones con los ensayos de recristalización usando una serie
de diluciones del polipéptido que se va a determinar y los AFP de
tipo I y/o HPLC-12 nativos obtenidos de la sangre de
babosa vivípara americana obtenidos en las mismas diluciones tal
como el polipéptido que se va a ensayar, es decir, la comparación
del mismo p/v de polipéptido o proteína. Se ilustra en los Ejemplos
la manera en la que dicho ensayo de recristalización se puede
llevar a cabo y evaluar. Se puede considerar que un polipéptido que
presenta cualquiera o numerosas de las características
anteriormente mencionadas corresponde de manera sustancial con la
HPLC-12.
En una forma de realización preferida de la
invención el constructo de ADN y las condiciones de cultivo del
huésped son tales que este segrega un polipéptido monomérico con una
secuencia de aminoácidos que corresponde de manera sustancial con la
proteína AFP HPLC-12 de tipo III. El constructo de
ADN no expresara de esta forma de manera preferible en tándem un
dímero o multímero de una secuencia de aminoácidos que corresponda
de manera sustancial con la de la proteína AFP HPLC- 12 de tipo III.
la producción de dímeros o multímeros requerirá etapas de
procesamiento corriente abajo adicionales o puede impedir la
secreción de un polipéptido activo. De manera preferible el
constructo de ADN comprenderá por tanto una secuencia de ácido
nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que corresponde
de manera sustancial con la de la proteína AFP
HPLC-12 de tipo III en forma monomérica. De manera
natural, el constructo de ADN puede comprender múltiples copias de
la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de
aminoácidos que corresponde de manera sustancial con la de la
proteína AFP HPLC-12 de tipo III en forma monomérica
en tándem.
Una forma de realización preferida adicional de
la invención implica un constructo de ADN que el que la secuencia
de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
corresponde de manera sustancial con los AFP HPLC-12
de tipo III comprende los codones preferidos del organismo huésped
del procedimiento. Esto se prefiere con respecto al hecho que la
eficiencia de la translación se incrementa evitando ciertos
codones, de manera particular en los organismos huésped. Los usos de
los codones preferidos difieren en los procariotas, en levaduras y
plantas del uso del códon encontrado en solla roja. Por ejemplo, los
codones GCA, GCG, y GCT se cuentan en conjunto para más del 65% de
los codones de alanina de genes conocidos de E. coli, S.
cerevisiae y Z. mays, por cuanto cuentan menos del 25% de
los codones de alanina de un pescado tal como la solla roja. De
manera similar este es el caso para los codones de treonina ACA,
ACG y ACT (PCT/US90/02626). Se puede derivar el uso del códon tal
como se prefiere por la bacteria del ácido láctico y las levaduras a
partir de la bibliografía específica para estos grupos de
microorganismos. Una persona experta en la técnica de la tecnología
del ADN recombinante con estos organismos de expresión particular,
conocerá que codones se prefieren.
Cuando el organismo huésped es una levadura una
forma de realización preferida del constructo de ADN comprenderá la
presecuencia de ADN del factor de acoplamiento \alpha de S.
cerevisiae como secuencia señal. Esto puede comprender también
en una forma de realización adicional la presecuencia del factor de
acoplamiento \alpha de S. cerevisiae entre la presecuencia
y la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP, por lo cual
la presecuencia, la presecuencia y la secuencia de ácido nucleico
que codifica los AFP están en el mismo marco de lectura. De manera
alternativa, cuando el organismo huésped es una levadura, una forma
de realización preferida del constructo de ADN comprenderá la
secuencia señal invertasa de S. cerevisiae precediendo la
secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP.
Cuando el organismo huésped es una levadura, un
forma de realización preferida del constructo de ADN comprenderá el
promotor GAL7 inducible o un promotor GAPDH constitutivo de
Saccharomyces cerevisiae. Son bien conocidos otros
promotores adecuados de organismos huésped para la inclusión en el
constructo de ADN.
Las siguientes referencias se citan como ejemplos
que proporcionan sistemas de transformación posibles o elementos de
los mismos: para las levaduras Campbel y Duffus, para plantas el
PCT/US90/0626 y van den Elzen y col., (1985) y para animales
Hanahan, (1988). Antes del asunto de la invención se había producido
un polipéptido o proteína recombinante de calidad alimentaria no
aislado y purificado de manera sustancial, sustancialmente
equivalente a los AFP HPLC-12 de tipo III que
presenta dicha actividad alta de los AFP. Por vez primera se ha
producido un polipéptido o proteína recombinante de calidad
alimentaria sustancialmente aislado sustancialmente equivalente a
los AFP HPLC-12 de tipo III que presentan mayor
actividad que la de la solla roja. La invención cubre los productos
alimenticios que comprenden polipéptidos o proteínas de calidad
alimentaria recombinantes sustancialmente puros y aislados que
presentan propiedades mejoradas de modificación de los
procedimientos de crecimiento del cristal de hielo que tienen
influencia sobre las características de tamaño y forma del hielo,
en particular en el recrecimiento del mismo, minimizando por ejemplo
el daño potencial por congelamiento, evitando o inhibiendo por
ejemplo la recristalización del hielo tras congelamiento,
denominados péptidos anticongelantes recombinantes (AFP) que
presentan una actividad de los AFP mayor que la de una cantidad
igual de AFP de tipo I de solla roja, teniendo dicho polipéptido o
proteína una secuencia de aminoácidos que corresponde de manera
sustancial con la de la proteína AFP HPLC-12 de tipo
III. dichos polipéptidos recombinantes, y en particular los
polipéptidos o proteínas recombinantes presentan la actividad
anterior modificada tal como la actividad de inhibición del cristal
de hielo, los denominados péptidos anticongelantes recombinantes
(AFP) que presentan una actividad anticongelante específica mayor
que la de los AFP de la solla roja se pueden preparar mediante un
procedimiento tal como se describe en el presente documento.
Se usó la cepa JM109 de E. coli (endA1,
recA1, syrA96, thi, hsdR17, rk^{-}, mk^{+} relA1 supE44,
Yanish-perron, y col., 1985) para la
amplificación de los plásmidos. Se usó la cepa SU50 de S.
cerevisiae (MATas, cirº, leu2, his4, can1; Verbakel,
1991) para la transformación de los plásmidos de integración
multicopia. Se seleccionaron transformante de E. coli sobre
placas de agar Luria que contenían 100 \mug de ampicilina
ml^{-1} Sambrook y col. (1989). Las cepas de levadura se
mantuvieron sobre placas de YNB selectivo (Difco Yeast Nitrogen Base
al 0,67% sin aminoácidos, glucosa al 2%, agar al 2%) suplementadas
con los aminoácidos esenciales (histidina 20 \mug/ml, uracilo 20
\mug/ml). Se usó el mismo medio líquido para los precultivos, que
crecieron durante 48 horas a 30ºC y se diluyeron 1:10 en medio YP
(extracto de levadura Difco al 1%, peptona Difco al 2%) conteniendo
galactosa al 5% para la inducción del promotor GAL7.
Se proporcionan en la tabla 1 los detalles
relevantes de la AFP-III que contiene plásmidos.
Se llevó a cabo la transformación de JM109 por
Chung y col., (1989). Se llevó a cabo la transformación de
las cepas de levadura mediante electroporación, principalmente como
han descrito Becker y col., (1991). Se recuperaron los
transformante sobre placas de YNB selectivo. Una persona experta en
la técnica autentificará que son posibles diversos procedimientos
de transformación. Las alternativas dependen del organismo que se
va a transformar y están bien documentadas en diversos manuales
tales como Sambrook y col., (1989) y Campbell y Duffus
(1988).
Se aplicaron enzimas de restricción y enzimas de
modificación del ADN tal como recomendó el suministrador.
Se sintetizaron los oligonucleótidos en un
sintetizador de ADN Applied Biosystems 380A y se purificaron
mediante procedimientos normalizados.
Se purificaron los AFP III de babosa vivípara
americana, Macrozoarces americanus a partir de la sangre del
pescado capturado en las aguas marinas costeras de Newfoundland. Se
preparó la muestra de AFP III mediante centrifugación a partir del
suero coagulado del pescado tal como se ha descrito por Hew y
col., (1984).
Se llevó a cabo la cromatografía de intercambio
catiónico sobre una columna Mono S (HR5/5, Pharmacia Biotech) en el
sistema SMART (Pharmacia Biotech). La muestra tampón fue
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 10 mM (Merck) y se llevó a cabo
la elusión con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M
(Merck), con un flujo de 100 \mul/min. Se detectaron los péptidos
usando el \mu Peak Monitor (Pharmacia Biotech) a 214 y 280 nm. Se
recogieron las fracciones monitorizando la señal de 214 nm usando el
recolector de fracciones del sistema SMART integrado, se ajustó la
temperatura del sistema a 15ºC.
Se llevó a cabo la cromatografía líquida de alta
resolución en fase reversa (RP- HPLC) usando una columna \muRPC
C4/C18 SC2.1/10 (Pharmacia Biotech) sobre el sistema SMART
(Pharmacia Biotech). Se aplicó la muestra a la columna en ácido
trifluoroacético al 0,06% (TFA, Merck) en agua Milli Q (Solvente A)
y se eluyó usando acetonitrilo al 80% (Merck), TFA en agua Milli Q
al 0,054% (Solvente B). Se programó el gradiente normalizado usado
como sigue: 0 min. solvente A al 100%, 5 min. solvente A al 100%, 10
min. solvente A al 65%, 50 min solvente A al 40%, 55 min. solvente A
al 0%, 57,5 min. solvente A al 0% y a 58 min. solvente A al 100% a
un flujo de 100 \mul/min. Se detectaron los péptidos con el \mu
Peak Monitor (Pharmacia Biotech) a tres longitudes de onda 214, 256,
y 280 nm. Se recogieron los picos monitorizando la señal de 214 nm
usando el recolector de fracciones del sistema SMART integrado, se
ajustó la temperatura del sistema a 20ºC.
Se separaron las isoformas 1, 2 y 3 de los
AFP-III por medio de un gradiente modificado: 0 min.
solvente A al 100%, 10 min. solvente A al 60%, 35 min. solvente A
al 55%, 36 min solvente A al 45%, 45 min. solvente A al 45%, 46 min
solvente A al 0%, 50 min solvente A al 0%, 50,1 min solvente A al
100% y 60 min solvente A al 100%. Los tampones y todos los detalles
del sistema SMART son los mismos que aquellos usados con el
gradiente normalizado.
Se hicieron correr geles de poliacrilamida
Tricine al 16% (Novex) sobre una celda de electroforesis Xcell
(Novex) de acuerdo con el protocolo de los suministradores. La
muestra tampón fue de Novex y estuvo constituida por 3 ml de
TRIS-HCl 3,0 M, 2,4 ml de Glicerol, 0,8 g de SDS,
1,5 ml de Azul G de Coomassie al 0,1%, 0,5 ml de Rojo fenol al 0,1%
y \beta-mercaptoetanol al 5%, se ajustó el volumen
final a 10 ml con agua destilada, pH = 8,45). El tampón que se hizo
correr fue también de Novex y contuvo 12,1 gramos de TRIS, 17,9
gramos de Tricine y 1 gramo de SDS en un volumen total de 1 litro
de agua destilada, el valor del pH fue aproximadamente pH 8,3. Se
coloreó el gel usando Azul Brillante de Coomasie R250 al 10%
(Bio-RAD), se disolvió en una solución de Etanol al
40% (Merck), Ácido Acético al 10% (Merck) y agua destilada al 50%,
se calentó esta solución en un microondas durante 45 segundos, a
continuación se tiñeron los geles durante 15 minutos en un sacudidor
rotatorio. Se destiñeron los geles con una solución de Etanol al
10% (Merck), Ácido Acético al 7,5% (Merck) y agua destilada al
82,5%. En el caso de la determinación del peso molecular se usaron
marcadores preteñidos MMARK 12 (Novex)
Se hibridaron geles de Novex Tricine usando medio
de transferencia trans-blot sobre el módulo de
transferencia de hibridación western (Novex) de acuerdo con el
protocolo del suministrador. Tras las hibridaciones se bloqueó la
membrana con leche desnatada al 5% en NaCl 150 mM, Tris/HCl 50 mM
pH 7,4 y más tarde se incubó en leche desnatada a 1% en NaCl 150
mM, Tris/HCl 50 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,4 y un antisuero
monoclonal frente a los péptidos anticongelantes de babosa vivípara
americana. Se obtuvieron dos anticuerpos diferentes (obsequio de M.
MM Gani, Unilever Research, Colworth House Laboratory), uno para la
determinación de los grupos S y el otro para la determinación del
grupo Q. La incubación se llevó a cabo durante la noche a
temperatura ambiente bajo agitación suave. Se eliminaron los
anticuerpos no adsorbidos mediante lavado con el tampón de
incubación (3 x 5 min). Se incubó la membrana con el segundo
anticuerpo (anti cabra - IgG de ratón (H + L), Alkaline Phosphatase
Conjugate; BioRoad, Richmond) durante 2 horas a temperatura
ambiente. Se desarrolló el enzima usando BCIP/NBT (Biorad).
Para la digestión con tripsina se disolvió la
muestra en tampón de NH_{4}HCO_{3} 0,1 M pH 8,3. Se añadió
tripsina (TPCK tratada, Worthington, Millipore Corporation) en una
relación enzima : sustrato de 1:100. Tras 30 minutos se verificó el
pH y se añadió una vez más la misma cantidad de tripsina. Se llevó
a cabo la incubación durante la noche a 37ºC. se paró la digestión
mediante la adición de TFA para dar como resultado un valor de pH de
pH 2. Se separaron los péptidos por medio de RP-HPLC
sobre el sistema SMART (Pharmacia)
Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de
aminoácidos N-terminal sobre un LF 3000 Protein
Sequencer (Beckman) de acuerdo con el protocolo de los
suministradores. Se analizaron los derivados PTH de los aminoácido
sobre un sistema RP-HPLC automatizado, el sistema
Gold (Beckman)
Se hidrolizaron las muestras de
AFP-III en HCl 6 M que contenía Fenol al 1% bajo
vacío a 110ºC durante 24 horas y a continuación se secaron. Los
análisis se llevaron a cabo sobre un analizador de aminoácidos
Alpha plus de la serie 2 (Pharmacia Biotech) usando el protocolo de
los suministradores.
Las muestras que se iban a ensayar para la
actividad de los AFP-III se mezclaron con sacarosa
en polvo para dar un 30% en volumen de solución de sacarosa. Una
proporción de esta solución se colocó sobre el porta de un
microscopio, se recubrió con un cubre para evitar la evaporación y
se ajustó en una etapa de frío Linkam THMS, se conectó con un
sistema de enfriamiento Linkam CS 196 y se controló mediante un
controlador Linkam TMS 91. Se enfrió por crash esta solución a -40ºC
(\delta 99ºC/min.) y se calentó a continuación a -6ºC. Se examinó
el crecimiento de los cristales de hielo microscópicamente durante
el transcurso de los 30 minutos de incubación a -6ºC.
Para el ensayo de los péptidos purificados
mediante HPLC, se secaron las muestras de la columna de
RP-HPLC que contenían isoformas de
AFP-III en un Speed Vac Concentrator (Savant) tras
una etapa de rehidratación en agua Milli Q. Tras la segunda etapa
de secado se solubilizaron las muestras en 100 \mul de agua Milli
Q y se verificó el pH para tener la seguridad que se habían
eliminado todos los TFA del sistema tampón de la
RP-HPLC. Se diluyeron las muestras hasta un valor de
absorbancia de 0,700 a \lambda = 214 nm, esto es equivalente
aproximadamente a 0,1 \mug/ml de solución de
AFP-III de pescado. Para tener la seguridad que las
muestran contienen una cantidad igual de AFP-III,
se verificó posteriormente mediante el análisis de los aminoácidos.
Cuando se purificaron las muestras, se usaron isoformas de
AFP-III, se verificó su pureza mediante el análisis
de la secuencia de aminoácido N-terminal.
Procedimiento de inoculación: se hizo crecer un
cultivo del transformante apropiado en 25 ml de medio mínimo y se
cultivó durante la noche a 30ºC y 300 rpm. El cultivo se transfirió
posteriormente a un matraz de 1000 ml con agitación que contenía
500 ml de YP que contenía glucosa al 2% y se cultivó durante la
noche a 30ºC y 300 rpm. Se usó este cultivo como inóculo para el
experimento de alimentación discontinua.
Se usó el siguiente medio discontinuo: 110 g de
glucosa. 1 H_{2}O compuesto hasta 500 g con agua desmineralizada.
25 g de Trusoy, 50 g de extracto de levadura (Ohly), 10,5 g de
K_{2}HPO_{4}, 5 ml 1000 x solución de vitamina Egli, 50 ml 100 x
trazador de metales Egli (Egli, 1980), 0,25 g de
L-Histidina-HCl (Sigma), 3 g de
MgSO_{4}, 2 g de antiespumante hasta 4500 g con agua
desmineralizada. Se esterilizó térmicamente la solución de glucosa
y la solución de vitamina se esterilizó mediante filtración de
manera separada. Todos los demás componentes se esterilizaron
térmicamente en el fermentador. Se reguló la temperatura a 30ºC y el
pH hasta un valor de 5,0. Se inoculó el fermentador y se cultivaron
las células en un caudal de aire de 2 l/min y a una velocidad de
agitación de 600 rpm. Tras 18 horas se comenzó la fase de
alimentación.
Se usó el siguiente medio de alimentación: 1100 g
de glucosa.1 H_{2}O compuesto hasta 1750 g con agua
desmineralizada. 62,5 g de extracto de levadura (Ohly), 30 g de
K_{2}HPO_{4}, 5 ml 1000 x solución de vitamina Egli, 50 ml 100 x
trazador de metales Egli (Egli, 1980), 6,25 g de
L-Histidina.HCl (Sigma), 6,25 g de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g de antiespumante hasta 850 g con agua
desmineralizada.
Se reguló la bomba del alimento hasta un valor RQ
constante (relación de moles de CO_{2} producidos y moles de
O_{2} consumidos) de 1,05, basándose en la herramientas de
software tal como ha descrito Keulers (1993). Se cosechó el cultivo
tras 37 horas.
Se construyó una secuencia de nucleótido que
codificaba el péptido anticongelante HPLC I, optimizado para la
expresión en Saccharomyces cerevisiae como sigue: se
sintetizó una serie de 12 oligonucleótidos (invafp1, invafp2,
invafp3, invafp4, invafp5, invafp6, invafp7, invafp8, invafp9,
invafp10, invafp11 e invafp12), que comprendía principalmente la
secuencia de ADN del AFP maduro expresado en codones de S.
cerevisiae usados de manera preferencial. Se diseñó el gen
sintético para contener regiones de filamentos únicos 5'
compatibles con PstI y HindIII que generaron extremos
pegajosos (Fig. 2)
Para el montaje del gen de AFP sintético, se
disolvieron 50 pmol de cada uno de los oligonucleótidos en 12
\mul de agua, se incubaron durante 2 min. a 95ºC, y se colocaron
directamente sobre el hielo. Tras esta etapa de desnaturalización,
se fosforilaron los oligonucleótidos en un volumen final de 20
\mul, que contenían 2,5 mM de ATP, 5 mM de DDT y aproximadamente
10 U de polinucleótido quinasa, durante 40 min. a 37ºC, seguido por
2 min de desnaturalización a 95ºC y colocación sobre hielo. Se
mezclaron 10 \mul de cada oligonucleótido fosforilado con su ADN
de oligonucleótido más complementario para obtener una formación
dúplex. Tras 2 min de incubación a 95ºC para la desnaturalización
se enfrió lentamente cada dúplex a 30ºC. De nuevo se vertieron 10
\mul de todas las seis mezclas dúplex y se incubaron en un
volumen final de 100 \mul, que contenía Tris/HCl 50 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 8 mM, DTT 8 mM, y 40 \mug/ml de gelatina y 10 U de ADN
ligasa, durante dos horas a 20ºC. A continuación se precipitó la
mezcla de ligamiento, y se redisolvió en 30 \mul de tampón TE. Se
colocaron 15 \mul de la mezcla sobre un gel de agarosa al 2% y se
extrajo del gel la banda de ADN del tamaño esperado (aproximadamente
224 pares de bases) y finalmente se purificó mediante el
procedimiento Gene Clean II, como recomendaba el suministrador.
A continuación se ligó el fragmento de ADN
obtenido en el vector pTZ19R linealizado PstI/Hindi
(Pharmacia) y se transformo en la E. coli JM 109 mediante
procedimientos normalizados. Se aisló el ADN del plásmido de
diversos transformantes mediante el procedimiento de mini
preparación de lisis alcalina ligeramente modificado y se analizó
mediante análisis de restricción con diversos enzimas. Se confirmó
la secuencia del contenido inserto en cada uno de los plásmidos
mediante el dideoxi secuenciamiento de Sanger del plásmido de
filamento doble (Sanger y col., 1977). Este constructo
intermedio, que contenía la región de codificación del casete de
AFP-III sintético se denominó pUR7700 (Fig. 3).
El gen de AFP-III sintético
llevado por pUR7700 no contiene ninguna información necesaria para
la expresión de este péptido en la levadura. Para obtener la
expresión y secreción de este gen, deberán fabricarse los
constructos que contienen las fusiones translacionales del gen de
AFP-III con una secuencia señal de secreción
adecuada y estas secuencias de fusión se producen bajo el control
de un promotor del gen de la levadura.
Las secuencias señal de secreción adecuadas se
pueden seleccionar a partir de una variedad de genes que codifican
proteínas secretadas de manera eficiente por la levadura. Por
ejemplo, la invertasa codificada por SUC2 o el factor de
acoplamiento \alpha codificado por MF\alpha1 y
MF\alpha2. Para obtener una fusión adecuada con la
secuencia señal de la invertasa, se generó un fragmento PCR que
contenía la secuencia señal de la invertasa, parte del promotor
GAL7 y un enzima de restricción adecuado localizado para
asegurar un marco de fusión de la secuencia señal de la invertasa
con el gen de AFP-III sintético.
Para obtener este fragmento se diseñó un cebador
de PCR, invafp14, con la siguiente secuencia
Este cebador se usó como el cebador 3' en una
reacción PCR en combinación con el cebador PG7 05 AF 5' (Verbakel,
1991) que híbrida con la secuencia encontrada en el promotor
GAL7. Usando el ADN del plásmido pUR2778 como molde (Fig. 4,
van Gorcom y col., 1991) la reacción generó un fragmento 243
bp aproximadamente. Este fragmento se eluyó a partir de un gel de
agarosa y se purificó mediante el procedimiento Gene Clean de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento
purificado se digirió posteriormente con SacI y BamHI
y el fragmento de aproximadamente 88 bp resultante se ligó en los
emplazamientos apropiados del plásmido pTZ19R. La mezcla de
ligamiento se introdujo en la E. coli JM109 mediante
transformación y se aisló el ADN del plásmido a partir de un
transformante y se secuenció para confirmar la identidad del
inserto clonado. Este plásmido se designó pUR7701 (Fig. 5).
Para obtener un marco de fusión de la secuencia
señal de la invertasa con el gen de AFP-III
sintético pUR7701 se digirió con NheI y Hindi y se aisló el
fragmento de aproximadamente 196 bp y se ligó con el fragmento de
aproximadamente 2911 bp formado por digestión de pUR7701 con
NheI y Hindi. El plásmido resultante se nombró
pUR7702 (Fig. 6).
De una manera similar, un fragmento PCR que
contenía el factor de acoplamiento \alpha generó la secuencia
señal pre-pro usando el cebador MF\alphaAFPIII
como cebador 3':
Se generó un fragmento PCR que contenía parte del
promotor GAL7 y toda la secuencia que codifica el factor de
acoplamiento \alpha pre-pro a partir de un molde
de ADN de pUR2660 (Documento WO 94/03617) usando MF\alphaAFPIII y
PG7 05 AF como cebadores. PUR2660 contiene la secuencia del factor
de acoplamiento \alpha pre-pro bajo el control
del promotor GAL7. El fragmento resultante de
aproximadamente 462 bp se purificó tal como se ha descrito
anteriormente y se digirió con SacI y NheI. El
fragmento de aproximadamente 292 bp obtenido de tal manera se ligó
en el fragmento de aproximadamente 3025 bp obtenido mediante
digestión de pUR7702 con SacI y NheI. Se secuenció el
ADN del plásmido de diversos transformantes de E. coli JM109
obtenidos de este ligamiento para confirmar que se había clonado el
fragmento correcto. Uno de estos plásmidos se designó pUR7703 (Fig.
7).
Se introdujeron los plásmidos del constructo
capaces de expresar las fusiones de la secuencia señal del gen
sintético del casete de AFP-III en levadura en una
variedad de vectores de expresión de la levadura como sigue:
El fragmento SacI/HindIII de
aproximadamente 278 bp de pUR7702 y el fragmento SacI/HindIII de
aproximadamente 488 bp de pUR7703, que transportan la invertasa y
el factor de acoplamiento \alpha y se fusionan de manera
respectiva con los AFP-III, se clonaron de manera
independiente usando técnicas normalizadas en los vectores de
expresión también digeridos con SacI y HindIII. Estos
vectores de expresión transportan el promotor de S.
cerevisiae de tal manera que la inserción de los genes en el
emplazamiento SacI permite la transcripción dirigida de
GAL7 de los genes insertados.
Se fabricó pUR7704 (Fig. 8) mediante inserción de
la casete de AFP-III de la secuencia señal de la
invertasa a partir de pUR7702 en el vector de integración del ADN
ribosómico multicopia pUR2778 y PUR7706 (Fig 9) es pUR2778 que
contenía el factor de acoplamiento \alpha de la casete de
AFP-III, derivada de pUR7703, insertada entre los
emplazamientos SacI y HindIII.
Los plásmidos pUR7704 y pUR7706 se linealizaron
por digestión con HpaI cuyo objetivo es la integración de los
plásmidos en la región del ADNr de la levadura, a continuación se
introducen de forma independiente en la cepa SU50 de S.
cerevisiae mediante electroporación. Se seleccionaron los
transformantes por su capacidad para crecer en ausencia de leucina.
Para conseguir la expresión de los genes AFP-III
clonados, los transformantes que llevan pUR7704 o pUR7706 se
hicieron crecer en primer lugar durante 40 horas en medio mínimo
líquido a 30ºC, a continuación se diluyó a 1:10 en medio de
inducción recientemente preparado (extracto de levadura al 1%,
peptona Difco al 2%, galactosa al 5%), y se incubó a 30ºC durante
48 horas más. Al final de este período se ensayaron muestras del
sobrenadante del cultivo respecto de su capacidad para inhibir el
crecimiento de cristales de hielo.
Se examinó al microscopio el crecimiento de los
cristales de hielo a lo largo de una incubación de 30 minutos a
-6ºC. Se pudo demostrar claramente que las muestras de sobrenadante
derivadas de levaduras que llevan el gen sintético
AFP-III tuvieron un efecto inhibitorio sobre el
crecimiento de cristales de hielo cuando se compararon con muestras
de control similares preparadas a partir de sobrenadantes de
levaduras no transformadas o levaduras que transportan el vector de
expresión pero que carecen del gen sintético
AFP-III. Sin embargo, la actividad inhibitoria de
recristalización del material producido por la levadura fue
significativamente inferior al de una cantidad equivalente de una
preparación de AFP de pescado.
Para un análisis posterior del péptido
anticongelante producido se centrifugaron durante 5 min a 4000 rpm
muestras de 10 ml procedentes del cultivo inducido de los
transformante pUR7704 y pUR7706. Las células y sobrenadantes se
recogieron y se almacenaron a -20ºC. Se usó electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS desnaturalizante para separar las proteínas y se
detectó el AFP mediante hibridaciones de Western usando un
anticuerpo monoclonal anti AFP específico.
La presencia de una banda con un peso molecular
aparente de 6,5 kD en la muestras de sobrenadante procedente del
transformante de levadura que transporta pUR7704 y pUR7706 muestra
claramente que estos transformantes son capaces de producir AFP-
III. Se purificó el péptido mediante HPLC en fase reversa, y se
determinó la secuencia del N terminal. Esta secuencia demostró que
el péptido HPLC-1 se procesó y secretó
correctamente por la levadura.
Se purificaron las isoformas de
AFP-III usando un procedimiento en dos etapas. En
primer lugar se cargó la muestra sobre una columna Mono S de
intercambio catiónico y se eluyó usando el gradiente descrito. En
la Fig. 10 se muestra el modelo de elusión. Se aislaron un pico no
retardado (el pico Q) y cuatro picos eluídos (S1 a S4) a partir de
la columna. S1 representa la proteína con la capacidad de enlace más
baja en la columna de intercambio catiónico Mono S bajo estas
condiciones y S4 contiene la proteína con la capacidad de enlace
más alta en la columna. Los picos se recogieron y cargaron sobre
una columna RP-HPLC usando el gradiente descrito. En
la Fig. 11 se muestra el cromatograma del material total. Los picos
son de las isoformas de AFP-III y se numeran desde 1
a 12 de acuerdo con su comportamiento sobre esta columna usando las
condiciones especificadas. Todas las isoformas de
AFP-III eluyen entre 25 y 45 minutos. En las Fig.
12 a 16 se muestran los cromatogramas de la RP-HPLC
de las fracciones Q y S1 a S4. Cada fracción da como resultado
diferentes isoformas de AFP-III y cada isoforma AFP
contenida en cada pico se resume en la tabla 2.Se ensayaron las
fracciones recogidas a partir de las columnas Mono S y
RP-HPLC con antisuero
anti-AFP-III de ratón y todas las
isoformas de S1 a S4 dieron una reacción positiva al antisuero de
tipo S,, la isoforma 12 del grupo Q reaccionó positivamente a la del
antisuero de tipo Q. Se determinó la secuencia de aminoácidos
N-terminal de cinco de las isoformas (Tabla
3)El pico del AFP-III de tipo HPLC 7 se
contaminó con lisozima de pescado pero las otras secuencias de
aminoácidos identificadas se podrían relacionar con las secuencias
conocidas de las isoformas de AFP-III. Se ensayaron
cantidades iguales de las proteínas purificadas para la actividad
anticongelante.
Como se evidenció mediante el ensayo de
inhibición de la recristalización únicamente la isoforma de
HPLC-12 de AFP-III mostró actividad
anticongelante significativa. Para confirmar este hallazgo se
reconstituyeron las isoformas de los AFP-III de la
babosa vivípara americana en presencia y ausencia de la isoforma de
HPLC-12. La preparación del péptido completamente
reconstituido mantuvo la actividad de la preparación del pescado
crudo mientras que la preparación que carece de la isoforma de
HPLC-12 mostró una actividad anticongelante muy
reducida como se evidenció mediante el ensayo de
recristalización.
Usando una digestión tríptica de la isoforma 12
se determinó la secuencia total de aminoácidos de esta isoforma. Se
encontró que la secuencia era idéntica a la descrita en la
bibliografía. (Davies y Chow, 1990).
Se construyó como sigue una secuencia de
nucleótido que codifica el péptido anticongelante
HPLC-12 enlazado con la secuencia señal de invertasa
y con el uso del códon optimizado para la expresión en
Saccharomyces cerevisiae. Se sintetizó un conjunto de 15
oligonucleótidos (HPLC12.1, HPLC12.2, HPLC12.3, HPLC12.4, HPLC12.5,
HPLC12.6, HPLC12.7, HPLC12.8, HPLC12.9, HPLC12.10, HPLC12.11,
HPLC12.12, HPLC12.13, HPLC12, 14 y HPLC12.15), comprendiendo
principalmente la secuencia de ADN del AFP maduro expresado en
codones de S. cerevisiae usados de manera preferencial. Se
diseñó el gen sintético para contener regiones filamentosas únicas
compatibles con SacI y HindIII que generaron extremos
pegajosos. (Fig. 17).
Para el ensamblaje del gen
HPLC-12 sintético, se disolvieron 50 pmol de cada
uno de los oligonucleótidos en 12 \mul de agua, se incubaron
durante 2 min. a 95ºC, y se colocaron directamente sobre hielo.
Tras esta etapa de desnaturalización, se fosforilaron los
oligonucleótidos en un volumen final de 20 \mul, que contenía 2,5
mM de ATP, 5 mM de DDT y aproximadamente 10 U de polinucleótido
quinasa, durante 40 min. a 37ºC, seguido por 2 min de
desnaturalización a 95ºC y colocación sobre hielo. Se mezclaron 10
\mul de cada oligonucleótido fosforilado con su oligonucleótido
de ADN más complementario para obtener la formación dúplex. Tras 2
min de incubación a 95ºC para la desnaturalización, se enfrió
lentamente cada dúplex a 30ºC. De nuevo, se vertieron 10 \mul de
todas las mezclas dúplex y se incubaron en un volumen final de 100
\mul, que contenía 50 mM de Tris/HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl_{2}, 8
mM de DTTY, y 40 \mug/ml de gelatina y 10 U de ADN ligasa, durante
dos horas a 20ºC. A continuación se precipitó la mezcla de
ligamiento, y se redisolvió en 30 \mul de tampón TE, y se extrajo
del gel la banda de ADN del tamaño esperado (aproximadamente 291
pares de bases) y se purificó finalmente mediante el procedimiento
Gene Clean II, como recomendaba el
suministrador.
suministrador.
Se ligó el fragmento con un fragmento vector
derivado del vector de integración multicopia pUR2778 mediante
digestión con SacI y HindIII. Se confirmó la
secuencia del inserto y el plásmido resultante se nombró pUR7718
(Fig. 18).
Se linealizó el plásmido pUR7718 mediante
digestión con HpaI cuyos objetivos son la integración del plásmido
en la región del ADNr de la levadura, y a continuación se introdujo
posteriormente en la cepa SU50 de S. cerevisiae mediante
electroporación. Se seleccionaron los transformantes resultante
mediante su capacidad para crecer en ausencia de leucina.
Para conseguir la expresión del gen
HPLC-12 clonado, los transformante que transportaban
pUR7718 se hicieron crecer en primer lugar durante 40 horas en
medio líquido animal a 30ºC y a continuación se diluyeron
posteriormente 1:10 en un medio de inducción preparado de nuevo
(extracto de levadura al 1%, peptona Difco al 2%, galactosa al 5%)
y se incubaron a 30ºC durante 48 horas más. Al final de este periodo
se ensayaron las muestras del cultivo sobrenadante para su capacidad
de inhibir el crecimiento de los cristales de hielo.
Los resultados (ensayo de recristalización)
muestran claramente que los sobrenadantes del cultivo tenían
niveles altos de actividad anticongelante. La comparación de estos
resultados con aquellos obtenidos para la expresión de la variante
de HPLC-1 de la levadura mostraron que el
sobrenadante procedente del transformante que producía el nivel más
bajo de actividad anticongelante del HPLC-12 excedía
al del mejor transformante de HPLC-1
Se llevó a cabo una fermentación con alimentación
discontinua con un transformante SU50 que transportaba pUR7718. al
final de la fase de alimentación se cosecharon las células mediante
centrifugación en una centrífuga Jouan LR 5.22 usando cubetas de 1
l, durante 30 min a 4650 rpm (7200 g). Se ensayó el sobrenadante
para la actividad anticongelante mediante el ensayo de inhibición de
la recristalización del hielo. El sobrenadante sin diluir evita con
claridad el crecimiento del cristal, lo que demuestra la presencia
de niveles altos de péptido anticongelante activo en el sobrenadante
del cultivo.
Una técnica hibridación western del sobrenadante
procedente de esta fermentación mostró que se secretó material de
AFPIII-HPLC12. El peso molecular aparente del HPLC12
producido de levadura fue equivalente al del HPLC12 producido de
pescado. La purificación y el secuenciamiento de aminoácidos del
péptido producido de levadura confirmaron que este material era
indistinguible del péptido HPLC12 producido por la babosa vivípara
americana.
\newpage
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Figura 1. Isoformas de AFP de tipo III. Las
regiones encuadradas representan regiones de identidad y los
aminoácidos sombreados son aquellos identificados como importantes
para las propiedades anticongelantes de los péptidos.
Figura 2. Gen sintético que codifica el AFP de
tipo III de tipo HPLC1.
Figura 3. Representación esquemática de la
construcción de pUR7700, un plásmido que transporta el gen
AFP-III sintético.
Figura 4. Mapa de restricción del vector pUR2778
de expresión de la levadura.
Figura 5. Representación esquemática de la
construcción de pUR7701, un plásmido que transporta la secuencia
señal de la invertasa.
Figura 6. Representación esquemática de la
construcción de pUR7702, un plásmido que transporta el gen
AFP-III sintético ligado en marco con la secuencia
señal de la invertasa.
Figura 7. Representación esquemática de la
construcción de pUR7703, un plásmido que transporta el gen
AFP-III sintético fusionado en marco con el factor
de acoplamiento pre-pro de la secuencia señal de
secreción.
Figura 8. Representación esquemática de la
construcción del plásmido pUR7704, un vector de integración del ADNr
multicopia que transporta el gen AFP-III sintético
ligado en marco con la secuencia señal de la invertasa.
Figura 9. Representación esquemática de la
construcción del plásmido pUR7706, un vector de integración del ADNr
multicopia que transporta el gen AFP-III sintético
ligado en marco con la secuencia señal del factor de acoplamiento
pre-pro.
Figura 10. Modelo de elución de los péptidos
anticongelantes de la babosa vivípara americana a partir de una
columna Mono S.
Figura 11. Cromatograma de péptidos
anticongelantes separados mediante HPLC en fase reversa.
Figura 12. Cromatograma de péptidos
anticongelantes Mono S S1 separados mediante HPLC en fase
reversa.
Figura 13. Cromatograma de péptidos
anticongelantes Mono S S2 separados mediante HPLC en fase
reversa.
Figura 14. Cromatograma de péptidos
anticongelantes Mono S S3 separados mediante HPLC en fase
reversa.
Figura 15. Cromatograma de péptidos
anticongelante Mono S S4 separados mediante HPLC en fase
reversa.
Figura 16. Cromatograma de péptidos
anticongelantes Mono S S1 separados mediante HPLC en fase
reversa.
Figura 17. Gen sintético que codifica la proteína
de fusión de la secuencia señal de la invertasa del AFP HPLC12 de
tipo III.
Figura 18. representación esquemática del
plásmido pUR7718
| Nombre del plásmido | Características relevantes |
| pUR7700 | pTZ19 que transporta el gen sintético HPLC-1 |
| pUR7701 | pTZ19 que transporta la secuencia señal de la invertasa |
| pUR7702 | pTZ19 que transporta el gen de fusión HPLC-1 de la secuencia señal de la invertasa |
| pUR7703 | pTZ19 el gen de fusión HPLC1 de la secuencia señal del factor de acoplamiento \alpha |
| pUR7704 | Vector de expresión de la levadura que transporta el gen de fusión HPLC-1 de la |
| secuencia señal de la invertasa | |
| pUR7706 | Vector de expresión de la levadura que transporta el gen de fusión HPLC-1 de la |
| secuencia señal del factor de acoplamiento \alpha | |
| pUR7718 | Vector de expresión de la levadura que transporta el gen de fusión HPLC-12 de la |
| secuencia señal de la invertasa |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Fracción Mono S | Isoforma 3 de AFP |
| Q | 12 |
| S1 | 4 |
| 5 | |
| 6 | |
| S2 | 1 |
| 2 | |
| 3 | |
| 11 | |
| S3 | 7 |
| S4 | 7 |
| 9 |
\newpage
Lisozima de babosa vivípara americana, el péptido
se denominaba hasta ahora como AFP 3 isoforma 7:
\hskip0.5cm
Isoforma número 9:
\hskip0.5cm
Isoforma número 12:
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido nº 1
Término N 1-23
\hskip0.5cm
Péptido nº 2: 24 a 39
\hskip0.5cm
Péptido nº 3; 40 a 47
\hskip0.5cm
Péptido nº 4: 48 a 61
\hskip0.5cm
Péptido nº 5: 62 a 66
\hskip0.5cm
Claims (16)
1. Un producto alimenticio que comprende un
polipéptido que tiene (i) la secuencia de aminoácidos del AFP
HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1 o
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene más del 80% de homología
con la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC12 de tipo III que se
muestra en la Figura 1, siempre que el péptido presente una
actividad de inhibición de la recristalización del hielo al menos de
un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC12
de tipo III que se muestra en la Figura 1, no siendo el producto
alimenticio un organismo comestible que comprende de manera natural
el mencionado polipéptido en la mencionada forma o cantidad.
2. Un producto alimenticio que comprende un
polipéptido que tiene (i) la secuencia de aminoácidos del AFP
HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1 o
(ii) una secuencia de aminoácidos que difiere por uno o dos
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC12 de tipo
III que se muestra en la Figura 1, siempre que el polipéptido
presente la misma actividad de inhibición de la recristalización del
hielo de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura
1, no siendo el producto alimenticio un organismo comestible que
comprende de manera natural el mencionado polipéptido en la
mencionada forma o cantidad.
3. Un producto alimenticio de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el polipéptido es
recombinante.
4. Un producto alimenticio de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una cepa de
levadura que secreta el polipéptido en el producto alimenticio.
5. Un producto alimenticio de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es un producto
alimenticio congelado.
6. Un producto alimenticio de acuerdo con la
reivindicación 5 que es un helado.
7. Un producto alimenticio de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es una masa congelada o
un producto de panadería congelado.
8. El uso de un polipéptido que tiene (i) la
secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III
que se muestra en la Figura 1; o (ii) una secuencia de aminoácidos
que tiene más del 80% de homología con la secuencia de aminoácidos
del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la
Figura 1, siempre que el polipéptido presente una actividad de
inhibición de recristalización del hielo al menos de un polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos del AFP
HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura
1;
como un aditivo para evitar o inhibir la
recristalización del hielo en un producto alimenticio o un material
biológico.
9. El uso de un polipéptido que tiene (i) la
secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III
que se muestra en la Figura 1; o (ii) una secuencia de aminoácidos
que difiere por uno o dos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la
Figura 1, siempre que el polipéptido presente la misma actividad de
inhibición de recristalización del hielo de un polipéptido que tiene
la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo
III que se muestra en la Figura 1;
como un aditivo para evitar o inhibir la
recristalización del hielo en un producto alimenticio o un material
biológico.
10. Un procedimiento para producir un producto
alimenticio cuyo procedimiento comprende producir un polipéptido AFP
HPLC12 de tipo III mediante un procedimiento que comprende:
(1) proporcionar una levadura que comprende un
constructo de ADN que no está presente en la levadura nativa,
comprendiendo el constructo de ADN en el siguiente orden:
- (a)
- un promotor activo fuerte en la levadura,
- (b)
- un códon de inicio ATG; y
- (c)
- al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AFP HPLC-12 de tipo III que tiene (i) la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene más del 80% de homología con la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, siempre que un polipéptido que tiene la mencionada secuencia de aminoácidos presente una actividad de inhibición de la recristalización del hielo al menos de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1,
estando la mencionada secuencia de ácido nucleico
en marco de lectura con el códon de inicio ATG;
(2) cultivar la levadura bajo condiciones por las
cuales se produce o se induce la expresión del polipéptido
codificado por la secuencia de ácido nucleico; y de manera
opcional
(3) recoger el polipéptido AFP
HPLC-12 de tipo III expresado a partir de la
secuencia de ácido nucleico; y
añadir el polipéptido a un producto
alimenticio.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que el constructo de ADN comprende una
secuencia señal para permitir a la levadura la secreción del
polipéptido AFP HPLC-12 de tipo III por la levadura
durante el cultivo de la levadura.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11 en el que el códon de inicio ATG está presente en
la secuencia señal, cuya secuencia señal es homóloga o heteróloga
con la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP
HPLC-12 de tipo III y está en marco de lectura con
el códon de inicio ATG.
13. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la levadura es
S. cerevisiae.
14. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el que la secuencia
señal se selecciona a partir de la presecuencia del factor de
acoplamiento \alpha de S. cerevisiae y de la secuencia
señal de la invertasa de S. cerevisiae.
15. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en el que el promotor es
un promotor GAL7 inducible o un promotor GAPDH constitutivo de S.
cerevisiae.
16. Un procedimiento para producir un producto
alimenticio que comprende un polipéptido AFP HPLC-12
de tipo III cuyo procedimiento comprende:
(1) proporcionar una levadura que comprende un
constructo de ADN que no está presente en la levadura nativa,
comprendiendo el constructo de ADN en el siguiente orden:
- (a)
- un promotor activo fuerte en la levadura,
- (b)
- un códon de inicio ATG; y
- (c)
- al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AFP HPLC-12 de tipo III que tiene (i) la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene más del 80% de homología con la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, siempre que un polipéptido que comprende la mencionada secuencia de aminoácidos presente una actividad de inhibición de la recristalización del hielo al menos de la de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del AFP HPLC-12 de tipo III que se muestra en la Figura 1,
estando la mencionada secuencia de ácido nucleico
en marco de lectura con el códon de inicio ATG; y
(2) cultivar la levadura bajo condiciones por las
cuales se produce o se induce la expresión del polipéptido
codificado por la secuencia de ácido nucleico;
en la que la levadura está presente en el
producto alimenticio y segrega el polipéptido en el producto
alimenticio.
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