JP2004043484A - 食品級生物における海洋魚不凍ペプチドの発現及び食品におけるその適用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して性質を改善する製品改善用製品添加剤としての、III型AFP HPLC12に実質的に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質の使用であって、同量のニシナメタガレイAFPで得られるよりも高い特異改変活性、特に不凍活性を得るように不凍ペプチドにそれ自体公知の方法で実施することを特徴とする前記使用。
【選択図】なし
Description
極地魚類の血液は不凍ペプチド(又は、抗凍結ペプチドとも言う)の存在により凍結から保護されている。これらの不凍ペプチドはその構造により4種類に分類することができる(DaviesとHew,1990)。I型AFPはアラニン含量が高く、トレオニンとアスパラギン残基が等間隔で分配されており、α螺旋構造をもつ。II型AFPは特徴的な高い(8%)システイン含量をもつ。III型AFPは小さい(約64アミノ酸長)球状ペプチドである。最後のグループである不凍糖タンパク質は、特定二糖が結合した反復トリペプチドモチーフをもつ。これらの全ペプチドは共通して非束一性凝固点降下及び氷晶成長抑制性をもつ。これらの特徴は冷凍品の氷晶状態を改変するのに利用できると考えられる。魚類の血液からこれらのペプチドを精製するのは経済的に決して有効な方法とは思われないので、最新バイオテクノロジーを利用してAFPを大量生産する方法が求められている。
(a)宿主生物で活性な強力で場合により誘導性のプロモーターと、
(b)下記(c)のAFPコーディング核酸配列の発現中に宿主生物により生産されるタンパク質を分泌することが可能な任意DNAシグナル配列中に存在していてもよいATG開始コドン(その場合にはシグナル配列はAFPコーディング核酸配列と同種でも異種でもよく、ATG開始コドンと同一読み枠に配置される)と、
(c)III型AFPタンパク質HPLC−12のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードし、ATG開始コドンと同一読み枠に配置された少なくとも1種の核酸配列と、場合により、
(d)AFPコーディング核酸配列の3’末端に結合した停止コドン
をこの順序で含む。
1)天然宿主生物には存在せず且つ
(a)宿主生物で活性な強力で場合により誘導性のプロモーターと、
(b)下記(c)のAFPコーディング核酸配列の発現中に宿主生物により生産されるタンパク質を分泌することが可能な任意DNAシグナル配列中に存在していてもよいATG開始コドン(その場合にはシグナル配列はAFPコーディング核酸配列と同種でも異種でもよく、ATG開始コドンと同一読み枠に配置される)と、
(c)III型AFPタンパク質HPLC−12のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードし、ATG開始コドンと同一読み枠に配置された少なくとも1種の核酸配列と、場合により、
(d)AFPコーディング核酸配列の3’末端に結合した停止コドン
をこの順序で含むDNA構築物に含まれる少なくとも1種のAFPコーディング核酸配列の発現を生じるか又は誘導するような条件下で食品級宿主生物を培養することを特徴とする。
2.材料と方法
2.1 菌株と増殖条件
プラスミドの増幅には大腸菌株JM109(endA1,recA1,syrA96,thi,hsdR17,rk−,mk+ relA1 supE44,Yanisch−Perronら,1985)を用いた。多重コピー組み込みプラスミドの形質転換にはS.cerevisiae株SU50(MATa,cir°,leu2,his4,can1; Verbakel,1991)を用いた。100μg/mlアンピシリンを含むルリア寒天プレートで大腸菌形質転換細胞を選択した(Sambrookら,1989)。必須アミノ酸(ヒスチジン20μg/ml、ウラシル20μg/ml)を補充した選択YNBプレート(アミノ酸を含まない0.67% Difco酵母窒素ベース、2%グルコース、2%寒天)で酵母株を保存した。同一液体培地を予備培養に使用し、30℃で48時間培養し、GAL7プロモーターを誘導するために5%ガラクトースを含むYP培地(1%Difco酵母エキス、2%Difcoペプトン)で1:10に希釈した。
AFP−IIIを含むプラスミドの詳細については表1に示す。
JM109の形質転換はChungら(1989)に従った。酵母株の形質転換は主にBeckerら(1991)により記載されているようにエレクトロポレーションにより実施した。形質転換細胞を選択YNBプレートで回収した。当業者は種々の形質転換方法を実施できることを理解し得る。どのような方法を使用するかは形質転換しようとする生物に依存し、Sambrookら(1989)やCampbellとDuffus(1988)等の種々の便覧に詳細に記載されている。
制限酵素とDNA修飾酵素は製造業者により推奨されているように適用した。
オーシャンパウト(Macrozoarces americanus)からのAFP−IIIはニューファンドランド島の近海で捕獲した魚の血液から精製した。AFP−IIIサンプルはHewら(1984)により記載されているように凝固した魚の血清の遠心分離により調製した。
カチオン交換クロマトグラフィーはSMARTシステム(Pharmacia Biotech)でMono Sカラム(HR5/5,Pharmacia Biotech)で実施した。サンプル緩衝液は10mM Na2HPO4/NaH2PO4(Merck)pH6.0とし、溶離は0→0.5M NaCl(Merck)直線勾配を100μl/分の流速で用いて実施した。μピークモニター(Pharmacia Biotech)を用いて214及び280nmでペプチドを検出した。システム温度を15℃に設定して一体型SMARTシステムフラクションコレクターを使用して214nmシグナルをモニターしながらフラクションを集めた。
SMARTシステム(Pharmacia Biotech)でμRPC C4/C18 SC2.1/10カラム(Pharmacia Biotech)を使用して逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)を実施した。Milli Q水中0.06%トリフルオロ酢酸(TFA,Merck)(溶媒A)中でサンプルをカラムに加え、Milli Q水中80%アセトニトリル(Merck)、0.054%TFA(溶媒B)を使用して溶離した。使用した標準勾配は、100μl/分の流速で0分100%溶媒A、5分100%溶媒A、10分65%溶媒A、50分40%溶媒A、55分0%溶媒A、57.5分0%溶媒A、58分100%溶媒Aにプログラムした。μピークモニター(Pharmacia Biotech)を用いて214、256及び280nmの3種の波長でペプチドを検出した。システム温度を20℃に設定して一体型SMARTシステムフラクションコレクターを使用して214nmシグナルをモニターしながらピークを集めた。
製造業者のプロトコルに従って16%ポリアクリルアミドTricineゲル(Novex)をXcell電気泳動セル(Novex)用いて泳動させた。サンプル緩衝液はNovex製品であり、3.0ml TRIS−HCl 3.0M,2.4mlグリセロール,0.8g SDS,1.5ml 0.1%クーマシーブルーG,0.5ml 0.1%フェノールレッド及び5%β−メルカプトエタノールから構成されるものを蒸留水で最終容量10mlに調整し、pH=8.45とした。移動用緩衝液もNovex製品であり、合計1リットルの蒸留水中に12.1g TRIS,17.9g Tricine及び1g SDSを含むものとし、pH値は約pH8.3とした。40%エタノール(Merck)、10%酢酸(Merck)及び50%蒸留水の溶液に溶かした10%クーマシーブリリアントブルーR250(Bio−Rad)を使用してゲルを着色し、この溶液をマイクロ波で45秒間加熱した後、ゲルを回転震盪器で15分間染色した。ゲルを10%エタノール(Merck)、7.5%酢酸(Merck)及び82.5%蒸留水の溶液で脱色した。分子量測定の場合には、MARK12予備染色マーカー(Novex)を用いた。
製造業者のプロトコルに従ってウェスタントランスファーブロットモジュール(Novex)でトランスブロットトランスファー培地(Bio−Rad)を使用してNovex Tricineゲルをブロットした。ブロッティング後、膜を150mM NaCl,50mM Tris/HCl(pH7.4)中5%脱脂粉乳でブロックした後、150mM NaCl,50mM Tris/HCl,0.1%Tween 20(pH7.4)及びオーシャンパント不凍ペプチドに対するモノクローナル抗血清中1%脱脂粉乳中でインキュベートした。S基の判定とQ基の判定に用いる2種の異なる抗体を入手した(M.M Gani,Unilever Research,Colworth House Laboratoryから寄贈)。温和に撹拌しながら室温で一晩インキュベートした。未吸着抗体をインキュベーション用緩衝液で洗浄して除去した(3×5分)。膜を二次抗体(ヤギ抗マウスIgG(H+L)、アルカリ性ホスファターゼ結合体、BioRad,Richmond)と共に室温で2時間インキュベートした。BCIP/NBT(BioRad)を使用して酵素を展開した。
トリプシン消化に備え、サンプルを0.1M NH4HCO3緩衝液(pH8.3)に溶かした。トリプシン(TPCK処理、Worthington,Millipore Corporation)を1:100の酵素:基質比で加えた。30分後にpHを調べ、同一量のトリプシンをもう一度加えた。37℃で一晩インキュベーションを行った。TFAを加えて消化を停止し、pH値をpH2にした。SMARTシステム(Pharmacia)でRP−HPLCによりペプチドを分離した。
製造業者のプロトコルに従ってLF 3000タンパク質シーケンサー(Beckman)でN末端アミノ酸配列分析を行った。自動RP−HPLCシステムであるシステムGold(Beckman)でアミノ酸のPTH誘導体を分析した。
1%フェノールを含む6M HCl中でAFP−IIIサンプルを110℃で減圧下に24時間加水分解した後、乾燥した。分析は製造業者のプロトコルを使用してアルファプラスシリーズ2アミノ酸分析器(Pharmacia Biotech)で実施した。
AFP−III活性を試験しようとするサンプルをスクロース粉末と混合し、30容量%スクロース溶液とした。この溶液の一部を顕微鏡スライドに載せ、蒸発しないようにカバースリップを被せてLinkam THMS冷却段に置き、冷却段をLinkam CS 196冷却システムに接続してLinkam TMS 91コントローラーにより制御した。この溶液を−40℃まで急冷(δ99℃/分)した後、−6℃まで加熱した。−6℃で30分間インキュベートする間に氷晶の成長を顕微鏡試験した。
接種手順:適当な形質転換細胞を25mlの最小培地で30℃で300rpmで一晩培養した。次に、2%グルコースを含むYP500mlを入れた1000ml容震盪フラスコに培養物を移し、30℃で300rpmで一晩培養した。この培養物を補給バッチ実験の接種材料として使用した。
Saccharomyces cerevisiae中で発現するように最適化されたHPLC I 抗凍結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下のように構築した:主として、優先的に用いられるS.cerevisiaeコドン中に発現した成熟AFPのDNA配列を含む12個からなる1セットのオリゴヌクレオチド(invafp1、invafp2、invafp3、invafp4、invafp5、invafp6、invafp7、invafp8、invafp9、invafp10、invafp11及びinvafp12)を合成した。該合成遺伝子は、PstI及びHindIIIにより産生された付着端に対して適合性の5′一本鎖領域を含むように設計した(図2)。
pUR7700によって運ばれる合成AFP−III遺伝子は、酵母中でこのペプチドを発現させるのに必要な情報を全く含んでいない。この遺伝子を発現・分泌させるためには、AFP−III遺伝子と適当な分泌シグナル配列との翻訳融合体を含む構築物を作って、これらの融合体の配列を酵母遺伝子プロモーターの制御下に置かなければならない。
標準法を用い、それぞれインベルターゼ及びα接合因子とAFP−IIIとの融合体を保有する、pUR7702の約278bpのSacI/HindIIIフラグメントとpUR7703の約488bpのSacI/HindIIIフラグメントとを別々に、SacI及びHindIIIで消化した酵母発現ベクターにクローン化した。これらの発現ベクターはどちらもS.cervisiae GAL7プロモーターを保有しているので、遺伝子をSacI部位に挿入すると、GAL7に誘導されて、挿入された遺伝子が形質転換され得る。
プラスミドpUR7704及びpUR7706を、酵母rDNA領域に組み込むためにHpaIで消化して線状化し、次いで電気泳動により別々にS.cerevisiae株SU50に導入した。形質転換体は、ロイシンの不在下に増殖する該形質転換体の能力に基づいて選択される。クローン化AFP−III遺伝子を発現させるために、先ず、pUR7704又はpUR7706を保有する形質転換体を液体最少培地中30℃で40時間増殖させ、次いで、新たに調製した誘導培地(酵母エキス1%、Difcoペプトン2%、ガラクトース5%)に1:10稀釈し、30℃でさらに48時間インキュベートした。その後、培養上清試料を氷の結晶の成長を阻害する該試料の能力についてテストした。
2段階手順を用いてAFP−III由来のイソ型を精製した。先ず、試料を陽イオン交換Mono Sカラムに装入し、記載勾配を用いて溶離した。溶離パターンを図10に示す。該カラムから1つの非遅延(non−retarded)ピーク(Qピーク)と4つの溶離ピーク(S1〜S4)を単離した。S1は、これらの条件下でのMono S陽イオン交換カラムに対する結合能が最も低いタンパク質を表し、S4は、該カラムに対する結合能が最も高いタンパク質を含む。ピークを収集し、記載勾配を用いるRP−HPLCカラムに装入した。全物質からのクロマトグラムを図11に示す。ピークはAFP−IIIのイソ型であり、特定条件を用いたこのカラム上での挙動に従って1から12までの番号が付されている。AFP−IIIのイソ型は全て25〜45分の間に溶離する。Q及びS1〜S4分画のRP−HPLCクロマトグラムを図12〜図16に示す。分画はそれぞれ異なるAFP−IIIイソ型を生成するが、どのAFPイソ型がどのピークに含まれていたかを表2に要約する。Mono Sカラム及びRP−HPLCカラムから収集した分画をマウス抗AFP−III抗血清を用いてテストしたが、S1からS4までの全てのイソ型はS型抗血清に対して陽性の反応を示し、Qグループからのイソ型12はQ型抗血清に対して陽性の反応を示した。5種のイソ型からN末端アミノ酸配列を決定した(表3)。AFP−IIIHPLC7のピークは魚リゾチームで汚染されていたが、同定された他のアミノ酸配列はAFP−IIIイソ型の既知配列と関連付けることができた。等量の精製タンパク質を抗凍結活性についてテストした。
以下のように、インベルターゼシグナル配列に結合し且つSaccharomyces cerevisiae中での発現に最適化されたコドンを含むHPLC−12抗凍結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築した:主として、優先的に用いられるS.cerevisiaeコドン中に発現した成熟AFPのDNA配列を含む15個からなる1セットのオリゴヌクレオチド(HPLC12.1、HPLC12.2、HPLC12.3、HPLC12.4、HPLC12.5、HPLC12.6、HPLC12.7、HPLC12.8、HPLC12.9、HPLC12.10、HPLC12.11、HPLC12.12、HPLC12.13、HPLC12.14及びHPLC12.15)を合成した。該合成遺伝子は、SacI及びHindIIIにより産生された付着端に対して適合性の一本鎖領域を含むように設計した(図17)
Claims (12)
- III型AFPタンパク質HPLC12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列をもつ実質的に純粋な単離組換え食品級ポリペプチド又はタンパク質。
- III型AFPタンパク質HPLC12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質を含む食品であって、該食品は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記食品。
- 該ポリペプチド又はタンパク質が組換えポリペプチド又はタンパク質である請求項2に記載の食品。
- 該ポリペプチド又はタンパク質が食品級ポリペプチド又はタンパク質である請求項2又は3に記載の食品。
- III型AFPタンパク質HPLC12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列をもつ組換えポリペプチド又はタンパク質を発現し得る酵母を含む食品であって、該食品は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記食品。
- 食品が冷凍用製品である請求項2〜5のいずれか一項に記載の食品。
- 食品がアイスクリームである請求項6に記載の食品。
- 食品が冷凍パン生地又は冷凍パン製品である請求項6に記載の食品。
- III型AFPタンパク質HPLC12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質を添加した生物材料であって、該生物材料は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記生物材料。
- 該ポリペプチド又はタンパク質が組換えポリペプチド又はタンパク質である、請求項9に記載の生物材料。
- III型AFPタンパク質HPLC12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列をもつ組換えポリペプチド又はタンパク質を発現し得る酵母を添加した生物材料。
- 該生物材料が動物臓器もしくは組織または植物である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の生物材料。
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